CN112899267A - 植物叶片dna提取裂解缓冲液、植物叶片dna快速提取的方法及应用 - Google Patents

植物叶片dna提取裂解缓冲液、植物叶片dna快速提取的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及植物叶片DNA提取裂解缓冲液、植物叶片DNA快速提取的方法及应用。本发明的植物叶片DNA提取裂解缓冲液，包括以下组分：65～75mM Tris‑HCl、30～40mM EDTA，提取裂解缓冲液的pH为8.0。本发明优化植物裂解液，将新鲜植物叶片直接进行裂解，整个提取过程只有1次加液、1次加热1次离心、并在1管中完成，其余步骤均省略，离心后取上清液即可进行常规的分子生物学实验操作，且提取出的DNA进行PCR扩增效果稳定。

Description

植物叶片DNA提取裂解缓冲液、植物叶片DNA快速提取的方法 及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及植物叶片DNA提取裂解缓冲液、植物叶片DNA快速提取的方法及应用。
背景技术
在植物分子实验工作中，经常需要对大量材料进行DNA提取。植物DNA提取已经具备成熟的传统方法，如CTAB法。CTAB法是一种快速简便的提取植物基因组DNA的方法，其原理是：采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。但常规CTAB植物叶片DNA提取方法步骤多、操作繁杂，需要经历冻干、研磨、裂解、抽提、纯化、溶解等步骤，其中有些步骤需要用到多种有毒的有机溶剂，整个提取过程成本较高、操作繁杂，且花费较多时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物叶片DNA提取裂解缓冲液。
本发明的再一目的在于提供植物叶片DNA快速提取的方法。
本发明的再一目的在于提供上述植物叶片DNA提取裂解缓冲液的应用。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA提取裂解缓冲液，所述提取裂解缓冲液包括以下组分：65～75mM Tris-HCl、30～40mM EDTA，提取裂解缓冲液的pH为8.0。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA提取裂解缓冲液，所述提取裂解缓冲液包括以下组分：70mM Tris-HCl、35mM EDTA，pH为8.0。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取植物新鲜叶片，置于离心管中；优选的，用打孔器取植物新鲜叶片得到直径为1cm的圆形叶片；
(2)将所述离心管中加入150μL提取裂解缓冲液，其中，所述提取裂解缓冲液包括以下组分：65～75mM Tris-HCl、30～40mM EDTA，pH为8.0；
(3)研磨叶片；
(4)加热后，离心；
(5)取上清液，得到植物叶片DNA。
步骤(1)中，用0.6cm的打孔器取植物新鲜叶片(直径为1cm的圆形叶片) 或者直接用剪刀或刀片取叶片1cm╳0.5cm放入2mL EP管中。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，步骤(2)中，所述离心管中还加入钢珠；优选的，加入的钢珠的数量为1个，钢珠的直径为 4mm；或者加入的钢珠的数量为2个或2个以上，钢珠的直径为1～3mm。
将钢珠加入裂解液中，直接进行震荡破碎叶片的细胞壁，可有效地配合裂解液完成对植物叶片细胞的破碎，有利于叶片中DNA被释放到上清液中；裂解提取液中还可加入其它材质的微球、或采用超声波等其它可以破碎细胞壁的方法，以达到破碎细胞壁的效果。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，步骤(3)中，将离心管在组织研磨仪上研磨20～60s。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，步骤(4)中，将离心管在85～95℃水浴条件下加热5～15min，取出后，10000～1200rpm离心1～3min。
除了采用水浴的方法外，还可以采用金属加热器、空气加热器等方法达到加热的效果。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，步骤(4)中，将离心管在90℃水浴条件下加热10min，取出后，10000～12000rpm离心1～ 3min。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，步骤(4)中，将离心管在85～95℃水浴条件下加热5～15min，取出后，12000rpm离心1min。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，所述方法适用于提取植物叶片，其中植物指种子植物、藻类植物、蕨类植物。
本发明的植物叶片DNA快速提取的方法，所述方法适用于提取种子植物叶片的DNA。其中，种子植物(拉丁学名：Spermatophyta)，又叫显花植物，有两个基本特征，就是体内有维管组织—韧皮部和木质部、能产生种子并用种子繁殖。
优选的，本发明方法适用于提取被子植物叶片的DNA。其中，被子植物指为被子植物亚门。被子植物分为二个纲，即双子叶植物纲和单子叶植物纲。
优选的，本发明方法适用于提取农作物的叶片，其中，农作物还包括粮食作物﹑经济作物(油料作物、蔬菜作物、花、草、树木)两大类，粮食作物以水稻、玉米、豆类、薯类、青稞、蚕豆、小麦为主要作物；油料作物以油籽、蔓青、大芥、花生、胡麻、向日葵等为主；蔬菜作物主要有萝卜、白菜、芹菜、韭菜、蒜、葱、胡萝卜、菜瓜、莲花菜、菊芋、刀豆、芫荽、莴笋、黄花、辣椒、黄瓜、西红柿、香菜等；果类有梨、青梅、苹果、桃、杏、核桃、李子、樱桃、草莓、沙果、红枣等品种；野生果类有酸梨、野杏、毛桃、山枣、山樱桃、沙棘等；饲料作物如玉米、绿肥、紫云英等；药用作物有人参、当归、金银花、薄荷、艾蒿等。
根据本发明具体实施方式的植物叶片DNA快速提取的方法，所述植物叶片为谷子、水稻、玉米、大豆、番茄或烟草的叶片。
本发明还提供上述物叶片DNA提取裂解缓冲液的应用，尤其是在植物叶片 DNA提取方面。
本发明的有益效果：
本发明提供植物叶片DNA提取裂解缓冲液，将新鲜植物叶片直接进行裂解，其余步骤均省略，离心后取上清液即可得到DNA，整个提取过程只有1次加液、 1次加热1次离心、并在1管中完成，易于操作，且不需要用到强碱等存在危险的裂解液，提取物可直接用于进行常规的分子生物学实验操作，如PCR扩增等；本发明的提取裂解缓冲液成分简单，无毒害试剂；叶片DNA提取步骤简单，省略了冻干、抽提、纯化等步骤，经过测试，本发明的方法可用于多种植物叶片的快速提取，并且提取出的DNA进行PCR扩增效果稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是提取谷子、烟草、玉米DNA进行PCR的电泳图；
图2是提取大豆、番茄、烟草DNA进行PCR的电泳图；
图3是不同提取裂解液配方提取水稻和烟草DNA进行PCR的电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1植物叶片DNA快速提取方法
1.1本发明的植物叶片DNA快速提取方法，包括以下步骤：
(1)用0.6cm的打孔器取植物新鲜叶片(直径为1cm的圆形叶片)；
(2)每个EP管中分别加入1颗直径为4mm的钢珠和150μL裂解液到EP 管中，提取裂解缓冲液包括65mM Tris-HCl、30mM EDTA，pH8.0；(裂解液需将叶片浸泡)；
(3)将EP管在组织研磨仪上研磨20-60s后取出；
(4)将EP管放入85℃水浴锅中加热10min，然后取出，10000rpm离心1min；
(5)取上清液，即得。
1.2本发明的植物叶片DNA快速提取方法，包括以下步骤：
(1)用0.6cm的打孔器取植物新鲜叶片(直径为1cm的圆形叶片)；
(2)每个EP管中分别加入1颗直径为4mm的钢珠和150μL裂解液到EP 管中，提取裂解缓冲液包括70mM Tris-HCl、35mM EDTA，pH8.0；(裂解液需将叶片浸泡)；
(3)将EP管在组织研磨仪上研磨20-60s后取出；
(4)将EP管放入90℃水浴锅中加热10min，然后取出，12000rpm离心1min；
(5)取上清液，即得。
1.3本发明的植物叶片DNA快速提取方法，包括以下步骤：
(1)用0.6cm的打孔器取植物新鲜叶片(直径为1cm的圆形叶片)；
(2)每个EP管中分别加入1颗直径为4mm的钢珠和150μL裂解液到EP 管中，提取裂解缓冲液包括75mM Tris-HCl、40mM EDTA，pH8.0；(裂解液需将叶片浸泡)；
(3)将EP管在组织研磨仪上研磨20-60s后取出；
(4)将EP管放入95℃水浴锅中加热10min，然后取出，12000rpm离心1min；
(5)取上清液，即得。
实施例2考察本发明方法提取DNA的效果
1.1实验前准备
(1)配制提取裂解缓冲液：70mM Tris-HCl，35mM EDTA，调节pH值至8.0。混匀常温放置。
(2)准备EP管。
1.2提取叶片DNA
选取水稻、谷子、番茄、玉米、大豆、烟草6种作物的新鲜叶片，用打孔器分别打孔3个直径为1cm的叶片圆孔；将选取的叶片分别装入已经编号对应的EP管中，设置对照组(CK)，CK组的样品均是按照常规CTAB提取法进行提取的；实验组1-3均是通过本发明方法提取DNA。
常规CTAB提取法的步骤为：
①植物叶片液氮研磨成粉末后，把粉末转移至离心管中并加入750μL 1.5 ×CTAB裂解液(65℃预热)，充分混匀后于65℃水浴30min，期间每隔10min 缓慢摇匀一次。
②30min后取出待冷却至室温后，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1混合)，轻轻混匀10min，至下层液变为深绿色。
③混匀后将离心管放入离心机中，转速12000rpm，离心10min。
④吸取500μL上层液相至新的1.5ml离心管中，加入等体积(500μL) 预冷的异丙醇，轻轻混匀2min。于-20℃冰箱放置30min以沉淀DNA。
⑤离心管放入离心机中，转速12000rpm，离心10min。
⑥弃掉上清，加入500μL 75％乙醇洗涤沉淀2次，完成后置于通风橱中晾干2h。
⑦DNA晾干后，每管加入50μL TE溶解DNA；DNA完全溶解后即提取完成。
表1 6种作物的样品编号
物种 CK 1 2 3
谷子 GZ0 GZ1 GZ2 GZ3
水稻 SD0 SD1 SD2 SD3
玉米 YM0 YM1 YM2 YM3
大豆 DD0 DD1 DD2 DD3
番茄 FQ0 FQ1 FQ2 FQ3
烟草 YC0 YC1 YC2 YC3
1.3 PCR反应
(1)在冰上按照下表各组分用量，配制PCR反应mix，并分装至PCR反应专用的薄壁管中。
表2 PCR反应体系配制
组分 体积(μL)
DNA上清液 1
2X Hieff PCR mix 25
引物F(10μM) 0.3
引物R(10μM) 0.3
MgCl<sub>2</sub>(20mM) 3.75
ddH<sub>2</sub>O 补水至50
Total 50ul
(2)上述体系mix混匀3-5s，瞬时离心后放置到PCR仪上进行PCR反应。
(3)各物种使用的PCR引物序列如下表。
表3 6个物种进行PCR的引物序列
物种 引物F 引物R 扩增片段长度(bp)
水稻 GCACCGCTGTAAGGCCACAT AGGAGGAAGAGGACGCCCATT 190
谷子 GTCCGATGCCGCGAAAATAT ATGCCAGCAAAGGAACACAG 580
番茄 GTCGGTAAAGCGTATTTCTG CCATGAATCTGACACCTTG 213
玉米 GGTCAGCATGAAGAGCCTGC GACGTAGAGCACGCTGATGAG 305
大豆 GACAACGGCGTGACCTACATG CTAAGAATCTGCGCCTCGGTG 430
烟草 GCTTTTCACTTGCTTCCTTGTCTG TAAAAGTCCAAATCCACCACCTGA 500
(3)按照以下参数设置PCR反应条件：
表4 PCR仪反应参数设置
Figure RE-GDA0003028784840000071
(4)PCR反应结束后，吸取反应产物1.5uL PCR产物进行凝胶电泳检测。
如图1、2所示，与CK组常规CTAB法提取的DNA结果相比，本发明快速提取法获得DNA条带清晰，与CK组效果相同。
本发明选用水稻和烟草叶片，比较提取裂解液的浓度对提取效果的影响，结果见表5、图3：
表5不同配方提取裂解液配方快速提取水稻和烟草DNA的效果
Figure RE-GDA0003028784840000081
结果如表5、图3所示，只有Tris-HCl为70mM，EDTA为35mM时，水稻和烟草才能同时获得清晰、无非特异性的条带。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.植物叶片DNA提取裂解缓冲液，其特征在于，所述提取裂解缓冲液包括以下组分：65～75mM Tris-HCl、30～40mM EDTA，提取裂解缓冲液的pH为8.0。
2.根据权利要求1所述的植物叶片DNA提取裂解缓冲液，其特征在于，所述提取裂解缓冲液包括以下组分：70mM Tris-HCl、35mM EDTA，提取裂解缓冲液的pH为8.0。
3.植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)取植物新鲜叶片，置于离心管中；
(2)向所述离心管中加入150μL提取裂解缓冲液，其中，所述提取裂解缓冲液包括以下组分：65～75mM Tris-HCl、30～40mM EDTA，提取裂解缓冲液的pH为8.0；
(3)研磨叶片；
(4)加热后，离心；
(5)取上清液，得到植物叶片DNA。
4.根据权利要求3所述的植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心管中还加入钢珠。
5.根据权利要求3所述的植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，步骤(3)中，将离心管在组织研磨仪上研磨20～60s。
6.根据权利要求3所述的植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，步骤(4)中，将离心管在85～95℃水浴条件下加热5～15min，取出后，10000～12000rpm离心1～3min。
7.根据权利要求3所述的植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，步骤(4)中，将离心管在90℃水浴条件下加热10min，取出后，10000～12000rpm离心1～3min。
8.根据权利要求3所述的植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，步骤(4)中，将离心管在85～95℃水浴条件下加热5～15min，取出后，12000rpm离心1min。
9.根据权利要求3所述的植物叶片DNA快速提取的方法，其特征在于，所述植物叶片为谷子、水稻、玉米、大豆、番茄或烟草的叶片。
10.权利要求1所述的植物叶片DNA提取裂解缓冲液的应用。
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