CN109609497A - 一种兜兰dna提取缓冲液及其配制方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种兜兰DNA提取缓冲液及其配制方法和使用方法，属于基因工程技术领域，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：150～250mL Tris‑HCl溶液、10～20g氯化钠、80～120mL EDTA溶液和5～15mLβ‑巯基乙醇。采用本发明提供的兜兰DNA提取缓冲液能够去除样品中的色素和多糖物质，得到质量较好的DNA，进而能够在凝胶成像时，使主带明显，而没有添加兜兰DNA提取缓冲液提取的DNA，在凝胶成像时，主带不明显。

Description

一种兜兰DNA提取缓冲液及其配制方法和使用方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种兜兰DNA提取缓冲液及其配制方法和使用方法。
背景技术
兜兰属(Paphiopedilum)植物花形奇特、花色丰富、花期持久，是世界重要的观赏花卉，市场潜力巨大。因过度采集和生境破坏，许多种类在野外已难觅踪迹，兜兰属的全部种类被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》附录1的保护范畴。杏黄兜兰(Paphiopedilum armeniacum)是兜兰属的旗舰物种，花大花型圆整，花色金黄，一经发现就惊艳整个兰花界，在东京国际兰花展上一举夺魁。正因为极高的观赏价值和旺盛的市场需求，野外非法采集屡禁不止，加之杏黄兜兰野外自然分布区十分狭窄，现在野外已经很难找到杏黄兜兰。因此，杏黄兜兰的保护开发及遗传研究已刻不容缓。
无论是分子遗传分析工具的开发或是遗传背景分析研究，第一步都是需要提取杏黄兜兰的DNA。DNA提取质量的好坏直接影响到后面的研究结果。杏黄兜兰叶片较厚，叶片寿命较长，因此叶片组织中含有较多的色素和多糖类物质，在抽提过程中经常会出现粘稠的胶状物质，对上清液的吸出造成很大的困难。而且最终提出来的总DNA中色素和多糖较多，经常呈现果冻状凝块。电泳检测时，胶孔发亮，主带不明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兜兰DNA提取缓冲液及其配制方法和使用方法，采用本发明提供的兜兰DNA提取缓冲液，能够去除样品中的色素和多糖物质，得到质量较好的DNA，进而能够在凝胶成像时，使主带明显。
本发明提供了一种兜兰DNA提取缓冲液，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：150～250mLTris-HCl溶液、10～20g氯化钠、80～120mL EDTA溶液和5～15mLβ-巯基乙醇。
优选的，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：200mLTris-HCl溶液、14.61g氯化钠、100mL EDTA溶液和10mLβ-巯基乙醇。
优选的，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.8～1.2mol/L。
优选的，所述Tris-HCl溶液的浓度为1mol/L。
优选的，所述EDTA溶液的浓度为0.3～0.8mol/L。
优选的，所述EDTA溶液的浓度为0.5mol/L。
本发明还提供了上述技术方案所述的兜兰DNA提取缓冲液的配制方法，包括：将所述Tris-HCl溶液、氯化钠、EDTA溶液和β-巯基乙醇依次溶于水中，得到兜兰DNA提取缓冲液。
本发明还提供了上述技术方案所述的兜兰DNA提取缓冲液的使用方法，包括：样品与缓冲液混合、冰浴，将得到的冰浴物离心，弃掉上清液后，与裂解液混合。
优选的，所述冰浴的时间为8～12min。
优选的，所述离心的条件包括：所述离心的时间为5～10min，所述离心的转速为10000～13000rpm。
本发明提供了一种兜兰DNA提取缓冲液，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：150～250mLTris-HCl溶液、10～20g氯化钠、80～120mLEDTA溶液和5～15mLβ-巯基乙醇。在本发明中，所述巯基乙醇和EDTA具有快速结合沉淀混合溶液中色素蛋白和多糖类物质的能力，采用本发明的兜兰DNA提取缓冲液能够去除样品中色素和多糖物质，得到质量较好的DNA，进而能够在凝胶成像时，使主带明显。
本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的兜兰DNA提取缓冲液能够去除样品中的色素和多糖物质，得到质量较好的DNA，进而能够在凝胶成像时，使主带明显，而没有添加兜兰DNA提取缓冲液提取的DNA，在凝胶成像时，主带不明显。
附图说明
图1为提取的杏黄兜兰DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为marker，DNA-C为不采用本发明提供的缓冲液提取得到的杏黄兜兰DNA的琼脂糖凝胶电泳结果，DNA为采用本发明提供的缓冲液提取得到的杏黄兜兰DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
本发明提供了一种兜兰DNA提取缓冲液，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：150～250mLTris-HCl溶液、10～20g氯化钠、80～120mLEDTA溶液和5～15mLβ-巯基乙醇。
在本发明中，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升优选包括：200mLTris-HCl溶液、14.61g氯化钠、100mLEDTA溶液和10mLβ-巯基乙醇。
在本发明中，所述Tris-HCl溶液的浓度优选为0.8～1.2mol/L，更优选为1mol/L。在本发明中，所述Tris-HCl溶液的pH值优选为8。本发明对所述Tris-HCl溶液的配制方法没有特殊限定，采用常规配制方法即可。在本发明中，所述Tris-HCl溶液给反应体系提供稳定的pH。
在本发明中，所述EDTA溶液的浓度优选为0.3～0.8mol/L，更优选为0.5mol/L。在本发明中，所述EDTA溶液的pH值优选为8。在本发明中，所述EDTA溶液结合沉淀多糖类物质和部分色素蛋白。
在本发明中，所述氯化钠给反应体系提供适宜的离子浓度。
在本发明中，所述β-巯基乙醇结合沉淀色素蛋白和多糖类物质。
本发明还提供了上述技术方案所述的兜兰DNA提取缓冲液的配制方法，包括：将所述Tris-HCl溶液、氯化钠、EDTA溶液和β-巯基乙醇依次溶于水中，得到兜兰DNA提取缓冲液。
在本发明中，所述水优选为无菌纯净水。
本发明还提供了上述技术方案所述的兜兰DNA提取缓冲液的使用方法，包括：样品与缓冲液混合、冰浴，将得到的冰浴物离心，弃掉上清液后，与裂解液混合。
在本发明中，所述样品优选为杏黄兜兰的新鲜叶片。
本发明优选将所述样品经液氮研磨后，与缓冲液混合。在本发明中，所述样品的质量与缓冲液的体积比优选为(1.5～2.5):(1.5～2.5)，更优选为2:2。
在本发明中，所述冰浴的时间优选为8～12min，更优选为10min。
在本发明中，所述离心的条件包括：所述离心的时间优选为5～10min，更优选为6～9min，最优选为7～8min；所述离心的转速优选为10000～13000rpm，更优选为12000rpm。
本发明对所述裂解液的种类和使用量没有特殊限定，采用常规提取植物基因组DNA中的裂解液的种类和使用量即可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种兜兰DNA提取缓冲液及其配制方法和使用方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
兜兰DNA提取缓冲液配方及配制：
成分(每升含量)：
1、1M Tris-HCl(pH＝8.0)200mL；
2、NaCl 14.61g；
3、0.5M EDTA(pH＝8.0)，100mL；
4、β-巯基乙醇，10mL。
配制：在600mL无菌纯净水中依次加入上述组分，溶解后定容至1000mL，置于4℃冰箱中保存。
实施例2
兜兰DNA提取缓冲液配方及配制：
成分(每升含量)：
1、1M Tris-HCl(pH＝8.0)250mL；
2、NaCl 18.5g；
3、0.5M EDTA(pH＝8.0)，120mL；
4、β-巯基乙醇，15mL。
配制：在600mL无菌纯净水中依次加入上述组分，溶解后定容至1000mL，置于4℃冰箱中保存。
实施例3
一、杏黄兜兰快速去糖DNA提取方法
1、取杏黄兜兰新鲜叶片，液氮急冻3～4次，急速研磨，取2勺粉末于5mL离心管中，放于冰块中。
2、加2mL实施例1制备的兜兰DNA提取缓冲液，混匀，冰浴10min。
3、离心(12000rpm)5～10min，倒掉上清液。
5、取出管子，自然冷却至室温，加入2mL的24:1(氯仿:异戊乙醇＝24:1)混匀，不断轻轻摇晃5～10min。
6、离心(12000rpm)10min，吸取上清液1.8mL，加入2mL的24:1混匀，不断轻轻摇晃5～10min。离心(12000rpm)10min，吸取上清液1.6mL。
7、加入70％(体积比)异丙醇1.1mL，混匀，置于-20℃冰箱中30min(沉降DNA)。
8、离心(12000rpm)10min，倒掉上清液，加入70％乙醇清洗1遍，转入2mL的管子，再加入70％乙醇清洗1遍。
9、离心(12000rpm)10min，倒掉70％乙醇，加入无水乙醇清洗2遍(每次倒掉清洗液前可进行离心(12000r)10min)。
10、冷冻干燥5min，DNA干粉至于-20℃冰箱中备用；或用ddH2O溶解，加入1uLRNA酶温育30min(37℃)，用紫外分光光度计UV-240检测DNA纯度与浓度，按比例稀释到所需浓度后置于-20℃冰箱保存备用。
二、DNA的琼脂糖电泳分析
1、称取0.5g琼脂糖粉末至于锥形瓶中，加入50mL的0.5x TBE电泳缓冲液，然后至于微波炉中加热至完全融化，液体透明。摇匀，得胶液。冷却至60℃左右，加入适量的溴化乙錠至浓度为0.5ug/mL。
2、取有机玻璃制胶板槽，用透明胶带将板槽四周封严，并滴加少量胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。
3、水平放置胶槽，一端放置梳子，在槽内缓慢倒入冷却至60℃的胶液，使之形成均匀水平的胶液。
4、待胶凝固后，小心拔出梳子，撕下透明胶带，至于电泳槽内。
5、槽内加入0.5x TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。
6、把DNA分子量标准品(M)、待检测的DNA样品(DNA-C；DNA)用移液器加入到凝胶的加样孔中。
7、接通电泳仪和电泳槽，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。
8、观察分子量标准品溴酚蓝带的移动，当其移动至胶板前缘1cm处时停止电泳。
9、取出胶板，放置于紫外透视仪样品台上观察和拍照。
杏黄兜兰DNA样品电泳结果见图1。
从图1中可以得出，DNA主带位于2000kb的位置，主带清晰明显，说明得到了高纯度的大小约为2000kb的DNA片段。
对比例1
除不添加实施例1制备的缓冲液外，其余步骤与实施例3相同，结果见图1。
从图1中可以得出，DNA-C为不添加缓冲液的杏黄兜兰DNA电泳结果，DNA主带位于胶孔处，且有拖尾现象。这是由于DNA溶液中有大量多糖物质以及色素蛋白，杏黄兜兰DNA片段和多糖或蛋白结合形成大分子团状物，在电容过程中无法通过凝胶中的孔隙，停留在胶孔处，造成胶孔处发亮的条带。有少量结合多糖和色素蛋白能力较弱的大小不一的DNA小片段可以在电泳中通过胶孔，形成了拖尾现象。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的缓冲液能够去除样品中的色素和多糖物质，得到质量较好的DNA，进而能够在凝胶成像时，使主带明显，而没有添加缓冲液提取的DNA，在凝胶成像时，主带不明显。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种兜兰DNA提取缓冲液，其特征在于，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：150～250mLTris-HCl溶液、10～20g氯化钠、80～120mLEDTA溶液和5～15mLβ-巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的兜兰DNA提取缓冲液，其特征在于，所述兜兰DNA提取缓冲液以水为溶剂，每升包括：200mLTris-HCl溶液、14.61g氯化钠、100mLEDTA溶液和10mLβ-巯基乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的兜兰DNA提取缓冲液，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.8～1.2mol/L。
4.根据权利要求3所述的兜兰DNA提取缓冲液，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的浓度为1mol/L。
5.根据权利要求1或2所述的缓冲液，其特征在于，所述EDTA溶液的浓度为0.3～0.8mol/L。
6.根据权利要求5所述的兜兰DNA提取缓冲液，其特征在于，所述EDTA溶液的浓度为0.5mol/L。
7.权利要求1～6任一项所述的兜兰DNA提取缓冲液的配制方法，其特征在于，包括：将所述Tris-HCl溶液、氯化钠、EDTA溶液和β-巯基乙醇依次溶于水中，得到兜兰DNA提取缓冲液。
8.权利要求1～6任一项所述的兜兰DNA提取缓冲液的使用方法，其特征在于，包括：样品与兜兰DNA提取缓冲液混合、冰浴，将得到的冰浴物离心，弃掉上清液后，与裂解液混合。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述冰浴的时间为8～12min。
10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述离心的条件包括：所述离心的时间为5～10min，所述离心的转速为10000～13000rpm。
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