CN105505920A - 一种提取顽拗植物组织dna的新方法 - Google Patents

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吴潇
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

本发明公开了一种提取顽拗植物组织DNA的新方法。一种提取顽拗植物组织DNA的方法，该方法中所用抽提缓冲液是月桂酸钠抽提缓冲液。其优点在于：该发明运用生物降解性很好的阴离子表面活性剂——月桂酸钠作为提取缓冲液，既能将梨组织中存在的多糖、色素和多酚等次生物质进行洗脱，又因为该方法不需要水浴，省时，操作简便，最大程度地减小了提取过程中DNA的降解，DNA获得率高，较为完整，克服了试剂盒提取的DNA量少，CTAB提取DNA时间长，杂质多的弊端。

Description

一种提取顽拗植物组织DNA的新方法
技术领域
本发明属于DNA提取技术领域，涉及一种提取顽拗植物组织DNA的新方法。
背景技术
DNA是基本遗传物质，是遗传信息的载体。一定数量及高质量的DNA样品是进行限制性酶切、基因克隆、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的基础。因此，获取高质高量的DNA显得极为重要。由于不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，其DNA提取难易程度存在明显差异。从大多数的禾谷类及蔬菜类植物中提取DNA的难度就相对低于富含多糖、多酚、单宁、色素等代谢物质的木本植物。分子生物学家称含有大量影响高质量分离的初生次生物质的植物为顽拗植物，这类植物有梨、柿子、龙眼等。如何去除这些杂质是顽拗植物获得高质量的DNA面临的主要问题。
我国梨树栽培历史悠久，资源丰富，栽培面积和产量一直居世界首位，梨也是我国发展最迅速的水果之一，在国内位居全国水果栽培总面积和总产量的第三位。近些年，我国科研工作者关于梨的分子生物学层面开展了众多研究，2012年5月，世界首个梨全基因组序列图谱绘制也已经完成。梨作为多年生木本果树，其叶片、果皮等组织中富含多糖、酚类、单宁和其他次生物质，这些次生物质与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物而难以溶解或产生褐变；此外，梨果实水分含量大，尤其是成熟梨果肉组织DNA含量少。现有传统的CTAB法以及试剂盒提取法对上述梨组织DNA的提取都存在不足之处：传统CTAB及其改良方法操作繁琐，且获得的DNA纯度低，对上述梨组织DNA的提取量很有限，效率较低；试剂盒法仅适用于少量DNA的提取。针对上述方法存在的不足，创新了一种提取梨组织DNA的新方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，在顽拗植物尤其是梨多种组织上进行DNA的提取时，提供一种既保证较高的DNA纯度和浓度，又省时简便的DNA提取方法，以克服上述背景技术中的缺点，提高DNA提取效率。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种提取顽拗植物组织DNA的方法，该方法所用抽提缓冲液是月桂酸钠抽提缓冲液；所述的月桂酸钠抽提缓冲液，以500mL总量计，其配制方法是：称取月桂酸钠3～8g，氯化钠2.5～3.5g，加入50mL浓度为0.5～2mol·L‐1pH8.0的Tris‐HCl缓冲液、15～35mL浓度为0.5mol·L‐1pH8.0的EDTA、400mLddH2O，调节pH至8.0，ddH2O定容至500mL，灭菌后室温保存。
所述的月桂酸钠抽提缓冲液，以500mL总量计，其配制方法优选：称取月桂酸钠5g，氯化钠2.925g，加入50mL浓度为1mol·L‐1pH8.0的Tris‐Hcl、20mL浓度为0.5mol·L‐1pH8.0的EDTA、400mLddH2O，调节pH至8.0，ddH2O定容至500mL，灭菌后室温保存。
所述的顽拗植物优选自梨、柿子、龙眼；进一步优选梨。
本发明所述的一方法，优选包含以下步骤：
(1)将梨组织样品置于经过液氮预冷的研钵内，迅速研磨至粉状，研磨过程中防止DNA被降解，期间应不断加入液氮。将研磨好的粉末移入抽提管中，加入月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀；
(2)加入与步骤(1)月桂酸钠用量等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，再次反复缓慢的摇匀后，4℃，12000rpm，离心15～20分钟，吸取上清液；所述的酚、氯仿和异戊醇混合液中酚、氯仿和异戊醇体积比为20～30:20～28:1；
(3)加入步骤(2)中吸取的上清液总体积的0.7倍异丙醇，上下缓慢颠倒数次，静置沉淀1h以上，4℃，12000rpm，离心4～6分钟，倒去上清液；
(4)70％～75％(体积百分比)的乙醇洗涤步骤(3)所得沉淀，反复轻轻震荡洗涤，4℃，10000～12000rpm，离心5～10分钟，弃上清，重复此步骤两次；
(5)4℃，10000～12000rpm，短暂离心20～30秒，吸干残留乙醇；
(6)置于37℃烘箱，使乙醇挥发干净；
(7)加入TE缓冲液，放置在恒温箱溶解沉淀；
(8)待DNA完全溶解后，加入2～5μL的0.1mg·mL-1RNase，置于37℃烘箱30～60分钟消化RNA。
步骤(1)中梨组织与月桂酸钠提取缓冲液的用量关系进一步优选为：用2mLEP管提取时，梨叶片、果皮组织可取0.1～0.2g，梨果肉组织因为水分多，取0.5～0.6g：月桂酸钠提取缓冲液500～700μL；用50mL抽提试管提取梨组织大片段DNA时，叶片、果皮组织可取2.5～5.0g，梨果肉组织可以取12.5～15.0g：月桂酸钠提取缓冲液12～18mL。
步骤(3)中加入的异丙醇用量优选为步骤(2)吸取的上清液总体积的0.5～0.7倍，静置时间为1h以上；离心时的参数为：4℃，12000rpm，离心时间为4～6分钟。
步骤(7)中100mL的TE缓冲液配制方法为：1mL的1mol·L‐1pH＝8.0Tris‐HCl缓冲液、0.2mL的0.5mol·L‐1pH＝8.0EDTA，加入约80mLddH2O均匀混合，用ddH2O将溶液定容到100mL后，高温高压灭菌后室温保存；根据自己需要的DNA浓度选取TE缓冲液的用量，小片段提取时加50～200μL，大片段提取时加300～1000μL；恒温箱温度为65℃。
步骤(8)中RNase的用量为0.1mg·mL‐1的RNase加入2～5μL；烘箱温度为37℃，时间为30～60分钟。
有益效果
(1)本发明中梨不同组织DNA提取方法中所用的提取缓冲液是月桂酸钠提取缓冲液，月桂酸钠是一种阴离子表面活性剂，生物降解性很好，不仅有澄清去污作用，还可以促进沉降。月桂酸钠可以很好地洗脱梨组织中存在的多糖、色素和多酚等次生物质，使沉降的DNA纯度更高。
(2)采用本发明中的梨不同组织DNA提取的方法，样本量和试剂用量成倍性关系，可以根据自己需要的DNA的用途与样品组织用量进行换算，灵活变通，所以在对大量梨组织DNA的提取上也可以适用。
(3)本发明中月桂酸钠法提取步骤少，并且该方法不需要水浴，省时，操作简便，最大程度地减小了提取过程中DNA的降解，DNA获得率高、较为完整，能够获得大量且纯度高的DNA样品。
(4)本发明在梨果肉0.6g左右样品量中能提取到275.8ng/μL的DNA浓度，在梨果皮0.15g左右样品量中能提取到194.4ng/μL的DNA浓度，在梨叶片0.10g左右样品量中能提取到436.8ng/μL的DNA浓度，并且OD260/280值都达到了1.9以上(具体的数据见下表)。虽然用CTAB法提取0.10g梨叶片得到平均735.1ng/μL的DNA浓度，但是CTAB法提取的基因组DNA条带拖尾弥散，杂质多，纯度低(见附图3，图6)；月桂酸钠法提取的基因组DNA条带亮、清晰，在叶片虽然有点拖尾弥散，但是整体结果都说明该法提取梨果肉、果皮、叶片基因组DNA效率比试剂盒和传统的CTAB法更高。
3种不同方法提取真菌基因组DNA纯度和浓度检测结果
(5)本发明方法也可运用于其他顽拗植物组织的DNA提取。
附图说明
图1是用月桂酸钠方法、商品化试剂盒以及CTAB三种方法分别提取的梨果肉DNA片段的电泳图；其中商品化试剂盒提取的梨果肉DNA片段的方法按照说明书记载，CTAB法提取梨果肉DNA片段的方法为现有技术。
图2是用月桂酸钠方法、商品化试剂盒以及CTAB三种方法分别提取的梨果皮DNA片段的电泳图；
图3是用月桂酸钠方法、商品化试剂盒以及CTAB三种方法分别提取的梨叶片DNA片段的电泳图；
图4是用月桂酸钠方法分别提取的梨果肉、果皮以及叶片DNA片段的电泳图；
图5是用商品化试剂盒分别提取的梨果肉、果皮以及叶片DNA片段的电泳图；
图6是用CTAB方法分别提取的梨果肉、果皮以及叶片DNA片段的电泳图。
具体实施方式
下面以本发明方法在梨果肉DNA提取上的应用为例(图1，图4)，说明其具体实施过程。
实施例1
(1)取0.6g梨果肉组织样品置于经过液氮预冷的研钵内，迅速研磨至粉状，研磨过程中防止DNA被降解，期间不断加入液氮。将研磨好的粉末移入2mLEP管中，加入600μL月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀；
(2)加入600μL酚、氯仿和异戊醇(25:24:1)混合液，反复缓慢的摇匀后，4℃，12000rpm，离心20分钟，吸取1200μL上清液；
(3)在步骤(2)所得上清液中加入840μL异丙醇，上下缓慢颠倒数次，静置沉淀1h，4℃，12000rpm，离心5分钟，倒去上清液；
(4)75％乙醇洗涤沉淀，反复轻轻震荡洗涤，4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清，重复此步骤两次；
(5)4℃，10000rpm，短暂离心30s，用移液枪吸干残留乙醇；
(6)置于37℃烘箱5分钟左右，使乙醇挥发干净；
(7)加入100uL的TE缓冲液，放置于65℃恒温箱溶解沉淀；
(8)待DNA完全溶解后，加入2μL0.1mg·mL-1的RNase，置于37℃烘箱消化RNA1h。

Claims (8)

1.一种提取顽拗植物组织DNA的方法，其特征在于该方法中所用抽提缓冲液是月桂酸钠抽提缓冲液；所述的月桂酸钠抽提缓冲液，以500mL总量计，其配制方法是：称取月桂酸钠3～8g，氯化钠2.5～3.5g，加入50mL浓度为0.5～2mol·L‐1pH8.0的Tris‐HCl缓冲液、15～35mL浓度为0.5mol·L‐1pH8.0的EDTA、400mLddH2O，调节pH至8.0，ddH2O定容至500mL，灭菌后室温保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的月桂酸钠抽提缓冲液，以500mL总量计，其配制方法是：称取月桂酸钠5g，氯化钠2.925g，加入50mL浓度为1mol·L‐1pH8.0的Tris‐Hcl、20mL浓度为0.5mol·L‐1pH8.0的EDTA、400mLddH2O，调节pH至8.0，ddH2O定容至500mL，灭菌后室温保存。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的顽拗植物选自梨、柿子、龙眼；优选梨。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将梨组织样品置于经过液氮预冷的研钵内，迅速研磨至粉状，研磨过程中防止DNA被降解，期间应不断加入液氮；将研磨好的粉末移入抽提管中，加入月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀；
(2)加入与步骤(1)月桂酸钠抽提缓冲液用量等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，再次反复缓慢的摇匀后，4℃，12000rpm，离心15～20分钟，吸取上清液；所述的酚、氯仿和异戊醇混合液中酚、氯仿和异戊醇体积比为20～30:20～28:1；
(3)在步骤(2)所得上清液中加入异丙醇，上下缓慢颠倒数次，静置沉淀，离心，倒去上清液；
(4)70％～75％的乙醇洗涤步骤(3)所得沉淀，反复轻轻震荡洗涤，4℃，10000～12000rpm，离心5～10分钟，弃上清，重复此步骤两次；
(5)4℃，10000～12000rpm，短暂离心20～30秒，吸干残留乙醇；
(6)置于37℃烘箱，使乙醇挥发干净；
(7)加入TE缓冲液，放置在恒温箱溶解沉淀；
(8)待DNA完全溶解后，加入RNase，置于烘箱消化RNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中梨组织与月桂酸钠抽提缓冲液的用量关系为：用2mLEP管提取梨组织DNA时，梨叶片、果皮组织取0.1～0.2g，梨果肉组织取0.5～0.6g：月桂酸钠抽提缓冲液用量为500～700μL；用50mL抽提试管提取梨组织大片段DNA时，叶片、果皮组织取2.5～5.0g，梨果肉组织取12.5～15.0g：月桂酸钠抽提缓冲液用量为12～18mL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中加入的异丙醇用量为步骤(2)吸取的上清液总体积的0.5～0.7倍，静置时间为1h以上；离心时的参数为：4℃，12000rpm，离心时间为4～6分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(7)中100mL的TE缓冲液配制方法为：1mL的1mol·L‐1pH＝8.0Tris‐HCl缓冲液、0.2mL的0.5mol·L‐1pH＝8.0EDTA，加入约80mLddH2O均匀混合，用ddH2O将溶液定容到100mL后，高温高压灭菌后室温保存；根据自己需要的DNA浓度选取TE缓冲液的用量，小片段提取时加50～200μL，大片段提取时加300～1000μL；恒温箱温度为65℃。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(8)中RNase的用量为0.1mg·mL‐1的RNase加入2～5μL；烘箱温度为37℃，时间为30～60分钟。
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