CN103103268B

CN103103268B - 茄子est-ssr标记的开发及应用方法

Info

Publication number: CN103103268B
Application number: CN201310023573.1A
Authority: CN
Inventors: 陈火英; 葛海燕; 刘杨; 王新华; 刘新宇; 张国刚
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-01-22
Also published as: CN103103268A

Abstract

一种茄子EST-SSR标记的开发及应用方法，步骤为：1）从NCBI数据库中获得EST序列，进行处理并检测SSR；2）设计SSR标记的引物序列；3）获取表1编号1-48的茄子材料和茄子F₂群体的植株嫩绿叶片，提取总DNA；4）用设计的SSR标记引物序列扩增表1编号1-12的茄子材料；5）获得表1编号7-12的茄子材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表；6）用所获EST-SSR标记扩增表1编号13-48的茄子材料和F₂群体；7）计算每对引物的多态性信息含量并对表1编号13-48的茄子材料进行遗传多样性聚类分析；8）对步骤6）所获F₂群体扩增标记进行连锁作图和QTL定位。结果表明：G249引物与茄子果实长度及果型性状连锁，分别解释表型变异的4%和5.1%；G192引物与茄子花萼果实大小性状连锁，解释表型变异的5.3%。

Description

茄子EST-SSR标记的开发及应用方法

技术领域

本发明涉及的是一种植物的育种方法，具体涉及茄子EST-SSR标记的开发方法，以及利用该标记进行茄子遗传多样性的评价、分子遗传连锁图谱的构建和茄子重要性状的QTL定位的应用方法，属于育种技术领域。

背景技术

SSR标记，又称微卫星DNA，由串连重复的短序列组成，重复单位长度一般为1-6个bp。由于SSR标记具有多态性高、共显性、数量丰富、基因组覆盖距离广、高分辨率、易于检测及操作简单等特征，因此在遗传分析中起着重要的作用(Powell et al.，1996；Stagel et al.，2008)。

茄子(Solanum melongena L.),属于茄科茄属，是许多国家的重要蔬菜作物。茄子含有丰富的矿物质和维生素，茄子中含有的多酚物质具有重要的抗氧化活性(Nisha et al.，2009；Sudheesh et al.，1999)。与茄科的两个模式作物番茄和土豆相比，茄子具有大果型和各种抗逆性；而且，茄子具有独特的系统发生特征(Fukuoka et al.，2012)。尽管茄子种植广泛且具有如此重要的价值，但是与同科作物番茄(S.lycopersicumL.)、土豆(S.tuberosum L.)、辣椒(Capsicum spp.L.)相比，它的分子生物学研究仍然比较落后(Nunome et al.，2009；Fukuoka et al.，2012)。

目前，在茄子研究中，已经报道有一些分子遗传图谱(Barchi et al.，2010；Cao et al.，2006；Doganlaret al.，2002a；Doganlar et al.，2002b；Nunome et al.，2001；Nunome et al.，2003；Nunome et al.，2009；Sunseri et al.，2003；Wu et al.，2009)。然而，这些图谱主要是由标记RAPD(random amplifiedpolymorphic DNA)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)、AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism)标记(Nunome et al.，2001；Doganlar et al.，2002b；Nunome et al.，2003；Sunseri et al.，2003；Cao et al.，2006；Barchi et al.，2010)、cos II标记(constructed with conserved ortholog set II)(Wu etal.，2009)和SOL(Solanum orthologous)标记(Fukuoka et al.，2012)构建。2009年，Nunome et al.构建了一个包含236个SSR标记的连锁图，这张图谱是目前茄子研究中包含最多SSR标记的一张。此外，这些图谱的构图群体仍具有局限性。到目前为止，所有构图的种间F₂群体均为S. linnaeanum和S. melongena的杂交后代(Doganlar et al.，2002a；Doganlar et al.，2002b；Sunseri et al.，2003；Wu et al.，2009)，其余的图谱则均为种内F₂群体，其主要原因是茄子种间杂交种具有各种障碍。

在茄子上，已经开发出部分SSR标记(Nunome et al.，2009；Stagel et al.，2008)并应用于图谱的构建(Nunome et al.，2009)。然而，在茄子种内，标记的多态性比较低，为了构建一个高密度的连锁图谱，需要开发更多的标记。

目前，茄子的研究基础相比茄科其他作物一直比较薄弱，在公共数据库中能得到的序列信息比较有限。在2009年，Fukuoka等上传了大量的EST序列(Fukuoka et al.，2010)，这大大丰富了茄子数据库，并且为开发SSR标记提供了大量的信息。

为了进一步丰富茄子SSR的标记，用于分子遗传育种，申请人根据NCBI数据库中的茄子EST序列，开发了部分EST-SSR标记，并利用开发的标记对茄子种质进行了遗传多样性、遗传图谱构建及QTL定位研究等应用。

发明内容

本发明针对目前对茄子遗传育种技术比较薄弱的不足，开发茄子EST-SSR标记的引物序列，并将其应用于茄子遗传多样性、遗传连锁图谱构建和QTL定位的研究。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种茄子EST-SSR标记的开发和应用方法，其特征在于，具体按照以下步骤完成：

1）从NCBI数据库中获得EST序列，对所获得的EST序列进行处理并检测该EST序列中的SSR；

2）设计SSR标记的引物序列；

3）从田间获取如表1所示的编号1-48的茄子材料和茄子F₂群体的植株的嫩绿叶片，提取其总DNA；

4）用步骤2）所设计的SSR标记的引物序列扩增步骤3）中表1所示的编号1-12的茄子材料；

5）获得在步骤3）中表1所示的编号7-12的茄子材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表所示；

6）用步骤5）所获得的EST-SSR标记扩增步骤3）中表1所示的编号13-48的茄子材料和F₂群体；

7）计算每对引物的多态性信息含量并对步骤3）中表1所示的编号13-48的茄子材料进行遗传多样性的聚类分析；

8）对步骤6）所获得的F₂群体扩增的标记进行连锁作图和茄子果实性状的QTL定位。

表1本发明所用的所有植物材料

步骤3）中所述的提取总DNA的具体方法步骤如下：

1）将100-200mg所述嫩绿叶片的冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，将研磨的粉末转入2ml离心管中，加入800ul新鲜配制的提取缓冲液，涡旋混匀，冰浴保存10min，10000rpm、4℃离心15min，弃上清；

2）于沉淀中加入700ul65℃预热的裂解缓冲液，并用牙签搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

3）加入750ul的氯仿∶异戊醇为24：1的混合液，翻转50次以上，10000rpm、4℃离心15min，将上清转入2ml的离心管中；

4）加入750ul的氯仿∶异戊醇为24：1的混合液，翻转50次以上，10000rpm、4℃离心15min，将上清转入1.5ml的离心管中；

5）加0.1体积pH5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min，弃上清液，加700ul70%乙醇洗DNA小团，10000rpm、4℃离心10min，倒掉上清液，通风干燥20min；

6）加200μl的TE缓冲液4℃，30min以上溶解DNA，并保存。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明共开发EST-SSR引物187对，其中43对能成功地在编号13-48的36个茄子栽培种质中扩增出多态性，43对引物共获得113个多态性位点，最多一对引物检测到了6个多态位点。平均每对引物能检测到2.63个多态性位点。检测到的多态性信息含量（PIC值）范围为0.053-0.673，平均PIC值为0.35。43对EST-SSR引物在编号13-48的36个茄子种质材料中分析发现所有茄子种质的期望杂合度(He)（Nei基因多样性）平均值为0.352，Shannon信息指数(I)平均值为0.598。36份材料的相似系数范围是0.60-0.93，被这些引物分成不同的组别，且基本与其形态特征和系统进化相吻合。

2、43对EST-SSR引物中有10对在茄子亲本44和41之间有多态性，通过连锁分析将7个EST-SSR引物构建到本F₂群体上，并找到与之连锁的果实相关的3个QTLs。

附图说明

图1为本发明的EST-SSR标记对编号13-48的茄子材料的扩增图。

图2为本发明的EST-SSR标记分析的编号13-48的茄子材料的聚类图。

图3为本发明的EST-SSR标记对亲本44、41、F₁和F₂群体的扩增图。

图4为本发明的EST-SSR标记在F₂群体上的连锁分布及QTL定位图。

具体实施方式

本发明所述的茄子EST-SSR标记的开发和应用方法，具体按照以下步骤完成：

2）设计SSR标记的引物序列；

3）从田间获取如表1所示的编号1-48的茄子材料和茄子F2群体的植株的嫩绿叶片，提取其总DNA；

步骤3）中所述的提取总DNA的具体方法步骤如下：

3）加入750ul氯仿∶异戊醇为24：1的混合液，翻转50次以上，10000rpm、4℃离心15min，将上清转入2ml的离心管中；

4）加入750ul氯仿∶异戊醇为24：1的混合液，翻转50次以上，10000rpm、4℃离心15min，将上清转入1.5ml的离心管中；

6）加200μl TE缓冲液4℃，30min以上溶解DNA，并保存。

表1本发明所用的所有植物材料

以下对本发明作进一步描述：

1、供试材料（如表1所示）：选择茄子材料12份（编号1-12，其中6份为野生种质，6份为栽培种质）、栽培茄子材料36份（编号13-48）以及由亲本44和41构建的F₂群体。

2、总DNA提取方法：田间取所述供试材料的嫩绿叶片，提取其总DNA，具体方法步骤如下：

（1）将100-200mg所述嫩绿叶片的冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨；将研磨的粉末转入2ml离心管中，加入800ul新鲜配制的提取缓冲液，涡旋混匀，冰浴保存10min，10000rpm离心15min（4℃），弃上清；所述的提取缓冲液为0.35M Glucose、0.1M Tris.HCl、5mM Na.EDTA、2%PVP、1%(V/V)β-Me和dd Water。

（2）于沉淀中加入700ul65℃预热的裂解缓冲液，并用牙签搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；所述的裂解缓冲液为1.4M NaCl、0.1M Tris.HCl、20mM Na.EDTA、2%CTAB、2%PVP、1%(V/V)β-Me和dd Water。

（3）加入750ul的氯仿∶异戊醇为24：1的混合液，翻转50次以上，10000rpm离心15min（4℃），将上清转入2ml的离心管中。

（4）加入750ul的氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm离心15min（4℃），将上清转入1.5ml的离心管中。

（5）加0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min；弃上清液，加700ul70%乙醇洗DNA小团，10000rpm，离心10min（4℃），倒掉上清液，通风干燥20min。

（6）加200μl的TE缓冲液溶解DNA（4℃，30min以上），并保存；所述的TE缓冲液为10mMTris/HCl(PH8.0)和1mM EDTA(PH8.0)。

3、SSR的PCR反应体系为：体系总体积为10μL，模板DNA约为20ng.，前引物与后引物分别为0.1μM，2.5mM Mg Cl₂,0.2mM dNTPs,1×Taq buffer和1U Taq DNA Taq聚合酶(Shanghai Promega)。PCR反应在96孔PCR仪(EppendorfAG6321,Eppendorf)上进行。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性0.5min，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min后4℃保存。

4、扩增产物经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度5-8%，凝胶大小180×120×2mm，电泳缓冲液为1XTBE，恒压200v，电泳1-2h左右，具体时间以指示剂为准。电泳结束后，凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定（10%乙醇、0.5%冰乙酸）6min，两次；渗透（0.2%硝酸银水溶液）10-12min；蒸馏水漂洗3min，两次；0.002%(w/v)硫代硫酸钠的水溶液漂洗2min；显色（1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛）适度；0.75%碳酸钠水溶液终止显色(Zhang et al.,2002)。

5、数据整理及分析：

在相同迁移率位置上，条带有记为“1”，无则记为“0”构成1、0数据矩阵，建立Excel表格的数据库。

引物多态性信息含量(PIC，polymorphism information content)的计算公式为PIC=l-∑Pi²,其中Pi为任一引物第i对多态性条带在所有供试材料中出现的频率。

应用POPGENE1.31（Francis C.Yeh and Rong-cai Yang，1999说明书；Yeh and Boyle,1997）软件计算期望杂合度(He)（Nei基因多样性）(Nei,1973)）及Shannon信息指数(I)(Shannon and Weaver1949)等参数值。

利用NTSYS-PC(version2.10t)软件，采用非加权平均法（UPGMA）对材料进行进行聚类分析并绘制系统树图(Rohlf，2000)。

对F₂群体的数据记录为：母本带型记为1，父本带型记为2，F₁及杂合带型记为3。

对于所选择到的分子标记，利用MAPMAKER/EXP（VERSION3.0b）(Lander et al.1987)构建连锁群，LOD值最小为3.0，最大遗传距离为50cM。利用MAPMAKER/QTL（VERSION1.1b）(Lande and Botstein，1989)，将茄子果实相关性状标记到上述连锁群上,LOD值为2.0。

下面结合具体的实施例和附图对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明而不能限制本发明要求保护的范围。

具体实施例一：

1、实验材料取材：取如表1所示的编号1-48茄子材料，种植于实验大棚中。

2、从所述的田间材料上取嫩绿叶片，提取其总DNA，具体步骤如下：

（1）将100-200mg嫩绿叶片的冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。将研磨的粉末转入2ml离心管中，加入800ul新鲜配制的提取缓冲液(0.35M Glucose,0.1M Tris.HCl,5mM Na.EDTA,2%PVP，1%(V/V)β-Me,dd Water)，涡旋混匀，冰浴保存10min。10000rpm离心15min（4℃），弃上清；

（2）于沉淀中加入700ul65℃预热的裂解缓冲液(1.4M NaCl,0.1M Tris.HCl,20mM Na.EDTA,2%CTAB,2%PVP，1%(V/V)β-Me,ddWater)，并用牙签搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

（3）加入750ul的氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm离心15min（4℃），将上清转入2ml的离心管中；

（4）加入750ul的氯仿∶异戊醇（24：1）混合液，翻转50次以上，10000rpm离心15min（4℃），将上清转入1.5ml的离心管中；

（5）加0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min；弃上清液，加700ul70%乙醇洗DNA小团，10000rpm，离心10min（4℃），倒掉上清液，通风干燥20min；

（6）加200μl的TE缓冲液（10mM Tris/HCl(PH8.0)，1mM EDTA(PH8.0)，PH8.0）溶解DNA（4℃，30min以上），并保存。

3、利用开发的引物进行分析：具体步骤如下：

3.1将所有的引物对所取材料的编号1-12号材料进行预筛选：

SSR的PCR反应体系为：体系总体积为10μL，模板DNA约为20ng.，前引物与后引物分别为0.1μM，2.5mM Mg Cl₂,0.2mM dNTPs,1×Taq buffer和1U Taq DNA Taq聚合酶(Shanghai Promega)。PCR反应在96孔PCR仪(EppendorfAG6321,Eppendorf)上进行。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性0.5min，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min后4℃保存。

扩增产物经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度5-8%，凝胶大小180×120×2mm，电泳缓冲液为1XTBE，恒压200v，电泳1-2h左右，具体时间以指示剂为准。电泳结束后，凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定（10%乙醇、0.5%冰乙酸）6min，两次；渗透（0.2%硝酸银水溶液）10-12min；蒸馏水漂洗3min，两次；0.002%(w/v)硫代硫酸钠的水溶液漂洗2min；显色（1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛）适度；0.75%碳酸钠水溶液终止显色。

3.2对在栽培种质中表现差异的引物对编号13-48栽培种质中进行标记分析：

根据胶上条带的迁移率位置，相同位置条带有记为“1”，无则记为“0”构成1、0数据矩阵，建立Excel表格的数据库。

3.3数据整理及分析：

3.4引物扩增情况：

共开发EST-SSR引物187对，其中43对能成功在编号13-48的36个栽培种质中扩增出多态性，43对EST-SSR引物共获得113个多态性位点，最多一对引物检测到了6个多态位点。平均每对引物能检测到2.63个多态性位点。平均每对引物能检测到2.63个多态性位点（见图1）。

3.5SSR引物的特征：

43对EST-SSR引物在36份材料中检测到的PIC值范围为0.053-0.673，平均PIC值为0.35。43对EST-SSR引物在编号13-48的36个种质材料中分析发现所有茄子种质的期望杂合度(He)（Nei基因多样性）平均值为0.352，Shannon信息指数(I)平均值为0.598。

3.6聚类及系统进化分析：

36份材料的相似系数范围是0.60-0.93（见图2），从图2中可以看出，材料Ep143明显被分成一组别亲缘关系其它材料较远，该材料来自印度；TG1，YZ3分别为来自泰国、阿拉伯联和酋长国的材料，这三个材料均为小果型，颜色为绿色或白色。其余材料主要为来自中国各地的茄子种质，其中绿茄为来自云南的半野生茄，性状为小果型，颜色为绿色或白色。与材料Ep143，TG1，YZ3的亲缘关系较近，36份材料基本能被这些引物分成不同的组别，且基本与其形态特征和系统进化相吻合。

具体实施例二：

1、将编号44、41的茄子亲本、F₁及其F₂群体种植于温室大棚；

2、从所述的田间材料上取嫩绿叶片，提取其总DNA。

3、利用开发的引物进行分析：具体步骤如下：

3.1利用本标记开发的43对标记进行分析；

3.2数据整理及连锁分析：

F₂群体的数据记录为：母本带型记为1，父本带型记为2，F₁及杂合带型记为3。

3.3引物亲本多态性的筛选：

43对引物共在亲本中筛选出差异引物10对。占引物的23.26%（见图3）。

3.4遗传连锁图谱的构建：

通过连锁分析，将10对差异引物中的7个引物定位在本遗传图谱上，其中茄子染色体E5上一个，E8上一个，E9上两个，E10上两个，LG1上一个（见图4）。

3.5果实相关的QTL定位：

QTL分析发现，共有三个果实相关的QTL与本发明的EST-SSR标记相关联，其中位于茄子染色体E9上的G249引物与茄子果实长度及果型性状连锁，分别解释表型变异的4%和5.1%；位于茄子染色体LG1上的G192引物与茄子花萼果实大小性状连锁，解释表型变异的5.3%。

Claims

1.一组茄子EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述茄子EST-SSR标记引物组由43对引物组成，其中各引物序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.86所示。