CN105087564B - 鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法，属于生物技术领域。构建多重PCR体系：总量为20μL，从植物中提取10 ng的DNA作为扩增模版，加入1×TransStart TopTaq DNA聚合酶，2μL 10×TransStart TopTaq Buffer,dNTP 2.5mM,0.2 μM下游引物trnL‑Ff和上游的3个特定的引物SgF、CspF与CsF各0.1μM，其余为无菌水。本方法基于遗传背景进行分子鉴别，不受药材的产地等外在因素的影响，相对于化学方法，更为准确，也更为简单方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法，属于生物技术领域。
背景技术
草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai，俗称肿节风，通常用于治疗花斑癣、紫癜、风湿性关节痛、外伤。现代研究表明有治疗癌症、抗肿瘤、抗炎、抗病毒和非特异性免疫增强上等药理作用。然而，野生植物种质资源近年来已经减少，由于金粟兰、宽叶金粟兰、及己外形与草珊瑚极其相似，很容易与草珊瑚相混淆。但是他们有不同的属性和药用价值，这些易混植物也都有相应的肝毒性作用，及己在严重肝毒性病例报告和动物的毒性研究中已经证实有显著肝毒性，这限制了它在临床上的应用。
虽然草珊瑚新鲜叶片可以通过静脉、附属物和叶的非腺毛维管束结构之间的显微鉴定差异从其混淆品中鉴别出来，但是粉末或粉碎片形式的草珊瑚和易混植物通过形态学和组织学技术是很难识别的。在过去的几年中，利用化学分析技术如TLC、HPLC 、MS等识别草珊瑚及其相关制剂已经有所记载。虽然这些方法在某种程度上可以补充形态学或组织学鉴定的局限性，但化学指纹图谱只能检测部分化合物，只能提供有限的物种组成信息，不能给我们提供完全鉴别出草珊瑚的方法，特别是在和它极为相似的物种鉴别中。因此，选择恰当的鉴别草珊瑚产品的方法对监测质量至关重要。
随着分子生物学的发展，DNA分子标记如RAPD、ISSR和SSR等分子标记， ITS（Internal transcribed spacer）等DNA条形码技术提供了可靠的识别药材的方法。然而，这些基于基因组DNA的分子标记技术容易受到基因组DNA降解的影响，由于核基因组DNA比叶绿体DNA拷贝数少，在加工过的药材中更容易遭破坏而导致无法通过其分子标记技术进行鉴别。叶绿体DNA trnL-F区域的包含trnL（UAA）内含子和间隔，即trnL（UAA）- trnF（GAA）区作为DNA条形码，它可以很容易利用通用引物进行扩增，这一序列已被证明可用于对多种植物在种水平的识别，被广泛用于植物产品的检测。本课题组在前期研究中也发现，对于干燥或经加工过的药材，基于叶绿体DNA trnL-F区域的鉴别技术比基于核基因组DNA的分子标记技术更为稳定有效。
本研究对草珊瑚、金粟兰、宽叶金粟兰和及己的 trnL-F区序列进行测序，分析其序列结构和特征，寻找单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism SNP)分子标记，设计分别识别草珊瑚，金粟兰，宽叶金粟兰和及己的特异识别引物，建立多重PCR技术，可快速简单鉴别草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己3种混淆品的方法。本发明为草珊瑚与3个与其相似混淆种的分子鉴别提供了有效方法，对有效的鉴别和保护4种中药种质资源具有非常重要的意义，检索未见草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己等3种混淆品的同时进行分子鉴定的发明专利申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法，可快速简单鉴别草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己3种混淆品的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
根据前期测序实验所得的草珊瑚、金粟兰，及己和宽叶金粟兰的trnL-F基因序列，分析其特异SNP位点，分别设计可特异识别草珊瑚的上游特异性引物SgF（5’-TGATTCTGATAGATTTTTGA
AGAATTGA - 3’）、可特异识别金粟兰的上游特异性引物 CspF (5’-AACTATGTTTCTCATTCACTCTACTCGA- 3’)、可同时特异识别宽叶金粟兰和及己的上游特异性引物CsF（5’- TGAAGATCCAAGAAATTCCGACA C - 3’）同时与下游通用引物trnL-Ff（5’- ATTTGA ACT GGT GAC ACG AG - 3’）构建多重PCR体系：总量为20 μL，从植物中提取1 0 ng的DNA作为扩增模版，加入1μL 1×TransStart TopTaq DNA聚合酶 (TransGen 公司)，2μL 10×TransStart TopTaq Buffer,dNTP 2.5mM,0.2μM下游引物trnL-Ff和上游的3个特定的引物SgF、CspF与CsF各0.1 μM，其余为无菌水。构建多重PCR体系，反应程序如下： 95°C 预变性2分钟， 95°C 变性30 s， 50°C引物退火30s和72°C 延伸2分钟，35个循环；最后一个循环在72°C 延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。只有草珊瑚取得了575 bp，金粟兰生成特定的375 bp，及己和宽叶金粟兰生成特定的166bp，草珊瑚及其易混植物的混合样品中，这三个特定的序列都可被PCR扩增出来。
本发明的优点在于：
由于仅根据某些特征活性化学成分的存在进行鉴别，易受植物成长环境等外在条件的影响，很难进行准确鉴别，特别是混合样品的鉴别。本方法基于遗传背景的进行分子定量，不受药材的产地等外在因素的影响，相对于化学方法，更为准确，也更为简单方便。
由于叶绿体DNA比基因组DNA的拷贝数更多，在干燥及加工后的产品中更为稳定，本方法利用叶绿体DNA作为检测对象，比利用基因组DNA作为检测对象，更适合用于对在干燥及加工后的产品的鉴定。
本方法可对草珊瑚与3种常见的混淆品同时进行分子鉴定，准确确定3种混淆品的存在与否，效率更高，更便捷。
附图说明
图1利用引物trnL-Ff，SgF，CspF， CsF 多重PCR的产物凝胶电泳（M :2 log DNAladder；1-5：草珊瑚；6-9：金粟兰；10-11：及己；12-13：宽叶金粟兰；14-15：草珊瑚、金粟兰、及己混合物；16：草珊瑚、金粟兰、宽叶金粟兰混合物。
具体实施方式
仪器
PCR 仪(Eppendorf，型号5332) ，电泳系统( 北京市六一仪器厂，型号DYY-12) ，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R) ，凝胶成像分析仪(BIO-RAD ChemiDoc XRS)，微量移液器(Eppendorf) 。
试剂
2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲液，琼脂糖( Promega 公司) ，溴化乙锭( Fluka公司) ，TransStart®TopTaq DNA Polymerase ( 北京全式金公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。
材料
本研究实验样品是由福建中医药大学魏艺聪讲师鉴定并收集的采自不同产地的样品：十三种草珊瑚、四种金粟兰、四种宽叶金粟兰和三种及己样本是从中国不同产地上收集。五种草珊瑚样品粉末和三种金粟兰样品粉末从当地市场收集得来。
方法
4.1 DNA提取：
⑴ 取5 g新鲜草珊瑚和金粟兰属植物叶片剪碎，置于经过杀菌的研钵中，加入0.5gPVP粉末，再加入液氮迅速研磨，将粉末收集于袋子中，置于-20 ℃保存，长时间保存则置于-80 ℃中；
⑵ 取10 mLCTAB溶液于65 ℃水中预热，再加0.2 mL(200μL)巯基乙醇于预热的CTAB中（巯基乙醇：CTAB溶液=1:50）；
⑶ 取步骤（1）获得的粉末0.2 g于2 mLEP管（离心管），迅速加入1 mL预热的含有巯基乙醇的CTAB溶液（样品低温时加入），振荡2分钟左右将其放入65 ℃水浴锅，水浴约1小时；（每20分钟振荡一次，可适当多振荡几次）
⑷ 往管中加入600μL氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比=24:1，必须在通风橱操作），摇匀5分钟，再将其置于15-20 ℃以12000rpm离心10分钟；
⑸ 取600μL上清液，再加入1.2mL（2倍）预冷的无水乙醇或360μL（0.6倍）异丙醇，置于-20 ℃沉淀约3小时或过夜；
⑹ 取出EP管于4 ℃条件下以12000 rmp离心10分钟，去掉上清液，倒置于吸水纸数分钟；
⑺ 再加入700 μL70％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀，后于4 ℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，再重复一遍，最后置于超净台中吹干；（注意：不可吹干过度）
⑻ 在EP管中加入30-50 μL去离子水（ddH2O）或1×TE溶液，于4 ℃放置3小时或过夜，使其充分溶解，若手摇难以溶解，可用混匀机进行混匀，促其溶解；
⑼可用琼脂糖凝胶检测其是否含基因组DNA，后进行纯化。
特异性引物设计：
根据前期测序实验所得的草珊瑚、金粟兰，及己和宽叶金粟兰的trnL-F基因序列，分析其特异SNP位点，采用primer premier 5.0软件设计，根据引物设计的原则，通过特异性位点设计草珊瑚与其易混植物（金粟兰属）相互鉴别的特异性引物。选定草珊瑚特有的SNPs位点设计草珊瑚特异性引物并命名为SgF。选定金粟兰特有的SNPs位点设计金粟兰特异性引物和并命名为CspF。选定宽叶金粟兰和及己共同特有的SNPs位点设计宽叶金粟兰和及己特异性引物并命名为CsF。草珊瑚、金粟兰、及己、宽叶金粟兰通用的正向和反向引物见表1。
表1 引物
4.3建立多重PCR 鉴定体系
首先利用草珊瑚、金粟兰、及己、宽叶金粟兰的特异性引物SgF、CsF、CspF分别与通用引物构建PCR体系：总量为20 μL，从植物中提取1 0 ng的DNA作为扩增模版，加入1×TransStart TopTaq DNA聚合酶（1μL）(TransGen生物技术)，2μL 10×TransStart TopTaqBuffer,dNTP 2.5mM，0.2 μM反向引物trnL-Ff和0.1 μM正向的三个特定的引物SgF、ChF、CspF，其余为无菌水。反应程序如下： 95°C 预变性2分钟， 95°C 变性30 s， 50°C下引物退火30s和72°C 延伸2分钟，35个循环；最后一个循环在72℃延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。
然后单个产品和混合产品草珊瑚、金粟兰、及己、宽叶金粟兰如上所述相同浓度和温度条件下分别利用SgF、CspF、CsF和反向引物trnL-Ff构建多重PCR体系。
用复等位基因特异性PCR进行草珊瑚及其混淆产品的分子鉴别，四引物（SgF、ChF、CspF和反向引物trnL-Ff），组合产生不同的片段模式来鉴别草珊瑚及其混淆产品。如（图1）所示，只有草珊瑚取得了575 bp，只有金粟兰生成特定的375 bp，及己和宽叶金粟兰生成特定的166bp，草珊瑚及其易混植物的混合样品中，以上三个特定的序列都被PCR扩增出来。因此，这个方法准确且节省时间，可用于许多商业医药产品的测试。这是第一次运用分子技术识别草珊瑚与不同种类的混淆品及其混合产品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建中医药大学
<120> 鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物及方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atttgaactg gtgacacgag 20
Claims (2)
1.鉴别草珊瑚与3种混淆品的分子特异性标记引物，其特征在于：所述引物包括如下：
特异识别草珊瑚的上游特异性引物SgF：5’- TGATTCTGATAGATTTTTGAAGAATTGA - 3’；
特异识别金粟兰的上游特异性引物CspF：5’-AACTATGTTTCTCATTCACTCTACTCGA- 3’；
同时特异识别宽叶金粟兰和及己的上游特异性引物CsF：5’- TGAAGATCCAAGAAATTCCGACA C - 3’。
2.一种使用如权利要求1所述的引物鉴别草珊瑚与3种混淆品的多重PCR方法，其特征在于：分别设计特异识别草珊瑚的上游特异性引物SgF、特异识别金粟兰的上游特异性引物CspF、同时特异识别宽叶金粟兰和及己的上游特异性引物CsF，与下游通用引物trnL-Ff：5’- ATTTGAACTGGTGACACGAG - 3’，构建多重PCR体系：总量为20μL，从植物中提取10 ng的DNA作为扩增模板，加入1μL 1×TransStart TopTaq DNA聚合酶，2μL 10×TransStartTopTaq Buffer,dNTP 2.5mM，0.2μM下游引物trnL-Ff和上游的3个特定的引物SgF、CspF与CsF各0.1μM，其余为无菌水；反应程序如下：在PCR仪中，95℃预变性2分钟，95℃变性30 s，50℃引物退火30s和72℃延伸2分钟，进行35个循环；最后一个循环72℃延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。
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| 草珊瑚与金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究;魏艺聪等;《中国中药杂志》;20140930;第39卷(第17期);第3259-3262页 * |
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