CN109022457A - 一种*dna条形码序列及其应用 - Google Patents

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    • C12N9/0053—Oxidoreductases (1.) acting on a heme group of donors (1.9)
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Abstract

本发明公开了一种DNA条形码序列及其应用，属于物种鉴定技术领域。所述DNA条形码序列为SEQ ID NO：1。所述DNA条形码序列为COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。该DNA条形码序列可以作为DNA的标准检测序列，有效的对

Description

一种*DNA条形码序列及其应用
技术领域
本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种DNA条形码序列及其应用。
背景技术
(Hemiculter Leuciclus)，隶属鲤科(Cyprinidae)鲌亚科 (Culterinae)属(Hemiculter)，分布广泛，在许多河流、湖泊、水库和池塘均有分布。属于杂食性鱼类，繁殖快，生活力强，在许多水体中都能形成较大种群，在渔业上具有一定的价值。鲌亚科鱼类往往由于形态学特征的相似，不同种属的鱼类常常会产生混淆，难以区分，因此，有必要对物种进行有效的鉴定。
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、有足够变异的、标准的、易扩增并且相对较短的DNA片段，可以快速、准确的进行物种鉴定。线粒体DNA的COI基因具有长度适中、进化速率适中和富含系统进行发育信息等特点。在研究中，能够较好地对物种的COI基因片段进行有效扩增。因此，在动物物种分类和鉴定中，COI基因作为条形码应用有很大的潜力。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定和分类就显得尤其重要。目前，各国研究者已经开展了从湖泊到海洋不同地理区域的鱼类DNA条形码研究计划，研究表明DNA条形码在物种鉴定方面具有高效可行性。大量的研究结果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。
在实际操作中，往往会遇到标本量较少以及样本保存不完整等问题，这样给传统的物种分类和鉴定研究带来了很大的困难。在现有的技术中心，均没有DNA条形码序列以及COI基因作为DNA条形码标准检测序列的记载和报道。
采用DNA条形码结合传统的分类学方法，对物种高效准确的鉴定和分类起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以作为DNA的标准检测序列，能够有效的对物种进行鉴定。
本发明所采用的技术方案是：
一种DNA条形码序列，所述序列为SEQ ID NO:1。
优选地，所述DNA条形码序列为COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。
一种DNA条形码标准检测序列的应用，该DNA条形码序列可以作为DNA的标准检测序列，有效的对物种进行鉴定。
本发明具有以下优点：
本发明所得到的DNA条形码序列可以作为DNA的标准检测序列，对物种高效和准确的进行鉴定和分类。在实际工作中，有时要进行鱼卵和鱼苗的物种鉴定，鱼卵很难通过传统的形态学方法进行鉴定，另外处于生长发育期的鱼苗形态特征也还不是很显著，无法通过传统的形态学进行鉴定的时候，这时借助于物种的DNA标准条形码，就很容易对该物种的鱼卵和鱼苗进行鉴定。有时在物种鉴定的时候，会遇到样本不完整或残缺不全，也给传统的物种分类和鉴定带来困难，这时借助于物种的DNA标准条形码，可以很快的进行准确的鉴定。有时同一属內甚至亚科内的不同物种形态相似，有时会出现同一物种，会错误的把它界定为不同的物种，或者不同的物种，错误的把它界定为同一物种，分类关系混乱，利用该物种的标准条形码可以方便快捷的对其物种进行准确的鉴定。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明做进一步说明:
取金沙江水系向家坝库区的5个样本进行验证。
1.DNA的提取
剪取5mg左右的鱼类肌肉组织，尽可能剪碎，置于1.5ml的离心管中，室温下放置，待乙醇完全挥发干净后采用GENEray公司的细胞/组织基因组试剂盒进行基因组DNA的抽提。
2.PCR扩增
PCR引物采用COI基因在鲤科鱼类中的通用引物，上、下游引物序列分别为：FCOI：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC，RCOI： TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR反应体系总体积为50μl，采用PCR 试剂盒进行PCR扩增，具体成分见表1，PCR反应程序见表2。
表1PCR反应体系
反应成分 体积(μl)
灭菌双蒸水 22
P1 1
P2 1
基因组DNA模板 1
2ⅹPCR mix 25
表2PCR反应程序
3.琼脂糖凝胶电泳检测
以恒压5V/cm的标准进行对PCR产物进行电泳，当溴酚蓝移到距琼脂糖凝胶前沿约5cm时，停止电泳。取出凝胶，置于EB染色液中浸泡15min，然后用紫外透射仪进行观察。
4.序列测定
经琼脂糖电泳检测目的条带清晰的PCR产物，用离心柱式PCR产物纯化试剂盒进行目的片段的回收纯化后，送至武汉天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。
5个金沙江水系向家坝库区样本验证的结果：
测得的2个样本的COI基因片段与DNA条形码标准检测序列相似性为99.7％。
CAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGAACCGCTCTAAGCCTTCTCATTCGAGCCGAACTAAGCCAACCTGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACCGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTCTTATTGGAGGGTTTGGAAACTGACTCGTACCACTAATGATTGGGGCACCTGATATAGCATTCCCACGGATAAATAACATGAGTTTCTGACTCCTACCTCCCTCTTTCCTTCTACTACTAGCCTCCTCTGGTGTCGAAGCCGGGGCCGGAACAGGGTGAACGGTCTACCCGCCACTCGCAGGTAACCTTGCCCATGCAGGAGCGTCCGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTATCATCAATTTTAGGAGCAATTAACTTCATCACTACAACTATTAATATGAAACCACCAGCCATCTCTCAATACCAAACGCCCCTGTTCGTTTGAGCCGTACTTGTTACAGCCGTACTCCTTCTCCTATCCCTGCCAGTCCTGGCTGCTGGGATTACAATACTCCTTACAGACCGAAATCTTAATACTACATTCTTTGACCCAGCAGGGGGAGGAGACCCAATCCTGTACCAACACCTATTCTGATTCTT
测得的3个样本的COI基因片段与DNA条形码标准检测序列相似性为99.4％。
CAAAGACATTGGCACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGAACCGCTCTAAGCCTTCTCATTCGAGCCGAACTAAGCCAACCTGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACCGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTCTTATTGGAGGGTTCGGAAACTGACTCGTACCACTAATGATTGGGGCACCTGATATAGCATTCCCGCGGATAAATAACATGAGTTTCTGACTCCTACCGCCCTCTTTCCTTCTACTACTAGCCTCCTCTGGTGTCGAAGCCGGGGCCGGAACAGGGTGAACAGTCTACCCGCCACTCGCAGGTAACCTTGCCCATGCAGGAGCGTCCGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTATCATCAATTTTAGGAGCAATTAACTTCATCACTACAACTATTAATATAAAACCACCAGCCATCTCTCAATACCAAACGCCCCTATTCGTTTGAGCCGTACTTGTTACAGCCGTACTCCTTCTCCTATCCCTGCCAGTCCTGGCTGCTGGGATTACAATACTCCTTACAGACCGAAATCTTAATACTACATTCTTTGACCCAGCAGGGGGAGGAGACCCAATCCTGTACCAACACCTATTCTGATTCTT
根据测序结果，以上5个样本与DNA条形码标准检测序列的核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判断这些物种为。
本发明所得到的DNA条形码序列可以作为DNA的标准检测序列，对物种高效和准确的进行鉴定和分类。在实际工作中，有时要进行鱼卵和鱼苗的物种鉴定，鱼卵很难通过传统的形态学方法进行鉴定，另外处于生长发育期的鱼苗形态特征也还不是很显著，无法通过传统的形态学进行鉴定的时候，这时借助于物种的DNA标准条形码，就很容易对该物种的鱼卵和鱼苗进行鉴定。有时在物种鉴定的时候，会遇到样本不完整或残缺不全，也给传统的物种分类和鉴定带来困难，这时借助于物种的DNA标准条形码，可以很快的进行准确的鉴定。有时同一属內甚至亚科内的不同物种形态相似，有时会出现同一物种，会错误的把它界定为不同的物种，或者不同的物种，错误的把它界定为同一物种，分类关系混乱，利用该物种的标准条形码可以方便快捷的对其物种进行准确的鉴定。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种DNA条形码序列及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> DNA条形码序列(Hemiculter Leuciclus)
<400> 1
caaagacatt ggcacccttt atcttgtatt tggtgcctga gccggaatag tgggaaccgc 60
tctaagcctt ctcattcgag ccgaactaag ccaacctgga tcacttctgg gcgacgatca 120
aatttataat gttattgtta ccgcccatgc cttcgtaata attttcttta tagtaatacc 180
aattcttatt ggagggtttg gaaactgact cgtaccacta atgattgggg cacctgatat 240
agcattccca cggataaata acatgagttt ctgactccta cctccctctt tccttctact 300
actagcctcc tctggtgtcg aagccggggc cggaacaggg tgaacagtct acccgccact 360
cgcaggtaac cttgcccatg caggagcgtc cgtagaccta acaattttct cacttcacct 420
agcaggtgta tcatcaattt taggagcaat taacttcatc actacaacta ttaatatgaa 480
accaccagcc atctctcaat accaaacgcc cctattcgtt tgagccgtac ttgttacagc 540
cgtactcctt ctcctatccc tgccagtcct ggctgctggg attacaatac tccttacaga 600
ccgaaatctt aatactacat tctttgaccc agcaggggga ggagacccaa tcctgtacca 660
acacctattc tgattctt 678
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> DNA序列(Hemiculter Leuciclus)
<400> 2
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tctaagcctt ctcattcgag ccgaactaag ccaacctgga tcacttctgg gcgacgatca 120
aatttataat gttattgtta ccgcccatgc cttcgtaata attttcttta tagtaatacc 180
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agcaggtgta tcatcaattt taggagcaat taacttcatc actacaacta ttaatatgaa 480
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cgtactcctt ctcctatccc tgccagtcct ggctgctggg attacaatac tccttacaga 600
ccgaaatctt aatactacat tctttgaccc agcaggggga ggagacccaa tcctgtacca 660
acacctattc tgattctt 678
<210> 3
<211> 678
<212> DNA
<213> DNA序列(Hemiculter Leuciclus)
<400> 3
caaagacatt ggcacccttt atcttgtatt tggtgcctga gccggaatag tgggaaccgc 60
tctaagcctt ctcattcgag ccgaactaag ccaacctgga tcacttctgg gcgacgatca 120
aatttataat gttattgtta ccgcccatgc cttcgtaata attttcttta tagtaatacc 180
aattcttatt ggagggttcg gaaactgact cgtaccacta atgattgggg cacctgatat 240
agcattcccg cggataaata acatgagttt ctgactccta ccgccctctt tccttctact 300
actagcctcc tctggtgtcg aagccggggc cggaacaggg tgaacagtct acccgccact 360
cgcaggtaac cttgcccatg caggagcgtc cgtagaccta acaattttct cacttcacct 420
agcaggtgta tcatcaattt taggagcaat taacttcatc actacaacta ttaatataaa 480
accaccagcc atctctcaat accaaacgcc cctattcgtt tgagccgtac ttgttacagc 540
cgtactcctt ctcctatccc tgccagtcct ggctgctggg attacaatac tccttacaga 600
ccgaaatctt aatactacat tctttgaccc agcaggggga ggagacccaa tcctgtacca 660
acacctattc tgattctt 678

Claims (3)

1.一种DNA条形码序列，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的DNA条形码序列，其特征在于，所述DNA条形码序列为COI(cytochrome c oxidase subunit I，细胞色素c氧化酶亚基I)基因。
3.一种DNA条形码标准检测序列的应用，其特征在于，该DNA条形码序列可以作为DNA的标准检测序列，有效的对物种进行鉴定。
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