CN104293907A - 用于团头鲂家系鉴定的srap分子标记引物及其方法和应用 - Google Patents

用于团头鲂家系鉴定的srap分子标记引物及其方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于团头鲂家系鉴定的SRAP分子标记引物及其方法和应用，所用的SRAP分子标记引物选自下述引物组合之一：Me2/Em18、Me3/Em19、Me9/Em13、Me9/Em15、Me9/Em16、Me11/Em4、Me11/Em15、Me11/Em18、Me12/Em13、Me12/Em16，各引物的序列如序列表所示。本发明所公开的SRAP分子标记引物用于团头鲂家系鉴定，通过对团头鲂家系进行SRAP分子标记，所得到的条带清晰、多态性好、重复性高，而且操作简单，应用前景广阔。

Description

用于团头鲂家系鉴定的SRAP分子标记引物及其方法和应用
技术领域
本发明涉及一种用于团头鲂家系鉴定的SRAP分子标记引物，属于水产动物分子生物学技术领域。 
背景技术
相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism,SRAP)是一种基于传统PCR发展出来的的标记系统,通过独特的引物设计对基因的阅读框区域(Open Reading Frames,ORFs)进行扩增。该方法通过长17bp的正向引物对外显子进行特异扩增,长18bp的反向引物对内含子及启动子区域进行特异扩增。由于种内或种间的内含子、启动子之间间隔长度不同而产生多态性。与其他方法相比，SRAP分子标记具有简便、快速、稳定、重复性好、中等产率、可产生共显性标记、便于克隆测序目标片段的特点,广泛应用于指纹图谱的绘制、遗传连锁图的构建、比较基因组学、遗传多样性分析和基因定位研究。 
团头鲂，又称武昌鱼，因其肉质嫩滑，味道鲜美，是中国主要淡水养殖鱼类之一，但是对于该品种的家系分类鉴定一直是动物学领域的疑难问题，传统的分类鉴定方法操作复杂，耗时长久，难以在实验室环境下应用。 
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种基于分子生物学技术对团头鲂家系进行鉴定的方法，具体的说是利用SRAP分子标记引物对团头鲂的基因组DNA进行扩增以产生多态性从而进行家系的分类鉴定。 
为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 
用于团头鲂家系鉴定的SRAP分子标记引物，选自下述引物组合之一：Me2/Em18、Me3/Em19、Me9/Em13、Me9/Em15、Me9/Em16、Me11/Em4、Me11/Em15、Me11/Em18、Me12/Em13、Me12/Em16，具体的，各引物名称对应的序列如下表1所示： 
表1用于SRAP分析的引物序列 
利用上述所提供的任一引物组合可用于目标DNA进行特异扩增。由于不同家系团头鲂的内含子、启动子之间间隔长度不同而产生多态性。 
在本发明中，家系的概念如本领域技术人员所知，指的是起源于共同祖先的一群有性后代品种。 
申请人对上述引物组合用于团头鲂家系鉴定的多态性进行了详细研究，优选的引物组合选自Me3/Em19，Me11/Em4，Me11/Em15，表现出较高的多态性，最优选Me11/Em4，具有理想的多态性。 
在上述引物组合的基础上，本发明还公开了采用SRAP分子标记引物组合对团头鲂家系进行鉴定的方法，具体操作是通过上述所公开的任一引物组合，扩增团头鲂的基因组DNA并进行检测以确定家系划分。 
在上述方法中，SRAP-PCR反应体系中，引物浓度为0.3-0.8μM，Taq DNA聚合酶浓度为0.2-0.9U/15μL，Mg2+浓度为1.5-2.5mM，dNTPs浓度为0.2－0.4mM， 模板DNA浓度为10-30ng/15μL。 
优选的，引物浓度为0.5μM，Taq DNA聚合酶浓度为0.6U/15μL，Mg2+浓度为2.0mM，dNTPs浓度为0.25mM，模板DNA浓度为20ng/15μL。 
具体的反应条件可通过实验确定，通常PCR热循环参数为：94℃预变性5min；前5个循环参数为94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min；后35个循环参数为94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸10min。 
上述反应完成后，最终降温至4℃保存以供后续使用。 
在此基础上，由于具有如上诸多技术优势，本发明还提供了上述所公开的任一引物组合在团头鲂家系鉴定中的应用。 
应用本发明所公开的引物组合和方法进行SRAP分子标记实验,所得到的条带清晰、多态性好、重复性高,可以显著、清晰的显示不同家系的团头鲂在基因水平的差异,为基因水平的家系研究奠定良好的基础。本发明采用的SRAP分子标记,操作简单,SRAP的引物序列比较长,易于测序。此外,由于SRAP正、反向引物可以自由组合,不仅可以节约成本,同时也大大提高了引物的使用率。本发明的方法对仪器设备要求不高,应用前景十分广阔，在团头鲂家系鉴定方面具有非常高的适用性。 
附图说明
图1为引物组合Me11/Em4对团头鲂L9家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱； 
图2为引物组合Me11/Em4对团头鲂L29家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱； 
图3为引物组合Me11/Em4对团头鲂L30家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱； 
图4为引物组合Me11/Em4对团头鲂L32家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱； 
图5为引物组合Me11/Em4对团头鲂L34家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱； 
图6为引物组合Me11/Em4对团头鲂L36家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱； 
图7为引物组合Me11/Em4对团头鲂L37家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳图谱； 
图8为引物组合Me11/Em4对团头鲂L38家系父母本及F1个体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。 
具体实施方式
实施例1：团头鲂家系样本的构建 
8个团头鲂家系的样本均购买自湖北省鄂州市华中农业大学团头鲂育种基地，共有5个父本、8个母本，团头鲂家系的亲本均来自梁子湖自然群体，选择成熟的亲鱼进行雌雄配对并进行人工繁殖，通过杂交建立杂交家系子一代分别编号为L9、L29、L30、L32、L34、L36、L37、L38，家系信息如表2所示。实验用鱼鳍取自团头鲂小部分尾鳍，用95％的乙醇固定。 
表2实验所用团头鲂8个家系的信息 
实施例2:引物组合的筛选 
常规方法提取其DNA，并稀释到20ng/μL，从说明书表1中的88对SRAP引物中筛选出最适合团头鲂的引物对。SRAP-PCR反应体系总体积为15μL，包括TaqDNA聚合酶0.6U(MBI)，10×Buffer1.5μL，2.0mmol/L Mg2+，0.25mmol/LdNTPs(Roche)，每个引物0.5μmol/L，模板DNA约20ng。 
PCR热循环参数为：94℃预变性5min；前5个循环参数为94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min；后35个循环参数为94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸10min；降温至4℃保存。 
PCR扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，所用实验材料如下配制： 
(1)6％变性PAGE凝胶的配制：15mL的40％丙烯酰胺贮存液、10mL的10×TBE、42g尿素，用双蒸水定容至100mL。量取75mL6％变性PAGE，向其加入525μL10％过硫酸铵和60μL TEMED，混匀后迅速灌胶。 
(2)玻璃板的准备、组装、灌胶同第2章1.5.1。 
(3)电泳：向15μL扩增产物中加入6μL变性缓冲液，混匀，瞬间离心，在95℃水浴中变性5min后，立即置于冰水混合物中冷却。取下玻璃板，用1×TBE缓冲液将孔内多余的尿素吹出，将其固定在电泳槽上，倒入1×TBE电泳缓冲液，在500V电压下预电泳30min。取10μL变性的扩增产物上样，400V电压下电泳90min。 
从表1的由12个正向与20个反向引物两两配对成240对引物组合中进行SRAP扩增引物筛选，筛选出带型清晰、多态性较好的引物组合用于团头鲂的SRAP扩增和家系鉴定。引物由上海生工生物技术有限公司合。 
根据实验结果，从240个引物组合中筛选出10对引物，在团头鲂8个家系中能扩增出清晰稳定的带型并具有较好的多态性(表3)。采用这10对引物组合对8个家系进行SRAP扩增，共检测到105个位点，其中72个表现为多态性，比率为68.57％，平均每个引物组合扩增出7.2个多态性位点。引物组合Me3/Em19，Me11/Em4，Me11/Em15表现出较高的多态性，Me11/Em4表现出最为理想的多态性。 
表3SRAP引物组合的多态性信息 
实施例3:基于最佳引物组合进行的团头鲂群体遗传多样性及遗传变异分析 
数据处理方法为参照100bp DNA Marker，对获得的SRAP电泳图谱条带进行统计，每1条带即代表1个位点，条带清晰计为1，无带计为0，构建一个由0、1组成的数字矩阵。采用POPGENE1.32程序(Yeh et al.,1999)分析团头鲂8个家系群体的Nei′s基因多样性(h)和Shannon′s信息指数(I)，并计算出家系间的遗传分化系数(GST)，基于遗传分化系数估测家系间的基因流(Nm)。用ARLEQUIN3.11(Excoffier et al.,2006)对不同家系进行分子方差分析(AMOVA)。 
利用NTSYS-pc2.1(Rohlf,2000)计算8个家系393个团头鲂个体的遗传相似度Dice系数(Dice,1945)，计算公式为Sd＝2nxy/(2nxy+nx+ny)(x、y分别代表两个被研究的个体，nxy代表在两个体发现的共同标记的数目，nx、ny分别代表只在x个体和只在y个体中发现的标记数目)。NTSYS-pc在遗传相似矩阵的基础上进一步利用UPGMA法构建团头鲂家系的聚类图，并根据Dice系数用EIGEN程序进行主坐标分析(PCA)。 
参考附图1-8，基于105个SRAP条带计算团头鲂8个家系的遗传多样性参数，结果如表4所示。8个家系SRAP扩增的多态位点百分率(P)介于12.38％到27.62％之间。团头鲂8个家系的Nei′s基因多样性(h)在0.0514到0.1185之间变动，Shannon′s信息指数(I)大小从0.0747到0.1705。L36群体的3个遗传多样性参数最大，L9群体最小。 
表4团头鲂8个家系F1代的SRAP扩增位点多态性比例、Nei′s基因多样性及Shannon′s信息指数 
由POPGENE计算的群体间的遗传分化系数(GST)大小为0.6547，基于遗传分化系数估测家系间的基因流(Nm)为0.2637。群体变异的AMOVA分析(表5)显示67.25％的遗传变异是在群体间(FST＝0.67248，P<0.001)。 
表5团头鲂8个家系F1代的分子方差分析 
在上述基础上，应用NTSYS-pc 2.1，基于Dice遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，可进一步直观分析子代群体与亲本间的遗传关系。我们选择0.886作为分类的标准衡量值，所有的团头鲂个体分为6个组(I、II、III、IV、V、VI)。组I包括L9家系48个F1代及父母本(母本30及父本9)，组II由L38家系48个F1代及其父母本(母本7及父本4)构成的。组III分为3个亚群，包括拥有同一父本2的L30、L32、L37家系。其中，来自L30家系的48个F1代与它们的母本3、父本2聚为一支，家系L32、L37的F1代分别与其母本(母本4、母本5)各聚为一支。从聚类图中可以看出，L34与L36家系虽共有同一父本5，但并没有聚在一起。家系L34的F1代表现出与父本更近的亲缘关系，L34家系子代及其父母本(母本13、父本5)聚为组IV，而L36家系的全部F1个体与其母本10聚为组VI。组V包括家系L29的全部F1个体及其母本18、父本7。除不能准确鉴定L36家系的父本外，其他家系的F1代个体均能够鉴定出各自对应的亲本。 

Claims (7)

1.用于团头鲂家系鉴定的SRAP分子标记引物，选自下述引物组合之一：Me2/Em18、Me3/Em19、Me9/Em13、Me9/Em15、Me9/Em16、Me11/Em4、Me11/Em15、Me11/Em18、Me12/Em13、Me12/Em16，各引物的序列如序列表所示。
2.根据权利要求1的SRAP分子标记引物，其特征在于引物组合选自Me3/Em19，Me11/Em4，Me11/Em15。
3.根据权利要求1的SRAP分子标记引物，其特征在于引物组合为Me11/Em4。
4.采用SRAP分子标记引物组合对团头鲂家系进行鉴定的方法，其特征在于：采用权利要求1中的任一引物组合，扩增团头鲂的基因组DNA并进行检测。
5.根据权利要求2的方法，其特征在于SRAP-PCR反应体系中，引物浓度为0.3-0.8μM，Taq DNA聚合酶浓度为0.2-0.9U/15μL，Mg2+浓度为1.5-2.5mM，dNTPs浓度为0.2－0.4mM，模板DNA浓度为10-30ng/15μL。
6.根据权利要求2的方法，其特征在于SRAP-PCR反应体系中，引物浓度为0.5μM，Taq DNA聚合酶浓度为0.6U/15μL，Mg2+浓度为2.0mM，dNTPs浓度为0.25mM，模板DNA浓度为20ng/15μL。
7.权利要求1的任一引物组合在团头鲂家系鉴定中的应用。
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