CN105861730B - 一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用 - Google Patents

一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用，属于水产动物分子营养代谢技术领域。其通过高通量测序和物信息学分析，筛选到调控团头鲂肝脏SIRT1基因的一个microRNA，所述的microRNA为miR‑34a。还进行了分子生物学验证，结果显示miR‑34a能有效促进团头鲂肝脏SIRT1基因的表达。本发明公开的miR‑34a可以作为团头鲂糖代谢相关的分子标记，在团头鲂饲料糖利用和代谢调控中具有重要的实际应用价值。

Description

一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用，属于水产动物分子营养代谢技术领域。
背景技术
团头鲂(Megalobrama amblycephala)是一种重要的经济鱼类，在中国淡水养殖系统中，它具有重要的营养价值和经济价值。根据最新粮农组织渔业和水产养殖统计，我国团头鲂总产量于2014年已经达到78.3万吨。
糖是有机体重要的能源和碳源，它能分解产生能量，供有机体生命活动需要，其代谢的中间产物又可以转变为其他含碳化合物如氨基酸、脂肪、核苷酸等，为动物提供营养物质。但相较哺乳动物，鱼类对糖的耐受能力相对较弱，摄食高糖饲料不利于鱼类的生长和对饲料的利用。发明人在前期的研究中发现，翘嘴红鲌、异育银鲫、团头鲂、青鱼长期摄食高水平碳水化合物日粮会出现糖代谢酶活性下降、血糖持续偏高、应激蛋白表达上升等高糖不耐受现象，甚至出现肝细胞肿大甚至病变等症状，引发营养代谢综合症。
MicroRNA(miRNA)是近年来在真核生物体内发现的长度约为22个核苷酸的内源性小型非编码RNA，能够识别特定的目标mRNA，并在转录组后水平通过促进靶mRNA的降解或抑制翻译过程而发挥调控基因表达的作用。近年，随着高通量测序技术和分子生物学技术的发展，microRNAs(miRNAs)在哺乳动物胰岛素分泌、血糖水平和糖代谢中的调控作用逐渐被确定。如，miR-144可以通过抑制IRS1(胰岛素受体基质1)的表达破坏胰岛素信号造成胰岛素抵抗。miR-15b表达量的上升与血糖含量和胰岛素抵抗程度呈正相关。miR-30d也能够通过靶向MAP4K4以及MAFA两个胰岛素转录抑制调控子，进而提高胰岛素的合成。miR-29a和miR-29b通过减少MCT1的表达量，从而降低线粒体内的ATP与ADP比例而导致胰岛素释放降低。miR-96则能够直接抑制分泌颗粒的表达，从而减少胰岛素的释放。在哺乳动物II型糖尿病模型研究中，基于组织和基于物种的两种不同方法筛选，通过功能聚类分析发现miR-34a与胰岛素的释放不足、胰岛素抵抗以及细胞损伤有关，推测miR-34a可能对推进动物高糖代谢具有重要作用。
由于团头鲂的基因组和转录组信息尚不完全清楚，因而其miRNA研究也很少。近五年，不断有研究发现与团头鲂生长发育、肌间骨生长、脂肪代谢等相关miRNAs，可见，miRNA可能在团头鲂的生长发育和营养调控过程中发挥了重要作用。在哺乳动物中，发现miR-34a能够靶向SIRT1(Silent Information Regulation 1)，通过对关键因子的磷酸化/去磷酸化、乙酰化/去乙酰化的表观修饰，诱导或抑制胰岛素敏感组织中与代谢相关基因的表达，是糖代谢的中心调节因子。
本发明通过对团头鲂肝脏组织进行高通量miRNA测序，筛选与团头鲂肝脏糖代谢相关的分子标记，经过生物信息学差异基因表达分析初步选定了调控SIRT1基因的microRNA，命名为miR-34a。进一步进行了分子生物学实验，验证结果显示本发明所述的microRNA可以作为团头鲂肝脏糖代谢调控的microRNA分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用。
按照本发明提供的技术方案，一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA，所述miRNA为miR-34a，具体序列如SEQ ID NO:1所示。
所述miRNA的靶标基因是SIRT1，其为团头鲂肝脏糖代谢关键基因，具体序列如SEQID NO:2所示。通过荧光定量PCR法检测靶标基因SIRT1，从而判断糖代谢程度。
PCR检测时，采用的特异性上游引物Forward primer如SEQ ID NO:6所示；下游引物Reverse primer如SEQ ID NO:7所示；所用的内参为团头鲂β-actin，上游引物Forwardprimer如SEQ ID NO:8所示；下游引物Reverse primer如SEQ ID NO:9所示。
所述miR-34a在团头鲂摄食高糖饲料后肝脏组织中高表达。采用实时荧光定量PCR法检测团头鲂肝脏组织中miRNA的表达。具体步骤为：(1)提取团头鲂肝脏组织总RNA；(2)依次连接上3’接头和5’RNA接头，RT-PCR反转录成单链cDNA；(3)采用荧光定量PCR试剂盒进行miR-34a的扩增。
所述荧光定量PCR试剂盒，具体包括：反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参(团头鲂5s rRNA)、荧光定量PCR反应液。
PCR检测时，所采用的引物对如下：反转录引物RT primer的序列如SEQ ID NO:3所示；上游引物Forward primer序列如SEQ ID NO:4所示；下游引物Reverse primer序列如SEQ ID NO:5所示。
上述的试剂盒应用于团头鲂肝脏组织中miR-34a的定量检测。
本发明首先选取摄食高糖日粮和适宜糖日粮的团头鲂各3尾，送往测序公司进行高通量small RNA测序，对测序结果进行数据分析，得到新的miRNA以及已知的miRNA，并对所有的miRNA进行差异分析，对差异的miRNA进行靶基因预测，并对这些靶基因进行GO，KEGG分析。结合研究目的，选择与糖代谢相关的miRNA进行qPCR验证，采用edgeR进行差异表达miRNA表达分析，经过筛选，miR-34a作为其中的一个已知miRNA进行验证，序列为SEQ IDNO1，进一步以miR-34a为研究对象，通过搜索miRanda，TargetScan，RNAhybrid数据库，预测出miR-34a调控的靶基因——SIRT1。
根据上述的miRNA的序列和SIRT1的序列设计引物序列。
采用RT-PCR方法检测5尾摄食高糖日粮团头鲂、5尾摄食适宜糖日粮的团头鲂肝脏组织中miR-34a及SIRT1的表达情况，结果显示摄食高糖日粮团头鲂肝脏组织中miR-34a的表达明显高于摄食适宜糖日粮的团头鲂肝脏组织，前者是后者的近4.29倍；同样，摄食高糖日粮团头鲂肝脏组织中SIRT1的表达明显高于摄食适宜糖日粮的团头鲂肝脏组织，前者是后者的近3.11倍。
miRNA对SIRT1基因表达的调控实验结果显示，miR-34a能很好的正调控基因SIRT1。表明miR-34a可单独作为标志物应用于团头鲂日粮高糖代谢的调控。
本发明的有益效果：本发明提供的团头鲂肝脏组织miR-34a的茎环结构，可用于鱼类miR-34a靶标基因的生物信息学分析。团头鲂肝脏组织SIRT1基因序列，可用于鱼类SIRT1基因的生物信息学分析及定量分析。miR-34a与团头鲂日粮高糖代谢的分子调控有很好的相关性，可用于团头鲂日粮高糖利用相关的分子营养学中。本发明检测miR-34a表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便使用，又保证了结果的一致性。
附图说明
图1是团头鲂肝脏组织中miR-34a的茎环结构图。
图2是Real-time PCR检测团头鲂肝脏组织中miR-34a的相对表达量。
图3是Real-time PCR检测团头鲂肝脏组织中SIRT1的相对表达量。
具体实施方式
实施例1高通量转录组测序寻找团头鲂肝脏组织中差异表达的microRNA
选摄食高糖日粮(可消化糖为51％)和适宜糖日粮(可消化糖为34％)团头鲂各3尾，无菌条件下分别取他们的肝脏组织，取出后速冻于液氮30min，然后储存于-80℃冰箱，样本提取总RNA后依次连接上3’接头和5’RNA接头，RT-PCR反转录成单链cDNA，进行PCR扩增，筛选长度在140-150bp的片段构建Illumina测序文库，文库检测合格后，采用高通量测序法进行团头鲂肝脏组织小RNA测序。对获得的小RNA的Rawdata文库数据运用Fast-QC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，并过滤低质量序列。miRNA前体的标志性发夹结构，能够用来预测新的miRNA。
通过对截取一定长度sRNA比对上的基因组序列，探寻其二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征，使用miRNA预测软件Mireap(http://sourceforge.net/projects/mireap/)，获得miR-34a的茎环结构(具体如图1所示)。
由于每个样本存在测序量的差异，首先需要归一化每个样本中表达的miRNA tag数(公式：归一化的表达量(TPM)＝miRNA比对tag数/样品总测序量(M))，采用edgeR对两样本进行差异分析，判断miRNA表达在两组样本中是否存在显著差异，基于检验结果选取FDR≤0.05的miRNA为显著差异表达miRNA。通过分析最终挑选出表达差异明显的miR-34a，序列为SEQ ID NO:1，通过搜miRanda，TargetScan，RNAhybrid数据库，预测出他调控的靶基因为SIRT1，具体序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2Real-time PCR检测团头鲂肝脏组织中miR-34a的表达
随机选取摄食高糖日粮(可消化糖水平为51％)、摄食适宜糖日粮(可消化糖水平为34％)的团头鲂各5尾，无菌条件下分别取他们的肝脏组织，取出后速冻于液氮30min。取肝脏样品50-100mg，按照RNAiso Plus法(TaKaRa公司)抽提总RNA，以DNAase I酶处理过的RNA以及RT液为模板，按照以下步骤完成miRNA定量PCR。
(1)miRNA反转录
反应体系：在0.2mlPCR反应管中加入：
RT Primer 1μL；
Total RNA(终浓度500ng)XμL(根据浓度计算出X的具体数值)
反应条件：
Stage 1：将混匀的反应溶液置于65℃加热5min，之后放入冰中2min。
在上述溶液中加入：
反应条件：Stage 2：16℃30min，42℃60min，85℃，5min。
(2)miRNA实时荧光定量qRT-PCR
应用SYBR染料法，对miRNA采用实时定量检测。用团头鲂5s rRNA作为定量内参。
反应体系参照Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)说明书，总反应体系为25μL：
Real Time PCR反应程序：95℃5min；40循环：95℃5s，60℃30s
最后，利用相对定量算法，按照目的基因的相对表达量计算公式为：Rel.Exp＝2-ΔΔCt，获得miRNA相对表达量。
具体对比数据如图2所示。
表1团头鲂肝脏miRNA-34a基因荧光定量PCR引物
实施例3Real-time PCR检测团头鲂肝脏组织中SIRT1的表达
随机选取摄食高糖日粮(可消化糖水平为51％)、摄食适宜糖日粮(可消化糖水平为34％)的团头鲂各5尾，无菌条件下分别取他们的肝脏组织，取出后速冻于液氮30min，取肝脏样品50-100mg，按照RNAiso Plus法(TaKaRa公司)抽提总RNA，以DNAase I酶处理过的RNA以及RT液为模板，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser PrimeRT reagent Kit(大连TaKaRa公司)使用说明中SYBR Green Assay用的操作方法，进行RT反应，得到下一步反应所需cDNA。
团头鲂肝脏SIRT1mRNA相对量采用Primix Ex TaqTM II(Tli RNaseHPlus)Kit(大连Takara公司)，按照SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR扩增反应(ABI 7500荧光定量PCR，USA)，Real Time PCR反应体系为20μL，反应条件为：Holdingstage(50℃2min；95℃3min)；Cyclingstage(95℃15s；60℃60s，循环40次)；Melt curvestage(95℃15s，60℃60s)；Date collection(95℃30s，60℃15s)。团头鲂肝脏SIRT1mRNA表达水平计算以团头鲂β-actin为内参，对得到的各样品Ct值进行均一化处理，应用各自的标准曲线方法确定其相对水平。
具体对比数据如图3所示。
表2团头鲂肝脏SIRT1基因荧光定量PCR引物
引物名称 引物序列(5'-3')
SIRT1-F GGGCGGTTCT GAGATGTTGA
SIRT1-R GGACGGCGAA AATAAACGGG
β-actin-F TCTGCTATGT GGCTCTTGAC TTCG
β-actin-R CCTCTGGGCA CCTGAACCTC T
序列表
<160> 9
<210> SEQ ID NO:1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> miRNA-34a
TGGCAGTGTC TTAGCTGGTT GT 22
<210> SEQ ID NO:2
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> SIRT1
GTTGCATGCA TTAGAAGACA TAACAGGGGC TTTAGGAGGG AGGGAAATAC AAAAATATAT 60
CAAAGAGACT TGAGCACATT AAATAGAGCT GGTGCTAGTG AGTTCTGGTG TTTTAATGGT 120
GGTTTGTGTC TGCTGTGCAG TCTGTTTGAA GGCGTTTGTG TTCACTGTCT TGTACTGTCT 180
CTGCGAGGTG GCCGTCTGCG TCTTTCTCCG TCACTGGTGC ACCATCTTCC TCCACGTCAC 240
TGTCCTCGTT TTCGAAAGCG TCCGCGCTGC AGCGAGAGCC GTCACTGTCG CTGCCGCAGG 300
AACTGGAGGT CTCGTCTTCC GAACTGGAGT AAACCTCAGC CCCGTGGAAA ATGTAGCGGT 360
TCGGTGCTTG AAATAAATAC TGTGAGGCTC CGAGTCGTTT GCTGATTGGA CTCTGACAGA 420
TCCGGCTCCT CCAGCACCGT CTCCGCATTT CAACAACACG TTGGCGATCG GTTGCTTCTT 480
CATCCTTAGC GCACTGCGTG TCCTCAGTAG CATCCAGTGC TTCTGCAGCA TCACACGCTG 540
CCTTCCTACA GGGACTCACC GGCTTTGGAG AATGGACTTT TGGGTTCAAC TCTTCCGTCT 600
TTGAGACCAA CTCTTCAGTG TTAGTTTCCG GTAACGGCTC TGGATGAGGA CTTGTTTGCC 660
TGGCTGCTGG AGAAGATGCC ATTTCCTCCT CCTTTTTGGG AGACAGTGAA TTTTGACAAC 720
CAGTGATTCT GACTTCCTCT GATGTGTCTG TGACGGCCTG AGCGTGATCG GGGTCTGTGG 780
ACGTGCTCTC AGCGGACGTC TGTTCAGGCG GAGCAGGTAA CGGGGCAGGC GGTTTCTCGG 840
TGATCTCGCT GAGACGTGAC GAGTTGTAGC ACAGCTGCTC AAAGTCGCCA CCCAGACGAT 900
GGCAGAGTTC GTTCACGATG ACGTCACAGT CTCCGAGCAG CTCCACGTCG AAGTTCAGGT 960
GCGGCAACGG CTCGCGGTTT ATCAAGACTT GAGGCACGTC ATGAGGTATA GAGCTGGGTA 1020
TAAGAGCCAC TGGCCGCACT TTCAGCGAGG AGCCAATCAC AATGAGAAGG TCCACTTCAT 1080
CTTTATCCTG CTTCATGGCT CTGTGAAAAA ATTCTGGAAG GTTCTCGCCA AAGAAGACGA 1140
TGTCTGGTTT CATAATGGCA TATGGGATAT CTGACGGACA CCTCGGACAG TGAGGAACAA 1200
CCTGGTTGAA TATATCCTCT CTTATGGCCT CACAGTCAAC CTTATGTTTA CAGACAAGAC 1260
AGGATGCAGT CGCAAAAGAA CCATGACACT GAATGATCTT CTGGATTCCA GCGGCCTGCT 1320
CCAGTGTGTC GATGTTCTGA GTGTAGTTCC TCAGTAACCT TCCCTTCTTA TCCAGCATTG 1380
ATATGAACCT GTGACATGGA GACGGCTGGA ACTGTCCTGG ATAGATTTCC TTGGCAAATT 1440
TGAAAAAAGG CCTGGGATCT CTTCTAAAGT AGTCTATGTC AAACATGGCT TGAGGATCAG 1500
GAAGGTCAGG AAAATCCACA GCGAGTCTAG CGTATATGCC ATCTCTAGAA CGAAAGTCAG 1560
GAATCCCGCA AGAAACAGAC ACCCCAGCGC CGGTGAGCAC GAGAACCTTC TTTCTCTCAT 1620
TCAGGAGTCG GACAACGTCC TCTAATGTGT TGATGTCTTT GCGCTTTTTC CTTTTGGGCG 1680
GTTCTGAGAT GTTGATGATG ATCTGCCACA GCGTCATGTC GTCCAGATCT GGTGGAAGGA 1740
CCGTTTCGGG AAGCAAGTCT TTTAAAATGG CCCTCGGGTC GGTTCCTCTC ATGATGTGCT 1800
GCTGAATGAA CCGATAGGAA CCAATGTGTG GTTGAGGCGT CCAGTCACTG GAGCTGGCGC 1860
GAGAAGAGCA GTCATCATCA TCGTGAAGAA GATCAGGTGA CGTAAAACCA TTGGGATGGA 1920
CACCTTCGTC AATGAACTCA GAGAGCTCCG GTTCTGGTTC GGCGGTCAGT CCAGGTTCAG 1980
TGTGCTTGTT GTTGTTGTTG TTGAGTGAGG CCTGCTGGGT CTCGTCCATC AGCGCCGGTT 2040
CCGCCTCCAC CGGCTCGGTT CCGCCAGCAG CGCTCAGCTC CGAATCACCG GGCGGATCCA 2100
GAAGTCTCGG TCTCTTTAGA AGCGGCTCGT CCAGCTCAGC GGCGTCGGCA GGTTCGGCCC 2160
GTTTATTTTC GCCGTCCGCC ATCTTCGCCT GGGAGTGAGT GGAGG 2205
<210> SEQ ID NO:3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> miRNA-34a RT Primer
GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACACAACC 50
<210> SEQ ID NO:4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> miRNA-34a Forward primer
GCCGTTGGCA GTGTCTTAGC 20
<210> SEQ ID NO:5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> miRNA-34a Reverse primer
GTGCAGGGTC CGAGGTATTC 20
<210> SEQ ID NO:6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> SIRT1 Forward primer
GGGCGGTTCT GAGATGTTGA 20
<210> SEQ ID NO:7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> SIRT1 Reverse primer
GGACGGCGAA AATAAACGGG 20
<210> SEQ ID NO:8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> β-actin Forward primer
TCTGCTATGT GGCTCTTGAC TTCG 24
<210> SEQ ID NO:9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> β-actin Reverse primer
CCTCTGGGCA CCTGAACCTC T 21

Claims (7)

1. 检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是：采用实时荧光定量PCR法检测团头鲂肝脏组织中miRNA 的表达；
所述miRNA 为miR-34a，具体序列为UGGCAGUGUC UUAGCUGGUU GU，其具有特定茎环结构。
2.如权利要求1所述检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是：所述miRNA 的靶标基因是SIRT1，其为团头鲂肝脏糖代谢关键基因，具体序列如SEQID NO:2所示。
3.如权利要求1所述检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是：通过荧光定量PCR法检测靶标基因SIRT1，从而判断糖代谢程度。
4.如权利要求1所述检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是：PCR检测时，采用的特异性上游引物Forward primer如SEQ ID NO:6所示；下游引物Reverse primer如SEQ ID NO:7所示；所用的内参为团头鲂β-actin，上游引物Forwardprimer如SEQ ID NO:8所示；下游引物Reverse primer如SEQ ID NO:9所示。
5.如权利要求1所述检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是：所述miR-34a在团头鲂摄食高糖饲料后肝脏组织中高表达。
6.如权利要求1所述检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是具体步骤为：（1）提取团头鲂肝脏组织总RNA；（2）依次连接上3’接头和5’RNA接头，RT-PCR反转录成单链cDNA；（3）采用荧光定量PCR 试剂盒进行miR-34a 的扩增。
7.如权利要求6所述检测miRNA的检测试剂在检测团头鲂饲料糖利用和代谢的应用，其特征是所述荧光定量PCR 试剂盒具体包括：反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参，即团头鲂5s rRNA、荧光定量PCR 反应液；
具体引物对如下：反转录引物RT primer的序列如SEQ ID NO:3所示；上游引物Forwardprimer序列如SEQ ID NO:4所示；下游引物Reverse primer序列如SEQ ID NO:5所示。
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WO2006081284A2 (en) * 2005-01-25 2006-08-03 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for quantitating small rna molecules
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