CN104263720B - 植物叶片总rna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种富含多糖多酚的植物叶片总RNA提取方法。植物材料经液氮研磨后，经连续两次裂解，水饱和酚与氯仿混合溶液抽提，异丙醇沉淀得到总RNA。本发明的有益效果在于：1、连续两次裂解，有效克服多糖、多酚、次生代谢物对RNA提取过程的影响，2、无需水浴，减少RNase污染，3、无需使用低温离心机，操作方便，4、本方法有效避免传统沉淀方法中LiCl残留对下游实验的影响，所提取的RNA可以满足反转录PCR和实时荧光定量PCR等后续分子生物学实验。

Description

植物叶片总RNA提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种富含多糖多酚的植物叶片总RNA提取的方法。

背景技术

从植物组织中提取高质量的总RNA对于基因克隆及其功能鉴定、基因的表达和调控分析、分子标记辅助育种等具有重要意义[1]。

从植物组织中提取高质量的总RNA存在困难。植物体内富含多糖多酚，在RNA提取过程中，细胞破碎后多糖多酚物质与RNA发生作用。酚类化合物极易被氧化，生成物(如醌类)能与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失，用苯酚、氯仿抽提时RNA丢失[2]，从而影响RNA的分离纯化；多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来[3]；多糖还可以抑制很多酶的活性，因此污染了多糖多酚的RNA无法用于进一步的分子生物学研究；RNase会造成RNA的化学降解和酶解，RNA提取过程中污染的RNA酶有两种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源性RNA酶来自RNA制备过程中使用的玻璃、塑料制品和试剂及操作人员本身等，而内源性RNA酶是组织本身所固有的，当细胞破碎后即释放出来。因此，能否有效去除多糖、酚类化合物及去除或抑制RNA酶活性是提取高质量RNA成败的关键[4]。

现成的提取植物材料总RNA的方法对除多糖、酚类化合物及去除或抑制 RNA酶活性等亟需改良。目前，常见植物材料总RNA的方法主要有SDS法、CTAB法、异硫氰酸胍法[5]、热硼酸法[6]、商业化试剂盒Trizol[7]等，但对于多糖、多酚、次生代谢物较多的植物组织RNA的提取效果并不理想，阻碍了其分子生物学方面研究的进展[8]。我们迫切需要一种成本低廉，操作简单、方便，就能彻底除去材料中的蛋白质、DNA、多糖、多酚等有机类物质的提取方法。

发明内容

本发明目的是为了解决现有RNA提取方法对多糖、多酚、次生代谢物较多的植物组织RNA提取效果较差的缺陷，提供一种能彻底除去植物材料中蛋白质、DNA、多糖、多酚、以及次生代谢产物等有机类物质的总RNA提取方法。本方法所提取的RNA可满足反转录PCR和实时荧光定量PCR等研究的需要，同时大大降低实验的成本。

本发明为解决上述问题，提供一种新的植物叶片总RNA提取方法，其包括以下步骤：

(1)植物叶片在液氮环境下研磨成细粉状，快速转移到含有细胞裂解液I的离心管中，混匀后加入盐-醇溶液混匀后离心；

(2)转移上清液到含有细胞裂解液II的离心管中，混匀后加入盐-醇溶液混匀后离心；

(3)转移上清液到新离心管中，经等体积的水饱和酚与氯仿组成的混合试剂抽提后离心；

(4)取上清液，加入异丙醇沉淀离心，加DEPC水(灭菌过的0.1％DEPC水简称DEPC水))溶解总核酸，再用DNA酶I溶液消化DNA；

(5)经等体积氯仿抽提离心；

(6)转上清液到新的离心管，加入异丙醇沉淀离心；

(7)用醇洗涤，再经空气干燥后，溶解在DEPC水中低温保存。

在一种实施方式中，细胞裂解液I为含有2％-4％CTAB(每100ml蒸馏水中含2-4gCTAB)、2％-3％PVP(每100ml蒸馏水中含2-3g PVP)、0.1-0.3mol/L Tris-Hcl和25-50mmol/L EDTA的水溶液；所述细胞裂解液II为含有1％-3％SDS、25-50mmol/L的EDTA、0.1-0.3mol/L Tris-Hcl和2％-3％PVP的水溶液，细胞裂解液I和细胞裂解液II都调至pH8.0。在一种实施方式中，pH用0.1M-1M NaOH调节。

在一种实施方式中，盐-醇溶液为含有裂解液体积1/20-1/10的β-巯基乙醇、裂解液体积1/4-1/2的无水乙醇和裂解液体积1/4-1/2的3mol/L NaAc的水溶液。

在一种实施方式中，DNA酶I溶液浓度为0.1-0.5单位/μl，消化时间为10-60分钟。

在一种实施方式中，在上述步骤(4)和(6)中异丙醇的体积为上清液体积的1/2-2/3。

在一种实施方式中，细胞裂解液I和细胞裂解液II以500-800ul细胞裂解液/0.1-0.3g植物叶片的量加入。

在一种实施方式中，上述步骤(3)中水饱和酚与氯仿的体积比为1∶1。

在一种实施方式中，步骤(7)中醇为75％乙醇。

在一种实施方式中，离心的转速为5000-20000rpm，时间2-20分钟。

本发明的有益效果在于：1、连续两次裂解，有效克服多糖、多酚、次生代谢物对RNA提取过程的影响，2、无需水浴，减少RNase污染，3、无需使用低温离心机，操作方便，4、本方法有效避免传统沉淀方法中LiCl残留对下游实验的影响，所提取的RNA可以满足反转录PCR和实时荧光定量PCR等后续分子生物学实验。

附图说明

图1是根据实施例1步骤提取的芍药叶片总RNA的电泳结果图。

图2是根据实施例1步骤提取的芍药叶片总RNA的反转录PCR结果图。

图3是根据实施例2步骤提取的美国黄栌RNA的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明但不用来限制本发明。

溶液及试剂准备：

(1)细胞裂解液I

2％CTAB(w/v)

3％PVP(w/v)

0.1mol/L Tris-Hcl(pH8.0)

25mmol/L EDTA(pH8.0)

pH用1M NaOH调至8.0

(2)细胞裂解液II

2％SDS(w/v)

2％PVP(w/v)

25mmol/L EDTA(pH8.0)

0.1mol/L Tris-Hcl(pH8.0)

pH用1M NaOH调至8.0

(3)3mol/L NaAc

(4)水饱和酚∶氯仿体积比为1∶1

(5)DNA酶I溶液浓度为0.5单位/μl

(6)75％乙醇(现配)、异丙醇(分析纯)、β-巯基乙醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、液氮和灭菌过的0.1％DEPC水(简称DEPC水)。

实施例1：芍药叶片总RNA提取

1)、称取0.2g芍药叶片(液氮保存)在液氮中研磨至粉末状，快速转移到含有600ul细胞裂解液I的2.0ml离心管中，颠倒混匀加入30ul β-巯基乙醇、150ul无水乙醇和150ul3mol/L NaAc，颠倒混匀，冰上静置10分钟，离心5min。

2)、转移上清液到含有600ul细胞裂解液II的2.0ml离心管中，颠倒混匀再加入30ul β-巯基乙醇、150ul无水乙醇和150ul的3mol/L NaAc，颠倒混匀，冰上静置10分钟，离心5min。

3)、转移上清液到含有与上清液等体积水饱和酚∶氯仿(体积比为1∶1)的2.0ml离心管中，颠倒混匀，冰上静置10分钟，离心5min。

4)、转移上清液到含有上清液体积2/3的异丙醇的2.0ml离心管中，上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，离心5分钟，弃上清。

]5)、加入420ul DEPC水溶解沉淀，加入80ulDNaseI混合液(10ulDNaseI+70ulRDD)，室温放置20min。

6)、加入与上清液等体积氯仿，上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，离心5分钟，取上清。

7)、转移上清液到含有上清液体积2/3的异丙醇的2.0ml离心管中，上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，离心5分钟，弃上清。

8)、加入1ml 75％乙醇，12000r/min离心3min，弃上清。

9)、加入1ml 75％乙醇，12000r/min离心3min，弃上清，干燥。

10)、加入30ulDEPC水溶解。

以上离心转速均为12,000rpm，离心机为湘义离心机的TG16-WS。

快速电泳检测：用1％含溴化乙锭EB的琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳时间15分钟，电泳后用紫外成像仪观察。结果显示电泳带有5S、18S、28S三条RNA谱带完整性良好，未见DNA干扰，具体见图1。图1中从左到右分别为本分发明的方法、CTAB法和SDS法的结果；从图1中可以看出，对照样品降解明显，本发明方法所提取的RNA优于常规CTAB法和对照SDS法。

紫外法检测：样品的浓度取1ulRNA用紫外分光光度计(SMA 3000)测定测定OD260/OD280。OD260/OD280越接近2.0说明RNA纯度越高，此方法提取RNAOD260/OD280为1.932，纯度较高，可用于后续实验。

反转录PCR实验：反应按北京康为世纪生物技术有限公司TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix说明书进行。RT反应步骤为42℃45min后，85℃5min。用芍药内参基因特异引物，进行PCR扩增。反应体系为，10×PCR buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂0.2μL，10mmol/L dNTP Mix2μL，10μmol/L正向引物(5’-ACTGCTGAACGGGAAATTGT-3’)和反向引物(5’-CAACCGATGAGCTGCTTTTG-3’)各1μL，cDNA第一链模板1μL，rTaq酶(5U/μL，TakaRa)0.4μL，加无菌超纯水至20μL；扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min，扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图2)，扩增出分子量约为100bp的预期条带，说明本发明方法得到的RNA容易进行RT-PCR。

实施例2：美国黄栌叶片总RNA提取

采用的植物组织是美国黄栌叶片，提取步骤同实施例1。

快速电泳检测：用1％含溴化乙锭EB的琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳时间15分钟，电泳后用紫外成像仪观察。结果显示电泳带有5S、18S、28S三条RNA谱带完整性良好，未见DNA干扰(图3)。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。

参考文献

[1]裴东，谷瑞生.几种提取木本随物中RNA方法的比较和改进[J].植物生理学通讯，2002(4)：362-365

[2]Schneiderbauer A，Sandermann H Jr，Ernst D.Isolation of functionalRNA from

plant tissues rich in phenolic compounds.Anal Biochem，1991，197：91～95

[3]Lewinsohn E，Steele CL，Croteau R.Simple isolation of functional RNAfrom

woody stems of gymnosperms.Plant Mol Biol Reptr，1994，12：20～25

[4]李宏，王新力.植物组织RNA提取的难点及对策〔J〕.生物技术通报，1999，10(1)：36-39.

[5]张志刚，李栒，官春云等.改良提取水稻胚乳和拟南芥花柱中DNA和RNA的SDS法[J].植物生理学通讯，2006，(3)：493-495.

[6]李宏，王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报，1999，(1)：36-39.

[7]张薇，张庆华.植物组织总RNA提取方法的研究进展[J].绿色科技，2010(3)：29-31

[8]阮孟斌；李文彬；于晓玲；彭明；；一种适用于多糖多酚植物的高质量RNA快速提取方法[J]；热带作物学报；2011，32(9)：1704-1707 。

Claims (5)

1.植物叶片总RNA提取方法，其特征在于：

（1）植物叶片在液氮环境下研磨成细粉状，快速转移到含有细胞裂解液I的离心管中，混匀后加入盐-醇溶液混匀后，冰上静置10分钟，离心；

（2）转移上清液到含有细胞裂解液II的离心管中，混匀后加入盐-醇溶液混匀后，冰上静置10分钟，离心；

（3）转移上清液到新离心管中，经等体积的水饱和酚与氯仿组成的混合试剂抽提后，冰上静置10分钟，离心；

（4）取上清液，加入异丙醇沉淀，冰上静置10分钟，离心，加DEPC水溶解总核酸，再用DNA酶I溶液消化DNA；

（5）经等体积氯仿抽提，冰上静置10分钟，离心；

（6）转上清液到新的离心管，加入异丙醇沉淀，冰上静置10分钟，离心；

（7）用醇洗涤，再经空气干燥后，溶解在DEPC水中低温保存，

其中所述细胞裂解液I为以下配方的水溶液：

2 w/v% CTAB，

3 w/v% PVP，

0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0和

25 mmol/L EDTA，pH 8.0；

所述细胞裂解液II为以下配方的水溶液：

2 w/v% SDS，

2 w/v% PVP，

25 mmol/L EDTA，pH 8.0和

0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，

细胞裂解液I和细胞裂解液II都调至pH 8.0；并且

所述盐-醇溶液为含有裂解液体积1/20-1/10的β-巯基乙醇、裂解液体积1/4-1/2的无水乙醇和裂解液体积1/4-1/2的3mol/L NaAc的水溶液；

其中所述提取方法无需使用低温离心机，并且离心的转速为12,000 rpm，时间5分钟；

其中所述细胞裂解液I和细胞裂解液II以500-800 μl细胞裂解液/0.1-0.3 g植物叶片的量加入。

2.如权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于：DNA酶I溶液浓度为0.1-0.5 单位/μl，消化时间为10-60分钟。

3.如权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于：步骤(4)和(6)中异丙醇的体积为上清液体积的1/2-2/3。

4.如权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于：步骤(3)中水饱和酚与氯仿的体积比为1:1。

5.如权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于：步骤(7)中醇为75%乙醇。