CN110964719A - 一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良Trizol法提取淀粉含量高的组织RNA方法，其特征在于，是首先将冷冻后的样品研磨后通过RNA缓冲液和提取溶液进行提取后，逐步离心分离得透明沉淀，后水浴取样检测。本发明与现有的Trizol法或商用提取盒提取效果相比，本发明所提取的胚乳的电泳分离度更好，更便于后续的分析操作。
Description
技术领域
本发明涉及RNA提取领域，具体涉及一种改良Trizol法提取淀粉含量高的RNA方法。
背景技术
Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理是在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
而现有的采用Trizol法来提取胚乳RNA提取的方法或其他商用提取方法当中存在以下的不足：因水稻胚乳中淀粉含量很高，且淀粉与核酸性质相似，在提取时会与核酸共沉淀，且在提取过程中导致核酸降解，目前Trizol试剂无法有效分离淀粉与核酸，导致在提取过程中核酸无法提取出来，实验失败。商用试剂盒价格昂贵，且存在与传统Trizol法同样的问题，无法有效去除淀粉，导致提取降解。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，包括如下步骤：
步骤一：将冷冻后的样品在液氮中研磨后称重，称取不超过0.1g粉末放入390-410ul的RNA缓冲液中放入离心管，剧烈震荡1-2min。
步骤二：在所述离心管中加入240-260ul提取溶液，混匀后在3-5℃的温度下以12000-14000r/min的转速离心13-16min；
步骤三：将步骤二离心后的上清液转移至另一离心管中，加入0.9-1.1mlTRIZzol，室温放置5-7min；
加入190-210ul氯仿后剧烈震荡混匀，室温放置2-3min混匀后在3-5℃的温度下以12000-14000r/min的转速离心13-16min；
步骤四：将步骤四离心后的上清液转移至另一离心管中，加入0.4-0.65ml的异丙醇以及38-42ul的浓度为5M的NaCl溶液，混匀斡旋后室温放置8-12min，在3-5℃的温度下以11000-13000×g的速度离心至离心管底部有白色沉淀；
步骤五：将所述步骤四的离心管中的上清液去除后，加入0.9-1.1ml的75％无水乙醇，室温放置1-2min后在3-5℃的温度下以7000-8000×g的速度离心6-8min后重复所述步骤五至少一次；
步骤六：将所述步骤五的液体中的上清液去除后进行若干离心去除上清液操作后室温干燥至所述白色沉淀变透明；
步骤八：在所述透明沉淀中加入DEPC水后在56-58℃恒温金属浴中充分溶解5-10min后取样检测。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤一的冷冻为采用-80℃冰箱冷冻。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤一的RNA缓冲液由如下方法制备而得：
吸取10ml浓度为0.5M的EDTA和pH值为8.0的10ml 1M TRIS溶液到烧杯中，加入40ml DEPC灭菌水，称取6.36g氯化锂和1.5g SDS至烧杯中，搅拌溶解后，定容到100ml，121℃，20min下高压灭菌；
待灭菌后，加入1.5ml巯基乙醇，混匀得所述RNA缓冲液。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤二中的提取溶液为酚：氯仿：异戊醇以25：24:1的质量份比例混合而得。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤四当中的异丙醇为纯度为100％的异丙醇；所述NaCl溶液为采用DEPC水配制的NaCl溶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤六当中的室温干燥时间不超过5min。
本发明的有益效果在于：
本发明与现有的Trizol法或商用提取盒提取效果相比，本发明所提取的RNA的完整性更好，可进行后续的建库测序实验。
附图说明
图1为水稻胚乳美基生物植物RNA提取试剂盒的提取结果电泳图。
图2为天根多糖多酚RNA提取试剂盒的提取结果电泳图。
图3为现有的trizol法提取结果电泳图。
图4为本发明的改良trizol法提取结果电泳图。
具体实施方式
本发明的实施例：
1)从-80℃冰箱中取出样品，在液氮中快速充分研磨，称取不超过0.1g粉末于400ul RNA缓冲液中，剧烈震荡1.5min；
2)迅速往离心管中加入250ul酚：氯仿：异戊醇(25：24:1)，上下颠倒混匀后，在4℃，13000r/min的状态下离心15min；
3)转移上清至另一新的无酶离心管中，加入1ml TRIZzol，室温放置5-7min，加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置2-3min，在4℃，13000r/min状态下离心15min；
4)转移上清至新的无酶管中；
5)加入0.5ml的纯度为100％的异丙醇以及40ul浓度为5M的NaCl溶液(NaCl溶液DEPC水配制)，上下颠倒混匀后，涡旋器上轻轻震荡数秒后，室温放置10min；
6)在4℃和12000×g的情况下离心10min，此时在离心管底部可见少许白色沉淀；
7)轻轻地吸弃上清，加入1ml 75％无水乙醇(DEPC水配制)，室温放置1-2min，4℃，7500×g，离心7min；
8)重复步骤7；
9)倒掉上清液，剩余液体短暂离心后，用无酶枪头尽量吸除液体，室温干燥不超过5min，管底部白色沉淀变成透明为止；
10)加入30ul DEPC水，用手指轻弹离心管，后在57℃恒温金属浴中充分溶解5-10min。取出2ul进行电泳检测，其余在-80℃中保存。
RNA缓冲液制备方法：
分别吸取10ml 0.5M EDTA和10ml 1M TRIS溶液(TRIS溶液pH为8.0)到烧杯中，加入40ml DEPC灭菌水，称取6.36g氯化锂和1.5g SDS至烧杯中，搅拌溶解后，定容到100ml，121℃，20min高压灭菌。待灭菌后，加入1.5ml巯基乙醇，混匀。
图1为水稻胚乳美基生物植物RNA提取试剂盒的提取结果电泳图。提取降解严重，RNA已无明显的25S和18S条带。图2为天根多糖多酚RNA提取试剂盒的提取结果电泳图。采用此试剂盒，无法正常分离出RNA。图3为现有的trizol法提取结果电泳图。采用此试剂盒，无法正常分离出RNA。图4为本发明的改良trizol法提取结果电泳图。从图中可以看到，25S、18S条带清晰，且25S/18S亮度在2倍左右，说明RNA完整度很高，可用于后续的建库测序工作。
Claims (6)
1.一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将冷冻后的样品在液氮中研磨后称重，称取不超过0.1g粉末放入390-410ul的RNA缓冲液中放入离心管，剧烈震荡1-2min。
步骤二：在所述离心管中加入240-260ul提取溶液，混匀后在3-5℃的温度下以12000-14000r/min的转速离心13-16min；
步骤三：将步骤二离心后的上清液转移至另一离心管中，加入0.9-1.1ml TRIZzol，室温放置5-7min；
加入190-210ul氯仿后剧烈震荡混匀，室温放置2-3min混匀后在3-5℃的温度下以12000-14000r/min的转速离心13-16min；
步骤四：将步骤四离心后的上清液转移至另一离心管中，加入0.4-0.65ml的异丙醇以及38-42ul的浓度为5M的NaCl溶液，混匀斡旋后室温放置8-12min，在3-5℃的温度下以11000-13000×g的速度离心至离心管底部有白色沉淀；
步骤五：将所述步骤四的离心管中的上清液去除后，加入0.9-1.1ml的75％无水乙醇，室温放置1-2min后在3-5℃的温度下以7000-8000×g的速度离心6-8min后重复所述步骤五至少一次；
步骤六：将所述步骤五的液体中的上清液去除后进行若干离心去除上清液操作后室温干燥至所述白色沉淀变透明；
步骤八：在所述透明沉淀中加入DEPC水后在56-58℃恒温金属浴中充分溶解5-10min后取样检测。
2.如权利要求1所述的一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，其特征在于，所述步骤一的冷冻为采用-80℃冰箱冷冻。
3.如权利要求1所述的一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，其特征在于，所述步骤一的RNA缓冲液由如下方法制备而得：
吸取10ml浓度为0.5M的EDTA和pH值为8.0的10ml 1M TRIS溶液到烧杯中，加入40mlDEPC灭菌水，称取6.36g氯化锂和1.5g SDS至烧杯中，搅拌溶解后，定容到100ml，121℃，20min下高压灭菌；
待灭菌后，加入1.5ml巯基乙醇，混匀得所述RNA缓冲液。
4.如权利要求1所述的一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，其特征在于，所述步骤二中的提取溶液为酚：氯仿：异戊醇以25：24:1的质量份比例混合而得。
5.如权利要求1所述的一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，其特征在于，所述步骤四当中的异丙醇为纯度为100％的异丙醇；所述NaCl溶液为采用DEPC水配制的NaCl溶液。
6.如权利要求1所述的一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，其特征在于，所述步骤六当中的室温干燥时间不超过5min。
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