WO2021003952A1 - 极小量细胞核糖体保护的rna片段测序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了极小量细胞核糖体保护的RNA片段测序的方法，包括：(1)将细胞进行裂解处理，以便得到裂解液；(2)利用核糖核酸酶对裂解液进行酶解处理，并将所得到的酶解液加入到蔗糖缓冲液表面，进行离心处理，收集沉淀物；(3)将沉淀物进行纯化处理，以便得到核糖体保护的RNA粗提液；(4)将粗提液进行电泳，收集预定区域的凝胶切片，并从凝胶切片中提取核糖体保护的RNA；以及(5)对核糖体保护的RNA进行建库及测序；其中，步骤(1)中，细胞的个数为50～1×10 ⁶个。

Description

极小量细胞核糖体保护的RNA片段测序的方法 技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及极小量细胞核糖体保护的RNA片段测序的方法。

背景技术

近年来，随着二代测序技术的发展，出现了更多的技术帮助人们了解生物学中的各个事件。对于基因表达调控来说，涌现了大量基于测量mRNA水平的组学技术，而针对基因表达调控中其他的关键步骤测量的相关的组学方法则比较少见。翻译是基因表达中重要的一环，在这个过程中，核糖体将mRNA翻译成多肽，多肽进一步折叠并修饰成具有活性的蛋白质。为了能够给细胞在正确的位置产生正确的蛋白，细胞消耗了巨大的能量来调控这个过程。翻译的错误调控将会给人类带来疾病，如神经退行性疾病和贫血。因此，了解不同细胞、不同的发育过程中的翻译组将会帮助了解生物学现象以及帮助疾病的治疗。

目前，研究开发的核糖体的图谱技术实现了全基因组翻译水平的测量。核糖体的图谱技术的核心是：一个正在翻译的核糖体占据着mRNA的～30nt的一段核苷酸，这种占据非常强烈以至于可以保护它们避免被核酸酶酶切降解掉。对这些核糖体保护的片段进行测序，从而确定正在翻译的核糖体的精确位置。随后，人们发现了许多新的或选择性翻译的蛋白产物。然而，由于技术的限制，目前需要10 ⁷以上的细胞数目来进行试验。而对于一些稀有的细胞类型，该数目的细胞则是无法收集的。传统的核糖体图谱技术，由于步骤十分繁琐，需要经历多次电泳凝胶的纯化，加之微量级的小RNA的建库一直是领域内的难点，造成了少量细胞无法进行实验的现状。

因此，目前核糖体保护的RNA片段测序的方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了核糖体保护的RNA片段测序的方法，该方法能够在较短的时间内、使用极少数数目的细胞(低至几十个)即可实现对核糖体保护的RNA片段测序，获得高质量的全基因组范围的翻译组数据，从而为解释少量细胞翻译层次的调控提供可能性。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种核糖体保护的RNA片段测序的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将细胞进行裂解处理，以便得到裂解液；(2)利用核 糖核酸酶对所述裂解液进行酶切处理，并将所得到的酶切液加入到蔗糖缓冲液表面，进行离心处理，收集沉淀物；(3)将所述沉淀物进行纯化处理，以便得到核糖体保护的RNA粗提液；(4)将所述粗提液进行电泳，收集预定区域的凝胶切片，并从所述凝胶切片中提取核糖体保护的RNA；以及(5)对所述核糖体保护的RNA进行建库及测序；其中，步骤(1)中，所述细胞的个数为50～1×10 ⁶个。

采用传统的建库方法需要以10 ⁷以上的细胞数目进行试验，但是，对于一些稀有的细胞类型，如此大量的细胞是很难收集的。进而，发明人对核糖体保护的RNA片段的提取过程进行了优化，通过采用上述步骤可使用极少数量的细胞即可实现对核糖体保护的RNA片段测序，获得高质量的全基因组范围的翻译组数据，从而为解释少量细胞翻译层次的调控提供可能性。并且，该方法步骤简便，可以在很短时间内(如3天内)完成，降低了实验成本，提高实验效率，具有广泛的应用前景。

根据本发明的实施例，上述核糖体保护的RNA片段测序的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，步骤(2)中，采用RNase I酶对所述裂解液进行酶切处理，其中，所述RNase I酶的用量为0.5～1.5μL，优选1.0μL。由此，利用RNase I酶使裂解液中的RNA降解，而被核糖体保护的RNA片段得以保留。

在酶切反应中，往往加入过量的酶会导致过度消化，从而导致无法获得足够的片段进行下一步实验，而过少的酶量则使得反应不完全，获得的片段不完全是所需要的目的片段，导致影响实验结果。发明人通过以10000个小鼠胚胎干细胞细胞和1000个小鼠胚胎干细胞进行实验，分别加入了2μL、1μL、0.5μL和0.1μL的酶量进行了实验，实验结果表明，0.5μL和1μL的结果明显好于2μL或是0.1μL，并且在两个细胞数中结果比较一致。

根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：将所述蔗糖缓冲液加入到离心管中，然后将所述酶切液转移至所述蔗糖缓冲液表面，2～6℃下以200000～350000g的转速离心2～6小时，从所述离心管中吸取上清液，用团块缓冲液冲洗沉淀直至沉淀溶解；其中，所述团块缓冲液包括：含有0.5～1.5质量％SDS的浓度为5～15mM、pH值为7～8的Tris缓冲液。核糖体能够在上述蔗糖缓冲液中沉淀，由此，以达到分离目的。但是，沉淀后的核糖体经离心后会贴在离心管的侧壁上，不便于后续转移。进而，发明人经过大量实验发现，贴壁的核糖体沉淀可以在含有上述团块缓冲液的浸泡下与管壁分离，由此，便于进行后续操作。

根据本发明的实施例，步骤(3)中，所述纯化处理包括：将所述沉淀物依次用TRIzol和氯仿混匀和静置，并将所得到的混合液进行离心处理，收集上清液；向所述上清液中加入异丙醇和肝糖原，静置，离心，弃去上清液，用乙醇将沉淀悬浮，离心，弃去上清液， 使沉淀干燥，再用水溶解所述沉淀，以便得到所述核糖体保护的RNA粗提液。由此，以达到初步纯化的目的。

根据本发明的实施例，步骤(4)中，采用凝胶进行电泳，每块凝胶上样一种粗提液，并且不上样marker溶液。由于粗提液中RNA量很少，因此，为了防止样品在跑胶过程中的相互污染，一个样品准备一块胶。并且，由于marker溶液中的RNA浓度很高，为了避免其在跑胶过程中污染含有少量RNA的样品，不上样marker溶液。具体地，可以在相同的电泳条件下进行预实验，单独上样marker溶液，以确定不同长度RNA的位置，然后将该预实验的胶片与样品跑胶后的胶片进行比对，以便确定样品中预定长度RNA所在的胶片位置。

根据本发明的实施例，步骤(5)中，利用diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit进行所述建库。发明人对公开的一些建库试剂盒进行研究发现，该厂家、型号的试剂盒可以准确且特异性地实现对极少量核糖体保护的RNA片段进行建库。

在本发明的又一方面，本发明提出了另一种核糖体保护的RNA片段测序的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

(1)提供如下试剂：

多核糖体缓冲液，包括：20mM的Tris-HCl溶液，pH＝7.4；150mM的NaCl溶液；5mM的MgCl ₂溶液、1mM的二硫苏糖醇溶液；100μg/ml的放线菌酮(CHX)溶液；

裂解缓冲液，包括：1×所述多核糖体缓冲液、1质量％的Triton-X 100溶液；25U/ml的脱氧核糖核酸酶(Turbo DNase)；

蔗糖缓冲溶液，包括：1×多核糖体缓冲液；1M的蔗糖溶液；20U/ml的RNA酶抑制剂(SUPERase.In)；

RNA凝胶提取缓冲液，包括：300mM醋酸钠溶液；1M的NaCl溶液；0.05质量％的Tween；0.5mM的EDTA；

团块缓冲液，包括：1质量％的SDS溶液；10mM的Tirs溶液，pH＝7.5；

(2)将50～1×10 ⁶个细胞置于离心管中；

(3)将310μl冰冷的裂解缓冲液加入所述离心管，混匀，来回倒动所述离心管，再将所述离心管在冰上孵育；

(4)将所述离心管置于4℃离心机，20,000g离心10分钟，回收上清液置于新的离心管中；

(5)向所述上清液中加入1μlRNase I，在22℃下，用恒温混匀仪中以1000rpm的转速晃动45分钟；

(6)加入10μl RNase抑制剂，中止核酸酶消化，得到裂解液；

(7)先吸取0.7ml蔗糖缓冲溶液置于离心管底，缓慢的将上一步的300μL裂解液转移至蔗糖溶液顶部，将离心管置于离心机的转子中，在4℃，26,0000g条件下离心4小时，沉淀核糖体；

(8)从所述转子上取下离心管，弃去管中的上清液，用50μL团块缓冲液冲洗核糖体团块所在的位置，直至完全溶解，再将溶解液转移至新的离心管中；

(9)加入1ml TRIzol，混匀，室温放置5分钟，再加入0.2ml的氯仿，混匀后室温放置2分钟，在4℃，12,000g的条件下离心10分钟，收集上清液于新的离心管中，向离心管中加入0.75ml的异丙醇和1μL的肝糖原；

(10)在-20℃放置30分钟或过夜；在离心机中，4℃，最高转速的条件下离心40分钟，弃去液体，用80％的乙醇将沉淀漂浮起来，离心5分钟后弃去上清，将盖敞开，将沉淀晾干；

(11)用6μL不含RNase的水溶解沉淀，即得到核糖体保护的RNA粗提液；

(12)准备15％的尿素-TBE-PAGE胶，冲洗TBE胶的上样孔，吹走多余的尿素，在1×TBE溶液中预先在210V下进行电泳20分钟；

(13)在所述粗提液中加入6μL 2×变性上样缓冲液，在80℃下将样品变性90秒；

(14)再次仔细冲洗上样孔，上样上一步经变性处理后的样品，每个样品仅上样一块胶，且不上样marker溶液；

(15)于210V电压下电泳分离60分钟，至深蓝色染料跑出胶时停止电泳；

(16)确定样品所在的泳道，从淡蓝色染料下开始，切下一段胶块，放入不含RNase的1.5ml离心管中；

(17)将所述胶块上长度为29～34nt的RNA聚集区域切下，放入一个新的离心管中；

(18)向离心管中加入400μL RNA凝胶提取缓冲液，在-80放置30分钟；

(19)将离心管在22℃的恒温混匀仪内，1000rpm，轻轻混合过夜；

(20)离心，收集管底部的液体，将400μL液体转移至干净的离心管中；

(21)向离心管中加入500μL异丙醇，再加入1μL肝糖原，颠倒混匀，重复步骤(10)和(11)的操作，以便纯化RNA；

(22)利用diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit将溶解的RNA建库，并对获得的文库进行测序。

在本发明的方法中，通过各个步骤的改进和简化后，可以将时间传统的7天缩短为3天内，使用极少数数目的细胞(低至几十个)来获得高质量的全基因组范围的翻译组数据， 从而为揭示少量细胞翻译层次的调控提供可能性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的测序结果分析示意图，其中，A为测序数据中含有周期性的片段的比例；B为测序后比对到基因上的片段在编码区的分布比例；C为测序后比对到基因上的片段在5’和3’非编码区的分布比例；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同方法所需要的细胞数目分析示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的不同方法的建库所需RNA数目分析示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的不同离心条件对测序数据中含有周期性的片段的比例影响分析示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

一、试剂准备

1、多核糖体缓冲液

20mM Tris-HCl，pH＝7.4

150mM NaCl

5mM MgCl ₂

1mM DTT

100μg/ml CHX

2、裂解液

1×多核糖体缓冲液

1质量％Triton-X 100

25U/ml Turbo DNase

3、蔗糖缓冲溶液

1×多核糖体缓冲液

1M蔗糖

20U/ml SUPERase.In

4、RNA凝胶提取缓冲液

300mM醋酸钠，pH值为5.51M NaCl

0.05质量％Tween

0.5mM EDTA

5、团块缓冲液

1质量％SDS

10mMTirs，pH＝7.5

二、细胞裂解液的准备

1.将细胞样品置于1.5ml EP管管底。

2.将310μl冰冷的裂解缓冲液加入EP管。

3.适当混匀，来回倒动EP管，将EP管在冰上孵育10分钟。

4. 4℃离心机，20,000g离心10分钟，小心回收上清液。

5.将上清液放在一个新的EP管中。

三、RNA核酸酶消化和核糖体纯化回收

6.在上清中加入1μl RNase I(100U/μl)。在22℃下，用恒温混匀仪(Eppendorf

)，1000rpm，温和晃动45分钟。

7.加入10μl SUPERase·in即RNase抑制剂，中止核酸酶消化。

8.准备超速离心管(与Beckman MLA-150转子适配的1ml离心管)，先吸取0.7ml蔗糖缓冲溶液置于管底，缓慢的将上一步的300μL裂解液转移至蔗糖溶液顶部，用马克笔在管子的一边竖直标记一条线，将离心管放入转子时将这条线对准离心机的外边缘。

9.采用台式超速离心机(Optima MAX-XP，Beckman)，MLA-150转子(Beckman)，配套的1ml离心管(Beckman)在4℃，26,0000g条件下离心4小时沉淀核糖体。

10.从转子上取下离心管，吸出管中的上清液。

11.用50μL团块缓冲液冲洗核糖体团块所在的位置，直至完全溶解，转移至新的1.5mlEP管中。

12.加入1ml TRIzol，混匀，室温放置5分钟；再加入0.2ml的氯仿，混匀后室温放置 2分钟。

13.将溶液转移至Invitrogen ^TMPhasemaker ^TMTubes中，在离心机中，4℃，12,000g的条件下离心10分钟。

14.将上层的水相溶液转移至一个新的EP管中，加入0.75ml的异丙醇和1μL的肝糖原(glycogen，RNA grade)。

15.在-20℃放置30分钟，在离心机中，4℃，最高转速的条件下离心40分钟。吸出液体，用80％的乙醇将沉淀漂浮起来。离心5分钟后吸出上清。将盖敞开，将肝糖原沉淀晾干。

16.用6μL RNase-free的水溶解肝糖原，即得到核糖体保护的RNA。此时RNA可以在-20℃存储一周或在-80℃储存数月。

四、核糖体保护片段的纯化

17.准备15％的尿素-TBE-PAGE胶，冲洗TBE胶的上样孔，吹走多余的尿素。在1×TBE溶液中预先在210V下进行电泳20分钟。

18.在每个样品中加入6μL 2×变性上样缓冲液(Thermon)。

19.在80℃下将样品变性90秒。

20.再次仔细冲洗上样孔，上样，每块胶仅上样一种样品，且不上样marker溶液。

21. 210V，电泳分离60分钟，至深蓝色染料跑出胶即可。

22.确定样品所在的泳道，从淡蓝色染料下开始，切下约一小指宽的胶块，放入RNase-free的1.5ml EP管中。(注意：为了防止样品之间的污染，每个样品使用一个刀片。)

23.(预实验确定范围)将RNA marder划定的29-nt至34-nt区域切下，放入一个新的EP管中。

24.从聚丙烯酰胺凝胶切片中提取RNA

(i)加入400μL RNA凝胶提取缓冲液，在-80放置30分钟。

(ii)将样品在22℃的恒温混匀仪内，1000rpm，轻轻混合过夜。

(iii)简短离心，收集管底部的液体，将400μL液体转移至干净的EP管中。

25.加入500μL异丙醇，再加入1μL Glycogen，颠倒混匀，沉淀RNA。如步骤15和16所述沉淀并纯化RNA。

26.将RNA用RNase-free水溶解，此时RNA可以在-20℃储存一个月或在-80℃无限期储存。

五、基于diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit的建库方法

27.将溶解的RNA建库。

28.建库结束后，用

珠纯化PCR产物，去除剩余的PCR引物。

29.将所得文库进行二代测序。

利用本发明进行测序的结果分析参见图1。周期性是核糖体图谱测序非常重要的一个指标，如果在数据中有一定比例的片段具有周期性，则为数据质量好，比例越高说明数据质量越优，一般达到50％左右则为优。与Ingolia早期发表的数据(Ingolia et al.,2011 ^[1])相比，本实验方法所获得数据质量均为优(图1A)，而Ingolia方法所得测序数据中不含有周期性的片段。核糖体图谱数据中，在基因编码区(CDS)的比例越高，说明数据质量越优，一般在50％到80％之间。与mRNA测序数据相比，核糖体图谱在非翻译区的片段比例会明显降低，一般低于5％为优，同时3’UTR的比例往往比5’UTR的比例更低。本图说明本实验方法所获得数据质量均为优，各样品在编码区的比例均高于70％，3’UTR的比例均低于5’UTR，并都低于5％(图1B和C)。

实施例2

目前常用的三种核糖体图谱技术包括：Glincy et al.,2017 ^[2]、Hornstein et al.,2016 ^[3]和Reid et al.,2015 ^[4]。这三个技术与实施例1方法所需要的细胞数参见图2，可以看出，本方法所需要的细胞数目有了显著的下降，总共下降了多个数量级，由此，利用本发明的方法可以使用极少数的细胞即可实现对核糖体保护的RNA片段测序。并且，参见图3，本发明建库所需要的核糖体保护的RNA数量较少，帮助了核糖体图谱技术在少量细胞过程的应用。

实施例3

在实施例1的步骤三的第9步，比较不同离心条件对测序数据质量的影响。其中，对照组的离心条件为100,0000g条件下离心1小时。结果如图4所示，采用本发明的离心条件所得到的测序数据中含有周期性的片段的比例较高，说明测序数据质量较好。

参考文献

[1]Ingolia,N.T.,Lareau,L.F.,and Weissman,J.S.(2011).Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.Cell 147,789–802.

[2]Glincy,N.J.M.,and Ingolia,N.T.(2017).Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling.Methods.

[3]Hornstein,N.,Torres,D.,Das Sharma,S.,Tang,G.,Canoll,P.,and Sims,P.A.(2016).Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.Genome Biol.17,149.

[4]Reid,D.W.,Shenolikar,S.,and Nicchitta,C.V(2015).Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation.91,69–74.

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1. 一种核糖体保护的RNA片段测序的方法，其特征在于，包括：

   (1)将细胞进行裂解处理，以便得到裂解液；

   (2)利用核糖核酸酶对所述裂解液进行酶切处理，并将所得到的酶切液加入到蔗糖缓冲液表面，进行离心处理，收集沉淀物；

   (3)将所述沉淀物进行纯化处理，以便得到核糖体保护的RNA粗提液；

   (4)将所述粗提液进行电泳，收集预定区域的凝胶切片，并从所述凝胶切片中提取核糖体保护的RNA；以及

   (5)对所述核糖体保护的RNA进行建库及测序；

   其中，步骤(1)中，所述细胞的个数为50～1×10 ⁶个。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用RNase I酶对所述裂解液进行酶切处理，

   其中，所述RNase I酶的用量为0.5～1.5μL，优选1.0μL。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：

   将所述蔗糖缓冲液加入到离心管中，然后将所述酶切液转移至所述蔗糖缓冲液表面，2～6℃下以200000～350000g的转速离心2～6小时，从所述离心管中吸取上清液，用团块缓冲液冲洗沉淀直至沉淀溶解；

   其中，所述团块缓冲液包括：含有0.5～1.5质量％SDS的浓度为5～15mM、pH值为7～8的Tris缓冲液。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化处理包括：

   将所述沉淀物依次用TRIzol和氯仿混匀和静置，并将所得到的混合液进行离心处理，收集上清液；

   向所述上清液中加入异丙醇和肝糖原，静置，离心，弃去上清液，用乙醇将沉淀悬浮，离心，弃去上清液，使沉淀干燥，再用水溶解所述沉淀，以便得到所述核糖体保护的RNA粗提液。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，采用凝胶进行电泳，每块所述凝胶上样一种所述粗提液，并且不上样marker溶液。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，利用diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit进行所述建库。
7. 一种核糖体保护的RNA片段测序的方法，其特征在于，包括：

   (1)提供如下试剂：

   多核糖体缓冲液，包括：20mM的Tris-HCl溶液，pH＝7.4；150mM的NaCl溶液；5mM的MgCl ₂溶液、1mM的二硫苏糖醇溶液；100μg/ml的放线菌酮溶液；

   裂解缓冲液，包括：1×所述多核糖体缓冲液、1质量％的Triton-X 100溶液；25U/ml的脱氧核糖核酸酶；

   蔗糖缓冲溶液，包括：1×多核糖体缓冲液；1M的蔗糖溶液；20U/ml的RNA酶抑制剂；

   RNA凝胶提取缓冲液，包括：300mM醋酸钠溶液；1M的NaCl溶液；0.05质量％的Tween；0.5mM的EDTA；

   团块缓冲液，包括：1质量％的SDS溶液；10mM的Tirs溶液，pH＝7.5；

   (2)将50～1×10 ⁶个细胞置于离心管中；

   (3)将310μl冰冷的裂解缓冲液加入所述离心管，混匀，来回倒动所述离心管，再将所述离心管在冰上孵育；

   (4)将所述离心管置于4℃离心机，20,000g离心10分钟，回收上清液置于新的离心管中；

   (5)向所述上清液中加入1μlRNase I，在22℃下，用恒温混匀仪中以1000rpm的转速晃动45分钟；

   (6)加入10μl RNase抑制剂，中止核酸酶消化，得到裂解液；

   (7)先吸取0.7ml蔗糖缓冲溶液置于离心管底，缓慢的将上一步的300μL裂解液转移至蔗糖溶液顶部，将离心管置于离心机的转子中，在4℃，26,0000g条件下离心4小时，沉淀核糖体；

   (8)从所述转子上取下离心管，弃去管中的上清液，用50μL团块缓冲液冲洗核糖体团块所在的位置，直至完全溶解，再将溶解液转移至新的离心管中；

   (9)加入1ml TRIzol，混匀，室温放置5分钟，再加入0.2ml的氯仿，混匀后室温放置2分钟，在4℃，12,000g的条件下离心10分钟，收集上清液于新的离心管中，向离心管中加入0.75ml的异丙醇和1μL的肝糖原；

   (10)在-20℃放置30分钟或过夜；在离心机中，4℃，最高转速的条件下离心40分钟，弃去液体，用80％的乙醇将沉淀漂浮起来，离心5分钟后弃去上清，将盖敞开，将沉淀晾干；

   (11)用6μL不含RNase的水溶解沉淀，即得到核糖体保护的RNA粗提液；

   (12)准备15％的尿素-TBE-PAGE胶，冲洗TBE胶的上样孔，吹走多余的尿素，在 1×TBE溶液中预先在210V下进行电泳20分钟；

   (13)在所述粗提液中加入6μL 2×变性上样缓冲液，在80℃下将样品变性90秒；

   (14)再次冲洗上样孔，上样上一步经变性处理后的样品，每个样品仅上样一块胶，且不上样marker溶液；

   (15)于210V电压下电泳分离60分钟，至深蓝色染料跑出胶时停止电泳；

   (16)确定样品所在的泳道，从淡蓝色染料下开始，切下一段胶块，放入不含RNase的1.5ml离心管中；

   (17)将所述胶块上长度为29～34nt的RNA聚集区域切下，放入一个新的离心管中；

   (18)向离心管中加入400μL RNA凝胶提取缓冲液，在-80放置30分钟；

   (19)将离心管在22℃的恒温混匀仪内，1000rpm，轻轻混合过夜；

   (20)离心，收集管底部的液体，将400μL液体转移至干净的离心管中；

   (21)向离心管中加入500μL异丙醇，再加入1μL肝糖原，颠倒混匀，重复步骤(10)和(11)的操作，以便纯化RNA；

   (22)利用diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit将溶解的RNA建库，并对获得的文库进行测序。

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