CN106801096A - 一种染色质免疫共沉淀样品快速制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,包括:对细胞进行甲醛交联,固定蛋白与核酸的复合物,将蛋白核酸复合物抽提出来,再将染色质片段通过超声或酶解打断成小片段;将抗体挂到固相支持物磁珠上,再将获得的小片段加到制好的磁珠上孵育,获得磁珠抗原抗体复合物,孵育完成后将未结合物质洗去,对磁珠抗原抗体复合物进行重悬,获得待检测的磁珠抗原抗体复合物样品。本发明方法操作简单,制备得到的磁珠复合物样品可直接用于PCR检测或者扩增,构建DNA文库,样品制备时间明显缩短,同时还避免了由于过多洗脱步骤造成的某些蛋白质与DNA富集信号较弱的缺陷,大大提高了检测的灵敏度,且对后续的PCR鉴定和DNA片段扩增不会产生任何不良影响。
Description
技术领域
本发明属于染色质免疫共沉淀(ChIP)技术领域,更具体地,涉及染色质免疫共沉淀(ChIP)样品快速制备方法。
背景技术
组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质,含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多,二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白,是一类小分子碱性蛋白质,有五种类型:H1、H2A、H2B、H3及H4组蛋白,它们富含带正电荷的碱性氨基酸,能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。
许多组蛋白的各种翻译后修饰(PTM)(即甲基化、乙酰化、泛素化和SUMO化)发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点,但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域确是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化,并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/或核小体改构复合体来实现。
组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应,包括转录、异染色质的基因沉默和基因组稳定性。由于能影响到整个转录程序,与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中,组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下也与人类疾病相关,并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。因此,组蛋白是如何被调节的以及如何影响PTM-特异性结合蛋白的相互作用将继续成为重大的研究领域。
特异性翻译后修饰的基因组定位研究现在常采用染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)的方法。染色质免疫共沉淀是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。
富含有特定翻译后修饰的基因组位点可以通过将含有感兴趣的标记的染色质片段进行免疫沉淀来确定,然后在对与该翻译后修饰相关的不同位点其所占的相对比例进行定量。
大多数染色质免疫共沉淀(ChIP)实验方案的第一步是用甲醛处理细胞,通过交联将染色质结合蛋白的位置固定。后生动物来源的细胞就可以直接进行裂解,而酵母细胞则必须先要进行细胞壁破碎,这可以通过机械力剪切或酶消化来完成。染色质可以以下列两种方式之一来切成下片段:通过超声打断来得到200~500bp长的片段,或用微球菌核酸酶消化成单核小体。然后,添加与目标蛋白质特异的抗体,该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀结合复合体,再去交联,纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本,准备测序。测序时,将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
染色质免疫共沉淀样品的制备结果对后续测序分析起到了重要的作用,其制备效率也直接影响了整个ChIP-Seq操作的时间,而现有的样品制备流程往往耗时较长,成本高,检测的灵敏度也较低。
发明内容
针对上述现有技术中的问题,本发明提供了一种染色质免疫共沉淀(ChIP)样品快速制备方法,本发明制备得到样品为磁珠结合的核酸片段,可直接用于PCR检测或者扩增DNA、构建DNA文库。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种染色质免疫共沉淀(ChIP)样品快速制备方法,包括:对细胞进行甲醛交联,固定蛋白与核酸的复合物,将蛋白核酸复合物抽提出来,再将染色质片段通过超声或酶解打断成小片段;将抗体挂到固相支持物磁珠上,再将获得的小片段加到制好的磁珠上孵育,获得磁珠抗原抗体复合物,孵育完成后将未结合物质洗去,其特征在于,对磁珠抗原抗体复合物进行重悬,获得含有DNA的磁珠抗原抗体复合物样品;所述磁珠的初始添加量≤10μl。
现有的染色质免疫共沉淀(ChIP)样品制备方法中,需要解交联、蛋白酶降解蛋白质、沉淀富集核酸、扩增核酸、最终用于定量PCR检测或者构建DNA文库后的高通量测序等多个步骤;样品从制备到进行PCR检测,至少3-4天的时间,而本发明获得的磁珠抗原抗体复合物样品上的DNA片段可直接用于PCR检测或者扩增DNA,构建DNA文库,节约了1-2天的时间。实验证明,少量的磁珠(10μl)不会对后续的PCR鉴定和DNA片段扩增产生影响。本发明方法不仅大大节约了时间,同时还可以避免由于过多洗脱步骤造成的某些蛋白质与DNA富集信号较弱的缺陷,大大提高了检测的灵敏度。
优选地,所述磁珠的初始添加量为10μl,所述抗体的初始添加量为1-10μl。
优选地,所述染色质免疫共沉淀样品快速制备方法包括如下步骤:
S1. 细胞裂解,获得蛋白核酸复合物的小片段;
S2. 准备磁珠,磁珠结合抗体:将磁珠完全重悬,制成磁珠重悬液,每个EP管中加入10μl磁珠重悬液,准备两份磁珠重悬液,一份结合抗体,一份去除非特异性蛋白;取1-10μl的抗体,加入到准备好磁珠重悬液的EP管中,4℃旋转、孵育1h;将磁珠抗体复合物从溶液中分离出来,吸去上清,清洗磁珠抗体复合物,制成磁珠抗体重悬液;
S3. 免疫共沉淀样品制备:将S1获得的蛋白核酸复合物的小片段中加入S2获得的磁珠重悬液中,4℃旋转1h,去除非特异性蛋白,收集上清;将上清加入所述磁珠抗体复合物的重悬液中,轻轻重悬,4℃旋转、孵育2h,使抗原与磁珠抗体复合物结合;用500μl的洗涤缓冲液清洗磁珠抗原抗体复合物两次,每次3min,清洗后分离,移去上清,再重悬;最后将磁珠抗原抗体复合物重悬于50μl dd H2O中,取1-2μl用于后续检测。
优选地,所述步骤S3中第一次清洗磁珠抗原抗体复合物的洗涤缓冲液包括:50 mMHEPES-KOH,pH 7.5;140 mM NaCl;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100。优选地,所述步骤S3中第二次清洗磁珠抗原抗体复合物的洗涤缓冲液包括:39 mM NaH2PO4·H2O;32.3 mMNa2HPO4·7 H2O;154 mM NaCl,pH7.0。
本发明优化了洗脱缓冲液的配方,洗脱方法简单,蛋白质与DNA富集信号较强,大大提高了检测的灵敏度。
优选地,所述步骤S1包括:向细胞培养皿中加入甲醛进行交联,甲醛的终浓度为1%,37℃孵育10min,终止交联,用4℃的PBS洗细胞2~3次,最后一次吸干PBS;加入500μl预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液,冰上裂解30min;用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下,将裂解液收集到1.5ml EP管中,超声破碎,获得蛋白核酸复合物的小片段。
作为一种更优选的实施方式,所述染色质免疫共沉淀(ChIP)样品快速制备方法包括如下步骤:
S1. 细胞裂解,获得蛋白核酸复合物的小片段:向细胞培养皿中加入甲醛进行交联,甲醛的终浓度为1%,37℃孵育10min,终止交联,用4℃的PBS洗细胞2~3次,最后一次吸干PBS;加入500μl预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液,冰上裂解30min;用预冷的细胞刮将细胞刮下,将裂解液收集到1.5ml EP管中,超声破碎,获得蛋白核酸复合物的小片段;
S2. 准备磁珠,磁珠结合抗体:将磁珠完全重悬,吸取10μl磁珠到一个EP管中,将EP管放在磁力架上,将磁珠从溶液中分离出来,吸去上清,用500μl预冷的裂解缓冲液清洗磁珠三次,每次都用磁力架将磁珠分离出来,最后将EP管从磁力架上取下,制成磁珠重悬液,每个EP管中加入10μl磁珠重悬液,准备两份磁珠重悬液,一份结合抗体,一份去除非特异性蛋白;取1-10μl的抗体,加入到准备好磁珠重悬液的EP管中,4℃旋转、孵育1h;将磁珠抗体复合物从溶液中分离出来,吸去上清,用1000μl冷的裂解缓冲液清洗磁珠抗体复合物三次,最后一次吸尽上清,再加入25μl裂解缓冲液制成磁珠抗体重悬液;
S3. 免疫共沉淀样品制备:将S1获得的蛋白核酸复合物的小片段中加入S2获得的磁珠重悬液中,4℃旋转1h,去除非特异性蛋白,将EP管放在磁力架上,收集上清;将上清加入所述磁珠抗体复合物的重悬液中,轻轻重悬,4℃旋转、孵育2h,使抗原与磁珠抗体复合物结合,将EP管置于磁力架上,转移上清到一个新的EP管中,以备需要时进一步分析;用500μl的洗涤缓冲液清洗磁珠抗原抗体复合物两次,室温、每次3min,第一次用FA-140洗涤缓冲液(包括:50 mM HEPES-KOH,pH 7.5;140 mM NaCl;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100)洗涤,第二次用1xBuffer(包括:39 mM NaH2PO4·H2O;32.3 mM Na2HPO4·7 H2O;154 mM NaCl,pH7.0)洗涤,每次清洗后在磁力架上分离,移去上清,再重悬复合物;最后将磁珠抗原抗体复合物重悬于50μl dd H2O中,取1-2μl用于后续检测。
与现有技术相比,本发明有益效果在于:本发明制备得到样品为磁珠结合的核酸片段,可直接用于PCR检测或者扩增DNA、构建DNA文库。本发明方法不仅大大节约了时间,同时还避免了由于过多洗脱步骤造成的某些蛋白质与DNA富集信号较弱的缺陷,大大提高了检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明方法与常规方法制备ChIP样品的灵敏度比较;图中,WT: 负对照,P: 启动子;5: 5’编码区末端;3: 3’编码区末端;左图为本发明方法,右图为常规方法。
图2为本发明方法验证H3K4me3的ChIP结果;图中,1:ACT7基因的启动子区,2:ACT7基因5’编码区末端,3: ACT7基因3’编码区末端,4: ACT7基因的3’非编码区。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种染色质免疫共沉淀(ChIP)样品快速制备方法。
细胞原料:培养好的293T细胞;抗体原料:组蛋白H3抗体、H3K4me3抗体或Flag抗体;
实验包括如下步骤:
S1. 细胞裂解,获得蛋白核酸复合物的小片段:向细胞培养皿中加入甲醛进行交联,甲醛的终浓度为1%,37℃孵育10min,终止交联,用4℃的PBS洗细胞2~3次,最后一次吸干PBS;加入500μl预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液,冰上裂解30min;用预冷的细胞刮将细胞刮下,将裂解液收集到1.5ml EP管中,超声破碎,获得蛋白核酸复合物的小片段;
S2. 准备磁珠,磁珠结合抗体:将磁珠完全重悬,吸取10μl磁珠到一个EP管中,将EP管放在磁力架上,将磁珠从溶液中分离出来,吸去上清,用500μl预冷的裂解缓冲液清洗磁珠三次,每次都用磁力架将磁珠分离出来,最后将EP管从磁力架上取下,制成磁珠重悬液,每个EP管中加入10μl磁珠重悬液,准备两份磁珠重悬液,一份结合抗体,一份去除非特异性蛋白;取1-10μl的抗体,加入到准备好磁珠重悬液的EP管中,4℃旋转、孵育1h;将磁珠抗体复合物从溶液中分离出来,吸去上清,用1000μl冷的裂解缓冲液清洗磁珠抗体复合物三次,最后一次吸尽上清,再加入25μl裂解缓冲液制成磁珠抗体重悬液;
S3. 免疫共沉淀样品制备:将S1获得的蛋白核酸复合物的小片段中加入S2获得的磁珠重悬液中,4℃旋转1h,去除非特异性蛋白,将EP管放在磁力架上,收集上清;将上清加入所述磁珠抗体复合物的重悬液中,轻轻重悬,4℃旋转、孵育2h,使抗原与磁珠抗体复合物结合,将EP管置于磁力架上,转移上清到一个新的EP管中,以备需要时进一步分析;用500μl的洗涤缓冲液清洗磁珠抗原抗体复合物两次,室温、每次3min,第一次用FA-140洗涤缓冲液(包括:50 mM HEPES-KOH,pH 7.5;140 mM NaCl;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100)洗涤,第二次用1xBuffer(包括:39 mM NaH2PO4·H2O;32.3 mM Na2HPO4·7 H2O;154 mM NaCl,pH7.0)洗涤,每次清洗后在磁力架上分离,移去上清,再重悬复合物;最后将磁珠抗原抗体复合物重悬于50μl dd H2O中,取1-2μl用于后续检测。
将按照上述方法制备得到的样品与常规方法制备得到的样品检测的灵敏度进行比较,具体比较了KDM2在PKM基因不同区域的相对富集程度,结果如图1所示。KDM2是一个转录调控因子,已知与染色质结合,从图1可以看出,本发明方法与现有的常规方法相比,无需分离磁珠,洗脱步骤较少,节省时间,蛋白质和DNA富集信号强,灵敏度数据明显提升,且少量的磁珠不会对后续的PCR鉴定和DNA片段扩增产生影响。
图2为用本发明方法验证H3K4me3的ChIP结果,具体为H3K4me3在ACT7基因不同区域的相对富集数据。图2显示,利用本发明方法进行H3K4me3在ACT7基因不同区域的ChIP实验,证明H3K4me3只在5’编码区末端高度富集,而在其他区域没有明显富集。结果与传统方法的结果吻合,证明本发明方法的有效性,但相比传统方法大大节约实验时间。
综上所述,本发明染色质免疫共沉淀(ChIP)样品的制备方法具有快速、灵敏度高的优点。本发明突破了现有技术中必须洗脱磁珠的惯性思维,利用少量磁珠结合抗体,进而固定抗原DNA复合物,磁珠上偶联了足够的DNA片段可直接用于后续PCR扩增或者定量PCR检测;磁珠不需要与制得的复合物分离,不影响后续实验。样品制备时间明显缩短,同时还避免了由于过多洗脱步骤造成的某些蛋白质与DNA富集信号较弱的缺陷,大大提高了检测的灵敏度,且对后续的PCR鉴定和DNA片段扩增不会产生任何不良影响。
申请人声明,本发明通过上述实例来说明的具体所用仪器以及方法,但本发明并不局限于上述具体所用仪器及方法,即不意味着本发明必须依赖上述具体所用仪器以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的实施,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,包括:对细胞进行甲醛交联,固定蛋白与核酸的复合物,将蛋白核酸复合物抽提出来,再将染色质片段通过超声或酶解打断成小片段;将抗体挂到固相支持物磁珠上,再将获得的小片段加到制好的磁珠上孵育,获得磁珠抗原抗体复合物,孵育完成后将未结合物质洗去,其特征在于,对磁珠抗原抗体复合物进行重悬,获得待检测的磁珠抗原抗体复合物样品;所述磁珠的初始添加量≤10μl。
2.根据权利要求1所述的染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,其特征在于,所述磁珠的初始添加量为10μl,所述抗体的初始添加量为1-10μl。
3.根据权利要求1所述的染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1. 细胞裂解,获得蛋白核酸复合物的小片段;
S2. 准备磁珠,磁珠结合抗体:将磁珠完全重悬,制成磁珠重悬液,每个EP管中加入10μl磁珠重悬液,准备两份磁珠重悬液,一份结合抗体,一份去除非特异性蛋白;取1-10μl的抗体,加入到准备好磁珠重悬液的EP管中,4℃旋转、孵育1h;将磁珠抗体复合物从溶液中分离出来,吸去上清,清洗磁珠抗体复合物,制成磁珠抗体重悬液;
S3. 免疫共沉淀样品制备:将S1获得的蛋白核酸复合物的小片段中加入S2获得的磁珠重悬液中,4℃旋转1h,去除非特异性蛋白,收集上清;将上清加入所述磁珠抗体复合物的重悬液中,轻轻重悬,4℃旋转、孵育2h,使抗原与磁珠抗体复合物结合;用500μl的洗涤缓冲液清洗磁珠抗原抗体复合物两次,每次3min,清洗后分离,移去上清,再重悬;最后将磁珠抗原抗体复合物重悬于50μl dd H2O中,取1-2μl用于后续检测。
4. 根据权利要求3所述的染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,其特征在于,步骤S3中第一次清洗磁珠抗原抗体复合物的洗涤缓冲液包括:50 mM HEPES-KOH,pH 7.5;140 mMNaCl;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100。
5. 根据权利要求3所述的染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,其特征在于,步骤S3中第二次清洗磁珠抗原抗体复合物的洗涤缓冲液包括:39 mM NaH2PO4·H2O;32.3 mMNa2HPO4·7 H2O;154 mM NaCl,pH7.0。
6. 根据权利要求3所述的染色质免疫共沉淀样品快速制备方法,其特征在于,步骤S1包括:向细胞培养皿中加入甲醛进行交联,甲醛的终浓度为1%,37℃孵育10min,终止交联,用4℃的PBS洗细胞2~3次,最后一次吸干PBS;加入500μl预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液,冰上裂解30min;用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下,将裂解液收集到1.5mlEP管中,超声破碎,获得蛋白核酸复合物的小片段。
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