CN117660443B - 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 - Google Patents
一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117660443B CN117660443B CN202311700609.5A CN202311700609A CN117660443B CN 117660443 B CN117660443 B CN 117660443B CN 202311700609 A CN202311700609 A CN 202311700609A CN 117660443 B CN117660443 B CN 117660443B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- centrifuge tube
- liquid
- placing
- dna
- extraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 title claims abstract description 27
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 51
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 32
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 16
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims abstract description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 8
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 6
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 8
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 8
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 7
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 abstract description 6
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 abstract 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 9
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 9
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 9
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical class N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- -1 polymerases Proteins 0.000 description 4
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 3
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 235000009048 phenolic acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000007965 phenolic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000013574 canned fruits Nutrition 0.000 description 1
- 201000011529 cardiovascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 235000011869 dried fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 235000006486 human diet Nutrition 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，涉及分子生物学技术领域，所述浆果果实基因组DNA高质量提取方法包括以下步骤：将新鲜或冷冻浆果果实样品置于研钵内，加入提前准备的PVP10并进行研磨，研磨结束后收集至离心管中备用；向离心管中加入分离液，先震荡混匀1mi n，再冰上放置10mi n，最后放入4℃冷冻离心机中，8000rpm离心5mi n；吸去离心管中的上清液体，并向底部沉淀中加入56℃预热的裂解液16m l，再振荡混匀1mi n，56℃水浴锅孵育30mi n；利用分离液有效去除浆果中多糖、多酚等杂质对于基因组DNA干扰，提高DNA的纯度，改良版的裂解液能够充分裂解浆果植物细胞，用氯仿、无水乙醇和醋酸钾过滤掉多余蛋白成分，得到的基因组DNA纯度高，DNA完整性更好。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地说，它涉及一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法。
背景技术
浆果与减轻或预防疾病有关，占人类饮食中消耗的水果的很大一部分。浆果也广泛用于加工和衍生产品，包括干果和罐头水果，酸奶，饮料，果酱和果冻，以及新鲜和冷冻水果。已经充分证明，浆果含有抗氧化和抗炎多酚，如花青素和酚酸，它们在衰老以及预防和治疗心血管疾病和癌症中起着重要作用。因此，浆果作为一种重要果实，经常会进行分子生物学、生物医学相关的研究，也就有着相当多提取基因组DNA的需要。提取DNA的产量、质量和提取时间，对实验的准确性和可靠性有着较大的影响。完整、高分子量基因组DNA提取技术对于许多分子生物学应用至关重要，包括长PCR、限制性酶切、Southern印迹分析和基因组文库构建。
目前植物提取一般采用通用的提取方法例如CTAB法和SDS法等。但是由于不同植物的材料组分各异，而植物其自身所含的多糖、蛋白质和酚类物质也各有不同，相同的物质浓度也会出现偏差，就使这些模式植物的DNA提取方法对不同植物DNA的提取并没有达到预期效果。相同的提取方法并不适合所有的植物，不同的植物最适合的提取方法也不同。传统的这些方法没有针对特定的提取样品，所以导致对浆果果实的提取效率不高。
大多数浆果如葡萄、草莓、猕猴桃等富含许多植物化学物质、纤维、维生素和矿物质，浆果果实中富含大量的多糖类和酚类化合物，并且在成熟时会有大量的水分。多糖是DNA提取过程中的主要干扰物，多糖常与DNA共沉淀，使其具有粘性；以这种形式，它们还会干扰生物酶的活性，如聚合酶、连接酶和限制性内切酶。而多酚类物质，如类黄酮、单宁和酚酸，在植物界广泛存在，当它们与核酸结合时，不能通过传统的提取方式去除而导致基因组DNA降解。
为了解决浆果果实多糖多酚污染、水分含量多等问题，本发明提供了一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，所述浆果果实基因组DNA高质量提取方法包括以下步骤：
S1：将15g新鲜或冷冻浆果果实样品置于研钵内，加入提前准备的20mgPVP10并进行研磨，研磨时间2—3min，研磨结束后收集至50ml离心管中备用；
S2：向离心管中加入20ml分离液，先震荡混匀1min，再冰上放置10min，最后放入4℃冷冻离心机中，8000rpm离心5min；
S3：吸去离心管中的上清液体，并向底部沉淀中加入56℃预热的裂解液16ml，再振荡混匀1min，56℃水浴锅孵育30min，孵育期间手摇震荡几次；
S4：向离心管加入除杂液A，并置于多管涡旋混匀仪震荡15min，再1200rpm离心10min；
S5：转移上清液到新的50ml离心管中，向上清液中加入5ul Rnase酶震荡混匀，静置5min，加入等体积的除杂液B抽提，震荡混匀后，1200rpm离心10min，抽提后的上清液转入新的50ml离心管中，重复此步骤一次；
S6：向转入新50ml离心管中的上清液内加入0.8倍体积提前预冷的异丙醇，放置于-20℃15min，让DNA沉淀析出；
S7：移去上清液，用漂洗液漂洗两次，离心后干燥5min；
S8：加入60ul洗脱液溶解，56℃水浴10min；
S9：溶解的DNA-20℃保存。
本申请再进一步的技术方案：所述分离液包括2％—4％PVP、0.1M—0.5MTris-HCl、5％—10％PEG8000和0.5％—3％巯基乙醇，pH为7—8。
本申请再进一步的技术方案：所述裂解液包括0.1M—0.5MTris-HCl、10—100mMEDTA、0.3M—1M氯化钠、2％—3％CTAB和0.5％—3％巯基乙醇，pH为6—7。
本申请再进一步的技术方案：所述除杂液A包括5M醋酸钾、异丙醇和氯仿。
本申请再进一步的技术方案：所述Rnase酶的浓度为10mg/ml。
本申请再进一步的技术方案：所述除杂液B包括24：1氯仿-异戊醇。
本申请再进一步的技术方案：所述漂洗液包括80％乙醇。
本申请再进一步的技术方案：所述洗脱液为无酶水和TE缓冲液中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
1、本发明通过冷冻葡萄果实，液氮结合PVP10研磨解决了葡萄等浆果在提取过程中的氧化问题，并通过测试发现PVP10优于PVP40，后者有可能与核酸一起沉淀，从而成为污染物；
2、本发明操作简单，能够有效处理富含多糖多酚、含水量高的葡萄等浆果果实；
3、本发明的DNA提取方法重复性高、实验结果稳定、琼脂糖电泳条带清晰，为下游PCR等酶促反应奠定基础；
4、本发明对分离液、裂解液和漂洗液的组分进行了优化，分离液中加入PVP这种强还原剂可以避免DNA链与多酚结合，去除酚类化合物，通过后续抽提获得高质量、高纯度DNA；裂解液中测试CTAB最佳浓度，除杂液测试了醋酸钾和乙酸钠等试剂，筛选醋酸钾、乙酸钠和氯仿最佳配比，结合酚氯仿抽提从而最大程度降低蛋白质污染、减少多糖和色素杂质，提高提取核酸总量、纯度。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例的葡萄果肉基因组DNA凝胶电泳检测图；
图2为本发明实施例的研磨过程中不同PVP分子量测试实验的凝胶电泳检测图；
图3为本发明实施例的除杂液A提取测试实验的凝胶电泳检测图；
图4为本发明实施例的裂解液组分测试实验的凝胶电泳检测图。
图1中编号1-2泳道为实施例1提取基因组DNA检测结果；编号3-4泳道和5-6泳道分别为实施例2(竞品)货号DP342-T1和DP305-03提取基因组DNA检测结果；
图2中编号1-9泳道为研磨过程中加入PVP10的提取基因组DNA检测结果；10-17泳道为研磨过程中加入PVP40的提取基因组DNA检测结果；
图3中A泳道是除杂液A为l.6ml的3M乙酸钠、l.6ml的异丙醇、16ml氯仿(乙酸钠：异丙醇：氯仿＝1：1：10)的提取基因组DNA检测结果；
B是除杂液A为l.6ml的饱和乙酸铵、l.6ml的无水乙醇、16ml氯仿(饱和乙酸铵：无水乙醇：氯仿＝1：1：5)的提取基因组DNA检测结果；
C是除杂液A为l.6ml的5M醋酸钾、l.6ml的异丙醇、16ml氯仿(醋酸钾：无水乙醇：氯仿＝1：1：5)的提取基因组DNA检测结果；
图4中D泳道裂解液组分为0.5MTris-HCl、100mMEDTA、2％CTAB、0.4M氯化钠和2％巯基乙醇；
E泳道裂解液组分为0.5MTris-HCl、100mMEDTA、3％CTAB、0.4M氯化钠和0.5％巯基乙醇。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例的描述中，需要说明的是，若出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1：
一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，所述浆果果实基因组DNA高质量提取方法包括以下步骤：
S1：将15g葡萄果肉样品置于研钵内，加入提前准备的20mgPVP10并进行研磨，研磨时间2—3min，研磨结束后收集至50ml离心管中备用；
S2：向离心管中加入20ml分离液，先震荡混匀1min，再冰上放置10min，最后放入4℃冷冻离心机中，8000rpm离心5min；
S3：吸去离心管中的上清液体，并向底部沉淀中加入56℃预热的裂解液16ml，再振荡混匀1min，56℃水浴锅孵育30min，孵育期间手摇震荡几次；
S4：向离心管加入除杂液A，并置于多管涡旋混匀仪震荡15min，再1200rpm离心10min；
S5：转移上清液到新的50ml离心管中，向上清液中加入5ul Rnase酶(浓度为10mg/ml)震荡混匀，静置5min，加入等体积的除杂液B(24：1氯仿-异戊醇)抽提，震荡混匀后，1200rpm离心10min，抽提后的上清液转入新的50ml离心管中，重复此步骤一次；
S6：向转入新50ml离心管中的上清液内加入0.8倍体积提前预冷的异丙醇，放置于-20℃15min，让DNA沉淀析出；
S7：移去上清液，用漂洗液(80％乙醇)漂洗两次，离心后干燥5min；
S8：加入60ul洗脱液(无酶水或TE缓冲液)溶解，56℃水浴10min；
S9：溶解的DNA-20℃保存。
注：
S2中分离液的组成：2％PVP、0.5MTris-HCl、6％PEG8000和2％巯基乙醇，pH为7—8；
S3中裂解液的组成：0.5MTris-HCl、100mMEDTA、2％CTAB、0.4M氯化钠和2％巯基乙醇；
S4中除杂液A的组成：l.6ml的5M醋酸钾、l.6ml的异丙醇和16ml氯仿。
实施例2：本实施例使用商业植物提取试剂盒提取葡萄基因组DNA
按照商业提取试剂盒的操作步骤进行提取，所用商业试剂盒为天根生化科技有限公司生产的货号为DP342-T1、DP305-03两款试剂盒；
将实施例1和实施例2所提取的葡萄果肉基因组DNA利用琼脂糖凝胶电泳检测，DNAMarker上样量为2ul，DNA分子标尺(DNA Marker)为Takara的DL15000，货号是3582A；提取的葡萄果肉基因组DNA的上样量均为5ul上样缓冲液加1ul样品；检测结果见图1，并用紫外分光光度计(Nanodrop)和Qubit荧光计对上述总DNA进行质检，检测结果见表1；
表1紫外分光光度计和Qubit检测结果
注：表1中编号1-2泳道为实施例1提取基因组DNA检测结果；编号3-4和5-6泳道分为实施例2(竞品)货号DP342-T1和DP305-03提取基因组DNA检测结果；
提取基因组DNA检测结果计算总量所参考的浓度为Qubit测得浓度；
从表1可以看出，无论是从紫外分光光度计定量结果，还是Qubit定量结果来看，此方法提取葡萄果肉DNA含量比两款商业提取试剂盒提取的总DNA含量要高，此外该方法的OD260/280、OD260/230值比商业提取试剂盒略高；
从图1中可以看出，商业提取试剂盒提取的基因组DNA的电泳条带宽度相较于此方法提取的基因组DNA的电泳条带要窄要暗，由此可以看出此方法提取的葡萄果肉基因组DNA浓度更高、总量更多。
实施例3：本实施例使用不同PVP分子量测试实验
(1)实验材料：葡萄果肉；
(2)实验方法：控制变量(调整PVP分子量，保证其他条件不变)；
(3)实验条件：
①研磨条件：分别测试研磨过程加入PVP10和PVP40对提取影响；
②分离液：2％PVP、0.5MTris-HCl、6％PEG8000和2％巯基乙醇，pH为7—8；
③裂解液：0.5M Tris-HCl、100mMEDTA、3％CTAB、0.4M氯化钠和2％巯基乙醇；
④除杂液A：异丙醇、氯仿、5M醋酸钾；
⑤除杂液B：24：1氯仿-异戊醇；
⑥漂洗液：80％乙醇；
⑦洗脱液为TE缓冲液；
(4)实验步骤：同实施例1；
(5)实验结果：提取核酸样品的质检定量，检测步骤同实施例2，结果见表2及图2；
表2不同PVP分子量测试实验结果
根据Qubit定量结果(表2)来看，在研磨过程中加上PVP10的提取效果要比PVP40的提取效果要好；OD260/280、OD260/230略优，根据胶图结果(图2)来看，加入PVP10的提取核酸样品的条带亮度要略大于加入PVP40提取的核酸样品，加入PVP40提取的核酸样品有些许降解，由此可证明PVP10分子量提取核酸样品总量略大于PVP40分子量提取的核酸样品，并且几乎没有降解。
实施例4：本实施例进行除杂液A组分测试实验
(1)实验材料：葡萄果肉；
(2)实验类型：控制变量(调整除杂液A单一试剂组分，保证其他条件不变)；
(3)实验条件：
①研磨条件：PVP10、液氮研磨；
②分离液：2％PVP、0.5MTris-HCl、6％PEG8000和2％巯基乙醇，pH为7—8；
③裂解液：0.5M Tris-HCl、100mMEDTA、3％CTAB、0.4M氯化钠和2％巯基乙醇；
④除杂液A：分为三组，A组为l.6ml 3M乙酸钠、l.6ml异丙醇和16ml氯仿(乙酸钠：异丙醇：氯仿＝1：1：10)；B组为l.6ml饱和乙酸铵、l.6ml的异丙醇和16ml氯仿(饱和乙酸铵：异丙醇：氯仿＝1：1：10)；C组为l.6ml 5M醋酸钾、l.6ml的异丙醇和16ml氯仿(醋酸钾：异丙醇：氯仿＝1：1：10)；
⑤除杂液B：24：1氯仿-异戊醇；
⑥漂洗液：80％乙醇；
⑦洗脱液为TE缓冲液；
(4)实验步骤：同实施例1；
(5)实验结果：提取核酸样品的质检定量，检测步骤同实施例2，结果见表3及图3；
表3除杂液A提取测试实验结果
如表3及图3所示，根据A1-4、B1-4和C1-4Qubit的实验结果来看，除杂液A中加入5M醋酸钾相比于乙酸钠、饱和乙酸铵会提高提取核酸的浓度和总量；根据A1-4、B1-4、C1-4泳道结果显示5M醋酸钾提取效果要比乙酸钠、饱和乙酸铵提取效果要更好，条带更亮一些，因此采用5M醋酸钾作为除杂液组分之一。
实施例5：本实施例进行裂解液组分测试
(1)实验材料：葡萄果肉；
(2)实验条件：
①研磨条件：PVP10、液氮研磨；
②分离液：2％PVP、0.5MTris-HCl、6％PEG8000和2％巯基乙醇，pH为7—8；
③裂解液：分为两组，分别为0.5M Tris-HCl、100mMEDTA、2％CTAB、0.4M氯化钠和2％巯基乙醇(D1-4组)；0.5M Tris-HCl、100mMEDTA、3％CTAB、0.4M氯化钠和0.5％巯基乙醇(E1-4组)；
④除杂液A：l.6ml 5M醋酸钾、l.6ml异丙醇和16ml氯仿(醋酸钾：异丙醇：氯仿＝1：1：10)；
⑤除杂液B：24：1氯仿-异戊醇；
⑥漂洗液：80％乙醇；
⑦洗脱液为TE缓冲液；
(4)实验步骤：同实施例1；
(5)实验结果：提取核酸样品的质检定量，检测步骤同实施例2，结果见表4及图4；
表4裂解液组分测试实验结果
根据Qubit定量结果(表4)来看，加入2％CTAB、2％巯基乙醇作为裂解液组分提取浓度高于3％CTAB、0.5％巯基乙醇提取，根据胶图结果(图4)来看，D泳道裂解液组分提取核酸样品的条带宽度要略大于E泳道提取的核酸样品，由此可证明0.5M Tris-HCl、100mMEDTA、2％CTAB、0.4M氯化钠、2％巯基乙醇作为裂解液组分提取核酸样品浓度总量较优，没有降解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，其特征在于，所述浆果果实基因组DNA高质量提取方法包括以下步骤：
S1：将15g新鲜或冷冻浆果果实样品置于研钵内，加入提前准备的20mg PVP10并进行研磨，研磨时间2—3min，研磨结束后收集至50ml离心管中备用；
S2：向离心管中加入20ml分离液，先震荡混匀1min，再冰上放置10min，最后放入4℃冷冻离心机中，8000rpm离心5min；
所述分离液的组分为2%—4%PVP、0.1M—0.5MTris-HCl、5%—10%PEG8000和0.5%—3%巯基乙醇，pH为7—8；
S3：吸去离心管中的上清液体，并向底部沉淀中加入56℃预热的裂解液16ml，再振荡混匀1min，56℃水浴锅孵育30min，孵育期间手摇震荡几次；
所述裂解液的组分为0.1M—0.5MTris-HCl、10—100mMEDTA、0.3M—1M氯化钠、2%—3%CTAB和0.5%—3%巯基乙醇，pH为6—7；
S4：向离心管加入除杂液A，并置于多管涡旋混匀仪震荡15min，再1200rpm离心10min；
所述除杂液A的组分为一份5M醋酸钾、一份异丙醇和十份氯仿；
S5：转移上清液到新的50ml离心管中，向上清液中加入5ul Rnase酶震荡混匀，静置5min，加入等体积的除杂液B抽提，震荡混匀后，1200rpm离心10min，抽提后的上清液转入新的50ml离心管中，重复此步骤一次；
所述除杂液B的组分为24：1氯仿-异戊醇；
S6：向转入新50ml离心管中的上清液内加入0.8倍体积提前预冷的异丙醇，放置于-20℃15min，让DNA沉淀析出；
S7：移去上清液，用漂洗液漂洗两次，离心后干燥5min；
S8：加入60ul洗脱液溶解，56℃水浴10min；
S9：溶解的DNA-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，其特征在于：所述Rnase酶的浓度为10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，其特征在于：所述漂洗液的组分为80%乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种浆果果实基因组DNA高质量提取方法，其特征在于：所述洗脱液的组分为TE缓冲液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311700609.5A CN117660443B (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311700609.5A CN117660443B (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117660443A CN117660443A (zh) | 2024-03-08 |
| CN117660443B true CN117660443B (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=90078611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311700609.5A Active CN117660443B (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117660443B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805071A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-07-29 | 浙江省农业科学院 | 一种草莓基因组dna的提取方法 |
| CN105368815A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-03-02 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 多糖多酚植物基因组的提取方法 |
| CN105505917A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种高质量果实基因组dna的提取方法及提取试剂盒 |
| AU2020102458A4 (en) * | 2020-09-28 | 2020-11-12 | Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry | Method for extracting high-quality dna from idesia polycarpa |
| CN113549615A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-10-26 | 浙江大学 | 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 |
| CN116254259A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-06-13 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种植物基因组dna提取试剂盒及其提取方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1529840A1 (en) * | 2003-11-04 | 2005-05-11 | Qiagen GmbH | A rapid and low cost method for isolating nucleic acid |
-
2023
- 2023-12-11 CN CN202311700609.5A patent/CN117660443B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805071A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-07-29 | 浙江省农业科学院 | 一种草莓基因组dna的提取方法 |
| CN105368815A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-03-02 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 多糖多酚植物基因组的提取方法 |
| CN105505917A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种高质量果实基因组dna的提取方法及提取试剂盒 |
| AU2020102458A4 (en) * | 2020-09-28 | 2020-11-12 | Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry | Method for extracting high-quality dna from idesia polycarpa |
| CN113549615A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-10-26 | 浙江大学 | 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 |
| CN116254259A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-06-13 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种植物基因组dna提取试剂盒及其提取方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A Simple and Rapid Method for Isolation of High Quality Genomic DNA from Fruit Trees and Conifers Using PVP;C.S.Kim等;Nucleic Acids Research;19970301;第25卷(第5期);1085–1086 * |
| Isolation and Amplification of Genomic DNA from Recalcitrant Dried Berries of Black Pepper (Piper nigrum L.)—A Medicinal Spice;K. Dhanya等;Mol Biotechnol;20070713;165-168 * |
| 一种高质量葡萄基因组DNA提取方法;徐美隆 等;北方园艺;20110815(15);全文 * |
| 越橘果实总RNA提取方法比较研究;裴嘉博 等;东北农业大学学报;20121025(10);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117660443A (zh) | 2024-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Flamini | Recent applications of mass spectrometry in the study of grape and wine polyphenols | |
| CN108060159B (zh) | 一种富含多糖多酚植物的dna提取方法 | |
| Işçi et al. | Evaluation of methods for DNA extraction from must and wine | |
| CN107418952A (zh) | 一种土壤微生物宏基因组dna的提取方法及相应的试剂盒 | |
| Wulan et al. | Comparison of two commercial DNA extraction kit to obtain high quality porcine DNA | |
| CN117660443B (zh) | 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 | |
| US20040224344A1 (en) | Methods and compositions to extract DNA, RNA and protein simultaneously from biological samples | |
| HUT70980A (en) | Dna isolation method | |
| CN116254259A (zh) | 一种植物基因组dna提取试剂盒及其提取方法 | |
| CN114264741B (zh) | 一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法 | |
| Rumbaugh et al. | Grapevine red blotch virus alters grape skin cell‐wall composition impacting phenolic extractability during winemaking | |
| CN113549615B (zh) | 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 | |
| Drábek et al. | Quantification of DNA during winemaking by fluorimetry and Vitis vinifera L.-specific quantitative PCR | |
| Onache et al. | Comparison of some DNA extraction methods from monovarietal must and wines | |
| CN111778237B (zh) | 一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系 | |
| CN112646806A (zh) | 一种土壤dna快速提取方法及试剂盒 | |
| Majidi et al. | Isolation of high-quality RNA from a wide range of woody plants | |
| CN105779442B (zh) | 一种天然纤维素利用菌群的宏转录组rna的提取方法 | |
| Randles et al. | Changes in polysomes in Nicotiana glutinosa L. leaves infected with lettuce necrotic yellows virus | |
| CN113832143B (zh) | 一种蓝果忍冬dna的提取方法 | |
| CN115058415B (zh) | 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 | |
| CN114507709B (zh) | 一种用于保护血液中游离dna的保护剂 | |
| CN104293770A (zh) | 一种快速提取土壤微生物rna的试剂盒及方法 | |
| CN110964719A (zh) | 一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法 | |
| CN107523565A (zh) | 基于纳米磁珠的多酚类植物rna的简化提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |