CN113549615A - 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 - Google Patents

一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113549615A
CN113549615A CN202111004931.5A CN202111004931A CN113549615A CN 113549615 A CN113549615 A CN 113549615A CN 202111004931 A CN202111004931 A CN 202111004931A CN 113549615 A CN113549615 A CN 113549615A
Authority
CN
China
Prior art keywords
column
supernatant
solution
strawberry
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111004931.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113549615B (zh
Inventor
罗自生
陈彦培
徐艳群
李栋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202111004931.5A priority Critical patent/CN113549615B/zh
Publication of CN113549615A publication Critical patent/CN113549615A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113549615B publication Critical patent/CN113549615B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，包括以下步骤：将草莓果实样品加入液氮研磨成粉末，加入特制的分离液进行预除杂；除去分离液并加入裂解提取液后离心取上清液；在上清液中加入烷醇混合液离心后继续取上清液；将上清液与特制的过柱缓冲液以及等体积的预冷后的异丙醇，混匀后得过柱液；将过柱液过DNA吸附柱后，洗涤后进行精准干燥，最终得到高质量草莓基因组DNA。本发明通过优化多糖多酚分离液配方，研制独特的过柱缓冲体系以及调试精准的干燥工艺来实现高质量草莓基因组DNA的分离提取。

Description

一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法。
背景技术
草莓是蔷薇科草莓属植物，其果实由花托发育而成，色泽鲜艳，具有独特质地和香气的同时也有着较高营养价值，是深受消费者喜爱的一种时令水果，也是我国重要的经济作物。另一方面，典型的非呼吸跃变发育模式以及染色体多倍性使栽培草莓具有巨大的学术研究价值。得到高质量的基因组DNA是大部分分子生物学研究的前提和关键步骤，然而草莓的特殊性在于其果实中含有极其丰富的多糖、多酚、维生素等次级代谢物，易与核酸结合，给基因组DNA的提取、分离、纯化带来了极大的困难；而今高通量测序技术的快速发展和第三代测序技术的涌现也对基因组质量提出了更高要求。
目前，植物基因组DNA的提取方法一般有CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(十二烷基苯磺酸钠)法和吸附柱法，以及基于此的一系列试剂盒方法。对于常规植物的叶片组织，上述提取方法可以获得质量较高的基因组DNA。但是对于草莓果实，应用CTAB以及SDS法，专利申请人所在单位进行的大量实验结果仍然显示获得的基因组DNA溶液有不同程度的粘度异常、呈色褐化等问题；而应用各个厂商生产的富含多糖多酚植物专用试剂盒所得结果表明，获得的基因组浓度低且片段完整性差，均无法满足下游的实验要求。
更进一步地，对于多糖多酚含量极高的草莓果实，公开号为CN104805071A的中国专利文献公开了一种草莓基因组DNA的提取方法，用液氮将样品磨成粉末，加入CTAB提取液，55～65℃水浴后冷却至室温，加入醋酸钾后冰浴，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心，再在所得上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀、静置、离心分离得上清液；在上清液中加入异丙醇后，离心得沉淀物；离心后去除上清液，加入含RNase的TE缓冲液在37℃水浴，然后加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀、静置、离心分离得上清液，向上清液中加入醋酸钠和无水乙醇后，离心去除上清液，向沉淀中加入TE缓冲液溶解沉淀，即为草莓基因组DNA溶液。公开号为CN105368815B的中国专利文献公开了一种多糖多酚植物基因组的提取方法，步骤为：取植物材料研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇，混匀后置水浴中；离心机中离心后弃上清；加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，离心后弃上清；向沉淀中加入预热的3×CTAB裂解液并混匀，水浴裂解；加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入NaCl和冰异丙醇，混匀，沉淀1～3小时；取出离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即完成提取。以上述两项专利文献为代表的一系列CTAB优化方法所得的DNA溶液，其OD260/230值仍然偏低，琼脂糖凝胶电泳显示条带粘滞于上样孔附近。
公开号为CN107475248B的中国专利文献公开了一种植物基因组DNA快速提取方法，包括以下步骤：(1)取植物组织样品，加入液氮将植物组织样品研磨成粉末，并收集到离心管中；(2)向离心管中加入BufferA，并进行水浴，使植物组织样品与BufferA混匀；(3)向离心管中加入BufferB混匀，并进行离心处理；(4)收集上清液，并向上清液中加入结合液LN充分混匀，得到混合液；(5)向吸附柱中加入平衡液LB，并离心处理后倒掉收集管中的滤液；(6)将步骤(4)中的混合液加入吸附柱中，离心处理后倒掉废液；(7)向吸附柱中加入漂洗液PW，离心后倒掉废液；重复步骤(7)后执行步骤(8)；(8)将吸附柱进行离心，去除剩余液体，并将吸附柱放置在室温环境下；(9)将吸附柱放入干净的离心管中，向吸附柱上的吸附膜的中心滴加洗脱缓冲液EB，在室温下放置后进行离心处理，收集DNA样品。以该专利文献为代表的改良离心柱法所得DNA溶液浓度偏低，OD260/280值偏高，提示基因组发生部分降解。
为了从草莓果实中获得近乎满足所有下游实验要求的高质量基因组，现急需开发出一种可靠、高效的基因组DNA提取方法。
发明内容
针对草莓果实的特殊性，本发明提供了一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，该技术可靠，所得DNA能够满足扩增、二代甚至三代测序等下游生物学实验要求。
本发明的技术方案如下：
一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，包括以下步骤：将草莓果实样品加入液氮研磨成粉末，加入分离液进行预除杂；除去分离液并加入裂解提取液后离心取上清液；在上清液中加入烷醇混合液离心后继续取上清液；将上清液与过柱缓冲液以及等体积的预冷后的异丙醇，混匀后得过柱液；将过柱液过DNA吸附柱后，洗涤后进行干燥，最终得到高质量草莓基因组DNA；
所述的分离液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、0.02mol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、0-15％的PEG8000(聚乙二醇)、1.5-4.5％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、2.5-3.5％的巯基乙醇以及0-5％的甘油(丙三醇)；
所述的过柱缓冲液的组成包括：3-5mol/L的盐酸胍、1-3mol/L的NaCl、0.01-0.1mol/L的磷酸二氢钠以及2-4％的吐温-20；
干燥条件为开盖氮吹2-5分钟后于37℃摇床内100-150rpm温育3-6分钟。
分离液、过柱缓冲液均为水溶液。
本发明通过优化多糖多酚分离液配方，研制独特的过柱缓冲体系以及调试精准的干燥工艺来实现高质量草莓基因组DNA的分离提取。
进一步优选的，一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，包括以下步骤：
(1)将草莓果实样品加入液氮研磨成粉末，并收集到预冷离心管中；
(2)向预冷离心管中加入分离液，并使草莓果实样品与分离液混合均匀，冰浴后进行离心处理，弃去上清液；
(3)再向预冷离心管中加入裂解提取液、巯基乙醇和RNA消化酶，混匀后进行水浴；
(4)向预冷离心管中加入1/2体积的Tris饱和酚以及同样1/2体积的烷醇混合液，充分混匀后进行离心处理，收集上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液转移至新的离心管中，并加入等体积的烷醇混合液以及适量RNA消化酶，混匀后离心处理，取上清液；
(6)将步骤(5)得到的上清液转移至新的离心管中，并加入等体积的过柱缓冲液以及等体积的-15～-25℃预冷后的异丙醇，混匀后得过柱液；将所述的过柱液加入DNA吸附柱中，置于收集管中静置后进行离心处理；
(7)向DNA吸附柱中加入洗涤液，置于收集管中静置后进行离心处理；
(8)将DNA吸附柱置于新的离心管中进行干燥；
(9)向干燥后的DNA吸附柱中加入预热的TE缓冲液，静置后进行离心处理，得到高质量草莓基因组DNA。
步骤(4)中1/2体积的Tris饱和酚是指Tris饱和酚的体积是步骤(3)中混匀后预冷离心管中混合液体积的一半；1/2体积的烷醇混合液是指烷醇混合液的体积是步骤(3)中混匀后预冷离心管中混合液体积的一半。步骤(5)、(6)中等体积是指所添加的溶液的体积与离心管中溶液的体积相等。
步骤(2)的目的是预先分离大部分多糖及多酚类色素杂质并弃去。为得到理想效果，步骤(2)应重复2～5次，直至上清液均一澄清，流动性佳且接近无色，此时说明样品中大部分次级代谢物杂质已被预先去除。
步骤(2)的离心参数优选为3-5℃，7000-10000rpm，5-10min。
本发明的分离液是针对草莓果实的多糖多酚含量极高的特点而特殊设计的：其中Tris-HCl提供缓冲环境，EDTA释放离子抑制DNase活性避免DNA降解，高分子量的PEG易与酚亲和，同时促溶多糖，帮助沉淀核酸，PVP络合多酚将其去除，巯基乙醇则可以保护核酸，也防止多酚氧化使其易于去除，最后甘油起到了很好的稳定溶液体系的效果，使优化配方的分离液各组分充分发挥作用。
优选的，所述的分离液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl、0.02mol/L的EDTA、1-15％的PEG8000、1.5-4.5％的PVP、3％的巯基乙醇以及4-5％的甘油；最优选的，所述的分离液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl、0.02mol/L的EDTA、10％的PEG8000、3％的PVP、3％的巯基乙醇以及5％的甘油。
步骤(3)和(5)的RNA消化酶选用10mg/mL的RNase A，用量为25μL/mL上清液。
优选的，步骤(3)中，水浴温度为60-70℃，水浴时间为20-60min；水浴过程中每5-10min将预冷离心管颠倒混匀一次。
所述的裂解提取液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl、0.05-1mol/L的EDTA、1-1.5mol/L的NaCl(氯化钠)、2-3％的PVP以及2-3％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。
优化后的CTAB裂解提取液能在高盐环境下更加彻底地进一步去除多糖多酚以及蛋白质杂质。
优选的，步骤(4)中的离心参数为15-20℃，12000-13000rpm，10-15min。
优选的，步骤(5)中的离心参数为3-5℃，12000-13000rpm，7-10min。
优选的，步骤(6)和步骤(7)的离心参数为3-5℃，10000-11000rpm，1-2min。
所述的DNA吸附柱可选用商用硅胶基质吸附柱。DNA吸附柱使用前应加入200μL的NaOH(3M)溶液，静置3min后室温13000rpm离心2.5分钟，晾干，以达到吸附膜平衡活化效果。
步骤(6)中离心至收集管中的过柱液重新加入DNA吸附柱中进行吸附，之后进行离心处理；此步骤重复1-2次，可显著提高DNA的最终得率。
本发明所提取的核酸由CTAB体系经由步骤(6)转入吸附柱体系，其中在过柱缓冲液下与吸附膜的结合是关键步骤。本发明独特优化的过柱缓冲液配方引入磷酸氢二钠以提供酸性缓冲环境，在大量实验基础上发现此配方提供的高盐低pH环境以及预冷异丙醇优于乙醇的疏水性和低温能极大地促进核酸与吸附膜的特异性结合，直接提高最终的DNA浓度，而盐酸胍还可进一步去除蛋白杂质。此外，实践证明，本发明所述的过柱缓冲液配方可适配多数商用硅胶基质吸附柱。
最优选的，所述的过柱缓冲液的组成包括：3mol/L的盐酸胍、2mol/L的NaCl、0.05mol/L的磷酸二氢钠以及3％的吐温-20。
优选的，所述的洗涤液组分包括：80％的无水乙醇、0.01-0.02mol/L的NaCl、0.01-0.02mol/L的Tris-HCl以及1-2％的PVP。洗涤液醇溶盐离子的同时进一步除去残余的多糖多酚杂质。
步骤(7)还包括：向DNA吸附柱中加入洗涤液，置于收集管中静置后进行离心处理；再使用80％的乙醇重复洗涤多次。
步骤(8)中的离心参数为3-5℃，12000-14000rpm，2-3分钟。
步骤(8)中所涉及的干燥工艺对最终所得DNA溶液质量有直接影响。干燥不彻底将导致OD260/230过低，盐离子或多糖污染严重，使最终DNA溶液溶有乙醇，严重影响下游生物实验；干燥过度则导致260/280偏高，DNA片段发生降解。与此前传统方法与多数相关专利文献中置于通风橱中或室温晾干的干燥方法相比，本发明提供的精准干燥工艺能很好地平衡所得DNA溶液的纯度与完整性。经过长久试验和摸索，最优选的干燥工艺为：开盖氮吹3分钟后于37℃摇床内100rpm温育5分钟。
优选的，步骤(9)中TE缓冲液应滴加于吸附膜中央，离心至管底的洗脱液应重新加入吸附柱中进行1-2次重复洗脱后再将吸附柱弃去。
与现有的技术方法相比较，本发明具有以下优势并可达到如下有益效果：
通过实施本发明所述的提取方法，综合多种基因组提取方法优点，建立了多维深度除杂体系，能够从次级代谢物丰富且复杂的特殊植物组织中获得高质量的基因组DNA，尤其是草莓果实的基因组DNA。其中所得基因组DNA的“高质量”应从多方面评估(当称取样本0.22g且最终得液50μL时)：
1.基因组DNA浓度：以核酸检测金标准Qubit3.0核酸荧光定量仪检测时浓度可达24ng/μL以上、含量1200ng以上，浓度最高可达28.3ng/μL、含量最高可达1415ng。琼脂糖凝胶电泳条带明亮。
2.基因组DNA纯度：以Nanodrop300仪器测定OD值评估时，OD260/230在1.48至1.93范围内，OD260/280在1.7至1.94范围内。琼脂糖凝胶电泳时上样孔附近无明亮条带黏附，上样孔至基因组条带之间无拖带痕迹或弥散状条带且目的基因组条带呈规整条形，清晰明亮，表明得液几乎无多糖多酚、蛋白、盐离子等杂质污染。
3.基因组完整性：琼脂糖凝胶电泳时出现目的条带位置高于15kb的Marker条带且目的条带下方无任何拖尾痕迹。
4.达到下游生物学实验要求：因不经扩增等过程，第三代Nanopore单分子测序是目前对DNA样品质量要求最高的测序技术。经检验，满足该技术要求的基因组DNA能够顺利高效进行下游生物学实验。本发明所得的草莓基因组DNA经三代测序水平质检结果显示，基因组片段分布合理，三代Nanopore芯片可用孔情况良好，能够满足该技术对DNA样本的质量要求。
附图说明
图1为实施例1、实施例2、实施例3所述序号为A、H、I、J、M、N、O、P、Q、R、U、V的提取方案所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道标号即提取方案序号；
图2为对比例1所述序号为CTAB1、CTAB2、TG1、TG2、OMG1、OMG2、FG、NEW的提取方案所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道标号即提取方案序号；
图3为对比例1所述序号NEW的提取方案所得基因组DNA进行三代Nanopore测序文库构建后上机测序完毕时“Read Length Histogram”所采集显示的数据(芯片FLO-MIN106D)；
图4为对比例1所述序号NEW的提取方案所得基因组DNA进行三代Nanopore测序文库构建后上机测序完毕时“States Panel”所采集显示的数据(芯片FLO-MIN106D)。
具体实施方式
实施例1
本实施例着重于草莓基因组提取以及其中分离液配方优化，材料为液氮速冻后冻存的草莓果实，品种为“奶油”。实施步骤如下：
(1)液氮研磨植物组织样品至极细齑粉，称取0.22g于2mL已灭菌的预冷离心管中。
(2)于离心管中加入1.5mL分离液，充分混匀，冰浴8分钟后4℃，8000rpm离心8分钟。
(3)弃去上清液加入1mL分离液，充分混匀后4℃，8000rpm离心8分钟，此步骤重复3次，此时上清液均一澄清且接近无色。
(4)弃去澄清上清液后加入800μL已65℃预热的裂解提取液(均为水溶液)，16μL巯基乙醇及20μL的RNase A，混匀后于65℃水浴50分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次。
(5)水浴后加入1/2体积的tris饱和酚以及1/2体积的烷醇混合液，充分混匀后16℃，12500rpm离心10分钟。
(6)小心取上清液到新管，加入等体积的烷醇混合液，混匀后4℃，12500rpm离心8分钟，与此同时在吸附柱内加入200μL的NaOH(3M)溶液，静置3min后室温13000rpm离心2.5分钟，晾干。
(7)小心取上清液到新管，加入等体积过柱缓冲液以及已于-20℃预冷的同样等体积异丙醇，充分混匀制成过柱液。取700μL过柱液加入硅基DNA吸附柱(Biosharp公司)，静置3分钟后室温11000rpm离心1.5分钟。
(8)将收集液重新加入吸附柱，再次离心，弃去收集液。剩余过柱液同样进行过柱收集。
(9)过柱完毕后吸附柱内加入700μL的洗涤液，静置3分钟后室温11000rpm离心1.5分钟，弃去废液，将洗涤液更换为80％乙醇重复2次洗涤。
(10)洗涤完毕后将吸附柱和收集管室温13000rpm空管离心2.5分钟，将吸附柱置于新离心管开盖氮吹3分钟后于37℃摇床内100rpm温育5分钟。
(11)最后在吸附柱的膜中央加入50μL的65℃预热TE缓冲液，静置5分钟后室温11000rpm离心1.5分钟。收集的洗脱液重新加入吸附柱，静置3分钟后13000rpm离心2.5分钟，弃去吸附柱，得到高质量基因组DNA溶液。
裂解提取液组成为Tris-HCl 0.1M，EDTA 0.05M，NaCl(氯化钠)1.4M，PVP 2.5％以及CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)2.5％。过柱缓冲液组分为盐酸胍3M，NaCl 2M，磷酸二氢钠0.05M以及吐温-20 3％。洗涤液组分为无水乙醇80％，NaCl 0.015M，Tris-HCl 0.015M以及1.5％PVP。
本实施例中试验的以下数种分离液配方(pH均为8.0)：
A：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，1.5％PVP以及3％巯基乙醇。
B：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，3％PVP以及3％巯基乙醇。
C：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，4.5％PVP以及3％巯基乙醇。
D：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，1％PEG8000以及3％PVP，3％巯基乙醇。
E：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，5％PEG8000以及3％PVP，3％巯基乙醇。
F：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，10％PEG8000以及3％PVP，3％巯基乙醇。
G：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，15％PEG8000以及3％PVP，3％巯基乙醇。
H：0.1M Tris-HCl，0.02M EDTA，10％PEG8000，3％PVP，3％巯基乙醇及5％甘油。
I：不使用分离液进行预除杂而直接进行裂解提取。
最终对所得草莓基因组DNA进行质检：使用Qubit3.0仪器对DNA浓度进行精确定量，使用Nanodrop300仪器对DNA的浓度及OD260/280、OD260/230值进行测定以评估纯度(富含多糖多酚植物组织所得高纯基因组DNA的OD260/280应在1.7-1.9，OD260/230应在1.6-2.0)，并计算出所得DNA总量，结果如表1所示，部分有可见明显差异的琼脂糖电泳结果见图1(琼脂糖凝胶电泳条件：琼脂糖0.8％，电压120V，电流200mA，上样量3μL，下同)。
表1实施例1所述各分离液配方所得草莓基因组DNA质检参数
Figure BDA0003236920950000091
可见分离液配方对OD260/230影响明显，PEG8000的加入可有效增加OD260/230，提升除杂效果，促进DNA的纯化。I序号所代表的实施例所得基因组溶液与其他组相比略微粘稠，且略带褐色，表明多糖多酚杂质未除净。
本发明所述的最优分离液配方(序号H)可得到最佳的有益效果。
实施例2
本实施例着重于草莓基因组提取以及其中过柱缓冲液配方优化。实施步骤如实施例1，区别如下：
本实验例材料为“红颜”草莓果实，步骤(3)预除杂仅重复2次，加入裂解提取液后水浴40分钟，第二次加入烷醇混合液时一并加入了10μL的RNase A，所用硅胶基质吸附柱于Omega公司所获，最后洗脱时加入40μL的TE缓冲液。
本实验例的分离液配方采用实施例1中序号H的配方。
本实验例试验的以下数种代表性过柱缓冲液配方：
J：3M盐酸胍，2M NaCl，0.05M磷酸二氢钠以及3％吐温-20。
K：5M盐酸胍，0.025M Tris-HCl，0.01M EDTA以及3％吐温-20。
L：5M盐酸胍以及2M醋酸钠。
M：5M高氯酸钠。
N：5M异硫氰酸胍，0.05M Tris-HCl，0.02M EDTA，1‰曲拉通(此配方为2010年农业部《转基因植物及其产品成分检测脱氧核糖核酸提取和纯化》文件中涉及DNA吸附柱缓冲体系的配方)。
O：不使用缓冲液直接加入异丙醇过柱。
最终对所得草莓基因组DNA进行质检：使用Qubit3.0仪器对DNA浓度进行精确定量，使用Nanodrop300仪器对DNA的浓度及OD260/280、OD260/230值进行测定以评估纯度，并计算出所得DNA总量，结果如表2所示，部分有可见明显差异的琼脂糖电泳结果见图1。
表2实施例2所述各过柱缓冲液配方所得草莓基因组DNA质检参数
Figure BDA0003236920950000101
过柱缓冲液与等体积醇起到了促进DNA与吸附膜结合的作用。从表2数据可知，各不同配方造成的结合效果差异较大，若过柱时无法有效使DNA与膜结合(如M与O)，则大部分裂解抽提所得的珍贵DNA溶液会随着收集液的弃去而丢失，造成最终得率的锐减。
进一步地，缓冲液配方对最终DNA浓度及总量有较大影响，但对OD260/280影响相对较小，且本发明所述的过柱缓冲液配方(序号J)有最佳的有益效果。
实施例3
本实施例着重于草莓基因组提取以及其中干燥工艺的有益效果优化。实施步骤如实施例1，区别如下：
本实验例材料为“章姬”草莓果实，样品称取量为0.25g，加入裂解提取液后水浴45分钟，第二次加入烷醇混合液时一并加入了10μL的RNase A，所用硅胶基质吸附柱于Solarbio公司所获，最后洗脱时加入40μL的TE缓冲液。
进一步地，本实验例的分离液配方采用实施例1中序号H的配方。
本实验例试验的以下数种代表性干燥方案：
P：室温晾干10分钟。
Q：通风橱风干10分钟。
R：氮吹10分钟。
S：37℃摇床100rpm温育10分钟。
T：37℃摇床100rpm温育5分钟后氮吹3分钟。
U：氮吹3分钟后37℃摇床100rpm温育5分钟。
V：不进行后续干燥操作。
最终对所得草莓基因组DNA进行质检：使用Qubit3.0仪器对DNA浓度进行精确定量，使用Nanodrop300仪器对DNA的浓度及OD260/280、OD260/230值进行测定以评估纯度，并计算出所得DNA总量，结果如表3所示，部分有可见明显差异的琼脂糖电泳结果见图1。
表3实施例3所述各干燥方案所得草莓基因组DNA质检参数
Figure BDA0003236920950000111
Figure BDA0003236920950000121
表3中结果显示步骤(10)中所涉及的干燥工艺对DNA溶液吸光度有直接影响。干燥不彻底如P、V所代表的干燥方案将导致OD260/230过低，盐或多糖杂质无法去除，且残余乙醇会对下游实验产生影响；干燥过度如Q、R所代表的干燥方案则导致OD260/280偏高，DNA片段发生降解，完整性降低。
进一步地，本发明所述的干燥方案(序号U)有最佳的有益效果，此精准干燥工艺能够很好地平衡所得DNA溶液的纯度与完整性。
对比例1
由于植物组织的基因组DNA提取多使用CTAB法，相应地，在本对比例中，以超低温冻存的“红颜”草莓果实液氮研磨称取0.22g为材料，分别由传统CTAB法、改良CTAB法、天根公司试剂盒、天根公司试剂盒、Omega公司试剂盒、Forgene公司试剂盒以及本发明方法进行提取，最后以45μL的TE缓冲液进行溶解或洗脱，所得的基因组DNA溶液被用作对比。
1.传统CTAB法的实施方式：
样品材料加入800μL预热的提取液(2％CTAB)，65℃水浴60分钟，加入烷醇混合液(96％三氯甲烷与4％异戊醇)，混匀，离心，取上清，加入600μL异丙醇后离心，弃上清，晾干，加入乙醇和醋酸钠，静置30分钟。离心，弃上清，加入乙醇洗涤30分钟，离心，弃去乙醇，室温放置5分钟晾干，加入TE缓冲液溶解DNA沉淀(记为CTAB1)。
2.改良CTAB法的实施方式：
样品材料按照发明内容实施至步骤(6)，取上清后加入1/10体积的醋酸钠(3M)与等体积预冷的异丙醇，-20℃冷藏60分钟。此后12000rpm，4℃离心15分钟，弃上清，加入80％乙醇洗涤三次，通风橱晾干10分钟后加入TE缓冲液溶解DNA沉淀(记为CTAB2)。
3.TIANGEN天根公司植物基因组DNA提取试剂盒DP305：
实施时依照其说明书步骤进行提取(记为TG1)。
4.TIANGEN天根公司新型植物基因组DNA提取试剂盒DP320：
实施时依照其说明书步骤进行提取(记为TG2)。
5.OMEGA公司试剂盒HP Plant DNA Kit,D2485:
实施时依照其说明书中针对常规冻样的操作步骤进行提取(记为OMG1)。
实施时依照其说明书中针对DNA含量低样本的操作步骤进行提取(记为OMG2)。
6.FORGENE福际公司Plant DNA Isolation Kit,DE-06111:
实施时依照其说明书步骤进行提取(记为FG)。
7.依照实施例2中的“J”组实验条件，以本发明提供的新流程进行提取(记为NEW)。
最终对所得草莓基因组DNA进行质检：使用Qubit3.0仪器对DNA浓度进行精确定量，使用Nanodrop300仪器对DNA的浓度及OD260/280、OD260/230值进行测定以评估纯度，并计算出所得DNA总量，结果如表4所示，琼脂糖电泳结果见图2。
表4对比例1所述各提取方法所得草莓基因组DNA质检参数
Figure BDA0003236920950000131
综合表4数据及图2琼脂糖凝胶电泳图情况可知，在本对比例中，由本发明方法提取所得的基因组DNA兼顾了纯度和浓度，有着最高质量。
更进一步地，选取本对比例中“NEW”序号提取所得的基因组DNA溶液进行三代Nanopore上机测序，以实现目前最昂贵和最严格的DNA样本测序质检，从而有效评估本发明所述方法的有益效果。质检以两个维度评估，一是通过上机时三代测序程序对所提取基因组内的DNA片段长度进行检测与量化呈现以进一步直接精确评估基因组完整性(图3)；二是将所选基因组溶液根据三代测序要求进行文库构建，装载至Nanopore芯片进行读取，通过监测芯片孔终时状态以评估基因组质量；由于不经过扩增步骤，Nanopore芯片孔对提取所得的初始基因组DNA(用以文库构建的基因组DNA)中杂质极其敏感，以此达到间接评估基因组质量的目的(图4)。
由图3可直观读取基因组DNA中片段分布情况(供试草莓基因组大小约800Mb)，可见经提取，仪器读取的主要基因组片段大小集中于4至20Kb(千碱基对)，预估N50值为17.07Kb，甚至仍存在70Kb以上大小的片段。这说明提取过程中未发生明显的基因组降解，进一步验证了基因组的良好完整性。图4展示了三代测序芯片孔的可用情况，若基因组中仍含有多糖多酚杂质，则会引起芯片孔大量堵塞，使得“Unavailable”数值较大。实际上，由本发明所述方法提取的基因组在此环节中表现优异，“Unavailable”数值仅为4且80％以上芯片孔高效运作，未受杂质干扰，表明文库构建所用的供试初始基因组达到了较高水平的纯度。
综上，由本发明所述提取方案所得的高质量基因组DNA除了具有高水平的纯度、浓度(样本量、得液体积一定情况下)以及片段完整性，同时也通过了高要求的三代Nanopore测序质检，能够胜任下游实验需求，为以草莓为代表的富含多糖多酚特殊植物组织提供了一种可靠，高效的基因组提取方案。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将草莓果实样品加入液氮研磨成粉末，加入分离液进行预除杂；除去分离液并加入裂解提取液后离心取上清液；在上清液中加入烷醇混合液离心后继续取上清液；将上清液与过柱缓冲液以及等体积的预冷后的异丙醇，混匀后得过柱液；将过柱液过DNA吸附柱后，洗涤后进行干燥，最终得到高质量草莓基因组DNA；
所述的分离液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl、0.02mol/L的EDTA、0-15％的PEG8000、1.5-4.5％的PVP、2.5-3.5％的巯基乙醇以及0-5％的甘油；
所述的过柱缓冲液的组成包括：3-5mol/L的盐酸胍、1-3mol/L的NaCl、0.01-0.1mol/L的磷酸二氢钠以及2-4％的吐温-20；
干燥条件为开盖氮吹2-5分钟后于37℃摇床内100-150rpm温育3-6分钟。
2.根据权利要求1所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将草莓果实样品加入液氮研磨成粉末，并收集到预冷离心管中；
(2)向预冷离心管中加入分离液，并使草莓果实样品与分离液混合均匀，冰浴后进行离心处理，弃去上清液；
(3)再向预冷离心管中加入裂解提取液、巯基乙醇和RNA消化酶，混匀后进行水浴；
(4)向预冷离心管中加入1/2体积的Tris饱和酚以及同样1/2体积的烷醇混合液，充分混匀后进行离心处理，收集上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液转移至新的离心管中，并加入等体积的烷醇混合液以及适量RNA消化酶，混匀后离心处理，取上清液；
(6)将步骤(5)得到的上清液转移至新的离心管中，并加入等体积的过柱缓冲液以及等体积的-15～-25℃预冷后的异丙醇，混匀后得过柱液；将所述的过柱液加入DNA吸附柱中，置于收集管中静置后进行离心处理；
(7)向DNA吸附柱中加入洗涤液，置于收集管中静置后进行离心处理；
(8)将DNA吸附柱置于新的离心管中进行干燥；
(9)向干燥后的DNA吸附柱中加入预热的TE缓冲液，静置后进行离心处理，得到高质量草莓基因组DNA。
3.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，所述的分离液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl、0.02mol/L的EDTA、1-15％的PEG8000、1.5-4.5％的PVP、3％的巯基乙醇以及4-5％的甘油。
4.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，步骤(3)中，水浴温度为60-70℃，水浴时间为20-60min；水浴过程中每5-10min将预冷离心管颠倒混匀一次。
5.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，所述的裂解提取液的组成包括：0.1mol/L的Tris-HCl、0.05-1mol/L的EDTA、1-1.5mol/L的NaCl、2-3％的PVP以及2-3％的CTAB。
6.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，步骤(4)中的离心参数为15-20℃，12000-13000rpm，10-15min；步骤(5)中的离心参数为3-5℃，12000-13000rpm，7-10min；步骤(6)和步骤(7)的离心参数为3-5℃，10000-11000rpm，1-2min；步骤(8)中的离心参数为3-5℃，12000-14000rpm，2-3分钟。
7.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，所述的过柱缓冲液的组成包括：3mol/L的盐酸胍、2mol/L的NaCl、0.05mol/L的磷酸二氢钠以及3％的吐温-20。
8.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，所述的洗涤液组分包括：80％的无水乙醇、0.01-0.02mol/L的NaCl、0.01-0.02mol/L的Tris-HCl以及1-2％的PVP。
9.根据权利要求2所述的高质量草莓基因组DNA的分离提取方法，其特征在于，步骤(9)中的干燥工艺为：开盖氮吹3分钟后于37℃摇床内100rpm温育5分钟。
CN202111004931.5A 2021-08-30 2021-08-30 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 Active CN113549615B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111004931.5A CN113549615B (zh) 2021-08-30 2021-08-30 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111004931.5A CN113549615B (zh) 2021-08-30 2021-08-30 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113549615A true CN113549615A (zh) 2021-10-26
CN113549615B CN113549615B (zh) 2023-07-25

Family

ID=78106203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111004931.5A Active CN113549615B (zh) 2021-08-30 2021-08-30 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113549615B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117660443A (zh) * 2023-12-11 2024-03-08 南京派森诺基因科技有限公司 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法
CN117660443B (zh) * 2023-12-11 2024-06-07 南京派森诺基因科技有限公司 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101613697A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化dna的方法
CN103898094A (zh) * 2014-03-14 2014-07-02 中国科学院上海有机化学研究所 一种红木心材基因组dna的提取方法
CN104805071A (zh) * 2015-01-30 2015-07-29 浙江省农业科学院 一种草莓基因组dna的提取方法
JP2016002005A (ja) * 2014-06-13 2016-01-12 公益財団法人かずさＤｎａ研究所 イチゴ種子のｄｎａ粗抽出液を用いたイチゴｆ１種子の純度検定法
CN105368815A (zh) * 2015-11-25 2016-03-02 上海派森诺生物科技股份有限公司 多糖多酚植物基因组的提取方法
CN107058296A (zh) * 2017-05-27 2017-08-18 山东森芃生物科技有限公司 土壤尿液dna提取试剂盒及方法
CN107326023A (zh) * 2017-07-14 2017-11-07 河南科技大学 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法
CN107988204A (zh) * 2017-11-24 2018-05-04 广州基迪奥生物科技有限公司 一种全血dna快速提取方法
CN108060159A (zh) * 2017-11-30 2018-05-22 广州海思医疗科技有限公司 一种富含多糖多酚植物的dna提取方法
CN108949751A (zh) * 2018-09-03 2018-12-07 四川省植物工程研究院 一种提取富含果胶类多糖植物dna的试剂盒及方法
AU2020102458A4 (en) * 2020-09-28 2020-11-12 Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry Method for extracting high-quality dna from idesia polycarpa

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101613697A (zh) * 2009-08-05 2009-12-30 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化dna的方法
CN103898094A (zh) * 2014-03-14 2014-07-02 中国科学院上海有机化学研究所 一种红木心材基因组dna的提取方法
JP2016002005A (ja) * 2014-06-13 2016-01-12 公益財団法人かずさＤｎａ研究所 イチゴ種子のｄｎａ粗抽出液を用いたイチゴｆ１種子の純度検定法
CN104805071A (zh) * 2015-01-30 2015-07-29 浙江省农业科学院 一种草莓基因组dna的提取方法
CN105368815A (zh) * 2015-11-25 2016-03-02 上海派森诺生物科技股份有限公司 多糖多酚植物基因组的提取方法
CN107058296A (zh) * 2017-05-27 2017-08-18 山东森芃生物科技有限公司 土壤尿液dna提取试剂盒及方法
CN107326023A (zh) * 2017-07-14 2017-11-07 河南科技大学 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法
CN107988204A (zh) * 2017-11-24 2018-05-04 广州基迪奥生物科技有限公司 一种全血dna快速提取方法
CN108060159A (zh) * 2017-11-30 2018-05-22 广州海思医疗科技有限公司 一种富含多糖多酚植物的dna提取方法
CN108949751A (zh) * 2018-09-03 2018-12-07 四川省植物工程研究院 一种提取富含果胶类多糖植物dna的试剂盒及方法
AU2020102458A4 (en) * 2020-09-28 2020-11-12 Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry Method for extracting high-quality dna from idesia polycarpa

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANTIAGO VILANOVA等: "SILEX: a fast and inexpensive high-quality DNA extraction method suitable for multiple sequencing platforms and recalcitrant plant species", PLANT METHODS, vol. 16, no. 110 *
严嘉玮等: "2种草莓成熟过程中果实特征品质指标的变化", 食品科学, vol. 38, no. 4, pages 125 - 132 *
吴帆;柳新红;蒋冬月;李因刚;杨少宗;刘华红;倪穗;: "典型樱亚属植物基因组DNA改良提取方法研究", 中国野生植物资源, no. 02 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117660443A (zh) * 2023-12-11 2024-03-08 南京派森诺基因科技有限公司 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法
CN117660443B (zh) * 2023-12-11 2024-06-07 南京派森诺基因科技有限公司 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113549615B (zh) 2023-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ding et al. Using silica particles to isolate total RNA from plant tissues recalcitrant to extraction in guanidine thiocyanate
CN108103168A (zh) 一种ffpe样本中dna质量的评估方法
Yu et al. An easily-performed high-throughput method for plant genomic DNA extraction
CN111733274B (zh) 用于鉴定花椰菜“浙农松花80天”品种的snp位点及引物组和方法
CN104404030B (zh) 一种快速提取植物基因组dna的试剂盒及方法
Zarei et al. An effective protocol for isolation of high-quality RNA from pomegranate seeds
CN107488732A (zh) 检测辣椒转基因成分的三重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法
CN107385117B (zh) 一种甘薯种薯复合病毒病（spvd）病原的检测方法
CN113502293A (zh) 油茶自交不亲和关联基因、snp分子标记及应用
CN113549615A (zh) 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法
CN111718928A (zh) 一种黄精叶绿体dna提取优化方法
CN109694923B (zh) 薄壳山核桃品种靖州1号的特征序列、标记引物及鉴定方法
CN109880822A (zh) 一种山桐子高质量dna提取方法
CN112779247B (zh) 植物组织基因组dna提取试剂盒及高通量提取方法
EP3896176A1 (en) Method for the determination of the fingerprint in varieties of cannabis
CN108841820B (zh) 高效提取植物基因组dna的无毒提取液组合gpr.1及提取方法
CN102433324B (zh) 植物基因组dna的循环提取方法
CN111575273A (zh) 一种中药贝母dna提取试剂及提取方法
CN110577950A (zh) 一种用于提取微量药用植物样品dna的提取液及其提取方法
CN113637783B (zh) 基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物及其应用
Sánchez et al. A fast and efficient protocol for small RNA extraction in Japanese plum and other Prunus species
US8927214B2 (en) Methods and compositions for dual extraction of protein and nucleic acid
EP3467127B1 (en) Method for identifying variety of hop
CN114164206B (zh) 大豆基因组dna提取试剂及其应用
CN107523565A (zh) 基于纳米磁珠的多酚类植物rna的简化提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant