CN112779247B - 植物组织基因组dna提取试剂盒及高通量提取方法 - Google Patents

植物组织基因组dna提取试剂盒及高通量提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种植物组织基因组DNA提取试剂盒及高通量提取方法。利用本试剂盒可以快速提取较高质量的玉米基因组DNA，提取的DNA能够满足一般的分子标记检测和测序建库等需求。配合本发明的DNA提取方法，既实现了高质量高通量的DNA提取，又极大地提升了整个DNA提取流程的效率，相比于常规提取方案大大降低了DNA提取成本。DNA提取从裂解、纯化到收集产物的整个过程均可由仪器完成，自动化程度高，提取所用的试剂安全性高，可最大程度避免对人体的伤害。

Description

植物组织基因组DNA提取试剂盒及高通量提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及植物组织基因组DNA提取试剂盒及高通量提取方法。
背景技术
玉米是世界范围内种植最为广泛和产量最高的作物之一，同时在食品、饲料和工业等各个领域中都有着重要的用途，是最为重要的粮食作物和经济作物之一。随着社会发展的不断进步和各方面的因素，未来我国对玉米的需求和产量相比仍会有着巨大的缺口，但玉米的种植面积在近年来却有着微量减少的趋势。如何利用有限的土地资源来满足日益增长的需求，培育更加优秀的玉米品种是解决这一问题的最有效手段之一，而分子标记技术在培育玉米新品种和品种保护中扮演着越来越重要的角色。
脱氧核糖核酸(英文DeoxyriboNucleic Acid，缩写为DNA)是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种，携带者一切生物体几乎所有的遗传信息，是生物体生长发育和遗传必不可少的生物大分子。DNA提取也成为生物医药和农林牧渔等领域内所有学科科学研究和检测的基础之一。
DNA提取最常用的方法包括酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备等。随着分子标记技术在培育新品种、转基因检测和基因诊断等领域的快速发展和应用，传统的DNA提取方法已经不能满足当今生物技术的要求。磁珠法核酸提取技术应运而生，是生物科学和纳米材料科学相结合的高新技术产品，是我国核酸提取纯化技术的一次重大突破，它彻底解决了我国核酸提取纯化长期依赖进口的局面。
与传统方法相比，磁珠法提取DNA有着无法比拟的优势，如：①提取方法简单，提取时间短，整个过程主要包括四步；②可以实现自动化和高通量提取，即节约了人力成本，又节约了时间成本；③生物磁珠可与核酸特异性结合，而不与其他杂质如蛋白质、糖等结合，因此可以提取得到高质量高浓度的DNA；④操作安全，不使用传统方法中常见的氯仿和苯等有毒有害试剂，既环保又能降低试剂对实验人员身体的伤害。
目前大部分的DNA提取方法仍然存在取样效率低、提取过程时间长、提取高质量DNA的成本较高效率低等问题。如何充分利用磁珠法的独特优势，实现更快速高通量高质量和更低成本的DNA提取，仍然是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量高质量和低成本的植物组织基因组DNA提取试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种从取样到DNA提取完成更加高通量的植物组织基因组DNA提取方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供植物组织基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒包含组织裂解液、磁珠结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液II、洗涤液III和DNA洗脱液；
其中，所述组织裂解液为：0.1％～2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，0.1mol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)pH8.0，0.01mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)pH8.0，1mol/L氯化钾，1-3％PVP40；
所述磁珠结合液的制备方法为：将直径为300-600nm的硅羟基磁珠与异丙醇混合，用超纯水定容，即得磁珠结合液；所述磁珠结合液中硅羟基磁珠的终浓度为2-5mg/mL，异丙醇的终浓度为90％；一定范围内磁珠浓度越高结合DNA的能力越强；
所述洗涤液Ⅰ为：1-3％SDS(十二烷基硫酸钠)，50-60％乙醇，0.5-1mol/L氯化钠，0.01-0.05mol/L Tris pH8.0，0.005-0.01mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容；
所述洗涤液II为：0.01-0.05mol/L Tris pH8.0，0.005-0.01mol/L EDTA pH8.0，0.1-0.3mol/L醋酸钠，0.5-2％冰醋酸，75％乙醇，用超纯水定容；
所述洗涤液III为：0.01mol/L Tris pH8.0，0.001mol/L EDTApH8.0，75％乙醇，用超纯水定容；
所述DNA洗脱液为：0.01mol/L Tris pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容。
试剂盒的优选方案如下：
组织裂解液：1％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，0.1mol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)pH8.0，0.01mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)pH8.0，1mol/L氯化钾，2％PVP40；
磁珠结合液：将直径约为400nm的硅羟基磁珠与异丙醇混合，用超纯水定容，即得磁珠结合液；所述磁珠结合液中硅羟基磁珠的终浓度为3mg/mL，异丙醇的终浓度为90％；
洗涤液Ⅰ：2％SDS(十二烷基硫酸钠)，50％乙醇，1mol/L氯化钠，0.05mol/L TrispH8.0，0.01mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容；
洗涤液II：0.05mol/L Tris pH8.0，0.01mol/L EDTA pH8.0，0.3mol/L醋酸钠，1％的冰醋酸(1L)，75％乙醇，用超纯水定容；
洗涤液III：0.01mol/L Tris pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，75％乙醇，用超纯水定容；
DNA洗脱液：0.01mol/L Tris pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容。
可根据实际需求选择是否在DNA洗脱液中加核糖核酸酶(RNase A)，每100ul加0.1-0.3ul浓度为10mg/ml的RNase A，37℃孵育30min即可。
第二方面，本发明提供所述试剂盒在植物组织基因组DNA提取中的应用。
所述植物组织为植物叶片或种子，如玉米叶片(从苗期到玉米授粉后2周之间的叶片)，该试剂盒对其它植物如水稻、小麦、棉花等同样适用，对种子等其它器官组织也同样适用，根据样本情况适当更改试剂浓度即可。
第三方面，本发明提供玉米叶片基因组DNA高通量提取方法，包括：
1)将6-16mg玉米叶片置于1.4ml空白管中，取完样后再将管放置到96孔板架上，然后向各管中加入1-2颗粒径4mm的钢珠，然后用微孔板分液器或96通道工作站或排枪向各管中加入250-400ul组织裂解液；对96孔板进行封膜，用磨样器进行研磨直至叶片充分磨碎(一般磨碎2-4min)；
2)叶片磨碎后将96孔板置于60-65℃水浴锅中进行水浴30-40min，水浴结束后放入适配96孔板的离心机中3000-4000rpm离心10-15min，然后去掉96孔板上的封膜，将96孔板放置在基于磁珠法提取DNA的半自动或全自动工作站(如OKTOPURE DNA自动提取工作站)中；
3)取上清加入到等体积的磁珠结合液中，并吸打混匀，待结合后利用磁力架使磁珠与液体分离，待分离后吸走所有液体；
4)将洗涤液Ⅰ加入磁珠中清洗，清洗后磁珠与液体分离，吸走所有液体；
5)将洗涤液II加入磁珠中清洗，清洗后磁珠与液体分离，吸走所有液体；
6)将洗涤液III加入磁珠中清洗，清洗后磁珠与液体分离，吸走所有液体；
7)清洗后的磁珠用DNA洗脱液进行洗脱，得到纯化的DNA。
前述的方法，步骤4)中向吸附有DNA的磁珠中加入200-300ul(优选200ul)洗涤液Ⅰ。
前述的方法，步骤5)中向吸附有DNA的磁珠中加入200-300ul(优选200ul)洗涤液II。
前述的方法，步骤6)中向吸附有DNA的磁珠中加入200-300ul(优选200ul)洗涤液III。
进一步地，取样的方法是用1.4ml空白管结合植物叶片取样器每次取4-8片叶到空白管中，然后将叶片放置于配套的赛默飞(ThermoFisher)96孔板架上，然后盖上薄薄的一层透气性较好的海绵，再盖上盖子，防止管子顶部和盖子之间有空隙，再将96孔板防置于装有干燥剂和脱氧剂的自封袋中，置于冰盒中或4℃保存，此方法的特点是取样速度快、取样体积小、每个孔的样品量均一、取得的叶片容易保存。
若取样完成后的样品需要保存较长时间，可先将96孔板从自封袋中取出，用离心机离心将叶片甩至管低，然后打开盖子用冷冻干燥机冷冻干燥，完成后再盖上盖子置于阴凉干燥处，或仍置于装有干燥剂的自封袋中4℃保存。
进一步地，加液前先用钢珠加样器或手动给每个取样管中加入1-2颗粒径4mm的钢珠，然后用微孔板分液器或96通道工作站或排枪等设备给每个样品管中加入250-400ul组织裂解液。
进一步地，加完组织裂解液和钢珠后用热封膜仪给每个96孔板进行封膜，封膜后不需使用液氮直接用磨样器打碎研磨，磨样时间一般在2-4min，将叶片充分磨碎即可。
进一步地，叶片磨碎后直接置于65℃水浴锅中进行水浴30-40min，水浴结束后4000rpm离心10min，然后再揭开热封膜，放置于利用磁珠法进行DNA提取的半自动或全自动工作站中，准备进行DNA提取。
利用自动化DNA提取工作站，则后面几步可由仪器自动完成(如果是半自动化设备，则需要配合磁力架等手动操作)：①调整合适的吸液高度吸取上清，吸取上清的高度至少要高于杂质层2mm以上，避免吸取到沉淀中的杂质；②将上清吸取到等体积的磁珠结合液中，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上；③等待结合100s后，将废液全部吸走；④移走磁力架，加入200ul的洗涤液Ⅰ，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走；⑤移走磁力架，加入200ul的洗涤液II，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走；⑥移走磁力架，加入200ul的洗涤液III，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走；⑦移走磁力架，根据需要加入60-100ul DNA洗脱液(烘干剩余液体后再加洗脱液更佳)，并吸打混匀，等待360s后置于磁力架上，等待结合100s后，将DNA吸取到新的96孔板中；⑧将装有DNA的96孔板封膜或盖上配套的硅胶盖，低温保存，DNA提取结束。
利用本发明的DNA提取试剂盒可以完成剩余的DNA提取步骤，包括吸上清、DNA结合、DNA洗涤和DNA洗脱几个步骤，以OKTOPURE工作站为例，每次可提取8个96孔板共768份样品，加上样品研磨、水浴及加液等步骤提取时间一共3-4h，提取过程一般仅需要1人即可顺利完成，即保证了高通量高质量又节约了人力。
本发明中，所述玉米叶片可以是玉米授粉后2周左右仍然较绿的叶片，此时叶片杂质更多且细胞老化，DNA提取的难度更高，这样是为了测试提取DNA的质量，当然取样时期越早或样品质量越好提取的DNA质量更佳。本发明主要通过改良的取样方法提高了取样效率和样品的保存质量，并协同优化了DNA提取流程和试剂盒配方实现了高质量、高通量和低成本的DNA提取。
第四方面，本发明提供按照上述方法提取的玉米叶片基因组DNA的以下任一应用：
(1)用于文库构建；
(2)用于基因分型；
(3)用于PCR扩增。
与普通DNA提取试剂盒相比，本发明试剂盒有着DNA质量高、成本低、配制简单、DNA获取率高等特点；能完全适配一般的自动化磁珠法DNA提取工作站，相比进口试剂盒而言不仅价格较低且提取的DNA质量稳定可靠，本发明单个DNA提取平均成本(包含试剂和实验耗材)约0.5-1元，而一般进口工作站DNA提取试剂盒平均成本(包含试剂和耗材)约5-10元以上，因此可以替代进口试剂盒等产品。
本发明的植物组织基因组DNA高通量提取方法的优点在于：①取样速度快，且取样体积小易保存；②相较传统的取样方法，取得的叶片能够长时间保存；③相比于传统的磨碎方式，具有步骤简单、效果好和通量高的特点；④采用特有的取样方式，DNA提取过程中不需要加入过多的试剂，进一步节约了成本和减少了提取时间；⑤优化过的DNA结合、洗涤和洗脱步骤，在保证获取高质量高浓度DNA的同时有效洗去了杂质；⑥如果对DNA浓度要求不高，即使降低结合液中磁珠浓度，仍然可以获取足够PCR等实验需求的高质量DNA，可灵活控制成本。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中利用1％琼脂糖检测不同DNA提取方案下提取的DNA质量(上下3次重复)。
图2为本发明较佳实施例中超微量分光光度计Nanodrop检测提取的DNA质量。
图3为本发明较佳实施例中提取DNA用普通标记扩增的效果。
图4为本发明较佳实施例中提取DNA进行KASP标记分型的效果。
图5为本发明较佳实施例中提取DNA送至石家庄博瑞迪生物技术有限公司建库质检的结果。
图6为本发明较佳实施例中提取DNA送至石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行电泳检测的结果。
具体实施方式
本发明提供一种高通量高质量和低成本提取玉米基因组DNA的试剂盒和提取方法，采用以下技术方案实现：
1、一种高通量提取玉米等植物基因组DNA的试剂盒，包含组织裂解液、磁珠结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液II、洗涤液III和DNA洗脱液：①组织裂解液为：0.1％～2％的十六烷基三甲基溴化铵，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.01mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，1mol/L氯化钾，2％的PVP40；②磁珠结合液为：2-5mg/ml直径为300-600nm的硅羟基生物磁珠，90％异丙醇溶液，一定范围内磁珠浓度越高结合DNA的能力就越强；③洗涤液Ⅰ为：2％的十二烷基硫酸钠，60％乙醇，1mol/L氯化钠，0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.005mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)；④洗涤液II为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.005mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，0.3mol/L醋酸钠，5ml冰醋酸(1L)，75％乙醇；⑤洗涤液III为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.001mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，75％乙醇；⑥DNA洗脱液为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.001mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，可根据实际需求选择是否加核糖核酸酶(RNase A)。
2、一种从取样到DNA提取完成的更加快捷简单且高通量的DNA提取方法：
①用1.4ml空白管结合植物叶片取样器每次取4-8片叶(约6-16mg)到空白管中，然后将叶片放置于配套的赛默飞96孔板架上，然后盖上一层透气性较好的海绵，再盖上盖子，防止管子顶部和盖子之间有空隙，再将96孔板防置于装有干燥剂的自封袋中低温或4℃保存；
②取样完成后的样品如果需要保存较长时间，可先将96孔板从自封袋中取出，然乎用离心机离心将叶片甩至管低，然后打开盖子用冷冻干燥机冷冻干燥，完成后再盖上盖子至于阴凉干燥处，或仍置于装有干燥剂的自封袋中4℃保存；
③加液前先用钢珠加样器或手动向每个管中加入1-2颗4mm的钢珠，然后用微孔板分液器或96通道工作站或排枪等设备给每个样品管中加入250-400ul组织裂解液；
④加完裂解液和钢珠后用热封膜仪给每个96孔板进行封膜，封膜后直接用磨样器研磨不需使用液氮，磨样时间一般在2-4min，将叶片充分磨碎即可；
⑤叶片磨碎后直接置于65℃水浴锅中进行水浴30-40min，水浴结束后4000rpm离心10min，离心后揭开热封膜，放置于利用磁珠法进行DNA提取的半自动或全自动工作站中；
⑥一般的自动化DNA提取工作站可自动完成以下步骤，只需要对提取步骤和时间进行适当的修改(如果是半自动工作站或者排枪等则需要配合磁力架手动操作)。首先调整合适的吸液高度吸取上清，吸取上清的高度至少要高于杂质层2mm以上，避免吸取到沉淀中的杂质。将上清吸取到等体积的磁珠结合液中，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入200ul的洗涤液Ⅰ，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入200ul的洗涤液II，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入200ul的洗涤液III，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入60ul DNA洗脱液(烘干剩余液体后再加洗脱液更佳)，并吸打混匀，等待360s后置于磁力架上，等待结合100s后，将DNA吸取到新的96孔板中；⑦将装有DNA的96孔板封膜或盖上配套的硅胶盖，低温保存，DNA提取结束。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的硅羟基磁珠购自厦门普瑞迈格生物科技有限公司，型号为PMSi400001。
磨样器购自美国SPEX，型号为GenoGrinder2010。
空白管购自赛默飞公司，1.4mlMatrix管(货号4140)。
实施例1利用三种不同方法提取的玉米叶片基因组DNA，比较提取的DNA质量和提取效率
为了更好地体现DNA的提取效果，所选叶片应保证均匀一致，且取玉米授粉后2周左右仍然较绿的叶片，此时的叶片杂质更多且细胞老化，DNA提取的难度更高。
方法1：CTAB法提取玉米叶片DNA
CTAB法是玉米基因组DNA提取中最常用的方法之一，提取的DNA质量也是比较高的，缺点是提取通量较低，需要使用氯仿等有毒试剂。
(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
(2)用取样器取6片玉米叶片(约12mg)置于2ml离心管中，加入粒径5mm的钢珠1颗和裂解液(CTAB 4g，NaCl 16.34g，1M Tris-HCl 20ml(pH8.0)，0.5M EDTA 8ml，用超纯水定容至200ml(pH8.0)，然后灭菌)直接研磨或加钢珠用液氮磨至粉状；
(3)加入500ul的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，30min后取出；
(6)冷却2min后，加入500ul的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，剧烈振荡2～3min(若提取的是总基因组，则不能剧烈震荡)，使两者混合均匀；
(7)放入离心机中12000rpm离心10min，与此同时，将300ul预先在-20℃预冷的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
(8)12000rpm离心10min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入装有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合；
(9)12000rpm离心10min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
(10)60s后，直立离心管，加入400ul的75％乙醇轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物悬浮于液体中；
(11)放置30min，使DNA块状物中的杂质溶解；
(12)12000rpm离心10min后，倒掉液体，再加入400ul 75％的乙醇，将DNA再洗30min；
(13)12000rpm离心10min后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)；
(14)加入60ul 1×TE缓冲液，使DNA溶解。
方法2：用本发明的植物组织基因组DNA提取试剂盒及配套方案提取玉米基因组DNA
本试剂盒包含组织裂解液、磁珠结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液II、洗涤液III和DNA洗脱液：①组织裂解液为：0.1％的十六烷基三甲基溴化铵，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.01mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，1mol/L氯化钾，2％的PVP40；②磁珠结合液为：2mg/ml直径为400nm的硅羟基生物磁珠，90％异丙醇溶液，一定范围内磁珠浓度越高结合DNA的能力就越强；③洗涤液Ⅰ为：2％的十二烷基硫酸钠，60％乙醇，1mol/L氯化钠，0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.005mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)；④洗涤液II为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.005mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，0.3mol/L醋酸钠，5ml冰醋酸(1L)，75％乙醇；⑤洗涤液III为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.001mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，75％乙醇；⑥DNA洗脱液为：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，0.001mol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)，可根据实际需求选择是否加核糖核酸酶(RNase A)。
DNA提取方法如下：
(1)用打孔器取6片玉米叶(约12mg)置于1.4ml空白管中，然后置于空白管架上架上，给每个样品管中加入4mm钢珠2颗；
(2)用微孔板分液器或类似加液设备给每孔加300ul组织裂解液，1500rpm研磨3min。水浴过程中，打开DNA自动提取工作站做准备工作，比如装载枪头和准备磁珠结合液等。
(3)65℃水浴30-40min，然后4000rpm离心10min。
(4)离心结束后拿出，揭开96孔板热封膜，放置于利用磁珠法进行DNA提取的工作站中(如LGC公司的OKTOPURE工作站)。
(5)自动化DNA提取工作站可自动完成以下步骤，仅需对提取步骤和时间进行适当的修改。首先调整合适的吸液高度吸取上清，避免吸取到沉淀的杂质。将上清吸取到等体积的磁珠结合液中，并吸打混匀，等待100s后置于磁力架上，等待结合180s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入200ul的洗涤液Ⅰ，并吸打混匀，等待100s后置于磁力架上，等待结合180s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入200ul的洗涤液II，并吸打混匀，等待100s后置于磁力架上，等待结合180s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入200ul的洗涤液III，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合100s后，将废液全部吸走。移走磁力架，加入60ul DNA洗脱液，并吸打混匀，等待180s后置于磁力架上，等待结合60s后，将DNA吸取到新的96孔板中；⑦将装有DNA的96孔板封膜或盖上配套的硅胶盖，低温保存，DNA提取结束。
方法3：用进口试剂盒(美国艾吉析科技，货号NAP44914)配合本发明DNA提取方法提取玉米基因组DNA，所采用的试剂盒为进口的磁珠法DNA提取试剂盒。
根据图1和图2的几个重复结果来看，三种方法提取的DNA都有着一少部分的降解，但主带清晰。方法1和方法3是两种常用的高质量DNA提取方法，与本发明的提取试剂盒及方案相比可以看出，在DNA质量方面，方法1提取的DNA浓度更高降解也更为明显，方法3则质量和浓度均相对稍差。尽管选取的为玉米授粉后质量较差叶片，本发明的试剂盒提取的DNA浓度相较方法1虽浓度稍低，但纯度较高有清晰主带，且DNA浓度也较高，因为一般实验少量RNA影响较小，所以未使用RNase A，260/280均会偏高一点。相比于常规方法1，本试剂盒及配套提取方案有着极高的效率提升，实现了高通量、高效率和低劳动量的目标，提取效率是常规方法的10倍左右。相比于进口磁珠法试剂盒，不仅提取的DNA质量和浓度更胜一筹，且本试剂盒在成本上节省了10倍左右。
实施例2对提取的DNA进行标记检测
按照实施例1中方法2提取玉米叶片基因组DNA。对提取的DNA进行以下操作：
1、常规标记检测：选用一个玉米常用的内参基因zSSIIb标记，以提取的DNA为模板，根据公布的引物(引物序列：zSSIIb-1F:5′-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3′，zSSIIb-2R:5′-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3′，预期扩增片段大小151bp)对该标记进行PCR扩增，PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图3(所用Marker为2000DNAMarker)。
2、KASP标记检测：随机选取一个多态性较好的KASP标记，再随机挑选一些用本实验方案提出的玉米叶片DNA进行分型，分型前将DNA进行稀释至KASP检测所需要的浓度即可。PCR程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火60s，退火温度每个循环下降0.6℃最后至55℃，10个循环；94℃20s，55℃60s，26个循环；30℃(低于40℃适合读取荧光的温度即可)60s。荧光检测分型结果见图4。
根据不同类型标记的检测结果，可以看出普通PCR扩增和KASP荧光分型效果均十分良好，完全达到了日常实验检测所需标准。
实施例3利用提取的DNA进行文库构建
将实施例1中方法2提取玉米叶片基因组DNA送至石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行质检及建库测序，对于建库DNA的要求标准为：
A类：样品质量满足建库测序要求，且总量满足2次或2次以上建库需要；
B类：样品质量满足建库测序要求，且总量满足1次但不足2次建库需要；
C类：样品质量不完全满足建库测序要求，可以尝试建库；
D类：样品质量完全不满足建库测序要求，不建议使用的样品。
从图5和图6的质检结果中可以看出，本发明提取的玉米叶片基因组DNA质量大部分为B级水平，99％以上都可以达到测序建库的标准。进一步根据5000份以上玉米材料的测序结果来看，一般情况下数据缺失率均在1％左右，总体数据缺失率的平均值也在1％左右，测序数据在正常测序误差的范围之内，因此本发明提取的DNA能够满足一般测序建库样品的需求。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.玉米叶片取样方法和基因组DNA高通量提取方法，其特征在于，包括：
1)将6-16mg玉米叶片置于1.4ml空白管中，然后置于96孔板架上，盖上薄薄的一层透气性较好的海绵，再盖上盖子，防止管子顶部和盖子之间有空隙，再将96孔板防置于装有干燥剂和脱氧剂的自封袋中，置于冰盒中或4℃保存；若取样完成后的样品需要保存较长时间，则先将96孔板从自封袋中取出，用离心机离心将叶片甩至管低，然后打开盖子用冷冻干燥机冷冻干燥，完成后再盖上盖子置于阴凉干燥处，或置于装有干燥剂的自封袋中4℃保存；
取完样后再将管放置到96孔板架上，然后向各管中加入1-2颗粒径4mm的钢珠，然后用微孔板分液器或96通道工作站或排枪向各管中加入250-400ul组织裂解液；对96孔板进行封膜，用磨样器进行研磨直至叶片充分磨碎；
2)叶片磨碎后将96孔板置于60-65℃水浴锅中进行水浴30-40min，水浴结束后放入适配96孔板的离心机中3000-4000rpm离心10-15min，然后去掉96孔板上的封膜，将96孔板放置在基于磁珠法提取DNA的半自动或全自动工作站中；
3)取上清加入到等体积的磁珠结合液中，并吸打混匀，待结合后利用磁力架使磁珠与液体分离，待分离后吸走所有液体；
4)将洗涤液Ⅰ加入磁珠中清洗，清洗后磁珠与液体分离，吸走所有液体；
5)将洗涤液Ⅱ加入磁珠中清洗，清洗后磁珠与液体分离，吸走所有液体；
6)将洗涤液III加入磁珠中清洗，清洗后磁珠与液体分离，吸走所有液体；
7)清洗后的磁珠用DNA洗脱液进行洗脱，得到纯化的DNA；
其中，所述玉米叶片为苗期到玉米授粉后2周之间的叶片；
所述组织裂解液为：0.1％～2％CTAB，0.1mol/L Tris pH8.0，0.01mol/L EDTA pH8.0，1mol/L氯化钾，1-3％PVP40；
所述磁珠结合液的制备方法为：将直径为300-600nm的硅羟基磁珠与异丙醇混合，用超纯水定容，即得磁珠结合液；所述磁珠结合液中硅羟基磁珠的终浓度为2-5mg/mL，异丙醇的终浓度为90％；
所述洗涤液Ⅰ为：1-3％SDS，50-60％乙醇，0.5-1mol/L氯化钠，0.01-0.05mol/L TrispH8.0，0.005～0.01mol/L EDTA pH8.0；
所述洗涤液Ⅱ为：0.01-0.05mol/L Tris pH8.0，0.005-0.01mol/L EDTA pH8.0，0.1-0.3mol/L醋酸钠，0.5-2％冰醋酸，75％乙醇，用超纯水定容；
所述洗涤液III为：0.01mol/L Tris pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，75％乙醇，用水定容；
所述DNA洗脱液为：0.01mol/L Tris pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中向吸附有DNA的磁珠中加入200-300ul洗涤液Ⅰ。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中向吸附有DNA的磁珠中加入200-300ul洗涤液Ⅱ。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中向吸附有DNA的磁珠中加入200-300ul洗涤液III。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述工作站为OKTOPURE DNA自动提取工作站。
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