CN112075343B - 一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，属于植物基因技术领域。该方法包括烟草叶盘的制备、烟草叶盘的处理、烟草叶盘的培养、是否携带卡那霉素抗性标签的判定这几大步骤。通过本发明方法能直接通过叶盘颜色判定素材有无标签，无需其他分子试验，此方法操作简便、可直接观察且判定正确率较高。本发明方法可操作性强，同时可以节约成本，并且不受相关生化试剂及仪器设备的限制，易于推广应用。

Description

一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法

技术领域

本发明属于植物基因技术领域，具体涉及一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法。

背景技术

基因编辑，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。利用基因编辑技术可以精确的定位到基因组的某一位点上，在该位点剪断靶标DNA片段，插入、敲除或定点修改基因片段。通过基因编辑，特定的敲除某一基因、或者插入某一基因、或者定点突变使基因失活，可以最直接有效的研究该基因功能以及它对植物各方面性状的影响。目前，应用最多的是CRISPR/Cas9系统，其可对特定外源DNA序列进行剪切，该技术已经在拟南芥、烟草、水稻等多类植物中实现了成功编辑，从而获得大量的植物基因编辑素材。

近年来，植物基因编辑研究快速发展，基因编辑将带有编辑目的基因的SgRNA与表达载体载体连接，后导入植物，之后对植物基因组进行修饰，随着基因编辑技术的不断改进，编辑素材数量和规模也相应增大，通过DNA提取PCR扩增或分子检测的方法来大批量筛选有无标签的方法通常耗费人力、费用昂贵。因此，建立一种能够在庞大的编辑素材群体中可直观、简便、低成本、有效地判定其植株有无标签的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，该方法主要是利用卡那霉素溶液处理烟草叶盘后，可直接肉眼观察叶盘变化，从而判定基因编辑素材是否含有标签，此方法对于获得大量的基因编辑素材有无标签鉴定具有重要意义，并对后续的育种研究提供实际指导条件。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，包括如下步骤：

步骤（1），制备烟草叶盘；

步骤（2），将步骤（1）制备好的烟草叶盘置于培养皿中，加入含有卡那霉素的MS液体培养基中进行浸泡；所述的含有卡那霉素的MS液体培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+200mg/L~400mg/L卡那霉素；

步骤（3），将浸泡在含有卡那霉素的MS液体培养基中的烟草叶盘放置于培养室进行培养；

步骤（4），当观察到烟草叶盘呈现为黄白色时，则表示所取叶盘的植株为无标签；当观察到烟草叶盘呈现绿色时，则表示所取叶盘的植株携带卡那霉素抗性标签。

进一步，优选的是，步骤（1）中，利用直径0.6-1.2cm的打孔器制备烟草植株叶盘。

进一步，优选的是，步骤（1）中，制备烟草叶盘植株选择T0、T1、T2及Tn代植株作为材料，T0代植株选择生长具有4-5片真叶之后的植株；T1、T2及Tn代植株选择团棵期及以后。

进一步，优选的是，步骤（2）中，含有卡那霉素的MS液体培养基的制备方法为：向MS基本培养基中添加蔗糖至30g/L，pH值为5.7；之后添加过滤灭菌的卡那霉素调至培养基中卡那霉素浓度为200mg/L~400mg/L。

进一步，优选的是，步骤（3）中，叶盘的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养7-15d，并进行观察。

本发明构思是：由于氨基糖苷类抗生素进入植物细胞可与细胞内的30S核糖体结合，使细胞中的蛋白质合成受阻而逐渐褐化死亡，而npt-II基因(新霉素磷酸转移酶基因)编码的表达产物能够影响抗生素与核糖体亚基的结合，从而使抗生素失活，因而npt-II基因具有卡那霉素抗性，是一个有效的选择标记基因；因此，本发明通过利用卡那霉素溶液处理烟草叶盘，根据其培养后的性状来判定基因编辑素材是否含有标签。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、本发明针对目前获得的大量基因编辑素材，可以通过卡那霉素筛选烟草叶盘直接通过叶盘颜色判定素材有无标签，无需其他分子试验，此方法操作简便、可直接观察且判定正确率较高。

2、该方法可操作性强，同时可以节约成本，每个样品与现有技术相比可节约成本10-20倍，并且不受相关生化试剂及仪器设备的限制，其所用实验试剂更为常规。

附图说明

图1为含有卡那霉素MS溶液处理T0代组培烟草叶盘观察结果；

图2为35S、NOS、Cas9(CSN) 3对引物PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，包括如下步骤：

步骤（1），制备烟草叶盘；

步骤（2），将步骤（1）制备好的烟草叶盘置于培养皿中，加入含有卡那霉素的MS液体培养基中进行浸泡；所述的含有卡那霉素的MS液体培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+200mg/L卡那霉素；

步骤（3），将浸泡在含有卡那霉素的MS液体培养基中的烟草叶盘放置于培养室进行培养；

步骤（4），当观察到烟草叶盘呈现为黄白色时，则表示所取叶盘的植株为无标签；当观察到烟草叶盘呈现绿色时，则表示所取叶盘的植株携带卡那霉素抗性标签。

实施例2

一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，包括如下步骤：

步骤（1），制备烟草叶盘；

步骤（2），将步骤（1）制备好的烟草叶盘置于培养皿中，加入含有卡那霉素的MS液体培养基中进行浸泡；所述的含有卡那霉素的MS液体培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+400mg/L卡那霉素；

步骤（3），将浸泡在含有卡那霉素的MS液体培养基中的烟草叶盘放置于培养室进行培养；

步骤（4），当观察到烟草叶盘呈现为黄白色时，则表示所取叶盘的植株为无标签；当观察到烟草叶盘呈现绿色时，则表示所取叶盘的植株携带卡那霉素抗性标签。

步骤（1）中，利用直径0.6-1.2cm的打孔器制备烟草植株叶盘。制备烟草叶盘植株选择T0、T1、T2、Tn代植株作为材料，T0代植株选择生长具有4-5片真叶之后的植株；T1、T2及Tn代植株选择团棵期及以后。

步骤（2）中，含有卡那霉素的MS液体培养基的制备方法为：向MS基本培养基中添加蔗糖至30g/L，pH值为5.7；之后添加过滤灭菌的卡那霉素调至培养基中卡那霉素浓度为400mg/L。

步骤（3）中，叶盘的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养7-15d，并进行观察。

实施例3

一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，包括如下步骤：

步骤（1），制备烟草叶盘；

步骤（2），将步骤（1）制备好的烟草叶盘置于培养皿中，加入含有卡那霉素的MS液体培养基中进行浸泡；所述的含有卡那霉素的MS液体培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+300mg/L卡那霉素；

步骤（3），将浸泡在含有卡那霉素的MS液体培养基中的烟草叶盘放置于培养室进行培养；

步骤（4），当观察到烟草叶盘呈现为黄白色时，则表示所取叶盘的植株为无标签；当观察到烟草叶盘呈现绿色时，则表示所取叶盘的植株携带卡那霉素抗性标签。

步骤（1）中，利用直径0.6-1.2cm的打孔器制备烟草植株叶盘。制备烟草叶盘植株选择T0、T1、T2、Tn代植株作为材料，T0代植株选择生长具有4-5片真叶之后的植株；T1、T2及Tn代植株选择团棵期及以后。

步骤（2）中，含有卡那霉素的MS液体培养基的制备方法为：向MS基本培养基中添加蔗糖至30g/L，pH值为5.7；之后添加过滤灭菌的卡那霉素调至培养基中卡那霉素浓度为300mg/L。

步骤（3）中，叶盘的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养7-15d，并进行观察。

应用实例1

本实例是基于利用卡那霉素溶液处理T0代烟草组培苗叶盘，是一种简便有效判定基因编辑素材有无标签的方法，包括如下步骤：

步骤（1），烟草叶盘的制备：选择具有4-5片真叶的T0代组培苗，利用直径1cm的打孔器制备5种烟草叶盘，其中包括对照红花大金元（阴性对照）叶盘与编号为1、2、3的基因编辑素材以及阳性对照（确定有转化标签）植株叶盘，每个植株制备10-15个烟草叶盘；

步骤（2），烟草叶盘的处理：将步骤（1）制备好的5种烟草叶盘放置于直径60mm培养皿中，加入含有200mg/L卡那霉素的MS液体培养基（即MS基本培养基+30g/L蔗糖+200mg/L卡那霉素）中进行浸泡；含有卡那霉素的MS液体培养基的制备方法为：向MS基本培养基中添加蔗糖至30g/L，pH值为5.7；之后添加过滤灭菌的卡那霉素调至培养基中卡那霉素浓度为200mg/L。

步骤（3），烟草叶盘的培养：将浸泡在含有卡那霉素的MS液体培养基中的烟草叶盘放置于培养室进行培养；叶盘的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养7-15d，期间进行观察记录叶盘的变化情况；

步骤（4），提取烟草DNA：取样，用镊子取步骤（1）中5种素材植株新鲜叶片0.1g，严格按照植物基因组DNA提取试剂盒[优选采用植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)]的使用说明书及规程进行5个样品的DNA提取；提取完成后获得5个样品DNA，将获得的DNA放置冰箱(低于4℃)保存；

步骤（5），PCR检测：将步骤（4）中提取好的5个DNA样品，依据烟草与烟草制品转基因检测方法（GB/T 24310-2009），选用35S、NOS及Cas9（CSN）3对引物进行PCR扩增，首先进行PCR扩增体系的添加，在通风橱或超净工作台中进行PCR反应体系添加，同时将反应体系放置冰上进行配制。按照GBT 24310-2009烟草及烟草制品 转基因检测方法，进行PCR体系添加，本实验室利用2 × Rapid Taq Master Mix、对应的上下游引物、及提取的样品DNA模板进行反应体系添加，配制50μL PCR扩增体系，其中2 × Rapid Taq Master Mix 25μL、10μmol/L浓度的上下游引物各2μL、样品DNA模板根据测定的浓度进行添加（根据所测得浓度按600ng加入DNA模板），其余用无菌水补齐。对于检测过程中每次包含样品对照（阳性对照是经鉴定为含有检测目标成分的对照烟草样品、阴性对照经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品、空白对照是样品DNA提取过程中放置在操作区内的开盖的空白参照样品及试剂对照是检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品；其中空白对照和试剂对照按照国标《烟草及烟草制品转基因检测方法GBT 24310-2009》来设置即可）。然后进行PCR扩增程序设定，对于本实验室标签检测设计的引物NOS、35S、Cas9（CSN）3对引物，其退火温度分别是63℃、64℃、56℃，进行反应的体系是50μL，扩增程序为95℃ 3min; 95℃ 15s,退火温度 15s, 72℃10s, 35个循环；72℃ 5min; 12保存。最后对PCR程序完成后，获得的PCR扩增产物，进行电泳分析检测，获得PCR检测结果。具体方法是：

将制备好的1.5%琼脂糖凝胶放置于电泳槽中（电泳缓冲液可以先放置4℃冰箱中冷藏，以便电泳过程中条带更清晰）；

取10μL PCR产物与10μL染料进行混合，将样品与Marker点至胶孔，145V电泳45 min；

取出电泳好的凝胶，在凝胶成像仪中观察条带，并保存图片；

采用35S引物对：

35S-F：5'-ctacaaatgccatcattgcg-3’；（SEQ ID NO.1）

35S-R：5'-gggtcttgcgaaggatagtg-3’；（SEQ ID NO.2）

扩增片段有两条，长度分别为205bp和522bp。

NOS引物对：

NOS-F：5'-gattgaatcctgttgccggt-3’；（SEQ ID NO.3）

NOS-R：5'-gtaacatagatgacaccgcg-3’；（SEQ ID NO.4）

扩增片段长度为213bp。

Cas9(CSN)引物对：

Cas9(CSN)-F：5'-cattgcgttgtcactcgg-3’；（SEQ ID NO.5）

Cas9(CSN)-R：5'-tgcgtagccattcttgga-3’；（SEQ ID NO.6）

扩增片段长度为358bp。

步骤（6），烟草叶盘培养方法与PCR检测结果对比：将步骤（3）中得到的烟草叶盘观察结果（图1）与目前公认的标签检测方法PCR检测结果（图2）进行对比。

本实施例中，经含200mg/L卡那霉素的MS液体培养基浸泡处理这5种烟草叶盘，7d后烟草叶盘发生变化，但在15d后发现烟草叶盘变化更为明显，且可以更加清楚的判定，红花大金元（阴性对照）叶盘大多数为黄白色，阳性对照（确定有转化标签）叶盘颜色较绿，1与2号基因编辑素材叶盘多数为黄白色，3号基因编辑素材叶盘颜色较绿，此结果说明1与2号基因编辑素材为无标签材料，而3号基因编辑素材为有标签材料；通过PCR检测结果发现，红花大金元（阴性对照）、1与2号基因编辑素材、空白对照及试剂对照，进行3对引物PCR扩增之后，均无条带，而阳性对照（确定有转化标签）与3号基因编辑素材具有目的条带，说明1与2号基因编辑素材为无标签材料，而3号基因编辑素材为有标签材料。经过分析发现经过卡那霉素筛选获得植物素材有无标签的结果与目前公认的标签检测方法PCR检测结果基本一致。

应用实例2

本实施例是基于利用卡那霉素溶液处理T1代烟草漂盘苗叶盘，是一种简便有效判定基因编辑素材有无标签的方法，包括如下步骤：

步骤（1），烟草叶盘的制备：选择团棵期的T1代漂盘苗，将从温室或大棚取回的叶片进行自来水冲洗5min，再利用无菌水冲洗5次，之后利用直径0.8cm的打孔器制备烟草叶盘，其中包括对照红花大金元（阴性对照）叶盘与基因编辑素材以及阳性对照（确定有转化标签）植株叶盘，每个植株制备10-15个烟草叶盘；

步骤（2），烟草叶盘的处理：将步骤（1）制备好的烟草叶盘放置于直径60mm培养皿中，加入含有400mg/L卡那霉素的MS液体培养基（即MS基本培养基+30g/L蔗糖+400mg/L卡那霉素）中进行浸泡；

步骤（3）、步骤（4）、步骤（5）与实施例1一致；

步骤（6），烟草叶盘培养方法与PCR检测结果对比：将步骤（3）中得到的烟草叶盘观察结果与目前公认的标签检测方法PCR检测结果进行对比（未放置图片）。

本实施例中，经含400mg/L卡那霉素的MS液体培养基浸泡处理这烟草叶盘，7d后烟草叶盘发生变化，但在15d后发现烟草叶盘变化更为明显，且可以更加清楚的判定，红花大金元（阴性对照）叶盘大多数为黄白色，阳性对照（确定有转化标签）叶盘颜色较绿，无标签基因编辑素材叶盘颜色为黄白色，有标签基因编辑素材叶盘颜色为绿色；通过PCR检测结果发现，红花大金元（阴性对照）无标签基因编辑素材、空白对照及试剂对照，进行3对引物PCR扩增之后，均无条带，而阳性对照（确定有转化标签）与有标签基因编辑素材具有目的条带。

综上试验可知，经含有卡那霉素溶液浸泡培养烟草叶盘，观察烟草叶盘变化，从而获得植物素材有无标签的结果，且结果与目前公认的标签检测方法PCR检测结果基本一致。说明本发明方法对于素材有无标签的判定行之有效。因此成功构建一种简便有效判定基因编辑素材有无标签的方法。

采用本发明方法同时对K326、NC102、NC297、云烟85、云烟87、云烟97、中烟100这些品种的烟草植株进行检测，每个品种随机抽取10株，每个植株制备10个烟草叶盘，检测发现经过本发明方法筛选获得上述素材有无标签的结果与目前公认的标签检测方法PCR检测结果基本一致，本发明方法准确率为95%以上。

此外，本发明在研究中发现，卡那霉素低于本发明保护的范围，例如MS液体培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+50mg/L卡那霉素，处理后，所有叶片显示都是绿色，没有明显的区分；卡那霉素高于本发明保护的范围，烟草叶盘也都呈现黄白色，没有区分度。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ctacaaatgc catcattgcg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gggtcttgcg aaggatagtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gattgaatcc tgttgccggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtaacataga tgacaccgcg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cattgcgttg tcactcgg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgcgtagcca ttcttgga 18

Claims (1)

1.一种简便有效检测烟草基因编辑素材有无标签的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），制备烟草叶盘；

步骤（2），将步骤（1）制备好的烟草叶盘置于培养皿中，加入含有卡那霉素的MS液体培养基中进行浸泡；所述的含有卡那霉素的MS液体培养基为MS基本培养基+30g/L蔗糖+200mg/L~400mg/L卡那霉素；

步骤（3），将浸泡在含有卡那霉素的MS液体培养基中的烟草叶盘放置于培养室进行培养；

步骤（4），当观察到烟草叶盘呈现为黄白色时，则表示所取叶盘的植株为无标签；当观察到烟草叶盘呈现绿色时，则表示所取叶盘的植株携带卡那霉素抗性标签；

步骤（1）中，利用直径0.6-1.2cm的打孔器制备烟草植株叶盘；

步骤（1）中，制备烟草叶盘植株选择T0、T1、T2及Tn代植株作为材料，T0代植株选择生长具有4-5片真叶之后的植株；T1、T2及Tn代植株选择团棵期及以后；

步骤（2）中，含有卡那霉素的MS液体培养基的制备方法为：向MS基本培养基中添加蔗糖至30g/L，pH值为5.7；之后添加过滤灭菌的卡那霉素调至培养基中卡那霉素浓度为200mg/L~400mg/L；

步骤（3）中，叶盘的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养7-15d，并进行观察。

Images