CN117126860A

CN117126860A - Dtx31基因及其用途

Info

Publication number: CN117126860A
Application number: CN202210546919.5A
Authority: CN
Inventors: 宋佳丽; 李乐攻; 张海纹
Original assignee: Beijing Second Foreign Language College Affiliated High School
Current assignee: Beijing Second Foreign Language College Affiliated High School
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2023-11-28

Abstract

本申请公开一种DTX31基因及其用途。本申请的DTX31基因具有核苷酸序列(SEQ ID NO:1)或具有促进植物根毛伸长受阻的突变体。本申请还涉及特异性识别基因的靶序列，例如SEQ ID NO:2。本申请还涉及转化有基因或其变体的转基因植物以及作为靶序列的基因编辑植物。本申请还涉及所述基因或其变体用于影响植物根毛伸长的用途。

Description

DTX31基因及其用途

技术领域

本申请涉及一种基因，特别涉及DTX31基因及其用途。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科植物，拟南芥地域分布广，属于自花受粉植物，基因高度纯合，采用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。同时由于拟南芥基因组小，由五对染色体组成。拟南芥基因组约为12,500万个碱基对，包含约2.6万个基因，编码约2.5万种蛋白质。通过物理(例如辐射处理)、化学(例如EMS诱变)及生物(例如利用植物内源转座子或者根瘤农杆菌将DNA片段转入拟南芥基因组)的手段，已获得大量的发生在不同基因位点的突变体。

拟南芥具有植株小、结实多、生命周期短；形态特征分明，突变表型易于观察；自交繁殖，易于保持遗传稳定性；基因组简单、遗传操作简便、适宜在实验室培养的优点；因此成为全球应用最广泛的模式植物。模式植物的选择和利用对于开展遗传分析、基因克隆和功能研究意义重大。目前的研究主要在于表观遗传性、种子发育、细胞极性生长、植物免疫、胁迫问题等。

根毛是表皮细胞向外突出的、顶端密闭的管状结构，易与土粒紧贴在一起，以便有效地进行吸收。根毛的长度一般为数十微米到一千几百微米，这样可以增加植物吸收养分的表面积。根毛的数量很多，同时集生于根尖的一定区域，主要位于根尖的成熟区，进而形成根毛区，这也是吸收水分和无机盐的主要部位。

根毛中含有参与营养吸收和酶类和养分转运体，它对养分的吸收功能一直是植物营养、生理和农学专家的研究重点。根毛细胞的伸长是典型的极性细胞的顶端生长，其过程主要包括：细胞壁的软化和新细胞壁的定向沉积、囊泡运输、微管微丝的聚集和膨压的动力驱动。现有技术中关于膨压与细胞伸长之间的具体关系以及膨压调控的分子机制的公开很少，也没有公开调节膨压影响细胞伸长的关键基因。然而膨压对根毛细胞伸长的影响是十分重要的，如果管膨压过低会造成细胞质膜无法紧紧地贴着细胞壁，会严重影响根毛细胞的正常生长。目前的研究推测钾离子和氯离子影响了根毛细胞伸长过程中的膨压，但是现有技术没有公开钾离子和氯离子是如何影响根毛细胞膨压的，以及哪些基因在这个过程中发挥了重要作用。植物细胞伸长的动力来自于膨压，但是却没有公开调节膨压的关键基因。

发明内容

本申请的DTX31基因序列通过超表达和基因编辑技术证实了DTX31基因具有促进植物根毛伸长的功能。

发明人在已完成的拟南芥全基因组测序的基础上，克隆了基因，通过转基因和基因编辑技术验证了其功能，通过与对照组比较，发现缺失了DTX31基因的突变体植株根毛伸长比野生型更短，而转入DTX31基因的回补植株根毛伸长程度回复到野生型水平。在野生型基础上过表达DTX31得到的过表达植株的根毛比野生型更长，由此验证了DTX31基因是根毛伸长相关的功能基因。

具体地，本申请包括以下几方面：

本申请的第一方面涉及一种促进植物根毛伸长的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，即DTX31基因，所述基因序列如下：SEQ ID NO:1：

MEKDNDFKDPFLASTEEEELDPATQKALMEYLGVGSRASSLVSFSSTAVDIPPISGVGDFVREFRIESRKLWKLAGPAIFTTMSQYSLGAVTQVFAGHISTLALAAVSIENSVIAGFSFGIMLGMGSALETLCGQAFGAGKVSMLGVYLQRSWVILSVTALFLSLIYIFAAPILTFIGQTAAISAMAGIFSIYMIPQIFAYAINFPTAKFLQSQSKIMVMAGISGVVLVIHSFFTWLVMSRLHWGLPGLALVLNTSWWVIVVAQLVYIFNCTCGEAWSGFTWEAFHNLWGFVKLSLASAAMLCLEIWYFMALVLFAGYLKNAEVSVAALSICMNILGWAAMVAFGTNAAVSVRVSNELGASHPRTAKFSLVVAVILSTAIGMFIAAGLLFFRNEYPVLFVEDEEVRNVVRELTPMLAFCIVINNVQPVLSGVAVGAGWQAVVAYVNIACYYLFGVPFGLLLGFKLEYGVMGIWWGMVTGTFVQSIVLTWMICKTNWEKEASMAEERIKEWGGVPAEKETLLN。

本申请还涉及与SEQ ID NO:1所示序列互补的核苷酸序列，或其具有促进植物根毛伸长功能的选择如下的变体：

1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

2)对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和

3)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

本申请中术语“杂交条件”和“严紧性程度”属于本领域熟知的概念，并且具有相同的含义。

在本申请中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同或相似的促进植物根毛伸长的活性。

在本申请中，对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

在本申请中，对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同或相似的功能。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO:1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”。

在本申请中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST2.0算法，BLAST和BLAST2.0可以用于确定本申请的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

在本申请中，所述的DTX31基因来源于拟南芥，也可以人工合成。

本申请还涉及对上述DTX31基因序列具有特异性识别并编辑的靶序列，如含有SEQID NO:2所示的靶序列，所述靶序列如下：

SEQ ID NO:2

ATGGAGAAAGATAATGACTTCAAGGATCCGTTTCTGGCGTCAACTGAGGAGGAGGAGCTCGACCCGGCGACCCAAAAAGCATTGATGGAGTATCTTGGAGTCGGAAGCAGAGCATCTTCTCTTGTCTCCTTCTCCTCTACCGCCGTCGATATCCCTCCAATCTCCGGTGTCGGAGACTTTGTCAGAGAGTTTAGAATCGAGTCTAGAAAGCTATGGAAACTAGCTGGCCCTGCCATTTTTACAACGATGAGCCAATACTCTCTCGGAGCCGTCACTCAAGTTTTCGCCGGACATATTAGCACTCTTGCTCTTGCCGCCGTCTCCATTGAGAACTCCGTCATCGCCGGCTTTTCATTTGGTATCATGCTTGGAATGGGAAGTGCGTTGGAAACGCTATGCGGACAAGCGTTTGGAGCAGGGAAAGTATCAATGCTTGGCGTTTACTTACAACGCTCGTGGGTTATTCTAAGCGTAACCGCTCTCTTCCTTTCTCTAATCTATATCTTCGCGGCTCCAATCCTGACCTTTATAGGCCAAACCGCTGCAATCTCGGCCATGGCAGGGATTTTCTCCATTTACATGATCCCACAAATCTTTGCCTACGCTATCAACTTCCCAACGGCGAAGTTTTTGCAATCACAAAGCAAGATCATGGTCATGGCTGGAATATCCGGTGTGGTTCTTGTGATCCATAGTTTCTTCACGTGGCTAGTCATGTCTAGGTTACACTGGGGACTTCCTGGTTTAGCTTTAGTGCTTAACACGTCGTGGTGGGTCATCGTTGTTGCACAACTTGTGTATATCTTTAATTGTACGTGTGGAGAGGCTTGGTCTGGATTTACGTGGGAGGCTTTTCACAATTTGTGGGGGTTTGTTAAATTGTCTTTGGCTTCTGCTGCCATGCTCTGTTTGGAGATTTGGTATTTTATGGCACTCGTATTATTTGCTGGATATTTGAAGAATGCTGAAGTCTCCGTAGCTGCACTCTCCATATGCATGAACATTTTGGGATGGGCAGCTATGGTTGCGTTTGGGACAAACGCAGCAGTAAGTGTGAGAGTGTCAAATGAGCTAGGAGCTAGCCACCCAAGAACGGCCAAGTTTTCTCTAGTTGTGGCTGTGATATTGTCGACAGCAATTGGGATGTTTATAGCAGCCGGCCTACTCTTCTTCCGCAATGAGTACCCGGTTTTGTTTGTGGAAGATGAAGAAGTTAGAAATGTGGTTAGAGAACTCACGCCAATGCTTGCCTTTTGCATTGTCATCAACAATGTTCAACCTGTATTGTCTGGAGTGGCTGTGGGAGCGGGATGGCAAGCAGTTGTAGCGTATGTGAACATAGCATGCTACTACTTGTTCGGAGTCCCATTTGGTCTATTATTGGGATTTAAGCTTGAATATGGAGTAATGGGAATTTGGTGGGGGATGGTGACGGGAACTTTTGTTCAATCGATAGTCCTGACTTGGATGATCTGCAAAACCAATTGGGAGAAAGAGGCTTCAATGGCAGAGGAAAGGATAAAAGAATGGGGAGGAGTACCTGCAGAGAAAGAGACTCTTTTGAACTAG。

本申请还涉及一种载体，该载体含有本申请DTX31核苷酸序列，该载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。

本申请还涉及一种载体，该载体含有本申请所述的dtxX31靶序列，该载体可以通过例如将上述靶序列插入编辑载体或者可以通过人工合成得到。

本申请还涉及一种含有本申请载体的重组细胞，该重组细胞可以通过将含有本申请的载体转化至宿主细胞而得到。

适于构建本申请的重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞。

本申请还涉及一种双子叶植物愈伤组织，该愈伤组织转化有本申请的核苷酸序列和/或载体和/或感染有本申请的重组细胞。

本申请还涉及一种转基因植物，该转基因植物转化有本申请的核苷酸序列和/或载体和/或感染本申请的重组细胞。

本申请还涉及一种愈伤组织，其用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

本申请还涉及一种制备促进植物根毛伸长的转基因植物的方法。

所述方法包括用本申请的核苷酸序列转化双子叶植物的愈伤组织的步骤。在本申请的一个实施例中，所述双子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本申请的核苷酸序列的重组细胞。在本申请的一个实施例中，所述双子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了上述重组农杆菌。

在本申请中，可以采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于双子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本申请双子叶植物的基因转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

在本申请中，可以采用植物基因编辑技术对植物基因组中的目的基因进行编辑，包括CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs等。本领域周知，CRISPR/Cas9技术常被用于双子叶植物和双子叶植物的基因编辑，但其它编辑技术也可用于本申请所述双子叶植物的基因编辑。基因编辑后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

在一具体实施方式中，本申请的促进植物根毛伸长的方法，其包括以下步骤：

1)将本申请的核苷酸序列和/或重组载体转化入植物愈伤组织，或用本申请的重组细胞感染植物愈伤组织；

2)利用该愈伤组织再生转基因植物。

1)将本申请的编辑载体转化入植物愈伤组织，或用本申请的重组细胞感染植物愈伤组织；

2)利用该愈伤组织再生基因编辑植物。

本申请公开了DTX31基因促进植物根毛细胞生长，使根毛细胞生长良好，也为其他植物的根系改良、杂交育种或转基因植物的开发创造了条件。

本申请的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成法来获得。对于PCR扩增法，可以根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库为模板，扩増而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按照正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本申请的基因。用于PCR的引物可以根据本文所公开的本申请的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法，例如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本领域技术人员将认识到，本申请的实用性并不局限于对本申请的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

本申请利用高通量测序技术，通过基因的遗传转化和基因编辑，挖掘出促进植物根毛伸长的DTX31基因，所述基因能够大大提高转基因植物的根毛伸长，证明了DTX31基因是与控制植物根毛伸长的功能基因，这将有利于在分子水平上更深入探讨该功能形成的生理机理和机制，达到对植物产量和品质的合理调控作用，对各种经济作物的遗传育种产生重大的意义。

附图说明

图1A为根毛突变体dtx31与野生型WT表型。

图1B显示了dtx31突变体的获得。

图2A显示通过半定量PCR和GUS染色观察DTX31的表达模式。

图2B和图2C显示DTX31的亚细胞定位(拟南芥悬浮细胞体系)。

图3A显示了比较膨压和初始质壁分离。

图3B为野生型和突变体的根毛细胞质壁分离比例折线统计图。

图4A显示了有无外源基因时卵母细胞的电流。

图4B显示了DTX31对氯离子具有转运活性。

图5显示了氯离子对dtx31突变体表型的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。结合附图和实施例对本申请作进一步详细描述。

在进一步描述本申请具体实施方式之前，应当理解的是，本申请的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。

实验1DTX31基因的PCR扩增和(DTX31-pCambia1302)重组载体的构建

(1)AtDTX31基因的克隆，以DTX31-pCambia1302的构建为例，PCR体系：

(2)PCR反应条件：

(3)回收PCR产物：

a)直接回收：将反应产物直接加到DNA回收柱子上，加入三倍体积的HB Buffer，离心，再返上柱子，用Wash Buffer洗两次，空甩晾干，加入30μl dd H₂O洗下来即可。DNA纯化试剂盒购自美国OMEGA公司。

b)切胶回收：将反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，DNA片段用EB染色后在紫外切胶仪中切下目的DNA条带，放入2ml离心管中。

1)加入适量缓冲液(Binding buffer)，59℃恒温金属浴至融化，倒入层析柱，速度10000g离心1min；

2)将溶液再次倒回层析柱，重复上操作；

3)倒掉溶液，向层析柱中加入500μl缓冲液，速度10000g离心1min；

4)用SPW Wash buffer洗两次，13000g空甩2min；

5)将层析柱放到新的离心管中，打开盖子晾干残留酒精；

6)加入30μl dd H₂O，放置2min，13000g离心1min，4℃保存。

(4)限制性内切酶双酶切反应

50μl体系：

37℃恒温水浴酶切2.5小时。

(5)酶切回收

同PCR产物的回收。

(6)连接反应

将酶切回收的DNA片段与切开的载体连接，反应体系如下：

室温连接1小时。

(7)大肠杆菌的转化

1)将连接产物加入50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

2)42℃水浴锅或金属浴中热击90s，立即转移到冰上，放置2min；

3)向反应体系中加入500μl无菌液体LB培养基，混匀；

4)37℃摇床培养45min；

5)离心收集菌体；

6)吸掉上清液，将剩余菌体用移液枪吹打混匀，涂布于含相应抗性的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

(8)阳性克隆的筛选

菌落PCR反应体系：

用灭过菌的牙签挑取单克隆，在一块含相应抗生素的LB培养基上划线，并在菌落PCR反应液里轻轻沾几下使部分菌留到溶液里，挑选16个单克隆，37℃倒置过夜培养。菌落PCR程序同克隆基因时的程序。菌落PCR反应结束后，取10μl的反应液进行电泳检测，能够扩增到目的基因条带的为阳性克隆。

(9)提取阳性克隆质粒

确定阳性克隆后，用加入相应抗生素的液体LB培养基摇菌扩繁，培养温度37℃，转速200rpm，当菌体OD值达到1.0提取质粒。所用质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司。

1)将菌液倒入灭过菌的2ml离心管中，室温，10000g离心1min，倒掉上清，收集菌体，重复三次，6ml菌液为一个反应体系；

2)将底部沉淀有菌体的离心管倒扣在纸上，除去残余液体上清，加入250μl溶液一(含RNase A)，震荡器上震荡充分重悬菌液；

3)然后加入250μl溶液二，轻柔上下颠倒数次混匀，室温静置2min，破碎细胞；

4)再加入350μl溶液三，充分颠倒混匀，沉淀蛋白质等杂质；

5)室温条件下，转速13000g，离心15分钟；

6)将上清液转至层析柱中，室温10000g，离心1min；

7)向层析柱中加入500μl HB缓冲液，室温10000g离心1min；

8)加入750μl DNA Wash缓冲液，室温10000g离心1min；重复此步骤再洗一遍；

9)将收集液倒掉，空甩2min，甩干层析柱上的液体；

10)将柱子放置在干净的1.5ml离心管上，打开层析柱的盖子晾晒吹干，直到酒精完全挥发；

11)向层析柱中加入30μl dd H₂O，室温大于13000g离心1min，将提好的质粒保存在-20℃冰箱即可。

(10)载体测序

吸取5μl提取好的质粒送诺赛公司进行测序，测序引物为载体特定引物，拿到测序结果后用生物学软件DNAMAN进行序列比对分析，确保插入目的基因序列正确，插入位点正确且没有点突变，将正确的质粒留存备用。

实验2重组根癌农杆菌细胞的制备

(1)农杆菌感受态的制备

1)挑取已活化的农杆菌GV3101单菌落，放入20ml含有庆大霉素(Gen)和利福平(Rif)抗性的LB液体培养基中，在28℃恒温培养箱中，转速200rpm过夜培养；

2)室温条件下，转速5000g离心10min收集菌体；

3)加入1ml无菌1×TE溶液，重悬菌体即可，可液氮冻后-80℃保存。

(2)农杆菌GV3101转化

1)从-80℃取出GV3101感受态细胞置于冰上融化；

2)在每管农杆菌感受态细胞中加入10μl构建好的载体，冰浴5min；

3)置于液氮中冻2min；

4)取出后立即置于37℃水浴锅中，保持5min；

5)取出再次冰浴5min；

6)在超净工作台中加入1ml LB液体培养基；

7)28℃恒温培养箱中，200rpm培养4小时；

8)收集菌体：室温5000rpm离心5min；

9)涂布于含有三种抗性的LB固体培养基上，28℃倒置培养至少48小时，便可长出单克隆。

(3)阳性克隆的鉴定

与大肠杆菌的阳性克隆鉴定相似，用菌落PCR的方法鉴定。(注意PCR反应条件，预变性的时间相应延长一些，因为农杆菌的细胞不易破碎。)

(4)农杆菌侵染拟南芥植株

1)转化前一天，给待转的拟南芥植株浇水，保证湿润；

2)鉴定正确的农杆菌单菌落接种到含有三种抗生素的100ml LB液体培养基中，28℃摇床过夜培养至OD 600为2.0左右，5000rpm，离心10min收集菌体；

3)除去上清液，用转化液重悬菌体，保证完全混匀；

4)将拟南芥的花浸泡在混匀的转化液中，转化时间1min，转化过程中要不断摇晃转化液，保证农杆菌与花充分接触；

5)转化后的拟南芥平放在盒中，避光处理，黑暗过夜；

6)第二天扶起拟南芥，支撑好，保证足够的光照和营养，与周围别的植株隔离开，等待收种子；

7)果荚成熟后，收下所有种子，根据载体上的标记基因筛选转基因植株。

溶液配方：TE buffer

Tris-HCl 10mM

EDTA 1mM

pH＝7.5

转化液配方：

实验3 DTX31对根细胞的影响

3.1 DTX家族突变体的筛选和表型分析

3.1.1表型和遗传分析

通过本领域常规实验方法得到dtx31的纯合突变体，表型分析显示dtx31的根毛长度比野生型短，且互补植株表型能够得到恢复，说明缺失DTX31后，拟南芥的根毛伸长受到了限制(参见图1A)。

在本实施例中，将野生型(WT)和突变体dtx31的种子播撒在1/2MS的培养基上，在适宜的生长条件下培养四天，在体视显微镜下观察根毛，突变体dtx31与野生型相比根毛明显变短。将35S启动的DTX31基因转入dtx31突变体后，得到互补植株OE.DTX31/dtx31，且互补植株的表型恢复成野生型，证明dtx31根毛变短的表型是由DTX31基因的敲除而导致的(正常1/2MS培养基上培养四天后拍照，Bar＝0.2mm)。

在图1A中，(A)是野生型、dtx31突变体、35s:DTX31/dtx31互补植株RNA水平表达量检测。(B)是野生型、dtx31突变体、35s:DTX31/dtx31互补植株根毛表型(Bar:0.2mm)。

在图1B中，(A)是dtx31突变体T-DNA插入示意图。(B)是dtx31突变体鉴定：LP、RP是在T-DNA插入位点附近设计的引物，LBb1.3为T-DNA上的特异引物。

根据TAIR网站生物信息学预测结果，选择DTX家族成员中亚细胞定位在液泡膜或者细胞膜，组织定位在极性细胞，如根毛细胞、花粉管细胞、保卫细胞中的基因，从SIGnAL网站订购了以下五个基因At1g12950(DTX31)、At1g58340(DTX48)、At3g21690(DTX40)、At3g23550(DTX18)、At3g26590(DTX29)的突变体，共10个SALK突变体株系。经鉴定得到6个RNA水平完全敲除的纯合突变体：SALK_103884(DTX31)、SALK_067667(DTX48)、SALK_142702(DTX18)、SALK_062231C(DTX18)、SALK_119274C(DTX29)、SALK_076673C(DTX29)。得到2个RNA水平部分敲除的纯合突变体：SALK_098386(DTX48)、SALK_008195(DTX40)。鉴定的电泳图见图2A。

对突变体进行DNA水平的鉴定，首先提取待鉴定突变体和野生型植株的DNA，用特异引物RP和LBb1.3对所提取的DNA样品进行聚合酶链式反应扩增，以检验T-DNA是否插入，野生型中目的基因的两条染色体中均没有T-DNA插入，无T-DNA特异条带，突变体株系中能够扩增到特异条带的是T-DNA已正确插入的株系。选取有T-DNA插入的突变体植株，进行RNA水平的鉴定。根据各个基因的特异表达位置，提取其大量表达部位的RNA，具体为：提取SALK_103884、SALK_067667、SALK_098483、SALK_098386等突变体幼苗根部RNA，提取SALK_008195、SALK_066265、SALK_142702、SALK_062231C、SALK_119274C、SALK_076673C等突变体成熟花序的RNA，体外反转录为cDNA，以cDNA为模板，用基因的特异引物进行聚合酶链式反应，以Actin基因为内参，未检测到目标片段基因的株系即为RNA水平完全敲除的纯合突变体，目标片段基因表达降低的株系即为RNA水平部分敲除的纯合突变体。

实验4 DTX31的表达模式和DTX31的亚细胞定位

4.1 DTX31主要表达在根和根毛细胞中

为了确定DTX31在植物体内的表达情况和表达部位，发明人对DTX31做了半定量PCR的分析，以根、叶、茎、花的cDNA为模板，以ACTIN为内参，通过半定量PCR检测DTX31在不同植株部位中的表达情况，通过电泳图分析发现，DTX31基因主要表达在根中，在花中有十分微弱的表达，而在叶和茎中几乎没有表达(图2A-A)。

此外，构建了DTX31-promoter与GUS报告基因的重组质粒，利用农杆菌花侵染方法将重组质粒转入野生型拟南芥植株中，获得了NPDTX31::GUS的转基因植株，通过对T1代转基因植株进行筛选得到3株阳性克隆植株，将T2代材料进行GUS染色，GUS染色结果显示(如图2A-B)：基因主要表达在根毛细胞及根的成熟区，在萌发三天和七天的幼苗植株的根毛细胞中(图2A-B中a、b、c、d)，DTX31均有较高表达；在萌发一天的幼苗的根尖细胞中(图2A中B-e)，DTX31基因具有明显表达，随着植株的生长，根尖细胞中DTX31的表达消失(图2A中B-f)。DTX家族中有成员受到盐诱导表达水平加强，为观察DTX31基因是否受盐诱导，用75mM的NaCl溶液处理生长7天的转基因植株，结果显示有表达加强的现象出现，说明DTX31基因的表达可能受到盐溶液的诱导，有表达水平加强的作用(图2A-B-g，h)。

在图2A中，(A)是DTX31的半定量PCR结果(根、叶、茎和花)。(B)是DTX31的GUS染色结果：a、萌发两天的幼苗，DTX31在其根毛和根中都有表达(Bar:0.5mm)；b、萌发四天的幼苗DTX31在根毛和长根毛的根的区段都有表达(Bar:0.1mm)；c、生长七天的幼苗，DTX31主要在根毛中表达(Bar:0.2mm)；d、AtDTX31在根毛的发生点处表达(Bar:50μm)；e、萌发两天的幼苗根尖，DTX31有表达(Bar:50μm)；f、萌发四天的幼苗根尖，DTX31表达减弱甚至消失(Bar:50μm)；g、在正常培养基上生长十四天的幼苗DTX31在根中有表达(Bar:2mm)；h、在加有75mMNaCl的培养基上生长十四天的幼苗，DTX31表达量增多(Bar:2mm)。

4.2 DTX31特异定位于液泡膜

利用PEG介导的原生质体瞬时转化技术，把35S启动子驱动的DTX31::GFP融合基因瞬时表达在拟南芥野生型悬浮细胞中，过夜培养后在激光共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位。以35S驱动的GFP基因作为负对照，以特异定位于液泡膜的TPK1::GFP融合基因作为正对照。图2B显示空的GFP蛋白在叶绿体之外的细胞质中、细胞核以及细胞膜中都有表达，绿色荧光呈弥散状；而DTX31-GFP的绿色荧光在薄且部分弯曲的液泡膜上发出，在液泡膜的外周边缘有细胞核(图2B中黑色箭头所指)和细胞器存在，与TPK1-GFP表达模式十分相似。据此推断DTX31定位在液泡膜而不是细胞膜(图2B)。

图2B为拟南芥悬浮细胞：转入空的GFP的悬浮细胞做负对照；TPKI是特异定位于液泡膜上的蛋白质，转入TPKI-GFP的悬浮细胞做正对照；转入DTX31-GFP的悬浮细胞，液泡膜上发出绿色荧光，黑色箭头所指是细胞核(Bar:10μm)。

为了进一步验证DTX31的液泡膜定位，采用释放液泡的方法，与特异定位在液泡膜的TPK1蛋白做共定位检测。取生长三周左右的拟南芥叶片，提取其原生质体，通过PEG介导的原生质体瞬时转化技术把35S启动子驱动的DTX31::GFP融合基因瞬时表达在拟南芥原生质体中，过夜培养后通过控制缓冲液的渗透势将液泡完整的释放出来，用激光共聚焦显微镜观察。结果显示：DTX31-GFP融合蛋白定位在液泡膜上，释放出来的大液泡周围有叶绿体的环绕，并发出绿色荧光(图2C-A)，将特异表达在液泡膜的TPK1::RFP融合基因与DTX31::GFP融合基因共转化至原生质体中，激光共聚焦显微镜观察发现：DTX31-GFP融合蛋白与TPK1-RFP融合蛋白属于共定位，均位于液泡膜，确定DTX31是定位于液泡膜上的膜蛋白(图2C-B)。

图2C为拟南芥原生质体细胞释放的液泡，其中(A)表达DTX31-GFP融合蛋白的拟南芥原生质体释放出的液泡，周围有自发红色荧光的叶绿体环绕(Bar:10μm)。(B)特异表达在液泡膜的TPK1-RFP融合蛋白与DTX31-GFP融合蛋白共定位(Bar:10μm)。

实验5初始质壁分离法比较野生型与dtx31的根毛细胞

经初始质壁分离法比较野生型与dtx31的根毛细胞的膨压发现，dtx31根毛细胞膨压比野生型的大。图3A和3B(初始质壁分离法比较膨压)。图3A展示了不同渗透液处理下野生型与突变体根毛细胞质壁分离情况：用渗透势为250mOsm、300mOsm、400mOsm、500mOsm的渗透液同步处理生长四天的野生型和突变体幼苗后，根毛细胞质壁分离的情况：野生型根毛细胞在250mOsm渗透液处理下发生初始质壁分离，而突变体dtx31根毛细胞基本没有出现质壁分离情况；在300mOsm渗透液处理下，野生型根毛细胞质壁分离情况加重，质膜与细胞壁之间出现较大间隙，而突变体dtx31根毛细胞发生初始质壁分离，细胞膜与细胞壁刚刚分离；在400mOsm渗透液处理下，野生型根毛细胞中可以看到完整的液泡，突变体dtx31根毛细胞质壁分离情况加重，质膜与细胞壁之间出现较大间隙；在500mOsm渗透液处理下，野生型根毛细胞和突变体dtx31根毛细胞都全部发生质壁分离，都可以看到多个完整的小液泡，但野生型根毛细胞中的小液泡明显更小一些。白色箭头指示发生质壁分离的部位Bar＝10μm。与此同时图3B展示了野生型和突变体的根毛细胞质壁分离比例折线统计图。

实验6利用双电极电压钳(TEVC)方法探究DTX31功能

实验结果证实DTX31具有向外转运氯离子的功能(参见图4A和4B)。为了验证DTX31的离子转运功能，利用双电极电压钳技术记录DTX31的转运活性。当灌流液中有氯离子存在时，表达了DTX31的卵母细胞有较大的离子转运活性，而当用谷氨酸代替氯离子时，电信号消失。替换NaCl中的钠离子后，信号依然存在，加入氯离子通道的抑制剂DIDS后电信号完全被抑制。通过离子选择性实验，以及图4A可以看出，表达了DTX31的卵母细胞可以选择性的转运氯离子和溴离子，对苹果酸离子和柠檬酸离子并没有转运特性。

图4A中，左侧对照组未表达外源基因的爪蟾卵母细胞无明显电流产生，而右侧实验组显示了表达DTX31的卵母细胞记录到外向整流氯离子的电流。

通过离子选择性实验可以看出，表达了DTX31的卵母细胞可以选择性的转运氯离子和溴离子，对苹果酸离子和柠檬酸离子转运活性很小。

实验7氯离子强化dtx31突变体表型

通过改变培养基的成分，向培养基中加入不同浓度的无机盐离子以佐证氯离子对dtx31突变体表型的影响。结果表明：当向培养基中加入氯离子后，WT和dtx31根毛都会变短，但dtx31变短的幅度更大，当加入的氯离子浓度达到75mM时，dtx31基本没有根毛延伸出来，而WT还有根毛存在；当减少氯离子浓度时，dtx31根毛会一定程度的变长；而且加入其他无机盐离子无以上这两种情况发生；这个结果显示：dtx31根毛的伸长情况确实与培养基中氯离子浓度有相关性(参见图5)。

通过以上实验得知DTX31基因所编码的蛋白质是一个外向型的氯离子通道，当其缺失后，细胞内氯离子浓度异常，随之也导致细胞内膨压异常，进而影响根毛伸长。

尽管本申请的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种具有促进植物根毛伸长的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或与其互补的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:1为MEKDNDFKDPFLASTEEEELDPATQKALMEYLGVGSRASSLVSFSSTAVDIPPISGVGDFVREFRIESRKLWKLAGPAIFTTMSQYSLGAVTQVFAGHISTLALAAVSIENSVIAGFSFGIMLGMGSALETLCGQAFGAGKVSMLGVYLQRSWVILSVTALFLSLIYIFAAPILTFIGQTAAISAMAGIFSIYMIPQIFAYAINFPTAKFLQSQSKIMVMAGISGVVLVIHSFFTWLVMSRLHWGLPGLALVLNTSWWVIVVAQLVYIFNCTCGEAWSGFTWEAFHNLWGFVKLSLASAAMLCLEIWYFMALVLFAGYLKNAEVSVAALSICMNILGWAAMVAFGTNAAVSVRVSNELGASHPRTAKFSLVVAVILSTAIGMFIAAGLLFFRNEYPVLFVEDEEVRNVVRELTPMLAFCIVINNVQPVLSGVAVGAGWQAVVAYVNIACYYLFGVPFGLLLGFKLEYGVMGIWWGMVTGTFVQSIVLTWMICKTNWEKEASMAEERIKEWGGVPAEKETLLN。

2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述核苷酸序列SEQ ID NO:1。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核苷酸序列的靶序列，或含有权利要求1所述的核苷酸序列的互补序列的靶序列；所述靶序列是指能够对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行特异性识别的核苷酸序列，或能够对SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列进行特异性识别的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1。

4.权利要求1所述的核苷酸序列和/或权利要求2或3所述的载体用于影响植物根毛伸长的用途：优选地，所述植物是拟南芥。

5.权利要求1所述的核苷酸序列和/或权利要求2或3所述的载体用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

6.一种促进植物根毛伸长的方法，所述方法包括将权利要求1的核苷酸序列和/或权利要求2或3所述的载体转化入植物。

7.一种制备促进植物根毛伸长的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的核苷酸序列和/或权利要求2或3所述的载体转化入植物愈伤组织；

2)利用所述愈伤组织再生转基因植物，其中所述植物是拟南芥。