CN117586363A - 蛋白ZmRBOHC在调控植物产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛋白ZmRBOHC在调控植物产量中的应用，属于基因工程育种技术领域。本发明公开了蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在调控植物产量中的应用，所述蛋白质ZmRBOHC为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。本发明还公开了提高植物正常水分条件下产量的方法，包括将受体植物中所述蛋白的编码基因敲除，得到正常水分条件下产量高于受体植物的目的植物。本发明通过实验验证了蛋白ZmRBOHC对植物产量具有调控功能，蛋白ZmRBOHC及其相关生物材料可应用于植物产量的调控。

Description

蛋白ZmRBOHC在调控植物产量中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及ZmRBOHC在调控植物产量中的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是世界上广泛种植的重要作物，对世界的粮食安全及其重要。在全球气候粮食危机发生日益频繁的背景下，如何提高玉米的产量已经成为现代植物研究工作中急需解决的关键问题之一。
借助遗传学和植物分子生物学，挖掘并克隆玉米产量相关基因，通过基因工程方法将该类基因导入玉米中或在玉米中敲除从而提高正常生长条件下的玉米产量，具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何调控植物的产量。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质ZmRBOHC其相关生物材料在如下D1)-D4)任一中的应用，所述蛋白质ZmRBOHC为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
D1)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在调控植物产量中的应用；
D2)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在制备调控植物产量的产品中的应用；
D3)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在制备培育高产植物的产品中的应用；
D4)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在植物育种中的应用。
所述蛋白质ZmRBOHC的相关生物材料可以为调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质。
本发明中，SEQ ID No.1由948个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
进一步地，上述的应用中，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)抑制或降低上述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低上述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
进一步地，上述的应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的DNA分子：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
B8)所述核酸分子为表达靶向权利要求1中所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向权利要求1中所述蛋白编码基因的gRNA。
上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
进一步地，上述应用中，上述gRNA的靶标序列可为SEQ ID No.3第500-518位所示的核苷酸序列(即5’-AGCTCGACCGTACCAAGTC-3’)。
上述相关生物材料中，B2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP"，Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcids Res.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcid Res.,15:9627)。
上述相关生物材料中，B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.2所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有上述编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1300-35S、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用编码基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
在本发明中，当所述受体为玉米时，所述敲除载体为将所述ZmRBOHC蛋白的编码基因的gRNA插入到pBUE411载体的多克隆位点(如BsaI)后得到的重组质粒。当所述受体为大肠杆菌时，所述重组载体具体为将所述ZmRBOHC蛋白的编码基因插入到pGreenII-RFP载体的多克隆位点(如SmaI和NotⅠ)后得到的重组质粒。
在上述方法中，将所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
上述相关生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，B6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，B7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
进一步地，上述的应用，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为所述B1)至所述B7)任一种的生物材料，所述调控植物产量可为提高所述植物的产量；或，
所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为所述B8)或所述B9)所述的生物材料，所述调控植物产量可为降低所述植物的产量。
进一步地上述的应用中，所述植物可为下述任一种：
P1)单子叶植物，
P2)禾本目植物，
P3)禾本科植物，
P4)玉蜀黍属植物，
P5)玉米。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供一种增加玉米产量的方法，包括通过敲除玉米中权利要求1所述应用中的所述蛋白质的编码基因来增加玉米产量。
进一步地，上述的方法中，所述蛋白质的编码基因可为如下b1)-b3)中任一项所示的基因：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。进一步地，上述的方法中，所述所述植物可为下述任一种：
P1)单子叶植物，
P2)禾本目植物，
P3)禾本科植物，
P4)玉蜀黍属植物，
P5)玉米。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述的蛋白质或上述的生物材料。
在本发明中，所述产量提高可体现在如下任一：
1)在正常水分条件下提高植物的气孔开度；(敲除ZmRBOHC基因的转基因植物的气孔开度大于野生型)；
2)在正常水分条件下提高植物的光合速率；(敲除ZmRBOHC基因的转基因植物的光合速率高于野生型)；
3)在正常水分条件下提高植物的单株产量；(敲除ZmRBOHC基因的转基因植物的单株产量大于野生型)。
本发明还提供一种检测待测植物产量的方法，包括如下C1)-C3)任一所述的步骤，
C1)检测待测植物中是否含有中的所述蛋白质ZmRBOHC的编码基因的步骤，含有所述蛋白质ZmRBOHC的编码基因的植物产量低于不含有所述蛋白质ZmRBOHC的编码基因的植物；
C2)检测待测植物中是否含有蛋白质ZmRBOHC-1的编码基因的步骤，含有所述蛋白质ZmRBOHC-1的编码基因的植物产量高于不含有所述蛋白质ZmRBOHC-1的编码基因的植物，所述蛋白质ZmRBOHC-1的氨基序列如序列表中序列3所示；
C3)检测待测植物中是否含有蛋白质ZmRBOHC-2的编码基因的步骤，含有所述蛋白质ZmRBOHC-2的编码基因的植物产量高于不含有所述蛋白质ZmRBOHC-2的编码基因的植物，所述蛋白质ZmRBOHC-2的氨基序列如序列表中序列4所示。
本发明所述的蛋白质ZmRBOHC、蛋白质ZmRBOHC-1或ZmRBOHC-2也应在本发明的保护范围之内。
本发明所述的蛋白质的相关的生物材料也应在本发明的保护范围之内。
本发明取得的有益技术效果如下：
1、本发明通过实验验证了蛋白ZmRBOHC对植物产量具有调控功能，蛋白ZmRBOHC及其相关生物材料可应用于植物产量的调控；
2、本发明提供了调控植物产量的方法，根据本发明提供的技术方案获得正常水分条件下产量增加的的基因编辑纯合株系。
附图说明
图1为敲除ZmRBOHC的玉米株系的气孔相关表型。A为利用CRISPR/Cas9技术创建的ZmRBOHC敲除玉米(zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65)靶位点附近的序列与野生型的比对；B为ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米在正常水分条件下的气孔孔径；C为共聚焦显微镜下观察ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米在正常水分条件下叶片保卫细胞内的活性氧荧光染色；D为对保卫细胞内荧光密度的定量统计。
图2为ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米的温室植株形态及光合相关指标统计。A为温室正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米的植株形态；B为温室中ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米在正常水分条件下株高的统计结果；C为温室中ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米在正常水分条件下光合相关表型的统计结果。
图3为ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米的张掖田间实验及相关表型统计结果。A为张掖田间实验场的地理位置和鸟瞰图；B为正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米雌穗的代表性照片；C为正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米单株产量、单穗籽粒数、穗长和百粒重的统计；D为正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米地上去穗生物量、散粉时间、吐丝时间和散粉吐丝间隔的统计。
图4为ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米的涿州田间实验及相关表型统计结果。A为涿州田间实验的地理位置和鸟瞰图；B为生长棚开放和关闭状态的侧视图；C为生长棚中正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米的光合相关表型的统计；D为生长棚中正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米株高、散粉时间、吐丝时间和散粉吐丝间隔的统计；E为生长棚中正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米雌穗的代表性照片；F为生长棚中正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米地上去穗生物量、百粒重、穗长和单株产量的统计。
图5为ZmRBOHC定位于质膜并具有NADPH氧化酶活性。A为ZmRBOHC定位在原生质体质膜上；B为ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米在台面干旱条件下叶片中NADPH氧化酶的活性测定；C为在玉米原生质体内瞬时表达ZmRBOHC后测定NADPH氧化酶的活性。
各图中，zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65表示不同的ZmRBOHC玉米敲除株系，WT表示野生型玉米LH244。*表示p＜0.05的显著差异；**表示p＜0.01的极显著差异。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米转基因受体材料LH244(PI 612589)可从GRIN-Global(https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/search)获得。
玉米基因编辑载体pBUE411载体为中国农业大学陈其军老师惠赠，在文献“Hui-LiXing,LiZhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wangand Qi-Jun Chen(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants.BMC Plant Biology 2014,14:327.”中公开(文献中名称为pBUE411(Bar))。
公众可从申请人处获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验，不可作为其它用途使用。
实施例1、蛋白ZmRBOHC及其编码基因的获得
1、蛋白ZmRBOHC及其编码基因克隆
取玉米B73的种子，28℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到营养土或营养液中培养1周，取全株幼苗于液氮中速冻并研磨，提取总RNA，进行反转录，获得cDNA。以该cDNA为模板，引物F1和R1为引物进行PCR扩增。将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到2847bp的扩增产物。
经过测序，源自玉米B73的PCR产物具有SEQ ID No.2的第1-2847位所示核苷酸。将SEQ ID No.2所示的基因命名为ZmRBOHC，它编码的蛋白命名为ZmRBOHC。SEQ ID No.2编码SEQ ID No.1所示蛋白。
上述的引物序列如下：
F1：5’-ATGCGAGGAGGAGGAGGA-3’；
R1：5’-TCAGAAATGCTCCTTGTGGA-3’。
实施例2、蛋白ZmRBOHC对植株产量的影响
一、玉米ZmRBOHC基因敲除玉米株系的获得
通过CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在ZmRBOHC的第一个外显子上设计gRNA靶点，将设计的ZmRBOHC基因的gRNA(5’-AGCTCGACCGTACCAAGTC-3’，序列5)通过BsaI酶切位点连入pBUE411载体，获得CRISPR/Cas9敲除载体。
将构建好的载体使用上述农杆菌介导的玉米遗传稳定转化法转化玉米自交系LH244，获得转基因阳性T0代植株自交后获得T1代种子。T1代植株使用特异引物F2和R2对基因ZmRBOHC的gRNA附近的基因序列进行PCR扩增和测序，得到两个移码突变的编辑类型株系，自交后获得T2代种子，使用引物F3和R3对Cas9是否存在进行PCR鉴定。将鉴定到靶标序列存在纯合移码突变且不含Cas9的T2代植株进行自交获得T3代种子。以相同的方法对T3代植株再次进行基因型确认，如图1中的A所示，获得zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65两种移码突变T3代种子可以用于后续的表型试验。
上述引物的序列如下：
F2：5’-TGGACCTGCTGGAGGACGAT-3’(序列6)；
R2：5’-GTTGCCGCCGCTGATGAA-3’(序列7)。
F3：5’-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’(序列8)；
R3：5’-TATTCACTAGCTCGGGATAGTTGGC-3’(序列9)。
如图1中A所示的敲除株系zmrbohc-i1，与野生型玉米LH244相比，zmrbohc-i1两条同源染色体中，玉米基因组中ZmRBOHC基因发生了如下突变：用5’-CGCCGCGCGCAGCTCGACCGTACCAAAGTCCGGCGCGCAGCGCGCGATCCGCGGCC TCCGC-3’替换玉米基因组DNA中的ZmRBOHC基因中的5’-CGCCGCGCGCAGCTCGACCGTACCAAGTCCGGCGCGCAGCGCGCGATCCGCGGCCTCCGC-3’(SEQ IDNo.2第490-549位)，导致ZmRBOHC基因的CDS的第173位之后发生移码突变，从而将ZmRBOHC基因敲除。将该突变后的基因命名为ZmRBOHC-1基因；ZmRBOHC-1基因的编码序列是在SEQID No.2所示DNA分子的第513-514之间插入一个核苷酸A，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由250个氨基酸残基组成的蛋白质ZmRBOHC，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。
如图1中A所示的敲除株系zmrbohc-d54i65，与野生型玉米LH244相比，zmrbohc-d54i65两条同源染色体中，玉米基因组中ZmRBOHC基因发生了如下突变：用5’-CGCTTCATCAGCGGCGGCAACAAGGCCAGCAACGCCTGGATCGAGGTCCAGGCCAACTTCGACCGCCTCGC-3’(序列10)替换玉米基因组DNA中的ZmRBOHC基因中的5’-CGCCGCGCGCAGCTCGACCGTACCAAGTCCGGCGCGCAGCGCGCGATCCGCGGCCTCCGC-3’(SEQ ID No.3第490-549位)，导致ZmRBOHC基因的CDS的第165位之后发生移码突变，从而将ZmRBOHC基因敲除。将该突变后的基因命名为ZmRBOHC-2基因；ZmRBOHC-2基因的编码序列是将SEQ ID No.2所示DNA分子第493-546位的核苷酸替换为序列表中序列10的第4-68位的65个核苷酸，具体为TTCATCAGCGGCGGCAACAAGGCCAGCAACGCCTGGATCGAGGTCCAGGCCAACTTCGACCGCCT，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由223个氨基酸残基组成的蛋白质ZmRBOHC-2，其氨基酸序列如序列表中SEQID No.4所示。
二、ZmRBOHC敲除玉米的产量评价
1、ZmRBOHC参与玉米苗期叶片的失水速率和气孔开度的调节
使用台式扫描电子显微镜观察ZmRBOHC敲除玉米(zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65，图一中用ZmRBOHC表示)与野生型玉米(LH244，图一中用WT表示)的气孔，取正常浇水18天龄植株的第一片真叶进行观察，每个基因型至少观察并拍摄5个叶片，100个气孔，使用ImageJ测量气孔孔径。
使用H2DCFDA荧光染色法检测ZmRBOHC敲除玉米与野生型玉米叶片保卫细胞中的活性氧浓度。取正常浇水18天幼苗的第一片真叶浸入染色缓冲液(10mM Tris-HCl、50mMKCl、50μM H2DCFDA、0.02％Tween-20，pH＝7.2)中，并在室温下避光真空染色20分钟。然后用蒸馏水洗涤叶子以去除多余的染料。撕下叶片的下表皮，使用共聚焦显微镜对保卫细胞进行拍照，后使用ImageJ记录保卫细胞区域的平均灰度值以量化荧光强度，随机选择来自每个基因型不同叶片的20个气孔用于分析。
结果如图1中B、C和D所示，在正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米叶片的气孔孔径显著大于野生型玉米。在正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米叶片保卫细胞内活性氧浓度显著小于野生型。
因此，ZmRBOHC与玉米保卫细胞内活性氧浓度和气孔开闭的调节有关，敲除ZmRBOHC基因可显著降低保卫细胞内的活性氧，导致气孔开度大于野生型。
2、ZmRBOHC敲除玉米的温室表型分析
将ZmRBOHC敲除玉米(zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65)与野生型玉米LH244的种子，播种在装有4kg土壤(表层土、珍珠岩和蛭石的比例为5：4：1)的18L栽培盆中。在玻璃温室中培养，环境温度控制在20-26℃左右，光周期为12h光照/12h黑暗。正常浇水，使用LI-6400XT便携式光合测定仪在播种后的第55、62、70、76、83和90天的上午9:00和12:00之间测量各植株最新完全展开叶的光合作用参数并在第90天测量植株的株高。
结果如图2中A和B所示，在正常水分条件下，相对于野生型，ZmRBOHC敲除玉米植株的株高显著增高。如图2中C所示，在正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米较野生型具有更快的光合速率、更高的气孔导度和更大的蒸腾速率。
因此，在玉米成熟期，敲除ZmRBOHC基因可以增加正常水分条件下的株高、气孔导度、光合速率和蒸腾速率。
3、ZmRBOHC敲除玉米的田间表型分析
设计了两个地点在大田实验条件下，检测ZmRBOHC敲除玉米的田间表型。
第一个田间测定实验设计在2021年夏季的中国张掖(北纬38°50′49″，东经100°22′48″；平均海拔1551m)，生长季节(2021年5月至2021年9月)的降雨量约为90.6mm，平均日照长度约为14小时，平均温度约为20.5℃。所有基因型玉米的种子均于2021年5月10日播种，于2021年9月30日收获。每种基因型玉米均以单行(3m行，每行13棵，行距0.5m)种植，种植密度为58,000株/hm2。正常浇水的区域使用滴灌系统进行灌溉，每次灌溉大约使用450m3/hm2的水，以保持土壤水势高于-70kPa。记录散粉时间为从播种到雄穗主轴有一半花药散落花粉的天数，记录吐丝时间为从播种到雌穗可见约1cm花丝的时间，散粉吐丝间隔记录为上述两者的差值。收获后将所有植株和雌穗自然干燥，测量并记录每种基因型的单株产量，单穗籽粒数，百粒重和地上去掉雌穗的生物量。
结果如3所示，在正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米的单株产量和单穗籽粒数则都显著高于野生型，其中zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65的单株产量分别增加7.60％和8.40％，单穗籽粒数则分别增加7.19％和6.53％。同时ZmRBOHC敲除玉米的穗长和地上去穗生物量均显著高于野生型。另外，敲除ZmRBOHC不会影响正常水分条件下玉米植株的百粒重、散粉时间、吐丝时间和散粉吐丝间隔。
第二个田间测定实验设计在2021年夏季中国涿州(北纬39°27′59″，东经115°50′52″；平均海拔45m)的旱棚中，生长季节(2021年5月至2021年9月)的平均日照长度约为14h，平均温度约为23.1℃。所有基因型玉米(LH244、zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65)的种子均于2021年5月14日播种，于2021年9月10日收获。每个基因型株系均以单行(3m行，每行13棵，行距0.5m)种植，种植密度为58,000株/hm2。正常浇水的区域在整个生长季节都用充足的水灌溉，每次灌溉约使用600m3/hm2的水，以保持土壤水势高于-40kPa。在播种后第76天测量不同基因型株系的株高。在播种后第79天上午9:00到12:00之间测量所有不同基因型株系穗上叶的光合参数。在花期记录不同基因型株系的散粉时间、吐丝时间以及散粉吐丝间隔。收获后收集所有植株和雌穗，自然干燥后按行测量产量、穗长、百粒重以及地上去掉雌穗的生物量。
结果如4所示，在正常水分条件下，ZmRBOHC敲除玉米的光合速率、气孔导度、蒸腾速率、株高、地上去穗生物量和单株产量均显著高于野生型，而水分利用效率显著低于野生型。
因此，敲除ZmRBOHC可以增加正常水分条件下玉米的产量。
实施例3、蛋白ZmRBOHC及其编码基因的功能研究
1、ZmRBOHC蛋白亚细胞定位的观察
将ZmRBOHC基因的序列(SEQ ID No.2)的PCR产物进行回收，构建到pGreenⅡ-RFP载体上。重组载体中的启动子为Zmubiquitin1的启动子。
将上述重组载体转化玉米LH244自交系的原生质体，培养12h后使用Leica TCSSP5荧光显微镜561nm激发光观察ZmRBOHC蛋白的亚细胞定位。结果如图5A所示，ZmRBOHC-RFP蛋白定位在细胞质膜上。
2、ZmRBOHC蛋白的NADPH氧化酶活性分析
ZmRBOHC是NADPH氧化酶家族中的一个成员，该家族蛋白是胁迫下保卫细胞内活性氧最重要的来源。将ZmRBOHC敲除玉米(zmrbohc-i1和zmrbohc-d54i65)和野生型玉米LH244植株在培养盒中培养18天，取植株的第一片真叶，于洁净台面干旱5h，每种基因型取8片叶片混合。在液氮中研磨后取0.5g粉末加入1mL预冷的蛋白质提取缓冲液进行充分匀浆，后将匀浆的样品通过三层滤布过滤，并将滤液转移到1.5mL离心管中。将样品在4℃下以10,000g离心20min，并将上清液转移到超离心管中。通过在4℃下以100,000g超速离心60min分离总膜组分。弃去上清液，将沉淀重悬于0.5ml预冷的蛋白提取缓冲液中，通过Bradford法对蛋白质浓度进行测定。利用O2 ·-特异性染料XTT测定NADPH氧化酶产生的O2 ·-，从而表示NADPH氧化酶的活性。类似的方法被用于测定瞬时表达ZmRBOHC的玉米原生质体中的NADPH氧化酶活性。将未转化和瞬时表达ZmRBOHC的各500μl原生质体(106个细胞/毫升)进行总膜组分的分离。将获得总膜组分重新悬浮在200μl冰冷蛋白质提取缓冲液。通过Bradford分析对蛋白质浓度进行浓度测定后按上述方法进行NADPH氧化酶活性测定。
结果如图5中B和C所示，在台面干旱处理下ZmRBOHC敲除玉米中的NADPH氧化酶活性相对于野生型显著降低。且在原生质体中瞬时表达ZmRBOHC会显著增加NADPH氧化酶活性。表明ZmRBOHC可以产生额外的O2 ·-，具有NADPH氧化酶活性，。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在如下D1)-D4)任一中的应用，所述蛋白质ZmRBOHC为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
D1)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在调控植物产量中的应用；
D2)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在制备调控植物产量的产品中的应用；
D3)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在制备培育高产植物的产品中的应用；
D4)蛋白质ZmRBOHC或其相关生物材料在植物育种中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述相关生物材料为如下所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的DNA分子：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B8)所述核酸分子为表达靶向所述蛋白ZmRBOHC的编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向所述蛋白ZmRBOHC编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列如序列5所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物产量为提高所述植物的产量。
6.一种提高植物产量的方法，其特征在于，包括敲除待测植物中权利要求1中的所述蛋白质的编码基因的步骤。
7.一种检测待测植物产量的方法，其特征在于，包括如下C1)-C3)任一所述的步骤，
C1)检测待测植物中是否含有权利要求1中的所述蛋白质ZmRBOHC的编码基因的步骤，含有所述蛋白质ZmRBOHC的编码基因的植物产量低于不含有所述蛋白质ZmRBOHC的编码基因的植物；
C2)检测待测植物中是否含有蛋白质ZmRBOHC-1的编码基因的步骤，含有所述蛋白质ZmRBOHC-1的编码基因的植物产量高于不含有所述蛋白质ZmRBOHC-1的编码基因的植物，所述蛋白质ZmRBOHC-1的氨基序列如序列表中序列3所示；
C3)检测待测植物中是否含有蛋白质ZmRBOHC-2的编码基因的步骤，含有所述蛋白质ZmRBOHC-2的编码基因的植物产量高于不含有所述蛋白质ZmRBOHC-2的编码基因的植物，所述蛋白质ZmRBOHC-2的氨基序列如序列表中序列4所示。
8.根据权利要求6-7任一所述的方法，其特征在于：所述所述植物为单子叶植物；优选的，所述植物为禾本目植物；优选的，所述植物为禾本科植物；优选的，所述植物为玉蜀黍属植物；优选的，所述植物为玉米。
9.权利要求1中的所述蛋白质ZmRBOHC或权利要求7中所述的蛋白质ZmRBOHC-1或ZmRBOHC-2。
10.权利要求2中的所述生物材料。
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