CN104710522A

CN104710522A - 与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104710522A
Application number: CN201410746379.0A
Authority: CN
Inventors: 韩天富; 贾贞; 岳岩磊; 蒋炳军; 高小伟; 费志宏; 孙洪波; 吴存祥; 孙�石; 侯文胜
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-06-17

Abstract

本发明公开了一种与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的一种蛋白，是如下1)或2)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花时间相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明从大豆中发现了基因GmFULa，将其在拟南芥中过表达，得到转基因植物，该转基因植物的开花时间比未转基因的野生型提前，因此，可以看出该基因或其表达的蛋白具有促进植物开花时间提前的作用。

Description

与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国，大豆是四大粮食作物之一，对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。大豆是典型的短日照作物，单个品种的适种范围大都在1-1.5个纬度之间，不同纬度地区间引种会因日照长度的变化导致开花时间、成熟期提前或延迟，造成产量下降甚至颗粒无收。因此，培育对光周期相对钝感的广适应大豆品种一直是大豆育种的重要目标。通过常规育种方法培育大豆品种虽有很大成效，但在光周期反应敏感性改良方面进展较为缓慢，目前，迫切需要采用分子育种手段，通过外源基因的引入或对内在基因的遗传操作，定向调节大豆品种的光周期反应敏感性，加快广适应大豆品种的选育进程。

近年来，对拟南芥和水稻等模式植物开花途径的研究揭示了光周期调控植物开花的机制。相关研究表明，长日植物(如拟南芥)和短日植物(如水稻)开花的分子途径在进化上是保守的。因此，可借助植物开花相关基因的保守性从双子叶短日植物大豆中克隆、筛选光周期反应关键基因，通过改变光周期条件来分析其表达方式，并通过遗传转化进一步验证该基因的功能，进而通过基因操作手段获得光周期反应敏感性不同的大豆品种。

在拟南芥中，光受体接收外界光信号后，与生物钟基因相互作用将接收的光信号经CO(CONSTANCE)传递到下游基因FT(FLOWERING LOCUS T)，激活FT的表达，进而诱导花分生组织特征基因AP1和FUL的表达。FUL属于MADS-box转录因子超家族，它作为开花途径中相对下游的基因，参与了植物生殖转变(由营养生长到生殖生长的转变)、花果发育与果实成熟，是调节植物生长成熟的关键基因。通过转基因方法对FUL及其同源基因进行遗传操作，使其过表达或抑制其表达，可调节植物的生殖转变及花果发育进程，为通过分子手段培育广适应、株型改良或花果改良的作物品种创造条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物开花时间相关的蛋白，名称为GmFULa，来源于豆科、大豆属、栽培大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花时间相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述序列表中的序列2由244个氨基酸残基组成。为了使1)中的GmFULa便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签，但不限于如下标签。

表1为标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的GmFULa可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的GmFULa的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′末端第1-732位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的DNA分子也属于本发明的保护范围。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花时间相关蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物开花时间相关蛋白的DNA分子。

上述序列表中的序列1由1046个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-732位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的GmFULa。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体；所述表达载体具体为p3301m。

表达载体p3301m的制备：用HindⅢ和EcoRⅠ分别双酶切pBI121(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)和pCAMBIA3301(购自澳大利亚CAMBIA公司)，连接pBI121的3kb酶切产物和pCAMBIA3301的11256bp酶切产物，即得到载体p3301m。

可用现有的植物表达载体构建含有GmFULa基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与成花诱导、花果发育及果实成熟相关蛋白编码基因GmFULa的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆等双子叶植物。

使用GmFULa基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增上述DNA分子全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物开花时间中的应用也是本发明保护的范围；在本发明的实施例中，调节植物开花时间为提前开花时间。

上述应用中，所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；在本发明的实施例中具体采用的双子叶植物为拟南芥。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物。

上述方法中，所述编码上述蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。

上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物尤其具体为拟南芥；在本发明的实施例中具体采用的双子叶植物为拟南芥。

本发明的实验证明，本发明从大豆中发现了基因GmFULa，将其在拟南芥中过表达，得到转基因植物，该转基因植物的开花时间比未转基因的野生型提前，因此，可以看出该基因或其表达的蛋白具有促进植物开花时间提前的作用。

附图说明

图1为GmFULa的EST的PCR扩增产物电泳图谱

图2为GmFULa的全长cDNA的PCR扩增产物电泳图谱

图3为GmFULa在光周期反应敏感大豆品种自贡冬豆不同器官中的表达

图4为GmFULa在光周期反应敏感大豆品种自贡冬豆生长点中的表达

图5为转GmFULa拟南芥PCR方法检测

图6为转GmFULa拟南芥开花表型

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京三博公司完成。

实施例1、与开花时间相关蛋白GmFULa及其编码基因的获得及表达

一、与开花时间相关蛋白GmFULa及其编码基因的获得

本实施例利用同源克隆的方法，通过设计合成简并引物，以大豆总RNA的反转录cDNA为模板，通过PCR扩增技术，获得大豆的一个EST片段；并根据EST片段，设计特异性引物，利用RACE技术(Rapid amplification cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)克隆得到GmFULa的全长cDNA。

1、EST序列的获得及验证

以光周期敏感的大豆品种自贡冬豆(韩天富，盖钧镒，王金陵，周东兴，1998，大豆开花逆转现象的发现，作物学报(02):168-171)为实验材料，进行12小时短日照处理13天，并顶端分生组织并提取RNA，并用随机引物，进行反转录。反转录反应体系如下：

轻微混匀，低速离心；置于42℃水浴1小时；65℃终止反应10分钟，置于-20℃保存待用。

使用上述反转录产物作为模板，利用简并引物GmAP1/FUL-Degenerate-F(5'-GGRAGAGGRAGRGTTCARTT-3')和GmAP1/FUL-Degenerate-R(5'-CVAGTTGGTTTCTKCKTGWT-3')，进行PCR扩增，获取EST片段。PCR反应体系如下：

PCR反应条件：先95℃预变性5min；然后95℃30sec，52℃30sec，72℃45sec，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中，M为100bp DNA ladder的DNA分子量标准，1为GmFULa的EST序列的PCR产物。结果表明得到436bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照Takara公司的pMD18-T载体试剂盒说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。测序结果表明获得的436bp片段符合MADS-box结构域特征的基因片段。

2、3'RACE的扩增

在根据步骤1获得的EST序列，设计特异性引物GmFULa-FL-F(5'-ATGGGGAGAGGGAGAGTTCAGTT-3'),利用RACE试剂盒(FirstChoice^TMRLM-RACECatalog#1700)所提供的外部引物和内部引物组成引物对进行PCR扩增。RACE试剂盒提供的外部引物和内部引物分别为5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3'和5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3'。

第一轮PCR反应混合物如下：

PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃45sec，59℃45sec，72℃1min，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。

第一轮PCR产物稀释500倍后作为第二轮PCR反应的模板，将反应混合物中的引物改为3'内部引物，其余成分不变。第二轮PCR反应将退火温度调整为64℃，其余反应程序与第一轮相同。

第一轮PCR反应产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果呈弥散状。取第二轮PCR反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，获得1057bp的条带，并将该PCR产物连接到pMD18-T载体上，构建成质粒pMD18-GmFULa。

将该PCR产物测序，结果表明，该PCR产物含有732bp开放阅读框，该开放阅读框所示的基因命名为GmFULa，该基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端1-732位核苷酸所示，该基因编码的蛋白命名为GmFULa，该蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，含244个氨基酸残基。通过比对，GmFULa为拟南芥FRUITFULL同源基因。

二、大豆不同发育时期、不同组织中的表达情况

选择自贡冬豆(光周期敏感品种)为实验材料，在子叶展开后开始进行不同的光照处理：长日照处理(16h光照/8h黑暗)，短日照处理(12h光照/12h黑暗)，以及短日13天转长日处理。

分别提取上述不同光照处理的自贡冬豆不同发育时期各个组织中的总RNA，反转录为cDNA，应用Real-time RT-PCR方法，以GmActin为内标基因，检测GmFULa在大豆不同发育时期及不同组织中的相对表达量。组织表达分析结果如图3所示。结果表明，在大豆幼苗中，GmFULa主要在根中表达(图3a)；而在大豆成株中，GmFULa不仅在根中有较高表达，而且在苗端也有较强表达；并且在花和荚中均有强烈表达(图3b)，表明GmFULa不仅与根系发育有关，而且与生殖生长和花荚发育有关。

同时光照处理分析结果如图4所示，结果表明，无论是在新生叶(图4a)还是苗端(图4b)，GmFULa在长日照均下不表达，在短日照下表达逐渐增强，而在短日照13天转长日照下，GmFULa表达随之下降。与之相对应的是，自贡冬豆在长日照下营养生长，短日照下生殖生长，短日照13天转长日照则由生殖生长转入营养生长。这说明GmFULa在大豆的生殖转变乃至大豆生殖发育进程中均发挥着重要作用。

实施例2、GmFULa在促进植物开花时间提前中的应用

1、构建含有GmFULa的重组表达载体pTF101-GmFULa

重组载体p3301m-GmFULa为将GmFULa基因(序列表中的序列1自5’末端第1-732位核苷酸)插入表达载体p3301m，得到表达该基因的重组载体。

2、重组农杆菌的获得

取1μg上述步骤1制备的pTF101-GmFULa转化根癌农杆菌Gv3101(购自天根生化科技有限公司)感受态细胞，28℃条件下于LB培养基(含利福平50mg/L，庆大霉素25mg/L，卡那霉素50mg/L)上培养两天，挑选阳性克隆，得到重组农杆菌Gv3101/pTF101-GmFULa。

3、转GmFULa拟南芥的培育

1)转GmFULa拟南芥的获得

将重组农杆菌Gv3101/pTF101-GmFULa接种于LB培养基上(含利福平50mg/L，庆大霉素25mg/L，卡那霉素50mg/L)，28℃条件下250rpm振荡培养至OD600值为0.6-0.8，收集菌液置于离心管中，5000rpm离心5min并收集菌体，用MS液体培养基悬浮收集的菌体，使悬浮后菌液的OD600值约为0.6，最后加入Silwet L-77(购自北京五洲元业科贸公司，SL77080596)。

采用沾花浸染法利用重组农杆菌Gv3101/pTF101-GmFULa将基因GmFULa转入哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)的花中，得到T1代转GmFULa拟南芥。

2)转GmFULa拟南芥的鉴定

使用PCR的方法检测转基因，引物为AAACCCACGTCATGCCAGTT和CATCGAGACAAGCACGGTCA。

结果如图5所示，-为阴性对照，+为pTF101-GmFULa，WT为野生型拟南芥，T1-T4为T1代转GmFULa拟南芥，可以看出，T1代转GmFULa拟南芥中存在与正对照载体pTF101m-GmFULa一致的条带，而野生型拟南芥中则没有，说明为GmFULa转入拟南芥中。

4、转GmFULa拟南芥的开花情况

将阳性T1代转GmFULa拟南芥(GmFULa)和野生型拟南芥(WT)，观察开花时间。

结果如图6所示，在第24天GmFULa开花，野生型拟南芥没有开花。

从上述结果可以看出，与野生型拟南芥相比，阳性T1代转GmFULa拟南芥的开花明显提前，说明GmFULa具有促进开花的功能。

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：

所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述表达载体为p3301m。

7.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。

8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物开花时间中的应用。

9.一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白的DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。