CN101993885A

CN101993885A - 一种新型高效重组质粒载体及其应用

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Publication number: CN101993885A
Application number: CN200910091236XA
Authority: CN
Inventors: 聂李亚; 马素永; 许松山; 汤晓闯; 刘国强; 赵娜娜
Original assignee: BEIJING NORTHLAND BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING NORTHLAND BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2011-03-30

Abstract

本发明是一种高效的原核表达载体。本发明的载体含有多聚组氨酸和GST两种标签，便于根据实际情况对表达产物的快速纯化，以及协助目的蛋白在工程菌胞内实现可溶性表达；本发明的载体同时还含有卡那抗性基因，使得在生物医药类目的蛋白的生产过程中，终产品引起人体过敏反应的可能性降到最低，并且使得纯化工艺难度与成本也大大下降。本发明对提高目的产物的纯化效率、降低成本具有重要的意义。

Description

一种新型高效重组质粒载体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种质粒载体的构建方法，并且在实际应用中已经取得了初步成效，有广阔的应用前景，属于基因工程中的原核表达系统。

(二)背景技术

质粒是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：质粒具有自我复制功能、染色质以外的双价闭合环状DNA、它的DNA分子上有一个或多个限制性核酸内切酶切割位点、它的分子上还有特殊遗传标记基因。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同类型的质粒载体，近年来发展得很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。

用于生产重组蛋白的质粒载体很多都包含有纯化标签。纯化标签的运用是近年来发展起来的基因表达策略，并且已经被广泛应用。它的运用极大地方便了对目的蛋白的纯化。常见的标签有多聚精氨酸、多聚组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等。GST标签是最早使用的亲和标签，目标蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽亲和层析介质进行纯化。试验中发现GST标签能用于增加可溶性表达，某些目的蛋白还依赖于GST的协助进行正确地折叠，因此GST标签也可以认为是一种分子伴侣来增强蛋白的表达。但是纯化中所用GST亲和层析介质却比较昂贵，且还有使用寿命短的缺点。多聚组氨酸标签是基于组氨酸和金属离子特异结合的金属螯合层析技术，其具有分子量小、对目的蛋白的结构和功能影响小、所用层析介质廉价、使用寿命长，可应用于多种表达系统，纯化的条件温和、可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签等特点。因此综合两种标签的特性，构建一种既含有GST标签作为分子伴侣又含有多聚组氨酸纯化标签的载体具有很重要的实际意义。

另外质粒载体还常含有筛选标记。筛选标记包括氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、四环素，红霉素和氯霉素抗性等。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰。由于载体的筛选标记不同，所用的受体细胞也不同。同时抗性基因的选择，还要考虑到其残余对目的蛋白終产品是否产生影响，如当青霉素残留在目的蛋白中时，将该蛋白产品注射到人体内有可能产生过敏反应。在上述筛选标记中，卡那霉素是国内外一致认为比较好的筛选标记物。

(三)发明内容

本发明的一个方面，涉及一种高效的基因工程融合表达质粒，其为SEQ ID NO：1所示的pNL-06质粒。

本发明的特点是，在质粒中编码融合蛋白N末端标签的基因序列中，既含有GST标签作为分子伴侣又含有多聚组氨酸纯化标签，并且将多聚组氨酸纯化标签插在GST标签N端，让其暴露出来，更有利于目的片段的纯化。同时为了让强碱性的多聚组氨酸能在融合蛋白N末端高效表达，在多聚组氨酸序列的两端加上调和序列。另外本载体上的卡那霉素抗性基因的选择，使得在生物医药的生产过程中，终产品引起人体过敏反应的可能性降到最低，并且使得纯化工艺难度与成本大大下降。本发明有望成为一种新型实用载体取代现今常用的载体。

本领域普通技术人员知晓，所述质粒可以通过基因重组的方法或者全基因合成的方法制备。在本发明中，所述质粒是通过全基因合成的方法获得的。

在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得重组质粒pNL-06，包括如下步骤：

1)载体的构建

首先根据发明思路和原核表达载体的构建原则，选定组成质粒载体的各个组成元件：启动子、蛋白标签、抗性基因、原核内自主复制序列等，并排好各自的位置。再参照“GENE BANK”中各个组成元件的基因序列和相关序列在实际应用中的情况，设计出重组质粒pNL-06的碱基序列。然后采用全基因合成的方法合成重组质粒pNL-06。经质粒全基因测序，构建的重组载体基因为5231bp，结构图见图1。

2)pNL-06载体在重组胸腺素α1(Tα1)的表达及分离纯化中的应用

将Tα1结构基因序列插入到pNL-06载体中，得到重组子转化到表达宿主菌BL21，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液用镍离子亲和柱纯化，洗脱目的前体蛋白并用Sephadex G-25层析介质脱盐后，肠激酶酶切，再通过阴离子交换层析柱进一步纯化，得到最终蛋白纯度大于98％的终产物。同时将Tα1结构基因序列插入到商业化表达质粒PGEX-4T-1中，用于作为研究对照。

3)pNL-06载体在重组胸腺素β4(Tβ4)衍生物的表达及分离纯化中的应用

将Tβ4结构基因序列插入到pNL-06载体中，得到重组子转化到表达宿主菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液用镍离子亲和柱纯化，洗脱目的前体蛋白并用Sephadex G-25层析介质脱盐后，凝血酶酶切，再通过阴离子交换层析柱进一步纯化，得到最终蛋白纯度大于98％的终产物。同时将Tβ4结构基因序列插入到商业化表达质粒PGEX-4T-1中，用于作为研究对照。

(四)附图说明

图1NL-06的构建示意图

图2胸腺素α1的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pGEX-4T-1)：A，分子量Marker；B，诱导后；C，诱导前。

图3胸腺素α1的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pNL-06)：A，蛋白分子量Marker；B，诱导前；C，诱导后。

图4胸腺素α1纯化后电泳图谱：A，蛋白分子量Marker；B、C、D，三批纯化胸腺素α1样品。

图5胸腺素α1的纯化后的HPLC图谱。

图6胸腺素α1生物学活性图片：A，阴性对照；B，胸腺素α1。

图7胸腺素β4的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pGEX-4T-1)：A，分子量Marker；B，诱导后；C，诱导前。

图8胸腺素β4的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱(pNL-06)：A，蛋白分子量Marker；B，诱导前；C，诱导后。

图9胸腺素β4的纯化后的SDS-PAGE电泳图谱：A，蛋白分子量Marker；B、C、D，三批纯化胸腺素β4样品。

图10胸腺素β4的纯化后的HPLC电泳图谱。

图11胸腺素β4生物学活性图片：A，阴性对照；B，胸腺素β4。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这个实例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

实例1pNL-06载体的构建

首先根据发明思路和原核表达载体的构建原则，选定组成质粒载体的各个元件：启动子、蛋白标签、抗性基因、原核内自主复制序列等，并排好各自的位置。再参照“GENE BANK”中各个组成元件的基因序列和相关序列在实际应用中的情况，设计出重组质粒pNL-06的碱基序列。经转化、筛选成功的重组子命名为pNL-06(见图1)，经质粒全基因测序，构建的重组载体基因为5231bp。该质粒具有SEQ ID NO：1所示核酸序列，表1为序列表中的基因序列的各构成元件说明。

表1.序列表中的基因序列的各段说明

构成元件	位置
		Ptac	183-211
LacO	217-237
		6His+GST	258-953
TS	954-971
		ES	972-986
MCS	987-1070
		pGEX3P	1094-1116
KanrCDS	1704-2498
		Lac repressor	3580-4662

实例2：pNL-06载体在重组人胸腺素α1中的应用

1、pNL-06重组质粒的构建

以目的基因为模板，PCR扩增获得目的产物。

质粒pNL-06经BamH I、EcoR I双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中将胸腺素α1目的基因片段进行连接，经筛选得到的重组质粒。然后用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在含卡那霉素30μg/ml的LB中培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条30kD左右的蛋白带。经单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。同时将胸腺素α1基因重组到pGEX-4T-1质粒中，并转化大肠杆菌BL21用作对照。

2、发酵

1)种子的活化

取-80度保存的菌种100μL，接种于5毫升含卡那霉素30μg/ml的LB培养基的试管中，37度，220转/分，培养10小时左右，划斜面，斜面可以作为下一代种子来源，也可以转接一次，然后条件同上，培养24小时，成为活化种子，4度可保存2周。

2)摇瓶表达：挑取斜面培养的工程菌于含30μg/ml卡那霉素的LB培养基的试管过夜培养(37℃，230rpm)，再按1∶50接种含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素α1前体蛋白(30kD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。

3)发酵种子液的制备

a 种子液培养基(LB)：

胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、卡那霉素：30μg/mL。

b 培养过程

取活化种子液以1∶10的比例接种于1.8升LB培养基中。培养10小时，作为上罐种子液。

4)发酵过程

a.培养基及补料

a)M₉CA培养基(上罐培养基)：

Na₂HPO₄： 90g

KH₂PO₄： 45g

NaCl： 22.5g

NH₄Cl 5g

上述组分溶于2升的蒸馏水中，调pH7.4，放入30升发酵罐中，补蒸馏水至18升，121度，灭菌30分钟。冷却后再无菌加入以下两种组份：

20％Glucose溶液：180mL(每100mL含1M MgSO₄ 20mL，1M CaCl₂ 1mL，维生素B1 100mg)

20％Casein acid溶液：180mL

以上2种组份无菌过滤后4度后可保存1周。

b)补料液

Glucose： 75g

酵母提取物： 30g

Tryptone： 30g

MgSO₄·7H₂O 3g

无菌过滤后，4度可保存1周。

b.发酵各参数的控制及分批补料培养

发酵罐装置可以计算机自动控制，控制的关键参数如下：

a)温度：37度

b)溶氧和转速：当培养基中溶氧降至30％以下时，每次将转速提高50转/分，直至达到1000转/分后，通入纯氧，溶解氧保持在30％左右。

c)pH：自动流加30％氨水，使pH保持在7.0左右。

d)葡萄糖的流加：根据发酵过程，流加分为2个阶段，由菌体生长情况而定，2小时左右流加含100克葡萄糖的补料，3-5小时流加含200克葡萄糖的补料。

c.30升发酵罐中试高密度发酵

a)斜面上取一环菌种接入50mL LB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，230转/分，37度培养16小时。

b)从上述活化种子液接种于1.8升LB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，230转/分，37度培养6小时。

c)30升发酵罐发酵

取上述1.8升扩大种子液按1∶10接种量加入发酵罐，然后无菌加入卡那霉素540mg，37度，通气量1.5升/分，300转/分，自动流加30％氨水，使pH保持在7.0，培养2小时后开始流加含100克葡萄糖的补料，4-5小时流加含200克葡萄糖的补料，6小时左右加入IPTG至终浓度0.1-0.5mM诱导4小时，离心收集菌体。

d)胸腺素α1前体蛋白发酵表达量检测：

还原型SDS-PAGE分离胶15％和浓缩胶5％，上样量：10μL/lane。接通电源，以恒流30mA条件下开始电泳，直至电泳结束。

用考马斯亮兰法染色脱色：将电泳后的凝胶浸入染色液中，30分钟取出浸入脱色液中，直至凝胶底色几乎无色，取出凝胶保存在水中。

结果：使用嵌入胸腺素α1基因的pGEX-4T-1质粒转化的工程菌发酵目的前体蛋白表达量为35％(见图2)，而使用嵌入胸腺素α1基因的pNL-06质粒转化的工程菌发酵目的前体蛋白表达量为50％(见图3)，说明本项目改造后的质粒转化的工程菌蛋白表达量大大提高。

3.纯化：

(1)镍离子金属螯合亲和层析

采用镍-Chelating Sepharose Fast Flow层析介质，平衡液采用25mMTris-HCl，0.5M NaCl pH8，上样平衡后，菌体的破碎液高速离心后取上清上样，平衡后用25mM Tris-HCl，0.5M NaCl pH8，0.2M咪唑的洗脱液洗下目的前体蛋白。

(2)脱盐

上一步的洗脱液使用Sephadex G-25进行脱盐，平衡液为25mMTris-HCl，0.15M NaCl，pH8。

(3)酶解

上一步得到的样品溶液加入肠激酶(5U/mL)室温酶切16h。

(4)阴离子交换层析

采用Q Sepharose High Performance层析介质，平衡液为25mMTris-HCl，pH8，上一步得到的样品用水稀释3倍进行上样，平衡后采用25mM Tris-HCl，pH8，0.3M NaCl进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

结果：应用本工艺的镍金属螯合亲和层析介质与质粒改造前，应用GSH-Agrose亲和介质相比，其蛋白载量相近，其他步骤也相同，但镍金属螯合亲和层析介质的价格仅是GSH-Agrose亲和介质的1/8，并且使用次数是50次左右，而GSH-Agrose亲和介质的使用次数是20次左右，由于这一步占了样品制备成本的25％左右，所以通过质粒的改造，大大降低了胸腺素α1的纯化生产成本(见表2)。

表2.胸腺素α1的纯化生产成本比较。

4.检测

(1)Tricine-SDS-PAGE电泳纯度检测

Tricine分离胶16.5％和浓缩胶5％，上样量：10μg/lane。接通电源，以恒流35mA条件下开始电泳，直至电泳结束。

电泳后其纯度大于98％(见图4)。

(2)HPLC纯度检测，纯度大于98％。

使用C4反相高效液相层析柱，流动相：A，水+0.5％三氟乙酸(TFA)，B，乙晴(ACN)+0.5％三氟乙酸(TFA)。5％B平衡5min，上样，5％-90％B，25min，100％B，洗5min。检测波长：210nm。流速：1ml/min。柱温：25℃。样品上样约10μg。

检测后其纯度大于98％(见图5)。

(3)活性检测

淋巴细胞提取，最后将淋巴细胞用Hank’s液调成5×10⁶个/毫升。红细胞制备，最后将红细胞用Hank’s液配成5×10⁷个/毫升。每个试管中加入T淋巴细胞100μL搅匀后，加入100μL灭活及吸收过的小牛血清。然后再分别加入供试样品100μL。均于37℃水浴放置1h，每管加入绵羊红细胞100μL(临用前配置)。于37℃水浴8min，离心5min(500r/min)，于4℃放置2h，最后用戊二醛溶液1滴固定。计算活性。样品活性＝(样品形成的花结数-空白组的花结数)/空白组的花结数。检测后其生物活性大于10％(见图6和表3)。

表3胸腺素α1活性检测结果

	视野1	视野2	视野3	平均值	增殖率
						空白组	149	138	142	142	-
标准品	190	170	174	181	27.5％
						样品	211	217	181	197	34.5％

注：标准品和胸腺素α1浓度：100μg/ml

实例3：pNL-06载体在重组人胸腺肽β4中的应用

1、重组质粒的构建

以目的基因为模板，PCR扩增获得目的产物。

质粒pNL-06经BamH I、EcoR I双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中将目的基因片段进行连接，经筛选得到的重组质粒。然后用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在含卡那浓度为30μg/ml的LB中培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加入IPTG0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条31kD左右的蛋白带。经单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。同时将胸腺素α1基因重组到pGEX-4T-1质粒中，并转化大肠杆菌BL21用作对照。

2、发酵

1)种子的活化

2)摇瓶表达：挑取斜面培养的工程菌于含30μμμμμg/ml卡那霉素的LB培养基的试管过夜培养(37℃，230rpm)，再按1∶10接种含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导3小时。离心收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析，发现含人胸腺肽β4前体蛋白(31kD)以可溶性表达为主。

3)发酵种子液的制备

a 种子液培养基(LB)：

b 培养过程

4)发酵过程

a.培养基及补料

a)M₉CA培养基(上罐培养基)：

Na₂HPO₄： 108g

KH₂PO₄： 45g

NaCl： 18g

NH₄Cl 15g

20％Glucose溶液：180mL(每100mL含1M MgSO₄20mL，1M CaCl₂ 1mL，维生素B1 100mg)

20％Casein acid溶液：180mL

以上2种组份无菌过滤后4度后可保存1周。

b)补料液

Glucose： 100g

酵母提取物： 30g

Tryptone： 50g

MgSO₄·7H₂O 3g

无菌过滤后，4度可保存1周。

b.发酵各参数的控制及分批补料培养

发酵罐装置可以计算机自动控制，控制的关键参数如下：

a)温度：37度

c)pH：自动流加30％氨水，使pH保持在7.0左右。

d)葡萄糖的流加：根据发酵过程，流加分为2个阶段，由菌体生长情况而定，3小时左右流加含150克葡萄糖的补料，4-5小时流加含250克葡萄糖的补料。

c.30升发酵罐中试高密度发酵

c)30升发酵罐发酵

取上述1.8升扩大种子液按1∶10接种量加入发酵罐，然后无菌加入卡那霉素540mg，37度，通气量1.5升/分，300转/分，自动流加30％氨水，使pH保持在7.0，培养3小时后开始流加含150克葡萄糖的补料，4-5小时流加含250克葡萄糖的补料，7小时左右加入IPTG至终浓度0.2mM诱导3小时，离心收集菌体。

e)胸腺素β4前体蛋白发酵表达量检测：

还原型SDS-PAGE分离胶15％和浓缩胶5％，上样量：10μL/lane。接电源，以恒流30mA条件下开始电泳，直至电泳结束。

结果：使用嵌入胸腺素β4基因的pGEX-4T-1质粒转化的工程菌发酵目的前体蛋白表达量为35％(见图7)，而使用嵌入胸腺素β4基因的pNL-06质粒转化的工程菌发酵目的前体蛋白表达量为55％(见图8)，说明本项目改造后的质粒转化的工程菌蛋白表达量大大提高。

3.纯化：

(1)镍离子金属螯合亲和层析

采用镍-Chelating Sepharose Fast Flow层析介质，平衡液采用25mM Tris-HCl，0.5M NaCl pH8，上样平衡后，菌体的破碎液高速离心后取上清上样，平衡后用25mM Tris-HCl，0.5M NaCl pH8，0.2M咪唑的洗脱液洗下目的前体蛋白。

(2)脱盐

(3)酶解

上一步得到的样品溶液加入凝血酶(2U/mL)室温酶切18h。

(4)阴离子交换层析

采用Q Sepharose Fast Flow层析介质，平衡液为25mM Tris-HCl，pH8，上一步得到的样品用水稀释4倍进行上样，平衡后采用25mMTris-HCl，pH8，0.2M NaCl进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

结果：应用本工艺的镍金属螯合亲和层析介质与质粒改造前，应用GSH-Agrose亲和介质相比，其蛋白载量相近，其他步骤也相同，但镍金属螯合亲和层析介质的价格仅是GSH-Agrose亲和介质的1/8，并且使用次数是50次左右，而GSH-Agrose亲和介质的使用次数是20次左右，由于这一步占了样品制备成本的20％左右，所以通过质粒的改造，大大降低了胸腺素β4的纯化生产成本(见表4)。

表4.胸腺素β4的纯化生产成本比较。

4.检测

(1)Tricine-SDS-PAGE电泳纯度检测

电泳后其纯度大于98％(见图9)。

(2)HPLC纯度检测，纯度大于98％。

检测后其纯度大于98％(见图10)。

(3)活性检测

淋巴细胞提取，最后将淋巴细胞用Hank’s液调成5×10⁶个/毫升。红细胞制备，最后将红细胞用Hank’s液配成5×10⁷个/毫升。每个试管中加入T淋巴细胞100μl搅匀后，加入100μl灭活及吸收过的小牛血清。然后再分别加入供试样品100μl。均于37℃水浴放置1h，每管加入绵羊红细胞100μL(临用前配置)。于37℃水浴8min，离心5min(500r/min)，于4℃放置2h，最后用戊二醛溶液1滴固定。计算活性。样品活性＝(样品形成的花结数-空白组的花结数)/空白组的花结数。检测后其生物活性大于10％(见图11和表5)。

表5胸腺素β4活性检测结果

	视野1	视野2	视野3	平均值	增殖率
						空白组	149	138	142	143	-

标准品	190	170	174	181	27.5％
						样品	171	180	176	176	23％

注：胸腺素β4药品浓度：10μg/ml

序列表

<110>北京诺思兰德生物技术股份有限公司

<120>一种新型高效表达质粒载体及其应用

<160>1

<210>1

<211>5231

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：1

<400>1

agcttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 60

gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 120

tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc 180

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 240

cacaggaaac agtattcatg ggcagctctc atcatcatca tcatcactct agcggttccc 300

ctatactagg ttattggaaa attaagggcc ttgtgcaacc cactcgactt cttttggaat 360

atcttgaaga aaaatatgaa gagcatttgt atgagcgcga tgaaggtgat aaatggcgaa 420

acaaaaagtt tgaattgggt ttggagtttc ccaatcttcc ttattatatt gatggtgatg 480

ttaaattaac acagtctatg gccatcatac gttatatagc tgacaagcac aacatgttgg 540

gtggttgtcc aaaagagcgt gcagagattt caatgcttga aggagcggtt ttggatatta 600

gatacggtgt ttcgagaatt gcatatagta aagactttga aactctcaaa gttgattttc 660

ttagcaagct acctgaaatg ctgaaaatgt tcgaagatcg tttatgtcat aaaacatatt 720

taaatggtga tcatgtaacc catcctgact tcatgttgta tgacgctctt gatgttgttt 780

tatacatgga cccaatgtgc ctggatgcgt tcccaaaatt agtttgtttt aaaaaacgta 840

ttgaagctat cccacaaatt gataagtact tgaaatccag caagtatata gcatggcctt 900

tgcagggctg gcaagccacg tttggtggtg gcgaccatcc tccaaaatcg gatctggttc 960

cgcgtggatc cgacgacgac gacaagccgg aattcccggg tcgactcgag cggccgcatc 1020

gtgattgact cgagcggccg catcgtgact gactgacgat ctgcctcgcg cgtttcggtg 1080

atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 1140

cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 1200

gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta taattcttga agacgaaagg 1260

gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt 1320

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 1380

ggatcttcac ctagatcctt ttcacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 1440

ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 1500

aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 1560

gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 1620

actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 1680

agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 1740

ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 1800

atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 1860

tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 1920

cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 1980

tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 2040

tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 2100

tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 2160

tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 2220

ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 2280

tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 2340

gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 2400

gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 2460

gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat ttctagacca agtttactca 2520

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 2580

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 2640

gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 2700

tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 2760

ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 2820

ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 2880

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 2940

ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 3000

tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 3060

ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 3120

agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 3180

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 3240

gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 3300

tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 3360

accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 3420

gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 3480

atttcacacc gcataaattc cgacaccatc gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca 3540

tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac 3600

gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc 3660

agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac 3720

attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc 3780

acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc 3840

gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt 3900

aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg 3960

ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt 4020

cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga agacggtacg 4080

cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc 4140

ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata tctcactcgc 4200

aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa 4260

caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat 4320

cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat 4380

atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat gttatatccc gccgttaacc 4440

accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc 4500

tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa 4560

accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 4620

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 4680

aagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 4740

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgg 4800

attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 4860

atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 4920

atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttccgg 4980

caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg 5040

tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtgacct 5100

atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc 5160

tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg 5220

gcgttggaat t 5231

Claims

1.一种新型的高效原核融合蛋白表达载体。其特征为包含Tac启动子、含有多聚组氨酸和GST两种标签的基因序列，又含有卡那抗性基因、大肠杆菌自主复制序列，该质粒具有SEQ ID NO：1所示核酸序列。

2.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体携带有表达GST标签的基因序列。

3.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体GST标签基因序列的5’端，携带有含6个组氨酸的纯化标签对应的基因序列。

4.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体带有卡那霉素抗性基因。

5.按照权利要求1所述的载体，其特征在于其为大肠杆菌表达载体。

6.按照权利要求1所述的载体，其特征在于该载体GST标签基因序列的3’端，携带有肠激酶(EK)与凝血酶(Thrombin)酶切位点序列。

7.按照权利要求3所述的载体，其中，所述的含6个组氨酸片段的序列为：MGSSHHHHHHSSG 。

8.一种生产重组蛋白的方法，包括使用权利要求1所述的载体，应用在重组人胸腺素α1生产过程中。

9.一种生产重组蛋白的方法，包括使用权利要求1所述的载体，应用在重组人胸腺素β4生产过程中。