JP2024037919A - モルフィナンアルカロイドおよび誘導体を生成する方法 - Google Patents

モルフィナンアルカロイドおよび誘導体を生成する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】プロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によってプロモルフィナン、モルフィン、ナル-オピオイド、およびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成する方法を提供する。【解決手段】本方法は、プロモルフィナンアルカロイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程を含む。プロモルフィナンアルカロイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程により、プロモルフィナンアルカロイドがモルフィナンアルカロイドに変換される。【選択図】図３

Description

相互参照
本出願は、2018年2月8日に出願され代理人整理番号47840-708.801を有する、米国特許仮出願第62/628,264号の恩典を主張するものである。本出願は以下に関する：現在US 2014-0273109として公開されている米国特許出願第14/211,611号、該出願は2014年3月14日に出願され代理人整理番号STAN-1018を有する；現在WO 2014/143744として公開されている、PCT出願番号PCT/US2014/027833、該出願は2014年3月14日に出願され代理人整理番号STAN-1018WOを有する；米国特許出願第15/031,618号、該出願は2016 年4月22日に出願され代理人整理番号STAN-1078を有する；現在WO 2015/066642として公開されている、出願番号第PCT/US2014/063738号、該出願は2014年11月3日に出願され代理人整理番号STAN-1078WOを有する；2014年11月17日に出願され代理人整理番号STAN-1169PRVを有する、米国特許仮出願第62/080,610号；2015年1月23日に出願され代理人整理番号STAN-1169PRV2を有する、米国特許仮出願第62/107,238号；出願番号第PCT/US2015/060891号、該出願は2015年11月16日に出願され代理人整理番号STAN-1169WOを有する；2015年5月4日に出願され代理人整理番号STAN-1221PRVを有する、米国特許仮出願第62/156,701号；出願番号第PCT/US2016/030808号、該出願は2016年5月4日に出願され代理人整理番号STAN-1221WOを有する；出願番号第PCT/US2016/031506号、該出願は2016年5月9日に出願された；出願番号第PCT/US2017/057237号、該出願は2017年10月18日に出願された；出願番号第62/541,038号、該出願は2017年8月3日に出願された；および、出願番号第PCT/US2018/045222号、該出願は2018年8月3日に出願された；および、出願番号第16/149,025号、該出願は2018年10月1日に出願された。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での多様なベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）の生成のための方法を提供する。さらに、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内で生成された多様なアルカロイドの組成物を提供する。加えて、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインシンターゼの生成のための方法を提供する。特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換によって多様なアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらに特定の場合では、本開示により、サルタリジノール-7-O-アセテートのテバインへの変換によって多様なアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。
本発明の一局面は、遺伝子操作されていない細胞と比べて増大したチロシンヒドロキシラーゼ活性を有する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明の別の局面は、野生型TyrHを発現する細胞と比べて増大したチロシンヒドロキシラーゼ活性を有する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明のさらなる局面は、本明細書において提供されるようなチロシンヒドロキシラーゼ活性を増大させる変異を有さない野生型TyrHを発現する細胞と比べて増大したチロシンヒドロキシラーゼ活性を有する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。特に、遺伝子操作された非植物細胞は、基質阻害緩和変異；生成物阻害緩和変異；および補因子回復促進機構からなる群より選択される少なくとも1つの改変を有する。
本発明の一局面は、遺伝子操作されていない細胞と比べて増大したチロシンヒドロキシラーゼ活性を有する遺伝子操作された植物細胞を提供する。本発明の別の局面は、野生型チロシンヒドロキシラーゼ（TyrH）を発現する細胞と比べて増大したTyrH活性を有する遺伝子操作された植物細胞を提供する。本発明のさらなる局面は、本明細書において提供されるようなチロシンヒドロキシラーゼ活性を増大させる変異を有さない野生型TyrHを発現する細胞と比べて増大したチロシンヒドロキシラーゼ活性を有する遺伝子操作された植物細胞を提供する。特に、遺伝子操作された植物細胞は、基質阻害緩和変異；生成物阻害緩和変異；および補因子回復促進機構からなる群より選択される少なくとも1つの改変を有する。
一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたエピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。さらなる態様では、本開示により、オキシダーゼおよびレダクターゼをコードしている2つの分離型酵素を含む遺伝子操作されたエピメラーゼを介する（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへのエピマー化により、野生型エピメラーゼを介する（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへのエピマー化による多様なアルカロイド生成物の生成と比較して多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。
遺伝子操作された分割型エピメラーゼは、親エピメラーゼまたは野生型エピメラーゼに由来する分離型のオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素を含み得るが、遺伝子操作されたエピメラーゼはまた、別個の親エピメラーゼまたは野生型エピメラーゼに由来する分離型のオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素を含んでいてもよい。オキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を有する親エピメラーゼの例は:表1に列記したSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15および16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインシンターゼによるプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。さらなる態様では、本開示により、テバインシンターゼによるサルタリジノール-7-O-アセテートのテバインへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。親テバインシンターゼの例には:表2に列記したSEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36および37からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれる。
一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたテバインシンターゼによるプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。さらなる態様では、本開示により、遺伝子操作されたテバインシンターゼによるサルタリジノール-7-O-アセテートのテバインへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。
一部の態様では、遺伝子操作されたテバインシンターゼが融合酵素である。さらなる態様では、テバインシンターゼがアセチルトランスフェラーゼ酵素に融合されている。さらなる態様では、テバインシンターゼがアセチルトランスフェラーゼ酵素内にコードされている。他の態様では、テバインシンターゼがレダクターゼ酵素に融合されている。
一部の例では、遺伝子操作された非植物細胞が、表3に列記した酵素の群から選択される酵素を各々コードしている複数のコード配列を含む。一部の例では、異種コード配列が奏功可能に関連し得る。奏功可能に関連した異種コード配列は、テバインシンターゼ活性または遺伝子操作されたテバインシンターゼ活性により特定のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を生成させる同じ経路内に存在し得る。
一部の態様では、本開示により、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換する方法であって、四環性プロモルフィナン前駆体を少なくとも1種の酵素と接触させる工程を含み、該四環性プロモルフィナン前駆体を少なくとも1種の酵素と接触させる工程が、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換する、方法を提供する。一部の場合では、少なくとも1種の酵素が、該少なくとも1種の酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することによって生成される。一部の場合では、方法は、四環性プロモルフィナン前駆体を細胞培養物に添加する工程をさらに含む。一部の場合では、方法は、テバインまたはその誘導体を細胞培養物から回収する工程をさらに含む。一部の場合では、少なくとも1種の酵素は、テバインシンターゼを含む。一部の場合では、テバインシンターゼは、SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、35、36、および37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の場合では、テバインシンターゼは、Bet v 1フォールドタンパク質である。
[本発明1001]
(i) エピメラーゼと、
(ii) テバインシンターゼと、
(iii) (a) 基質阻害緩和変異、(b) 生成物阻害緩和変異、(c) 補因子回復促進機構、(d) フィードバック阻害緩和変異、(e) 転写モジュレーション改変、および (f) 不活性化変異からなる群より選択される少なくとも1つの改変と
を含む遺伝子操作された非植物細胞であって、
該遺伝子操作された非植物細胞内で、該遺伝子操作された非植物細胞が、プロモルフィナン分子の前駆体を、(i) モルフィナンアルカロイドと、(ii) ナル-オピオイドアルカロイドと、(iii) ノル-オピオイドアルカロイドとからなる群より選択されるアルカロイド生成物に変換する、遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1002]
エピメラーゼが遺伝子操作されたエピメラーゼである、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1003]
遺伝子操作されたエピメラーゼが分割型エピメラーゼである、本発明1002の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1004]
遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-1-ベンジルイソキノリン前駆体を(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換する、本発明1002または1003の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1005]
遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-レチクリンを(R)-レチクリンに変換する、本発明1002～1004のいずれかの遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1006]
前記遺伝子操作された非植物細胞内の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド分子の少なくとも50%が(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換される、本発明1004または1005の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1007]
テバインシンターゼが遺伝子操作されたテバインシンターゼである、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1008]
プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞に与えられる、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1009]
プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1010]
プロモルフィナン分子の前駆体が、レチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、コクラウリン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ノルレチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、4’-O’-メチルラウダノソリン、L-Dopa、チロシン、ドパミン、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、ヒドロキシフェニルピルビン酸、プレフェネート、コリスメート、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸（EPSP）、3-デオキシ-D-アラビノヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）、エリトロース-4-リン酸（E4P）、ホスホエノールピルビン酸（PEP）、およびグルコースからなる群より選択される、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1011]
前記遺伝子操作された非植物細胞内の四環性プロモルフィナン前駆体分子の少なくとも50%がテバインに変換される、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1012]
四環性プロモルフィナン分子が、サルタリジン、サルタリジノール、またはサルタリジノール-7-O-アセテートからなる群より選択される、本発明1011の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1013]
プロモルフィナン分子の前駆体が、式I:
Figure 2024037919000002
の(S)-基質またはその塩であり、式中:
R1、R2、R3およびR4は独立して、水素およびメチルから選択され;
R5は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される、
本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1014]
R1、R2、R3、R4およびR5のうちの少なくとも1つが水素である、本発明1013の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1015]
プロモルフィナン分子の前駆体が、式II:
Figure 2024037919000003
の化合物またはその塩である(S)-基質であり、式中:
R3は、水素およびC1～C4アルキルから選択され;
R6およびR7は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1～C4アシル、C1～C4アルキルおよびC1～C4アルコキシから選択され;
nは0、1、2、3または4であり;
n’は0、1、2、3、4または5である、
本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1016]
プロモルフィナン分子の前駆体がチロシンである、前記本発明のいずれかの遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1017]
プロモルフィナン分子の前駆体が糖である、前記本発明のいずれかの遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1018]
(i) BIA生成改変、(ii) O-脱メチル化改変、(iii) N-脱メチル化改変、および (iv) N-結合型改変からなる群より選択される少なくとも1つの改変をさらに含む、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1019]
モルフィナンアルカロイド生成物が、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、またはオキシモルホンである、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1020]
ナル-オピオイドアルカロイド生成物が、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン（axelopran）、ベベンプラン（bevenpran）、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミン、またはジプレノルフィンである、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1021]
ノル-オピオイドアルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノン、またはノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンである、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1022]
細菌細胞または真菌細胞である、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1023]
細菌細胞が、アナベナ属（Anabaena）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アセトバクター属（Acetobacter）、アセトバクテリウム属（Acetobacterium）、バチルス属（Bacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブラキバクテリウム属（Brachybacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ハフニア属（Hafnia）、ハロモナス属（Halomonas）、クレブシエラ属（Klebsiella）、コクリア属（Kocuria）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leucononstoc）、マクロコッカス属（Macrococcus）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロセラ属（Methylocella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ムーレラ属（Moorella）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、プロテウス属（Proteus）、シュードアルテロモナス属（Pseudoalteromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、セラチア属（Serratia）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、ワイセラ属（Weissella）、およびザイモモナス属（Zymomonas）からなる群より選択される属に由来する、本発明1022の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1024]
細菌細胞が、アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アルスロバクター・アリライテンシス（Arthrobacter arilaitensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス（Brachybacterium tyrofermentans）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium divergens）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Corynebacterium flavescens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、グルコナセトバクター・エウロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコナセトバクター・ホハンナエ（Gluconacetobacter johannae）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongata）、コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）、ラクトバチルス・アシディファリナエ（Lactobacillus acidifarinae）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ロイコノストク・シトレウム（Leuconostoc citreum）、マクロコッカス・カセオリティカス（Macrococcus caseolyticus）、マイクロバクテリウム・フォリオルム（Microbacterium foliorum）、ミクロコッカス・ライレ（Micrococcus lylae）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Propionibacterium acidipropionici）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、サイクロバクター・セラー（Psychrobacter celer）、スタフィロコッカス・コンディメンティ（Staphylococcus condimenti）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Streptomyces griseus）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）、ワイセラ・チバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・コレエンシス（Weissella koreensis）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）・ビフィドゥム（bifidum）/ブレーベ（breve）/ロンガム（longum）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、シュードアルテロモナス・シトレア（Pseudoalteromonas citrea）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、クロストリジウム（Clostridium）・リュングダリイ（ljungdahlii）/アセティカム（aceticum）/アセトブチリカム（acetobutylicum）/ベエイジェリンキー（beijerinckii）/ブチリカム（butyricum）、およびムーレラ（Moorella）・テモセルム（themocellum）/サーモアセチカ（thermoacetica）からなる群より選択される、本発明1022の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1025]
真菌細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ピキア属（Pichia）、およびアスペルギルス属（Aspergillus）からなる群より選択される属に由来する、本発明1022の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1026]
真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）およびアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）からなる群より選択される、本発明1022の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1027]
前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも50%多いアルカロイド生成物を生成する、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1028]
前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも2倍多いアルカロイド生成物を生成する、本発明1001の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1029]
プロモルフィナン分子の前駆体をテバインまたはその誘導体に変換する方法であって、
プロモルフィナン分子の前駆体を少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、該少なくとも1種の酵素がテバインシンターゼを含み、プロモルフィナン分子の少なくとも1種の前駆体が、該変換が起こる遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、工程
を含み、
ここで、プロモルフィナン分子の前駆体を少なくとも1種の酵素と接触させる工程が、プロモルフィナン分子の前駆体をテバインまたはその誘導体に変換する、
方法。
[本発明1030]
プロモルフィナン分子の前駆体のテバインへの変換が、遺伝子操作された非植物細胞内で起こる、本発明1029の方法。
[本発明1031]
プロモルフィナン分子の前駆体が、遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、本発明1029の方法。
[本発明1032]
遺伝子操作された非植物細胞が細菌細胞または真菌細胞である、本発明1029～1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
細菌細胞が、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、マクロコッカス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属からなる群より選択される属に由来する、本発明1031の方法。
[本発明1034]
細菌細胞が、アルスロバクター・ニコチアナエ、アセトバクター・アセチ、アルスロバクター・アリライテンシス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、バチルス・スファエリカス、バチルス・ステアロサーモフィラス、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス、ブレビバクテリウム・リネンス、カルノバクテリウム・ディバージェンス、コリネバクテリウム・フラベセンス、エンテロコッカス・フェシウム、グルコナセトバクター・エウロパエウス、グルコナセトバクター・ホハンナエ、グルコノバクター・オキシダンス、ハフニア・アルベイ、ハロモナス・エロンガタ、コクリア・リゾフィラ、ラクトバチルス・アシディファリナエ、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス、ロイコノストク・シトレウム、マクロコッカス・カセオリティカス、マイクロバクテリウム・フォリオルム、ミクロコッカス・ライレ、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・アシディラクティシ、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・フルオレッセンス、サイクロバクター・セラー、スタフィロコッカス・コンディメンティ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトマイセス・グリゼウス、テトラジェノコッカス・ハロフィルス、ワイセラ・チバリア、ワイセラ・コレエンシス、ザイモモナス・モビリス、コリネバクテリウム・グルタミクム、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム/ブレーベ/ロンガム、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・カゼイ、シュードアルテロモナス・シトレア、シュードモナス・プチダ、クロストリジウム・リュングダリイ/アセティカム/アセトブチリカム/ベエイジェリンキー/ブチリカム、およびムーレラ・テモセルム/サーモアセチカからなる群より選択される、本発明1031の方法。
[本発明1035]
真菌細胞が、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に由来する、本発明1031の方法。
[本発明1036]
真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウスおよびアスペルギルス・ニデュランスからなる群より選択される、本発明1031の方法。
[本発明1037]
少なくとも1種の酵素が、該少なくとも1種の酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することによって生成される、本発明1029の方法。
[本発明1038]
プロモルフィナン分子の前駆体を細胞培養物に添加する工程をさらに含む、本発明1029の方法。
[本発明1039]
テバインまたはその誘導体を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
少なくとも1種の酵素がテバインシンターゼを含む、本発明1029～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
少なくとも1種の酵素が、遺伝子操作されたテバインシンターゼ、遺伝子操作されたSalAT、形成性操作（DIR）タンパク質、またはカルコンイソメラーゼ（CHI）を含む、本発明1029～1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
テバインシンターゼ酵素がBet v 1フォールド（fold）タンパク質である、本発明1040の方法。
[本発明1043]
テバインシンターゼが、SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、35、36、および37からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1040の方法。
[本発明1044]
テバインシンターゼが、プロモルフィナン分子の前駆体の少なくとも50%をテバインに変換する、本発明1029の方法。
[本発明1045]
遺伝子操作された非植物細胞が、プロモルフィナン分子の前駆体の少なくとも90%をテバインに変換する、本発明1029の方法。
[本発明1046]
(i) エピメラーゼと、
(ii) テバインシンターゼと、
(iii) チロシンヒドロキシラーゼ（TyrH）、L-DOPA-デカルボキシラーゼ（DODC）、ノルコクラウリンシンターゼ（NCS）、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）、シトクロムP450 80B1（CYP80B1）、シトクロムP450レダクターゼ（CPR）、4’-O-メチルトランスフェラーゼ（4’OMT）、モノアミンオキシダーゼ（MAO）、トランスケトラーゼ（TKL1）、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（ZWF1）、五官能性AROMタンパク質（ARO1）、二官能性コリスミ酸シンターゼ（ARO2）、3-デオキシ-7-ホスホヘプツロン酸シンターゼ（ARO3）、3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ（ARO4）、コリスミ酸ムターゼ（ARO7）、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（TYR1）、芳香族アミノトランスフェラーゼ8（ARO8）、芳香族アミノトランスフェラーゼ9（ARO9）、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ARO10）、チロシナーゼ（TYR）からなる群より選択される少なくとも1種の酵素の改変と
を含む遺伝子操作された非植物細胞であって、
該遺伝子操作された非植物細胞内で、該遺伝子操作された非植物細胞が、プロモルフィナン分子の前駆体を、(i) モルフィナンアルカロイドと、(ii) ナル-オピオイドアルカロイドと、(iii) ノル-オピオイドアルカロイドとからなる群より選択されるアルカロイド生成物に変換する、遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1047]
エピメラーゼが遺伝子操作されたエピメラーゼである、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1048]
遺伝子操作されたエピメラーゼが分割型エピメラーゼである、本発明1047の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1049]
遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-1-ベンジルイソキノリン前駆体を(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換する、本発明1047または1048の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1050]
遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-レチクリンを(R)-レチクリンに変換する、本発明1047～1049のいずれかの遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1051]
前記遺伝子操作された非植物細胞内の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド分子の少なくとも50%が(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換される、本発明1049または1050の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1052]
テバインシンターゼが遺伝子操作されたテバインシンターゼである、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1053]
プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞に与えられる、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1054]
プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1055]
プロモルフィナン分子の前駆体が、レチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、コクラウリン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ノルレチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、4’-O’-メチルラウダノソリン、L-Dopa、チロシン、ドパミン、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、ヒドロキシフェニルピルビン酸、プレフェネート、コリスメート、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸（EPSP）、3-デオキシ-D-アラビノヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）、エリトロース-4-リン酸（E4P）、ホスホエノールピルビン酸（PEP）、およびグルコースからなる群より選択される、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1056]
前記遺伝子操作された非植物細胞内の四環性プロモルフィナン前駆体分子の少なくとも50%がテバインに変換される、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1057]
四環性プロモルフィナン分子が、サルタリジン、サルタリジノール、またはサルタリジノール-7-O-アセテートからなる群より選択される、本発明1056の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1058]
プロモルフィナン分子の前駆体が、式I:
Figure 2024037919000004
の(S)-基質またはその塩であり、式中:
R1、R2、R3およびR4は独立して、水素およびメチルから選択され;
R5は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される、
本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1059]
R1、R2、R3、R4およびR5のうちの少なくとも1つが水素である、本発明1057の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1060]
プロモルフィナン分子の前駆体が、式II:
Figure 2024037919000005
の化合物またはその塩である(S)-基質であり、式中:
R3は、水素およびC1～C4アルキルから選択され;
R6およびR7は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1～C4アシル、C1～C4アルキルおよびC1～C4アルコキシから選択され;
nは0、1、2、3または4であり;
n’は0、1、2、3、4または5である、
本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1061]
プロモルフィナン分子の前駆体がチロシンである、本発明1046～1060のいずれかの遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1062]
プロモルフィナン分子の前駆体が糖である、本発明1046～1060のいずれかの遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1063]
(i) BIA生成改変、(ii) O-脱メチル化改変、(iii) N-脱メチル化改変、および (iv) N-結合型改変からなる群より選択される少なくとも1つの改変をさらに含む、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1064]
モルフィナンアルカロイド生成物が、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、またはオキシモルホンである、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1065]
ナル-オピオイドアルカロイド生成物が、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン、ベベンプラン、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミン、またはジプレノルフィンである、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1066]
ノル-オピオイドアルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノン、またはノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンである、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1067]
細菌細胞または真菌細胞である、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1068]
細菌細胞が、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、マクロコッカス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属からなる群より選択される属に由来する、本発明1067の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1069]
細菌細胞が、アルスロバクター・ニコチアナエ、アセトバクター・アセチ、アルスロバクター・アリライテンシス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、バチルス・スファエリカス、バチルス・ステアロサーモフィラス、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス、ブレビバクテリウム・リネンス、カルノバクテリウム・ディバージェンス、コリネバクテリウム・フラベセンス、エンテロコッカス・フェシウム、グルコナセトバクター・エウロパエウス、グルコナセトバクター・ホハンナエ、グルコノバクター・オキシダンス、ハフニア・アルベイ、ハロモナス・エロンガタ、コクリア・リゾフィラ、ラクトバチルス・アシディファリナエ、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス、ロイコノストク・シトレウム、マクロコッカス・カセオリティカス、マイクロバクテリウム・フォリオルム、ミクロコッカス・ライレ、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・アシディラクティシ、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・フルオレッセンス、サイクロバクター・セラー、スタフィロコッカス・コンディメンティ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトマイセス・グリゼウス、テトラジェノコッカス・ハロフィルス、ワイセラ・チバリア、ワイセラ・コレエンシス、ザイモモナス・モビリス、コリネバクテリウム・グルタミクム、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム/ブレーベ/ロンガム、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・カゼイ、シュードアルテロモナス・シトレア、シュードモナス・プチダ、クロストリジウム・リュングダリイ/アセティカム/アセトブチリカム/ベエイジェリンキー/ブチリカム、およびムーレラ・テモセルム/サーモアセチカからなる群より選択される、本発明1067の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1070]
真菌細胞が、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に由来する、本発明1067の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1071]
真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス、およびアスペルギルス・ニデュランスからなる群より選択される、本発明1067の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1072]
前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも50%多いアルカロイド生成物を生成する、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
[本発明1073]
前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも2倍多いアルカロイド生成物を生成する、本発明1046の遺伝子操作された非植物細胞。
参照による組み入れ
本明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、参照により、あたかも個々の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられて具体的に個々に示されているのと同程度に、本明細書に組み入れられる。
本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲の詳細事項とともに示す。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を使用した実例の態様を示した以下の詳細説明、および添付の図面を参照することにより得られよう。
図1は、本発明の態様による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用およびサルベージ経路の例を示す。 図2は、本発明の態様による、グルコースの4-HPA、ドパミンおよび3,4-DHPAへの変換の生合成スキームを示す。 図3は、本発明の態様による（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの形成の一例の模式図を示す。 図4は、本発明の態様による親DRS-DRR酵素のアミノ酸配列を示す。 図5は、本発明の態様による、それぞれ図4に示す親融合酵素に由来するDRS酵素およびDRR酵素のアミノ酸配列を示す。 図6は、本発明の態様による、オピオイド3-O-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。 図7は、本発明の態様による、オピオイドN-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。 図8は、本発明の態様による、N-メチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を示す。 図9は、本発明の態様によるBM3変異体の機能性発現を示す。 図10は、本発明の態様による、微生物細胞内でのL-チロシンのノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換の生合成スキームを示す。 図11は、本発明の態様による、酵素発現および遺伝子操作用のプラスミド/YACベクターを示す。 図12は、本発明の態様による、ノルコクラウリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。 図13は、本発明の態様による、ノルラウダノソリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。 図14は、本発明の態様による、L-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。 図15は、本発明の態様による、半合成オピオイドの生成の生合成スキームを示す。 図16は、本発明の態様による、オピオイドの生成の生合成スキームを示す。 図17は、本発明の態様によるPbDRS-DRR、PrDRSおよびPrDRR間のアラインメントを示す。 図18は、本発明の態様によるL-チロシンからのレチクリンの生成用のプラットフォーム酵母株を示す。 図19は、本発明の態様によるL-チロシンからのテバインおよびヒドロコドンの生成用の酵母株を示す。 図20は、本発明の態様による、四環系骨格を五環系骨格に変換する一般的な閉環反応を示す。 図21は、本発明の態様による、モルフィナンアルカロイド生成酵素に関する生物情報学的検索によって作成された系統樹を示す。 図22は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株での糖およびL-チロシンからのモルフィナンアルカロイドテバインの生成を示す。 図23は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株での糖およびL-チロシンからのプロモルフィナンアルカロイドおよびモルフィナンアルカロイドテバインの生成を示す。
発明の詳細な説明
本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での多様なベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）の生成のための方法を提供する。さらに本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内で生成された多様なアルカロイドの組成物を提供する。加えて、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインシンターゼの生成のための方法を提供する。加えて、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたテバインシンターゼの生成のための方法を提供する。特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によってプロモルフィナン、モルフィナン、ナル-オピオイドおよびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によってモルフィナン、ナル-オピオイドおよびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、プロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によって多様なアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。
関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）
関心対象のBIAを生成する宿主細胞を提供する。一部の例では、宿主細胞の遺伝子操作された株、例えば、本明細書において論考する態様の遺伝子操作された株は、いくつかの構造分類、例えば非限定的に、前駆体BIA、ベンジルイソキノリン、プロモルフィナン、モルフィナン、ナル-オピオイド、ノル-オピオイドなどを越えて関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイドおよびその改変体を生成するためのプラットフォームを提供し得る。これらの分類の各々は、該分類のメンバーをもたらし得る遺伝子操作された宿主細胞の生合成経路の任意の簡便なメンバーの生合成前駆体、中間体およびその代謝産物を包含し得る。化合物の非限定的な例を以下に、これらの構造分類の各々について示す。一部の場合において、所与の例の構造は、それ自体がベンジルイソキノリンアルカロイドと特性評価される場合もあり、されない場合もある。一部の場合において、本発明での化学物質は、考えられ得るすべての異性体、例えば1種のエナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマー混合物および中間体混合物を包含し得る。
BIA前駆体としては、非限定的に、ノルコクラウリン（NC）およびノルラウダノソリン（NL）、ならびにNCおよびNL前駆体、例えばチロシン、チラミン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（4-HPA）、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸（4-HPPA）、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、およびドパミンが挙げられ得る。いくつかの態様では、1種または複数種の該BIA前駆体が3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）とドパミンである。一部の特定の場合では、1種または複数種の該BIA前駆体が4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（4-HPA）とドパミンである。特に、NLおよびNCは、それぞれ前駆体分子からピクテ・スペングラー縮合反応から合成され得、この場合、反応は自発的に起こり得るか、または任意の簡便な酵素によって触媒され得る。
ベンジルイソキノリンとしては、非限定的に、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、コクラウリン、3'-ヒドロキシコクラウリン、4'-O-メチルノルラウダノソリン、4'-O-メチル-ラウダノソリン、N-メチルノルコクラウリン、ラウダノソリン、N-メチルコクラウリン、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、パパベリン、ラウダニン、ラウダノシン、テトラヒドロパパベリン、1,2-ジヒドロパパベリン、およびオリエンタリン（orientaline）が挙げられ得る。
プロモルフィナンとしては、非限定的に、サルタリジン、サルタリジノール、およびサルタリジノール-7-O-アセテートが挙げられ得る。
モルフィナンとしては、非限定的に、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、およびヘテロコデインが挙げられ得る。特に、テバインは、サルタリジノール-7-O-アセテートから合成され得、この場合、反応は自発的に起こり得るか、または任意の簡便な酵素によって触媒され得る。
ナル-オピオイドとしては、非限定的に、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン（axelopran）、ベベンプラン（bevenpran）、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミンおよびジプレノルフィンが挙げられ得る。
ノル-オピオイドとしては、非限定的に、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンが挙げられ得る。
一部の特定の態様では、本発明の遺伝子操作株は、テトラヒドロビオプテリン合成に関する化合物、例えば非限定的に、ジヒドロネオプテリン三リン酸、6-ピルボイルテトラヒドロプテリン、5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン、7,8-ジヒドロビオプテリン、テトラヒドロビオプテリン4a-カルビノールアミン、キノノイドジヒドロビオプテリンおよびビオプテリンを生成させるためのプラットフォームを提供し得る。
宿主細胞
任意の簡便な細胞が主題の宿主細胞および方法に使用され得る。一部の場合では、宿主細胞が非植物細胞である。一部の例では、宿主細胞が微生物細胞であると特性評価され得る。一部の特定の場合では、宿主細胞が昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、または酵母細胞である。任意の簡便な型の宿主細胞が、主題のBIA生成細胞を作製するのに使用され得、例えばUS2008/0176754、およびUS2014/0273109を参照されたく、これらの開示内容は参照によりその全体が組み入れられる。関心対象の宿主細胞としては、非限定的に、グラム陽性細菌細胞およびグラム陰性細菌細胞のいずれであってもよい細菌細胞、昆虫細胞、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）S2およびツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）Sf9細胞、ならびに酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞が挙げられる。細菌細胞の非限定的な例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アナベナ属（Anabaena）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アセトバクター属（Acetobacter）、アセトバクテリウム属（Acetobacterium）、バチルス属（Bacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブラキバクテリウム属（Brachybacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ハフニア属（Hafnia）、ハロモナス属（Halomonas）、クレブシエラ属（Klebsiella）、コクリア属（Kocuria）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leucononstoc）、マクロコッカス属（Macrococcus）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロセラ属（Methylocella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ムーレラ属（Moorella）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、プロテウス属（Proteus）、シュードアルテロモナス属（Pseudoalteromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、セラチア属（Serratia）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、ワイセラ属（Weissella）、ザイモモナス属（Zymomonas）、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimuium）細胞が挙げられる。一部の例では、宿主細胞が酵母細胞または大腸菌（E.coli）細胞である。一部の場合では、宿主細胞が酵母細胞または大腸菌細胞である。一部の場合では、宿主細胞が酵母細胞である。一部の場合では、宿主細胞が、関心対象のBIA、例えばモルフィナンアルカロイドを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の場合では、宿主細胞が、関心対象の酵素を生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の場合では、宿主細胞が、テバインシンターゼを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。
テバインシンターゼはサルタリジノール-7-O-アセテートをテバインに、自然な反応と比べてより効率的に変換でき得る。一部の場合では、宿主細胞が、遺伝子操作されたテバインシンターゼを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の態様では、遺伝子操作されたテバインシンターゼが遺伝子操作された融合酵素であり得る。さらに、遺伝子操作されたテバインシンターゼはサルタリジノール-7-O-アセテートをテバインに、テバインシンターゼと比べてより効率的に変換でき得る。一部の態様では、テバインシンターゼが野生型テバインシンターゼであり得る。一部の態様では、テバインシンターゼが、野生型テバインシンターゼとかなり類似したものであり得る。一部の場合では、野生型テバインシンターゼとかなり類似しているテバインシンターゼが、野生型テバインシンターゼのアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上類似しているアミノ酸配列を有し得る。遺伝子操作されたテバインシンターゼは、テバインシンターゼと比べてサルタリジノール-7-O-アセテートをテバインにより効率的に変換するための別の酵素との融合酵素として遺伝子操作されてもよい。
Smolke et al.によるUS2008/0176754およびUS2014/0273109に記載の任意の宿主細胞が主題の細胞および方法における使用のために適合され得る。特定の態様では、酵母細胞がS. セレビシエ（S. cerevisiae）種であり得る。特定の態様では、酵母細胞がシゾサッカロミセス・ポンベ種であり得る。特定の態様では、酵母細胞がピキア・パストリス種であり得る。酵母は、シトクロムP450タンパク質がその活性が維持されるように小胞体膜内に適正にフォールディングされ得るため、宿主細胞として関心対象である。一例では、シトクロムP450タンパク質が関心対象のいくつかの生合成経路に関与している。さらなる例では、シトクロムP450タンパク質が、関心対象のBIAの生成に関与している。さらなる例では、シトクロムP450タンパク質が、関心対象の酵素の産生に関与している。
本明細書において有用性が見出される関心対象の酵母株としては、非限定的に、CEN.PK（遺伝子型:MATa/α ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2）、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、Σ1278B、AB972、SK1、およびFL100が挙げられる。一部の特定の場合では、該酵母株が、S288C（MATα; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1 hap1）、BY4741（MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0）、BY4742（MATα; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0）、BY4743（MATa/MATα; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; met15Δ0/MET15; LYS2/lys2Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0）、ならびにWAT11またはW(R)、それぞれシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）NADPH-P450レダクターゼATR1および酵母NADPH-P450レダクターゼCPR1を発現するW303-B株（MATa; ade2-1; his3-11、-15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr＋）の誘導体のいずれかである。別の態様では、酵母細胞がW303α（MATα; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1）である。さらなる関心対象の酵母株の実体および遺伝子型は、EUROSCARF（web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html）において知得され得る。
一部の場合では、宿主細胞が真菌細胞である。特定の態様では、真菌細胞がアスペルギルス属（Aspergillus）の種のものであり得、菌株としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（ATCC 1015、ATCC 9029、CBS 513.88）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（ATCC 56747、RIB40）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（NIH 2624、ATCC 20542）およびアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）（FGSC A4）が挙げられる。
特定の態様では、異種コード配列がアスペルギルス属の一種内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）、MbfAプロモーター、シトクロムcオキシダーゼサブユニットプロモーター（CoxA）、SrpBプロモーター、TvdAプロモーター、リンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（MdhA）、β-マンノシダーゼプロモーター（ManB）から選択され得る。特定の態様では、ターミネーターが、グルコアミラーゼターミネーター（GlaA）またはTrpCターミネーターから選択され得る。特定の態様では、プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、または宿主のゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばハイグロマイシンでの選択により、または窒素源の利用により、例えばアセトアミドを単独窒素源として用いて行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えば、プロトプラスト形質転換、酢酸リチウムまたはエレクトロポレーションを用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体MEもしくは固形MEA（3％麦芽エキス,0.5％ペプトンおよび±1.5％寒天）中またはVogel最少培地中で選択ありもしくはなしで培養され得る。
一部の場合では、宿主細胞が細菌細胞である。細菌細胞は任意の細菌属から選択され得る。細菌細胞が由来し得る属の例としては、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック（Leucononstoc）属、マクロコッカス（Macrococcus）属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコキスティス（Synechocystis）属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属が挙げられる。本開示の方法で使用され得る細菌の種の例としては、アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アルスロバクター・アリライテンシス（Arthrobacter arilaitensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス（Brachybacterium tyrofermentans）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium divergens）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Corynebacterium flavescens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、グルコナセトバクター・エウロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコナセトバクター・ホハンナエ（Gluconacetobacter johannae）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongata）、コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）、ラクトバチルス・アシディファリナエ（Lactobacillus acidifarinae）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ロイコノストク・シトレウム（Leuconostoc citreum）、マクロコッカス・カセオリティカス（Macrococcus caseolyticus）、マイクロバクテリウム・フォリオルム（Microbacterium foliorum）、ミクロコッカス・ライレ（Micrococcus lylae）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Propionibacterium acidipropionici）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、サイクロバクター・セラー（Psychrobacter celer）、スタフィロコッカス・コンディメンティ（Staphylococcus condimenti）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Streptomyces griseus）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）、ワイセラ・チバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・コレエンシス（Weissella koreensis）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）・ビフィドゥム（bifidum）/ブレーベ（breve）/ロンガム（longum）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、シュードアルテロモナス・シトレア（Pseudoalteromonas citrea）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、クロストリジウム（Clostridium）・リュングダリイ（ljungdahlii）/アセティカム（aceticum）/アセトブチリカム（acetobutylicum）/ベエイジェリンキー（beijerinckii）/ブチリカム（butyricum）、およびムーレラ（Moorella）・テモセルム（themocellum）/サーモアセチカ（thermoacetica）が挙げられる。
特定の態様では、細菌細胞が大腸菌株のものであり得る。特定の態様では、大腸菌株は、BL21、DH5α、XL1-Blue、HB101、BL21およびK12から選択され得る。特定の態様では、異種コード配列が大腸菌内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、T7プロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（tet）、lacオペロンプロモーター（lac）、lacO1プロモーターから選択され得る。特定の態様では、プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、またはゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、プラスミドが、pUC19またはpBADから選択される。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンまたはアンピシリンでの選択により行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えばコンジュゲーション、ヒートショック化学的形質転換またはエレクトロポレーションを用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体ルリア-ベルターニ（LB）培地中で約37℃にて抗生物質ありまたはなしで培養され得る。
特定の態様では、細菌細胞が枯草菌株であり得る。特定の態様では、枯草菌（B. subtilis）株は、1779、GP25、RO-NN-1、168、BSn5、BEST195、1A382および62178から選択され得る。特定の態様では、異種コード配列がバチルス属の一種内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、gracプロモーター、p43プロモーターまたはtrnQプロモーターから選択され得る。特定の態様では、該プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、またはゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、プラスミドが、pHP13、pE194、pC194、pHT01またはpHT43から選択される。特定の態様では、組込みベクター、例えばpDG364またはpDG1730が、発現カセットをゲノム内に組込むために使用され得る。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばエリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびスペクチノマイシンでの選択により行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えば自然形質転換能、ヒートショックまたは化学的形質転換を用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体ルリア-ベルターニ（LB）培地中で37℃にて、またはM9培地＋グルコースおよびトリプトファン中で培養され得る。
宿主細胞に対する遺伝子改変
宿主細胞は、関心対象のBIAの生成をもたらす1つまたは複数の改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含むように遺伝子操作され得る。付加的または代替的に、宿主細胞は、関心対象の酵素の産生をもたらす1つまたは複数の改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含むように遺伝子操作され得る。一部の場合では、改変は遺伝子改変、例えば、遺伝子もしくはその断片の変異、付加もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写調節である。本明細書で用いる場合、用語「変異」は、参照の配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換をいう。変異は特異的変異として、天然遺伝子の本来の遺伝子座に組込まれ得る。一部の場合では、変異は、別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入された遺伝子の追加コピーとして、またはエピゾーマルベクター上、例えば、2μもしくはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。一部の特定の場合では、該酵素の基質阻害コピーが天然細胞の転写調節下に存在している。一部の例では、該酵素の基質阻害コピーが、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的な調節を伴って導入される。一部の例では、1つまたは複数の改変の対象物が天然遺伝子であり得る。一部の例では、1つまたは複数の改変の対象物が非天然遺伝子であり得る。一部の例では、非天然遺伝子が宿主細胞内に挿入され得る。さらなる例では、非天然遺伝子が、宿主細胞内に挿入される前に1つまたは複数の改変によって変更され得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の関心対象のBIAを過剰生成し得る。過剰生成するとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非改変細胞）と比べて関心対象のBIA分子の改善または増大した生成を有することを意味する。改善または増大した生成とは、対照は関心対象のBIAの生成を有していない場合のいくらかの量の関心対象のBIAの生成、ならびに対照はいくらかの関心対象のBIAの生成を有している状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意味する。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有していない場合は、いくらかの量の関心対象の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有している状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをさらに過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有しない場合は、いくらかの量の関心対象の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のモルフィナンアルカロイドをさらに過剰生成させ得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がモルフィナンアルカロイドの生成を有しない場合はいくらかの量の関心対象のモルフィナンアルカロイドを生成させ得る、ならびに対照がいくらかの関心対象のモルフィナンアルカロイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドのうちの1種または複数種をさらに過剰生成させ得る。
一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、（例えば、本明細書に記載されるような）1つまたは複数の改変を欠いた対照宿主細胞と比べて増大量の（R）-レチクリンを生成することができる。一部の場合では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼを有する遺伝子操作された宿主細胞が、融合型エピメラーゼを有する宿主細胞と比べて増大量の（R）-レチクリンを生成することができる。一部の場合では、遺伝子操作されたエピメラーゼのオキシダーゼ部分に改変を有する遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作されたエピメラーゼのオキシダーゼ部分に該1つまたは複数の改変がない対照宿主細胞と比べて増大量の（R）-レチクリンを生成することができる。一部の特定の場合では、（R）-レチクリンの増大量が対照宿主細胞と比べて約10％以上、例えば対照宿主細胞と比べて約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、約2倍以上、約5倍以上またはさらには約10倍以上である。一部の場合では、（R）-レチクリンが、遺伝子操作された宿主細胞内のエピマー化反応の生成物である。一部の場合では、（R）-レチクリンが、遺伝子操作された宿主細胞内の少なくとも1種の遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒されるエピマー化反応の生成物である。このような場合、（S）-レチクリンはこのエピマー化反応の基質であり得る。
一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）がない対照宿主細胞と比べて増大量のテバインを生成することができる。一部の場合では、テバインシンターゼを有する遺伝子操作された宿主細胞が、テバインシンターゼがない宿主細胞と比べて増大量のテバインを生成することができる。一部の場合では、遺伝子操作されたテバインシンターゼを有する遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作されていないテバインシンターゼ（例えば、本明細書に記載のようなもの）を有する宿主細胞と比べて増大量のテバインを生成することができる。一部の特定の場合では、テバインの増大量が対照宿主細胞と比べて約10％以上、例えば対照宿主細胞と比べて約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、約2倍以上、約5倍以上またはさらには約10倍以上である。一部の場合では、テバインが遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインシンターゼの反応の生成物である。一部の場合では、テバインが、遺伝子操作された宿主細胞内の少なくとも1種の遺伝子操作されたテバインシンターゼによって触媒されるテバインシンターゼの反応の生成物である。このような場合、サルタリジノール-7-O-アセテートは、このテバインシンターゼの反応の基質であり得る。
さらに、遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種の関心対象の酵素を過剰産生し得る。過剰産生させるとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非改変細胞）と比べて関心対象の酵素の改善または増大した産生を有することを意図する。改善または増大した産生とは、対照が関心対象の酵素の産生を有しない場合のいくらかの量の関心対象の酵素の産生、ならびに対照がいくらかの関心対象の酵素の産生を有する状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意図する。
遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のDRS-DRR酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がDRS-DRR酵素の産生を有しない場合はいくらかの量のDRS-DRR酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのDRS-DRR酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種の遺伝子操作されたDRS-DRR酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がDRS-DRR酵素の産生を有しない場合または対照が遺伝子操作された宿主細胞と比べて同レベルの野生型エピメラーゼの産生を有する場合は、いくらかの量の遺伝子操作されたDRS-DRRエピメラーゼを産生し得る、ならびに対照がいくらかのDRS-DRR酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRRエピメラーゼは遺伝子操作された分離型エピメラーゼであり得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRRエピメラーゼは遺伝子操作された融合型エピメラーゼであり得る。
遺伝子操作された宿主細胞はさらに、DRS-DRR酵素に由来する1種または複数種の酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がDRS-DRR酵素に由来する酵素の産生を有しない場合は、DRS-DRR酵素に由来するいくらかの量の酵素を産生し得る、ならびに対照がDRS-DRR酵素に由来するいくらかの酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のテバインシンターゼ酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がテバインシンターゼ酵素の産生を有しない場合はいくらかの量のテバインシンターゼ酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのテバインシンターゼ酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種の遺伝子操作されたテバインシンターゼ酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がテバインシンターゼ酵素の産生を有しない場合または対照が遺伝子操作された宿主細胞と比べて同レベルの野生型テバインシンターゼの産生を有する場合はいくらかの量の遺伝子操作されたテバインシンターゼを産生し得る、ならびに対照がいくらかのテバインシンターゼ酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。一部の場合では、遺伝子操作されたテバインシンターゼが遺伝子操作された融合酵素であり得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、テバインシンターゼ酵素に由来する1種または複数種の酵素をさらに過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がテバインシンターゼ酵素に由来する酵素の産生を有しない場合はテバインシンターゼ酵素に由来するいくらかの量の該酵素を産生し得る、ならびに対照がテバインシンターゼ酵素に由来するいくらかの該酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
一部の場合では、1つまたは複数（例えば、2つ以上、3つ以上または4つ以上）の改変が、生合成酵素遺伝子における基質阻害緩和変異；生合成酵素遺伝子における生成物阻害緩和変異；補因子回復促進機構；生合成酵素遺伝子におけるフィードバック阻害緩和変異；生合成酵素遺伝子の転写モジュレーション改変；酵素遺伝子における不活性化変異；エピマー化モジュレーション；および酵素をコードする異種コード配列から選択され得る。1つまたは複数の改変を含む細胞は遺伝子操作された細胞と称され得る。
一部の場合では、該1つまたは複数（例えば、2つ以上、3つ以上または4つ以上）の改変が、局在変異；シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異；到達性（accessibility）変異；活性向上変異；遺伝子操作された融合型テバインシンターゼ改変；および遺伝子操作された分割型エピメラーゼ改変から選択され得る。1つまたは複数の改変を含む細胞は遺伝子操作された細胞と称され得る。
基質阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「基質阻害緩和変異」は、該細胞の基質阻害制御機構を緩和する変異をいう。
基質阻害を緩和する変異は、関心対象の細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させ、調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC50を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、遺伝子操作された宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。
関心対象のBIAまたはその前駆体のレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における基質阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が基質阻害緩和のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該1つまたは複数の変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、1種または複数種のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードしている。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の基質阻害緩和変異が、TyrHである生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の基質阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。
特定の態様では、該1つまたは複数の基質阻害緩和変異がTyrH遺伝子内に存在している。TyrH遺伝子は、チロシンをL-DOPAに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードしている。しかしながら、TyrHは、その基質チロシンによって阻害される。例えばヒトまたはラットにみられる哺乳動物チロシンヒドロキシラーゼ活性は、TyrH遺伝子に対する基質阻害を軽減する変異によって改善することができる。特に、チロシンによる基質阻害は、TyrH遺伝子内における点変異W166Yによって軽減させることができる。また、TyrH遺伝子内における点変異W166Yにより、チロシンのL-DOPAへの反応を触媒するためのチロシンヒドロキシラーゼの共基質BH4の結合が改善され得る。TyrHの該変異型（例えば、米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）は、糖からBIAを生成するために酵母株において発現させた場合、BIAの生成を有意に改善し得る。
任意の簡便な数および型の変異が、基質阻害制御機構を緩和するために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の基質阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の基質阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
補因子回復促進機構
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回復促進機構（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「補因子回復促進機構」は、該細胞の補因子回復制御機構を促進させる機構をいう。
関心対象のBIAまたはその前駆体のレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における補因子回復のさまざまな制御機構および生合成酵素が補因子回復促進のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回復促進機構を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードしている異種コード配列を含み得る。DHFRが発現されると、これにより7,8-ジヒドロビオプテリン（BH2）がテトラヒドロビオプテリン（BH4）に変換され得、それによりBH4がTyrH共基質として回復し得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の補因子回復促進機構を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。
任意の簡便な数および型の機構が、補因子回復制御機構を促進させるために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の補因子回復促進機構、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の補因子回復促進機構を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
産物阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の産物阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「産物阻害緩和変異」は、遺伝子操作された宿主細胞の短期間および/または長期間の産物阻害の制御機構を緩和する変異をいう。短期間の産物阻害は、共基質の結合部位への競合的結合がみられる該細胞の制御機構である。長期間の産物阻害は、所望の経路外の化合物の不可逆的結合がみられる該細胞の制御機構である。
産物阻害を緩和する変異は、関心対象の細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させ、調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC50を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、遺伝子操作された宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。
関心対象のBIAのレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における産物阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が産物阻害緩和のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の産物阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、1種または複数種のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードしている。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の産物阻害緩和変異が、TyrHである生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の産物阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに含む。
特定の態様では、該1つまたは複数の産物阻害緩和変異がTyrH遺伝子内に存在している。TyrH遺伝子は、チロシンをL-DOPAに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードしている。TyrHは、ヒドロキシル化反応を触媒するための共基質としてテトラヒドロビオプテリン（BH4）を必要とする。一部の微生物株、例えばサッカロミセス・セレビシエはBH4を天然に産生しないが、図1に示すような4-酵素合成/再利用経路により、この基質を産生するように遺伝子操作され得る。図1は、本発明の態様による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用およびサルベージ経路の例を示す。図1は、酵素PTPS、ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ；SepR、セピアプテリンレダクターゼ；PCD、プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ；QDHPR、ジヒドロプテリジンレダクターゼ；およびDHFR、ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を示す。図1に示した酵素のうち、酵母は内因性GTPシクロヒドロラーゼIを合成する。GTPおよびジヒドロネオプテリン三リン酸は酵母内で天然に合成される。さらに、図1における他の代謝産物は酵母内で天然に生成されない。
TyrHは、その産物L-DOPAならびに他のカテコールアミン、特にドパミンによって阻害される。例えばヒトまたはラット由来の哺乳動物チロシンヒドロキシラーゼ活性は、産物阻害を軽減する変異によって改善することができる。例えば、短期間の産物阻害、例えば共基質の結合部位への競合的結合は、TyrH遺伝子における点変異W166Yによって軽減され得る。特に、TyrH遺伝子における点変異W166Yにより共基質の結合が改善され得る。さらに、共基質の結合部位への競合的結合を軽減するための短期間の産物阻害は、TyrH遺伝子における点変異S40Dによっても改善され得る。また、短期間の産物阻害はTyrH遺伝子におけるR37E,R38E共同（joint）変異によっても改善され得る。特に、R37E,R38E変異は一緒になって、ドパミンの存在下でのチロシンヒドロキシラーゼ活性を明確に改善し得る。
さらに、長期間の産物阻害はTyrH遺伝子における点変異によって軽減され得る。長期間の産物阻害の軽減としては、チロシンヒドロキシラーゼ活性の産物阻害因子として作用するカテコールアミンの存在が少なくなるような、活性部位での鉄へのカテコールアミンの不可逆的結合が挙げられ得る。長期間の産物阻害は、それぞれTyrH遺伝子における変異E332DおよびY371Fによって軽減させることができる。
複数の型の基質阻害および産物阻害を軽減させてTyrHの活性をさらに改善するために変異の組合せ（例えば、一度に2つもしくは3つ、またはそれ以上の変異）を行なってもよい。TyrHの該変異型（例えば、米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）は、糖からBIAを生成するために酵母株において発現させた場合、BIAの生成を有意に改善し得る。
任意の簡便な数および型の変異が、産物阻害の制御機構を緩和するために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の産物阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の産物阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
フィードバック阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。付加的または代替的に、一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「フィードバック阻害緩和変異」は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害の制御機構を緩和する変異をいう。フィードバック阻害は、調節対象化合物の合成経路内の酵素が、該化合物がある一定レベルまで蓄積されたら阻害され、それにより細胞内の該化合物の量を均衡する該細胞の制御機構である。フィードバック阻害を緩和する変異は、遺伝子操作された宿主細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させる。このようにして、遺伝子操作された宿主細胞は調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC50を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。
関心対象のBIAのレベル調節に指向される、フィードバック阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が宿主細胞における緩和のために標的化され得る。宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異を該細胞にとって天然の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該1つまたは複数の変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼおよびコリスミ酸ムターゼから選択される1種または複数種の酵素をコードしているものであり得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼをコードしている。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子はコリスミ酸ムターゼをコードしているものであり得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO4およびARO7から選択される生合成酵素遺伝子内に存在し得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO4である生合成酵素遺伝子内に存在し得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO7である生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。
任意の簡便な数および型の変異が、フィードバック阻害の制御機構を緩和するために使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「変異」は、参照の配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換をいう。変異は特異的変異として、天然遺伝子の本来の遺伝子座に組込まれ得る。一部の場合では、変異は、別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入された遺伝子の追加コピーとして、またはエピゾーマルベクター上、例えば、2μもしくはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。一部の特定の場合では、該酵素のフィードバック阻害コピーが天然細胞の転写調節下に存在している。一部の例では、該酵素のフィードバック阻害コピーが、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入される。
特定の態様では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異がARO4遺伝子内に存在し得る。関心対象のARO4変異としては、非限定的に、229位のリシン残基のロイシンでの置換、166位のグルタミン残基のリシン残基での置換、またはHartmann M, et al.（（2003）Proc Natl Acad Sci U S A 100（3）:862-867）もしくはFukuda, et al.（（1992）J Ferment Bioeng 74（2）:117-119）に記載の変異が挙げられ得る。一部の例では、フィードバック阻害を付与するための変異は、変異誘発された酵素変異型ライブラリーから選択され得る。かかる選出体の例としては、Fukuda, et al.（（1990）Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of β-Phenylethyl Alcohol and β-Phenylethyl Acetate. Agr Biol Chem Tokyo 54（1）:269-271）に記載のような過剰のチロシンを有する培地中でのo-フルオロ-D,L-フェニルアラニンの増加またはaro3変異型酵母株の増殖の救済が挙げられ得る。
特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上のフィードバック阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15のフィードバック阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
転写モジュレーション改変
宿主細胞は、該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の1つまたは複数の転写モジュレーション改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含み得る。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。該細胞の任意の簡便な生合成酵素遺伝子が転写モジュレーションのために標的化され得る。転写モジュレーションとは、改変細胞内の関心対象の遺伝子の発現が、対照細胞（例えば、非改変細胞）と比べてモジュレートされる、例えば、増大または低減、向上または抑制されることを意味する。一部の場合では、関心対象の該遺伝子の転写モジュレーションとしては、発現の増大または増強が挙げられる。発現の増大または増強とは、関心対象の該遺伝子の発現レベルが、対照、すなわち改変されていない同じ細胞での発現と比べて（例えば、任意の簡便な遺伝子発現アッセイを使用することにより）2倍以上、例えば5倍以上、場合によっては25-、50-もしくは100倍以上、特定の態様では300倍以上またはそれより大きく増大していることを意味する。代替的に、細胞における関心対象の該遺伝子の発現が非常に少なくて検出不可能である場合では、関心対象の該遺伝子の発現レベルは、発現が容易に検出可能であるレベルまで増大しているならば、増大しているとみなす。一部の特定の場合では、関心対象の該遺伝子の転写モジュレーションとしては、発現の低減または抑制が挙げられる。発現の低減または抑制とは、関心対象の該遺伝子の発現レベルが、対照と比べて2倍以上、例えば5倍以上、場合によっては25-、50-もしくは100倍以上、特定の態様では300倍以上またはそれより大きく低減されていることを意味する。一部の場合では、発現は、検出不可能なレベルまで低減される。主題の宿主細胞における使用のために適合され得る関心対象の宿主細胞プロセスの改変は、Smolke et al.による米国特許出願公開第20140273109（14/211,611）号に記載されており、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
任意の簡便な生合成酵素遺伝子が転写モジュレートされ得、非限定的に、図2に記載の生合成酵素が挙げられ得る。特に、図2は、本発明の態様による、グルコースの4-HPA、ドパミンおよび3,4-DHPAへの変換の生合成スキームを示す。図2に記載の酵素の例としては、ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9、ARO8およびTKLが挙げられる。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ARO10、ARO9、ARO8およびTKLから選択され得る。一部の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がARO10であり得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がARO9であり得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がTKLであり得る。いくつかの態様では、宿主細胞が、1つまたは複数の遺伝子、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに対する1つまたは複数の転写モジュレーション改変を含む。
いくつかの態様では、転写モジュレーション改変としては、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の天然プロモーターの強力なプロモーターでの置換または強力なプロモーターの制御下での追加コピーの該遺伝子の発現が挙げられ得る。関心対象の該遺伝子の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいが、該プロモーターは宿主細胞内で活性であり得るものとする。関心対象の該遺伝子は、その天然プロモーターによって発現されるものであってもよい。付加的または代替的に、関心対象の該遺伝子は、非天然プロモーターによって発現されるものであってもよい。必要条件ではないが、かかるプロモーターは、これが使用される宿主において中程度から高度の強度であり得る。プロモーターは調節されていてもよく構成的であってもよい。いくつかの態様では、グルコース抑制型でないか、または培養培地中のグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターを使用してもよい。数多くの好適なプロモーターが存在しており、その例としては、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、枯草菌tsr遺伝子（フルクトースビリン酸（biphosphate）アルドラーゼをコードしている）のプロモーターまたはサッカロミセス・セレビシエ（グリセルアルデヒド-リン酸デヒドロゲナーゼをコードしている）（Bitter G. A., Meth. Enzymol. 152:673-684（1987））由来のGAPDHプロモーターが挙げられる。他の関心対象の強力なプロモーターとしては、非限定的に、パン酵母のADHIプロモーター（Ruohonen L., et al, J. Biotechnol. 39:193-203（1995））、リン酸欠乏誘導型プロモーター、例えば、酵母のPHO5プロモーター（Hinnen A., et al, in Yeast Genetic Engineering, Barr P. J., et al. eds, Butterworths（1989）、B.リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のアルカリホスファターゼプロモーター（Lee. J. W. K., et al, J. Gen. Microbiol. 137:1127-1133（1991））、GPD1、およびTEF1が挙げられる。酵母の関心対象のプロモーターとしては、非限定的に、誘導性プロモーター、例えば、Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、抑制性プロモーターMet25、tetO、および構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GPD）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH）、翻訳-伸長因子-1-αプロモーター（TEF）、シトクロムc-オキシダーゼプロモーター（CYC1）、MRP7プロモーターなどが挙げられる。一部の例では、該強力なプロモーターがGPD1である。一部の特定の場合では、該強力なプロモーターがTEF1である。ホルモン、例えばグルココルチコイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンにより誘導性のプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターもまた公知であり、非限定的に、グルコルチコイド（glucorticoid）応答エレメント（GRE）および甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）が挙げられ、例えば、米国特許第7,045,290号に記載のプロモーターを参照のこと。構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHの）を含むベクターが使用され得る。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBどおり）もまた、関心対象の遺伝子の発現を駆動させるために使用することができよう。例えば大腸菌の宿主細胞に特異的な任意の簡便なプロモーターが選択され得ることは理解されよう。一部の場合では、プロモーターの選択は、転写、したがって酵素レベルを最適化して産生を最大限にするとともにエネルギー資源を最小限にするために使用され得る。
不活性化変異
遺伝子操作された宿主細胞は、該細胞の酵素に対する1つまたは複数の不活性化変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を含み得る。1つまたは複数の不活性化変異を含めることにより、合成経路の遺伝子操作された宿主細胞のフラックスが、関心対象のBIAまたはこれをもたらす望ましい酵素もしくは前駆体のレベルが上昇するように改変され得る。一部の例では、該1つまたは複数の不活性化変異が、該細胞にとって天然の酵素に対するものである。付加的または代替的に、該1つまたは複数の不活性化変異が、該細胞にとって非天然の酵素に対するものである。本明細書で用いる場合、「不活性化変異」とは、該細胞の遺伝子または調節性DNA配列に対する1つまたは複数の変異であって、該変異により、関心対象の該遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が不活性化されることを意味する。一部の場合では、該遺伝子は該細胞にとって天然である。一部の例では、該遺伝子は、不活性化され、かつ、宿主細胞が生成する関心対象のBIAの合成経路の一部であるかまたは該合成経路と関連している酵素を、コードしている。一部の例では、不活性化変異は、関心対象の遺伝子を制御する調節性DNA配列内に配置される。一部の特定の場合では、不活性化変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。任意の簡便な変異（例えば、本明細書に記載のようなもの）が、関心対象の遺伝子または調節性DNA配列を不活性化させるために使用され得る。「不活性化される」または「不活性化させる」とは、変異された該遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が、非変異対照遺伝子によって発現される対照タンパク質と比べて10％以上、例えば20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上または99％以上低下することを意味する。一部の場合では、該タンパク質が酵素であり、不活性化変異によって該酵素の活性が低下する。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、該細胞にとって天然の酵素における不活性化変異を含む。任意の簡便な酵素が不活性化のために標的化され得る。関心対象の酵素としては、非限定的に、合成経路内における遺伝子操作された宿主細胞の作用が関心対象のBIAレベルを低下させる傾向にある表3に記載の酵素が挙げられ得る。一部の場合では、該酵素がグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がZWF1である。一部の場合では、該酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。いくつかの態様では、不活性化変異を含む酵素が、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1から選択される。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH2である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH3である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH4である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH5である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH6である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH7である。一部の場合では、該酵素がアルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有する。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素が、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6から選択される。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD2である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD3である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD4である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD5である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD6である。一部の態様では、宿主細胞が、表3に記載の1つまたは複数の遺伝子に対する1つまたは複数の不活性化変異を含む。
エピマー化改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を説明する。このような方法、プロセスおよびシステムの一部は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が、基質の多様な範囲のアルカロイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換がエピマー化反応を含む。一部の例では、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が遺伝子操作されたエピメラーゼによるエピマー化反応を含む。一部の場合では、基質アルカロイドのエピマー化が、図3に示し、スキーム1に一般的に示すように、（S）-基質を対応するシッフ塩基またはイミン中間体に酸化させ、次いで、この中間体を（R）-生成物に立体特異的に還元することにより行われ得る。スキーム1に示すように、R1、R2、R3およびR4はHまたはCH3であり得る。R5はH、OHまたはOCH3であり得る。
スキーム1
Figure 2024037919000006
一部の例では、（S）-基質の（R）-生成物への変換が、少なくとも1つの酸化反応と少なくとも1つの還元反応を伴い得る。一部の場合では、酸化反応の後に任意で還元反応が行われる。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が酵素の存在下で行われる。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が酵素によって触媒される。一部の場合では、酸化反応と還元反応がどちらも、少なくとも1種の酵素の存在下で行われる。一部の場合では、少なくとも1種の酵素は酸化反応と還元反応を触媒するのに有用である。酸化反応と還元反応は同じ酵素によって触媒されてもよい。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒される。一部の場合では、酸化反応と還元反応がどちらも、遺伝子操作された融合型エピメラーゼの存在下で行われる。一部の場合では、酸化反応と還元反応がどちらも、それぞれ別々に発現されるオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を有する遺伝子操作された分割型エピメラーゼの存在下で行われる。一部の場合では、遺伝子操作されたエピメラーゼが酸化反応と還元反応を触媒するのに有用である。酸化反応と還元反応が同じ遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒されてもよい。
本明細書に記載の一部の方法、プロセスおよびシステムでは、酸化反応が、酵素の存在下で行われ得る。一部の例では、酵素はオキシダーゼであり得る。一部の例では、酵素は遺伝子操作されたエピメラーゼの一部であり得る。一部の例では、遺伝子操作されたエピメラーゼがオキシダーゼ成分を有し得る。一部の場合では、オキシダーゼ成分が遺伝子操作された融合型エピメラーゼの成分であり得る。一部の場合では、オキシダーゼ成分が、遺伝子操作された分割型エピメラーゼの一部として独立して発現され得る。該オキシダーゼは（S）-1-ベンジルイソキノリンを基質として使用し得る。該オキシダーゼは、（S）-基質を対応するイミンまたはシッフ塩基誘導体に変換し得る。該オキシダーゼは1,2-デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）と称され得る。本開示における（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの酸化に適した酵素の非限定的な例としては、シトクロムP450オキシダーゼ、2-オキソグルタル酸依存性オキシダーゼ、およびフラボタンパク質オキシダーゼが挙げられる。例えば、（S）-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（STOX、E.C 1.3.3.8）は、（S）-ノルレチクリンおよび他の（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを1,2-デヒドロノルレチクリンおよび他の対応する1,2-デヒドロ生成物に酸化させ得る。一部の例では、先の例のいずれか1つのオキシダーゼドメインを含むタンパク質が酸化を行い得る。一部の例では、該オキシダーゼが、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主細胞内での酸化反応を触媒し得る。
一部の例では、還元反応に続いて酸化反応が行われ得る。一部の例では、還元反応は酵素によって行われ得る。一部の例では、還元反応は遺伝子操作されたエピメラーゼの一部である酵素によって行われ得る。一部の例では、該レダクターゼが、1-ベンジルイソキノリンに由来するイミンまたはシッフ塩基を基質として使用し得る。該レダクターゼは、該イミンまたはシッフ塩基誘導体を（R）-1-ベンジルイソキノリンに変換し得る。該レダクターゼは1,2-デヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）と称され得る。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するイミンまたはシッフ塩基の還元に適した酵素の非限定的な例としては、アルド-ケトレダクターゼ（例えば、コデイノンレダクターゼ様酵素（EC 1.1.1.247））および短鎖デヒドロゲナーゼ（例えば、サルタリジンレダクターゼ様酵素（EC 1.1.1.248））が挙げられる。一部の例では、先の例のいずれか1つのレダクターゼドメインを含むタンパク質が還元を行い得る。さらなる一態様では、還元が立体特異的である。一部の例では、該レダクターゼが、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主細胞内での還元反応を触媒し得る。
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピマー化反応を行い得る酵素の一例としては、オキシダーゼドメインとレダクターゼドメインを有するエピメラーゼが挙げられる。特に、該エピメラーゼは、シトクロムP450オキシダーゼ82Y2様ドメインを有し得る。さらに、該エピメラーゼは、コデイノンレダクターゼ様ドメインを有し得る。さらに、シトクロムP450オキシダーゼ82Y2様ドメインを有し、またコデイノンレダクターゼ様ドメインも有するエピメラーゼはDRS-DRR酵素と称され得る。特に、DRS-DRR酵素は、融合エピメラーゼである融合酵素であり得る。さらに、DRS-DRR酵素が少なくとも1つの活性増大改変によって改変されている場合、該融合酵素は遺伝子操作された融合エピメラーゼであり得る。
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を行うために使用され得るDRS-DRR酵素のアミノ酸配列の一例を図4に示す。特に図4は、本発明の態様による、DRS-DRR酵素のアミノ酸配列を示す。図4に見られるように、下線を引いた文字はシトクロムP450 CYP82Y2様ドメイン（AFB74617.1に対する59%の同一性）を表す。破線を引いた文字はアルドケトレダクターゼNADPH依存的コデイノンレダクターゼ様ドメイン（ACM44066.1に対する75%の同一性）を表す。DRS-DRR酵素のさらなるアミノ酸配列を表1に示す。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに使用されるエピメラーゼのアミノ酸配列は、表1に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、一部の特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的なアミノ酸配列との少なくとも80％～99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、コドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更される。
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、該エピメラーゼが:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるエピメラーゼを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。一部の場合では、該エピメラーゼが1種または複数種の酵素に分割され得る。さらに、該エピメラーゼの分割によって生成する1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞から回収してもよい。該エピメラーゼの分割によって生じるこのような1種または複数種の酵素もまた、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を触媒するために使用され得る。特に、該エピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞から回収された該1種または複数種の酵素は、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスに使用され得る。該プロセスは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるのに充分な量のエピメラーゼと接触させることを含み得る。いくつかの例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも5％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を行うために使用され得るDRS-DRR酵素のアミノ酸配列の一例を図4に示す。特に、図4は、本発明の態様による、コドン最適化されたDRS-DRR酵素のアミノ酸配列を示す。さらに、図5は、図4のDRS-DRR酵素の各々のオキシダーゼ部分とレダクターゼ部分を分割したものを示す。DRS-DRR酵素のさらなるアミノ酸配列を表1に示す。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに使用されるエピメラーゼのアミノ酸配列は、表1に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、一部の特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的なアミノ酸配列との少なくとも80％～99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、コドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更される。
相同なエピメラーゼのアミノ酸残基は、SEQ ID NO.16のナンバリングスキームに従って言及され得、このナンバリングシステムが本開示全体を通して、SEQ ID NO.16と相同なエピメラーゼの具体的なアミノ酸残基を示すのに使用される。SEQ ID NO.16と相同なエピメラーゼは、SEQ ID NO.16と少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％または99％の配列同一性を有し得る。一部の場合では、相同なエピメラーゼの50位であると示されたアミノ酸は該相同なエピメラーゼ内の50番目のアミノ酸でないかもしれないが、該相同なエピメラーゼのSEQ ID NO.16とのタンパク質アラインメントにおいてSEQ ID NO.16内の50位のアミノ酸に対応するアミノ酸であり得る。一部の場合では、相同性の酵素はSEQ ID NO.16と、一次配列、二次構造または三次構造のいずれかに従ってアラインメントされ得る。
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する遺伝子操作されたエピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、該エピメラーゼが:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17および18からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、1つまたは複数の活性向上改変を有する、遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるエピメラーゼを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。一部の場合では、該エピメラーゼが1種または複数種の酵素に分割され得る。さらに、該エピメラーゼの分割によって生成する1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞から回収してもよい。該エピメラーゼの分割によって生じるこのような1種または複数種の酵素もまた、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を触媒するために使用され得る。さらに、遺伝子操作された分割型エピメラーゼの使用は、細胞内でのベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の生成を、融合型エピメラーゼを用いた細胞内でのベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の生成と比較した場合に増大させるために用いられ得る。
さらなる場合では、該エピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞から回収された該1種または複数種の酵素は、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスに使用され得る。該プロセスは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるのに充分な量のエピメラーゼと接触させることを含み得る。いくつかの例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも5％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにインビボで接触させてもよい。さらに、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよく、または、遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、(S)-基質の(R)-生成物へのエピマー化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドが、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するもの、例えば、4環式のプロモルフィナンアルカロイドおよび5環式のモルフィナンアルカロイドなどである。別の態様では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、1-ベンジルイソキノリン、モルフィナン、プロモルフィナン、ノル-オピオイド、またはナル-オピオイドアルカロイドからなる群より選択される。
一部の例では、(S)-基質が、(S)-ノルレチクリン、(S)-レチクリン、(S)-テトラヒドロパパベリン、(S)-ノルコクラウリン、(S)-コクラウリン、(S)-N-メチルコクラウリン、(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、(S)-ノルイソオリエンタリン、(S)-オリエンタリン、(S)-イソオリエンタリン、(S)-ノルプロトシノメニン、(S)-プロトシノメニン、(S)-ノルラウダノソリン、(S)-ラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルラウダノソリン、(S)-6-O-メチルノルラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドである。
一部の例では、(S)-基質が、式I:
Figure 2024037919000007
の化合物またはその塩であり、式中:
R1、R2、R3およびR4は独立して、水素およびメチルから選択され;
R5は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される。
他の一部の例では、R1、R2、R3、R4およびR5のうちの少なくとも1つが水素である。
さらに他の例では、(S)-基質が、式II:
Figure 2024037919000008
の化合物またはその塩であり、式中:
R3は、水素およびC1～C4アルキルから選択され;
R6およびR7は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1～C4アシル、C1～C4アルキルおよびC1～C4アルコキシから選択され;
nは0、1、2、3または4であり;
n'は0、1、2、3、4または5である。
結合が環を横切って示されている場合、これは、置換が環内の不特定の原子または位置に存在し得ることを意味する。例えば、上記に示した式IIでは、6員環の任意の-CH-の水素がR7で置き換えられて-CR7-を形成し得る。
一部の例では、R6およびR7が独立して、メチルまたはメトキシである。他の一部の例では、nおよびn'が独立して1または2である。さらに他の態様では、R3が水素またはメチルである。
一部の例では、該方法により、(S)-レチクリンからアルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞を提供する。(S)-レチクリンの(R)-レチクリンへのエピマー化は、前駆体からの多様なアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る。一部の例では、前駆体がL-チロシンまたは糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド生成物としては、非限定的に、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、モルフィナンアルカロイド、プロモルフィナンアルカロイド、ノル-オピオイドアルカロイド、またはナル-オピオイドアルカロイドが挙げられ得る。
任意の適当な炭素源が、エピマー化1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの前駆体として使用され得る。好適な前駆体としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）またはその組合せが挙げられ得る。一部の例では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマスの加水分解生成物）。さらに他の態様では、炭素前駆体が1炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。また他の態様では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸（例えば、L-チロシン）が使用され得る。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、例えば、ノルラウダノソリン、ラウダノソリン、ノルレチクリンおよびレチクリンなどが本発明の遺伝子操作された宿主細胞に直接添加され得る。なおさらなる態様では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞に、1種のエナンチオマー（例えば、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド）またはエナンチオマー混合物、例えばラセミ混合物などとして添加され得る。
一部の例では、該方法により、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心のエピマー化を提供する。さらなる一態様では、該方法は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程を含む。該少なくとも1種の酵素は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心の立体化学的配置を反対の立体化学的配置に反転させ得る。一部の例では、該少なくとも1種の酵素は、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する。該少なくとも1種の酵素を使用するこの(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換の一部の例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、(S)-ノルレチクリン、(S)-レチクリン、(S)-テトラヒドロパパベリン、(S)-ノルコクラウリン、(S)-コクラウリン、(S)-N-メチルコクラウリン、(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、(S)-ノルイソオリエンタリン、(S)-オリエンタリン、(S)-イソオリエンタリン、(S)-ノルプロトシノメニン、(S)-プロトシノメニン、(S)-ノルラウダノソリン、(S)-ラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルラウダノソリン、(S)-6-O-メチルノルラウダノソリンおよび(S)-4'-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される。
さらに他の態様では、エピマー化される1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが2つ以上の立体中心を含み得、この2つ以上の立体中心のうち1個だけが反転されて該基質のジアステレオマーが生成する（例えば、(S,R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R,R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される）。該少なくとも1種の酵素と接触させた場合に1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の1つだけが反転される例で、生成物は1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマーと称される。
一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが該酵素に1種の立体異性体として提示される。他の一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが該酵素に立体異性体混合物として提示される。なおさらなる態様では、立体異性体混合物がラセミ混合物であり得る。他の一部の例では、立体異性体混合物は、1種の立体異性体が別の立体異性体と比べて富化されたものであり得る。
一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を回収する。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物から回収する。なおさらなる態様では、回収された1-ベンジルイソキノリンアルカロイドは、1種の立体異性体が、該酵素に提示される1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの本来の混合物と比べてエナンチオマー的に富化されている。なおさらなる態様では、回収された1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。
一部の例では、プロモルフィナンまたはその誘導体が回収される。一部の例では、プロモルフィナンが細胞培養物から回収される。
一部の例では、モルフィナンまたはその誘導体が回収される。一部の例では、モルフィナンが細胞培養物から回収される。
一部の例では、ナル-オピオイドまたはその誘導体が回収される。一部の例では、ナル-オピオイドが細胞培養物から回収される。
一部の例では、ノル-オピオイドまたはその誘導体が回収される。一部の例では、ノル-オピオイドが細胞培養物から回収される。
「異性体」は、同じ分子式を有する異なる化合物である。「立体異性体」は、空間内での原子の配列様式のみが異なる異性体である。「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせられない鏡像である1対の立体異性体である。1対のエナンチオマーの1:1の混合物が「ラセミ」混合物である。「ジアステレオ異性体」または「ジアステレオマー」は、少なくとも2個の不斉原子を有しているが互いに鏡像でない立体異性体である。用語「エピマー」は、本明細書で用いる場合、同一の化学式を有するが、ある特定の位置の光学配置が異なる化合物をいう。例えば、ある化合物の(R,S)立体異性体と(S,S)立体異性体は互いにエピマーである。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドがそのエピマー（例えば、epi-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド）に変換される。立体化学的絶対配置は、カーン・インゴルド・プレローグR-S体系に従って指定される。化合物が純粋なエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学的配置はRまたはSのいずれかで指定され得る。絶対配置が不明である分解された化合物は、ナトリウムD線の波長の直線偏光を回転させる方向（右旋性-または左旋性）に応じて（＋）または（-）と表示され得る。本明細書に記載の一部の特定の化合物は1つまたは複数の不斉中心を含み、したがって、エナンチオマー、ジアステレオマー、および立体化学的絶対配置に関して(R)-または(S)-で規定され得る他の立体異性体形態が生じ得る。
（表１）DRS-DRR酵素、分割されたDRSおよびDRR酵素のアミノ酸配列、ならびに他のヌクレオチド配列の例
Figure 2024037919000009
Figure 2024037919000010
Figure 2024037919000011
Figure 2024037919000012
Figure 2024037919000013
Figure 2024037919000014
Figure 2024037919000015
Figure 2024037919000016
Figure 2024037919000017
Figure 2024037919000018
Figure 2024037919000019
Figure 2024037919000020
Figure 2024037919000021
Figure 2024037919000022
Figure 2024037919000023
Figure 2024037919000024
Figure 2024037919000025
Figure 2024037919000026
Figure 2024037919000027
Figure 2024037919000028
Figure 2024037919000029
Figure 2024037919000030
Figure 2024037919000031
Figure 2024037919000032
Figure 2024037919000033
Figure 2024037919000034
Figure 2024037919000035
Figure 2024037919000036
Figure 2024037919000037
Figure 2024037919000038
Figure 2024037919000039
Figure 2024037919000040
Figure 2024037919000041
Figure 2024037919000042
Figure 2024037919000043
Figure 2024037919000044
Figure 2024037919000045
Figure 2024037919000046
Figure 2024037919000047
モルフィナンアルカロイド生成改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムによりプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換を説明する。一部の該方法、プロセスおよびシステムにより、四環系骨格の五環系骨格への変換を説明する（図20）。一部の該方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、四環性の前駆体またはプロモルフィナンアルカロイドからの五環式テバインまたはモルフィナンアルカロイドの生成を説明する。一部の例では、プロモルフィナンアルカロイドのテバインへの変換が、基質の多様な範囲のベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換のカギとなる工程である。
一部の例では、四環性の前駆体がサルタリジン、サルタリジノールまたはサルタリジノール-7-O-アセテートであり得る。四環性の前駆体は五環式テバインに、C-4とC-5間のオキシドブリッジの閉鎖によって変換され得る。一部の例では、四環性の前駆体サルタリジンが、閉環のために、C-7における段階的ヒドロキシル化およびO-アセチル化によって調製され得る。閉環は、アセテート脱離基の消失によって活性化され得る。一部の例では、アリル型消失およびテバインを生成させるオキシド閉環が自然に起こる。他の例では、五環式テバインを生成させる閉環反応が、pHまたは溶媒などの因子によって促進される。他の例では、テバイン生成閉環反応が、タンパク質または酵素との接触によって促進される。このような変換工程を図14に示し、スキーム2に一般的に示す。R1、R2およびR3はHまたはCH3であり得る。R4はCH3、CH3CH2、CH3CH2CH2または他の適切なアルキル基であり得る。一部の場合では、R1、R2、R3およびR4が、図14に示したようにCH3であり得る。
スキーム2
Figure 2024037919000048
一部の例では、四環性の前駆体を調製する第1の酵素がサルタリジンレダクターゼ（SalR）である。一部の場合では、SalRは、基質サルタリジンのC-7位をヒドロキシル化する（式III参照）。この反応の生成物は1種または複数種のサルタリジノールエピマーであり得る。一部の例では、生成物が（7S）-サルタリジノールである。一部の例では、サルタリジンレダクターゼが、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内での還元反応を触媒し得る。
一部の例では、四環性の前駆体を調製する第2の酵素がサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ（SalAT）である。一部の場合では、SalATがアセチル-CoAのアセチルをサルタリジノールの7-OHに転移させる（式IV参照）。他の場合では、SalATが、新規な補因子、例えばn-プロピオニル-CoAを利用してプロピオニルをサルタリジノールの7-OHに転移させ得る。一部の例では、SalATの生成物が（7S）-サルタリジノール-7-O-アセテートである。一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼが、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内でのアセチル転移反応を触媒し得る。
一部の例では、テバインの四環性の前駆体が（7S）-サルタリジノール-7-O-アセテートである。一部の例では、（7S）-サルタリジノール-7-O-アセテートが不安定であり、C-7のアセテートが自然に消失し、C-4とC-5間のオキシドブリッジが閉じてテバインが形成される（式V参照）。一部の例では、アセテート脱離基の消失速度がpHによって促進される。一部の例では、アリル型消失とオキシドブリッジ閉鎖が、テバインシンターゼ活性を有する酵素またはテバインシンターゼによって触媒される。一部の例では、この酵素がBet v 1-フォールド（fold）タンパク質である。一部の例では、この酵素が遺伝子操作されたテバインシンターゼ、遺伝子操作されたSalAT、形成性操作（DIR）タンパク質またはカルコンイソメラーゼ（CHI）である。一部の例では、テバインシンターゼ活性をコードしている酵素が、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内での閉環反応を触媒し得る。
一部の例では、サルタリジンレダクターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ（Ranunculales）目の植物、例えばケシ（Papaver somniferum）に由来するSalRまたはSalR様酵素であり得る。他の例では、サルタリジンレダクターゼ活性を有する酵素は、内因性モルヒネを生合成する哺乳動物または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。
一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ酵素は、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するSalATまたはSalAT様酵素であり得る。他の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、内因性モルヒネを生合成する哺乳動物または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。
一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するBet v 1フォールドタンパク質であり得る。一部の例では、Bet v 1タンパク質が、N末端からC末端に向かって順に以下のドメイン:β-ストランド、1つまたは2つのα-ヘリックス、6つのβ-ストランドおよび1つまたは2つのα-ヘリックスを含む。このタンパク質は、Bet v 1フォールドと、大型でバルキーな疎水性の分子、例えばモルフィナンアルカロイドを受容する活性部位とを有するように組織化される。このタンパク質は、任意の植物Bet v 1タンパク質、感染特異的10タンパク質（PR-10）、メジャーラテックスタンパク質（MLP）、果物もしくは花粉アレルゲン、植物ホルモン結合タンパク質（例えば、サイトカイニンもしくはブラシノステロイドに結合する）、植物ポリケチドシクラーゼ様タンパク質、またはBet v 1フォールドを有するノルコクラウリンシンターゼ（NCS）関連タンパク質であり得る。他の非植物Bet v 1フォールドタンパク質の例はポリケチドシクラーゼ、Hsp90 ATPaseホモログ活性化因子1（AHA1）タンパク質、SMU440様タンパク質（例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来）、PA1206関連タンパク質（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、CalCカリケアミシン耐性タンパク質（例えば、ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Micromonospora echinospora）由来）、および一酸化炭素代謝性オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）由来のCoxGタンパク質である。Bet v 1関連ファミリーのさらなる例としては、START脂質転移タンパク質、ホスファチジルイノシトール転移タンパク質、および環水酸化酵素が挙げられる。
一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来する形成性操作タンパク質であり得る。他の例では、該酵素が、植物由来の任意の形成性操作タンパク質であり得る。
一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するカルコンイソメラーゼタンパク質であり得る。他の例では、該酵素が、植物由来の任意のカルコンイソメラーゼタンパク質であり得る。
一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するSalAT様酵素であり得る。他の例では、該酵素が、植物由来の任意のSalAT様タンパク質であり得る。
一部の例では、テバインシンターゼ活性を有する酵素が、内因性モルヒネを生合成する哺乳動物または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。
一部の例では、上記の酵素と一緒にさらなるアクセサリータンパク質との任意の組合せが、任意の四環性の前駆体をテバインに変換する機能を果たし得る。一部の例では、このような酵素が、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内での該反応を触媒する。
テバインシンターゼ活性のためのアミノ酸配列の例を表2に示す。四環性の前駆体をテバインにするのに用いられるテバインシンターゼのアミノ酸配列は、表2に列記した所与のアミノ酸配列と45％以上同一であり得る。例えば、かかるテバインシンターゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも45％以上、46％以上、47％以上、48％以上、49％以上、50％以上、51％以上、52％以上、53％以上、54％以上、55％以上、56％以上、57％以上、58％以上、59％以上、60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、一部の特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的なアミノ酸配列との少なくとも80％～99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更される。
四環性の前駆体をテバインに変換するサルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼおよびテバインシンターゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、該テバインシンターゼが、SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36および37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。一部の場合では、テバインシンターゼが、他の酵素との融合タンパク質を形成し得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生される酵素を、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。このような1種または複数種の酵素は、四環性プロモルフィナン前駆体のテバインへの変換を触媒するためにも使用され得る。
他の例では、テバインシンターゼが、SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60および61からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
さらなる場合では、遺伝子操作された宿主細胞から回収される該1種または複数種の酵素が、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するための方法に使用され得る。該方法は、四環性プロモルフィナン前駆体を、前記四環性プロモルフィナン前駆体がテバインに変換されるのに充分な量の回収された該酵素と接触させる工程を含み得る。一例では、四環性プロモルフィナン前駆体を、前記四環性プロモルフィナン前駆体の少なくとも5％がテバインに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、四環性プロモルフィナン前駆体を、前記四環性プロモルフィナン前駆体の少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％がテバインに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
一部の例では、プロセス条件が、遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインの形成を補助するために実行される。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞をpH3.3で培養し、高細胞密度に達したら、pHをpH8.0に調整し、高pHでのテバインの生成の継続を補助する。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、糖および他の単純な前駆体、例えばチロシンをテバインに変換するためのさらなる酵素を産生する。一部の場合では、SalAT酵素がpH8.0で高活性を示すように遺伝子操作されており、後期プロモーターにより発現される。
一部の例では、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換する酵素のうちの1種または複数種が細胞内区画に局在する。一部の例では、SalR、SalATおよびBet v 1が、これが自身を遺伝子操作された宿主細胞の小胞体膜に局在させる標的化配列をコードするように改変され得る（例えばWO2014143744を参照されたい）。他の例では、SalATとBet v 1を単一のタンパク質融合体に共局在させ得る。一部の例では、SalATとBet v 1との融合体は、いくつかの方法のうちの1つ、例えば直接融合、酵母の細胞小器官への共局在によって、または酵素共局在ツール、例えばロイシンジッパー、アダプタードメインを利用するタンパク質骨格、もしくはアプタマーを利用するRNA骨格によって作出される。テバインシンターゼを共局在させると、酵素の活性部位間の基質チャンネリングが助長され、不安定な中間体、例えばサルタリジノール-7-O-アセテートの拡散が限定的となり得る。
一部の例では、遺伝子操作されたサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ（SalAT）酵素が、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するのに使用される。一部の例では、SalAT酵素が、2つの機能:（1）アセチル-CoAのアシル基のサルタリジノールの7-OHへの転移、ならびに（2）その後のアセチル基の消失およびC4炭素とC5炭素間のオキシドブリッジの閉鎖によるテバインの形成、を併せ持つように遺伝子操作されている。
一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素が、Bet v 1フォールドを有するペプチドに融合される。一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ酵素とBet v 1フォールドタンパク質が、N末端をC末端に、C末端をN末端に、N末端とN末端またはC末端とC末端の任意の順に融合され得る。一部の例では、この2つのタンパク質の配列が、直接融合され得るか、またはペプチドリンカー領域を介して融合され得る。
一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素が、Bet v 1フォールドを有するペプチドに、円順列置換変異によって融合される。一部の場合では、SalATのN末端とC末端が融合され、次いで、この配列内にBet v 1配列がランダムに挿入される。一部の場合では、得られた融合タンパク質ライブラリーがテバイン生成についてスクリーニングされる。他の場合では、円順列置換変異SalATライブラリーがまず、Bet v 1の非存在下での活性についてスクリーニングされる。他の場合では、SalATのN末端とC末端が融合され、該酵素が消化され、平滑末端クローニングされる。他の場合では、円順列置換変異SalATのこのライブラリーがサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性についてスクリーニングされる。他の場合では、円順列置換変異SalATライブラリーからの活性な変異体が、次いで、Bet v 1フォールドを有するペプチドとのタンパク質融合体を設計するために使用される。
四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素は四環性プロモルフィナン前駆体とインビトロで接触され得る。付加的または代替的に、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素は四環性プロモルフィナン前駆体とインビボで接触され得る。さらに、四環性プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、内部に四環性プロモルフィナン前駆体を有する細胞に供給され得るか、または遺伝子操作された宿主細胞内で産生され得る。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成させる遺伝子操作された宿主細胞であって、四環性プロモルフィナン前駆体のテバインへの変換が該アルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞が得られる。一部の例では、アルカロイド生成物がテバインである。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、テバインに由来する、例えば下流のモルフィナンアルカロイドを含む。別の態様では、四環性プロモルフィナン前駆体が遺伝子操作された宿主細胞内での生成物のへの中間体である。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、モルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドからなる群より選択される。
一部の例では、還元反応の基質が、式III:
Figure 2024037919000049
の化合物またはその塩であり、式中:
R1、R2およびR3は独立して、水素およびメチルから選択される。
一部の他の例では、R1、R2およびR3がメチルであり、還元反応がサルタリジンレダクターゼによって触媒される。
一部の例では、炭素鎖転移反応の基質が、式IV:
Figure 2024037919000050
の化合物またはその塩であり、式中:
R1、R2およびR3は独立して、水素およびメチルから選択される。
一部の他の例では、R1、R2およびR3がメチルであり、炭素鎖転移反応がサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼによって触媒される。
一部の例では、テバインシンターゼの基質が、式V:
Figure 2024037919000051
の化合物またはその塩であり、式中:
R1、R2およびR3は独立して、水素およびメチルから選択され;
R4が、メチル、エチル、プロピルおよび他の適切なアルキル基から選択される。
一部の他の例では、R1、R2、R3およびR4がメチルであり、閉環反応がテバインシンターゼによって触媒される。一部の例では、テバインシンターゼがBet v 1タンパク質である。
一部の例では、該方法により、サルタリジンからアルカロイド生成物を生成させる遺伝子操作された宿主細胞が得られる。サルタルジン（salutardine）のテバインへの変換は、前駆体からの多様なアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る。一部の例では、前駆体がL-チロシンまたは糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド生成物としては、非限定的に、モルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドが挙げられ得る。
任意の適当な炭素源が、五環式モルフィナンアルカロイドへの前駆体として使用され得る。好適な前駆体としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）またはその組合せが挙げられ得る。一部の例では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマスの加水分解生成物）。さらに他の態様では、炭素前駆体が1炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。また他の態様では、他の炭素含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸（例えば、L-チロシン）が使用され得る。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、例えばノルラウダノソリン、ラウダノソリン、ノルレチクリンおよびレチクリンなどが本発明の遺伝子操作された宿主細胞に直接添加され得る。
一部の例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物またはその誘導体が回収される。一部の例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が細胞培養物から回収される。一部の例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がモルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドである。
（表２）モルフィナンアルカロイド生成酵素のアミノ酸配列の例.
Figure 2024037919000052
Figure 2024037919000053
Figure 2024037919000054
Figure 2024037919000055
Figure 2024037919000056
Figure 2024037919000057
BIA生成改変
BIAが形成されたら、BIAをさらに誘導体化または改変してもよい。BIAは、遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素を用いて誘導体化または改変され得る。特に、BIAは、BIAを遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素と接触させることにより誘導体化または改変され得る。付加的または代替的に、BIAは、BIAを、遺伝子操作された宿主細胞にとって外部である供給源からBIAに供給される1種または複数種の酵素と接触させることにより誘導体化または改変され得る。BIAを誘導体化または改変するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、テーラリング（tailoring）反応を行なうために使用され得る。テーラリング反応の例としては、酸化、還元、O-メチル化、N-メチル化、O-脱メチル化、アセチル化、メチレンジオキシ結合形成、およびO,O-デメチレン化が挙げられる。BIAは、1つまたは複数のテーラリング反応を用いて誘導体化または改変され得る。
テーラリング反応の例を表9に示す。一部の例では、BIAまたはその誘導体において行なわれる炭素-炭素間のカップリング反応を触媒するためにテーラリング酵素が使用され得る。炭素-炭素間のカップリング反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ（Papaver somniferum）、ハナビシソウ、オウレン（Coptis japonica）、ベルベリス・ストロニファー（Berberis stolonifer）、キバナカラマツソウ（Thalictrum flavum）または別の種に由来するベルベリンブリッジ酵素（BBE）;ケシまたは別の種に由来するサルタリジンシンターゼ（SalSyn）;およびオウレンまたは別の種に由来するコリツベリンシンターゼ（CorSyn）が挙げられる。テーラリング酵素によって触媒され得る反応の非限定的な例をスキーム3に示し、ここで、Ra、Rb、RcおよびRdは独立して、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1～C4アシル、C1～C4アルキル、およびC1～C4アルコキシから選択される。一部の例では、Ra、Rb、およびこれらが結合している炭素原子が任意で炭素環または複素環を形成している。一部の例では、Rc、Rdおよびこれらが結合している炭素原子が任意で炭素環または複素環を形成している。
スキーム3
Figure 2024037919000058
一部の例では、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれる酸化反応を触媒するために使用され得る。酸化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、オウレン、アザミゲシ（Argemone mexicana）、ベルベリス・ウィルソニエー（Berberis wilsonae）または別の種に由来するテトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（STOX）;ケシまたは別の種に由来するジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ（DBOX）;ケシまたは別の種に由来するメチルスチロピンヒドロキシラーゼ（MSH）;およびケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するプロトピン6-ヒドロキシラーゼ（P6H）が挙げられる。
また、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれるメチレンジオキシブリッジ形成反応を触媒するために使用され得る。メチレンジオキシブリッジ形成反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するスチロピンシンターゼ（StySyn）;ケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するケイランチフォリンシンターゼ（CheSyn）;およびキバナカラマツソウ、トウオウレン（Coptis chinensis）または別の種に由来するカナジンシンターゼ（CAS）が挙げられる。
他の例では、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれるO-メチル化反応を触媒するために使用され得る。O-メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、ハカマオニゲシ（Papaver bracteatum）または別の種に由来するノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）;ケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、トウオウレンまたは別の種に由来する3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ（4'OMT）;ケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するレチクリン7-O-メチルトランスフェラーゼ（7OMT）;およびケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、トウオウレンまたは別の種に由来するスコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ（9OMT）が挙げられる。
さらに、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれるN-メチル化反応を触媒するために使用され得る。N-メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）;ケシ、ハナビシソウ、ハカマオニゲシまたは別の種に由来するテトラヒドロプロトベルベリンN-メチルトランスフェラーゼ（TNMT）が挙げられる。
さらに、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれるO-脱メチル化反応を触媒するために使用され得る。O-脱メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシまたは別の種に由来するテバインデメチラーゼ（T6ODM）;およびケシまたは別の種に由来するコデインデメチラーゼ（CODM）が挙げられる。
また、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれる還元反応を触媒するために使用され得る。還元反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、ハカマオニゲシまたは別の種に由来するサルタリジンレダクターゼ（SalR）;ケシまたは別の種に由来するコデイノンレダクターゼ（COR）;およびハナビシソウまたは別の種に由来するサングイナリンレダクターゼ（SanR）が挙げられる。他の例では、テーラリング酵素は、BIAまたはその誘導体において行なわれるアセチル化反応を触媒するために使用され得る。アセチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の一例としては、ケシまたは別の種に由来するサルタリジンアセチルトランスフェラーゼ（SalAT）が挙げられる。
O-脱メチル化改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、O-結合型メチル基の除去による第1ベンジルイソキノリンアルカロイドの第2ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1ベンジルイソキノリンアルカロイドの第2ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が、基質のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がデメチラーゼ反応を含む。
図6は、本発明の態様による、オピオイド3-O-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、3位の炭素に結合している酸素からメチル基を除去する作用を行ない得る。
ODM酵素のアミノ酸配列の例を表4に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるODMのアミノ酸配列は、表4に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％～99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更されている。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するODMを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該ODMは、表4に列記した所与のアミノ酸配列を含む。1種または複数種のODM酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるODMを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のODMと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触してもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのO-脱メチル化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、モルヒネ、オキシモルヒネ、オリパビン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、14-ヒドロキシモルヒネ、モルヒノンおよび14-ヒドロキシモルヒノンからなる群より選択される。
一部の例では、基質アルカロイドが、コデイン、オキシコドン、テバイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、コデイノンおよび14-ヒドロキシコデイノンからなる群より選択されるオピオイドである。
N-脱メチル化改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、N-結合型メチル基の除去による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換が、基質のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がデメチラーゼ反応を含む。
図7は、本発明の態様による、オピオイドN-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、その窒素からメチル基を除去する作用を行ない得る。
第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を行なうために使用され得るN-デメチラーゼ酵素のアミノ酸配列の例を表5に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるNDMのアミノ酸配列は、表5に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％～99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更されている。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するNDMを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該NDMは、表5に列記したアミノ酸配列を含む。1種または複数種のNDM酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるNDMを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のNDMと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触させてもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのN-脱メチル化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択される。
一部の例では、基質アルカロイドが、コデイン、オキシコドン、テバイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、コデイノン、および14-ヒドロキシコデイノン、モルヒネ、オキシモルホン、オリパビン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、14-ヒドロキシ-モルヒネ、モルヒノン、または14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択されるオピオイドである。
N-結合型改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、N-結合型側鎖基の付加による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、共基質から第1アルカロイドへの側鎖基の転移による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換が、基質のナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がメチルトランスフェラーゼ反応を含む。
図8は、本発明の態様による、N-メチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、その窒素にメチル基または他の炭素部分を付加する作用を行ない得る。S-アデノシルメチオニン（SAM）は、官能基（メチル、アリル、シクロプロピルメチルまたはその他）の供与体として作用し得る。
NMT酵素のアミノ酸配列の例を表6に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるNMTのアミノ酸配列は、表6に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％～99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更されている。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するNMTを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該NMTは、表6に示すアミノ酸配列を含む。1種または複数種のNMT酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるNMTを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のNMTと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触させてもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのN-メチルトランスフェラーゼがアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、ナロキソン、ナルトレキソンおよびナルメフェンを含む群から選択される。
一部の例では、基質アルカロイドが、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択されるオピオイドである。一部の例では、共基質がS-アデノシルメチオニン、アリル-S-アデノシルメチオニンまたはシクロプロピルメチル-S-アデノシルメチオニンである。
異種コード配列
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作された宿主細胞が所望の関心対象の酵素および/または関心対象のBIA、例えば、本明細書に記載のようなものを生成することを可能にする活性（1つまたは複数）をコードしている1つまたは複数の異種コード配列（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上）を有している。本明細書で用いる場合、用語「異種コード配列」は、宿主生物体内には通常存在しないが適正な条件下で該宿主の細胞内で発現され得るペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードしているか、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すために用いている。そのため、「異種コード配列」は、宿主細胞内には通常存在するコード配列の多重コピーを含んでおり、該細胞が、該細胞内には通常存在しないコード配列のさらなるコピーを発現するようになる。異種コード配列は、RNAもしくはその任意の型、例えばmRNA、DNAもしくはその任意の型、例えばcDNA、またはRNA/DNAハイブリッドであり得る。関心対象のコード配列としては、非限定的に、コード配列、イントロン、プロモーター領域、3'-UTRおよびエンハンサー領域などの特徴を含む完全長の転写単位が挙げられる。
一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、酵素を、例えば表3に列記した酵素を各々がコードしている複数の非相同コード配列を含み得る。一部の例では、該複数の異種コード配列にコードされた該複数の酵素が互いに相違し得る。一部の例では、該複数の異種コード配列にコードされた該複数の酵素の一部のものは互いに相違し得、該複数の異種コード配列にコードされた該複数の酵素の一部のものは複製コピーであり得る。
一部の例では、異種コード配列が奏功可能に関連し得る。奏功可能に関連した異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物および/またはテバインシンターゼ生成物を生成させる同じ経路内に存在し得る。一部の例では、奏功可能に関連した異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物および/またはテバインシンターゼ生成物を生成させる経路に沿って直に逐次的（directly sequential）であり得る。一部の例では、奏功可能に関連した異種コード配列は、該複数の異種コード配列にコードされた該酵素のうちの1種または複数種間に1種または複数種の天然酵素を有し得る。一部の例では、異種コード配列が、該複数の異種コード配列にコードされた該酵素のうちの1種または複数種間に1種または複数種の異種酵素を有し得る。一部の例では、異種コード配列が、該複数の異種コード配列にコードされた該酵素のうちの1種または複数種間に1種または複数種の非天然酵素を有し得る。
また、遺伝子操作された宿主細胞は、異種コード配列を適応させるための1つまたは複数の遺伝子改変を有するように改変され得る。天然の宿主ゲノムの改変としては、非限定的に、所望の経路に干渉し得る特定のタンパク質の発現を低減または除去するためのゲノムの改変が挙げられる。かかる天然タンパク質の存在は、該経路の中間体または最終産物のうちの1種を、代謝産物または所望の経路において利用可能でない他の化合物に急速に変換し得る。したがって、天然酵素の活性を低下させるか、または完全になくした場合、生成した中間体は、所望の産物への組込みに、より容易に利用可能となり得る。
異種コード配列としては、非限定的に、植物において通常、関心対象のBIAの生成を担う野生型配列または等価な配列のいずれかである酵素をコードしている配列が挙げられる。一部の場合では、異種配列にコードされる酵素は、1-BIA経路内の任意の酵素であり得、任意の簡便な供給源に由来するものであり得る。具体的な合成経路での異種コード配列にコードされた酵素の選択および数は、所望の産物に基づいて選択され得る。特定の態様では、本発明の宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の異種コード配列、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の異種コード配列を含み得る。
本明細書で用いる場合、用語「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のcDNAまたはmRNAの配列、ならびに完全長の転写単位のコード部分、すなわち、イントロンとエキソンを含む遺伝子、ならびに酵素をコードしているか、またはその等価なアミノ酸配列をコードしている「コドン最適化」配列、切断型配列または他の形態の改変配列も包含しているが、該等価なアミノ酸配列は機能性タンパク質を産生させるものとする。かかる等価なアミノ酸配列は1個または複数のアミノ酸の欠失を有し得、該欠失はN-末端、C-末端または内部である。切断型形態は、これが本明細書に示した触媒能を有している限り想定される。また、経路内での代謝産物の移行を容易にするために2種以上の酵素の融合体も想定されるが、触媒活性が維持されているものとする。
奏功可能な断片、変異型または切断型形態はモデリングおよび/またはスクリーニングによって同定され得る。一部の場合では、これは、例えばタンパク質のN-末端、C-末端または内部の領域の段階的な様式での欠失の後、得られた誘導体を所望の反応に対するその活性に関して本来の配列と比較して解析することによって行なわれる。当該誘導体がこの能力を動作させる場合、これは該酵素の等価な誘導体を適正に構成しているとみなされる。
例では、一部の異種タンパク質は、組換え宿主において発現させた場合、不正確にプロセッシングされるという事態を示し得る。例えば、微生物系生産宿主において発現させたシトクロムP450酵素などの植物タンパク質は、不正確なプロセッシングの事態を有し得る。特に、サルタリジンシンターゼは、酵母において異種発現させた場合、N-結合型グリコシル化が起こり得る。このN-結合型グリコシル化は植物では観察され得ず、異種微生物宿主内での該酵素の活性を低下させるような生成中のSalSyn転写物の不正確なN-末端選別を示し得る。かかる例では、N-結合型グリコシル化パターンを除去するような生成中の転写物のN-末端選別の修正に指向されるプロテインエンジニアリングにより、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の改善がもたらされ得る。例えばWO2016183023A1を参照されたい。
また、本発明の一部の局面は、種々の該酵素の天然アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列をコードしている異種コード配列に関する。「等価な」アミノ酸配列は、具体的なアミノ酸配列と同一ではないが、所望の目的に使用した場合、具体的な該アミノ酸配列の同様の活性と比べて、そのタンパク質の生物学的活性に本質的に影響しない少なくともいくつかのアミノ酸変化（欠失、置換、反転、挿入など）を含むアミノ酸配列と定義する。生物学的活性は、テバインシンターゼの例では、その触媒活性をいう。また、等価な配列は、本来のアミノ酸配列とは異なる特性を有するように遺伝子操作された、および/または進化したものも包含していることを意味している。関心対象の変異可能な特性としては、触媒活性、基質特異性、選択性、安定性、可溶性、局在性などが挙げられる。
一部の例では、各型の酵素の発現が、さらなる遺伝子コピー（すなわち、多重コピー）によって高まり、これにより、中間体の蓄積および/または関心対象のBIAの生成が増大する。本発明の一部の態様は、1種または複数種の酵素の複数種の種の変異体の同時発現による宿主細胞における関心対象のBIAの生成の増大を含む。一部の場合では、1種または複数種の酵素のさらなる遺伝子コピーが宿主細胞に含まれている。任意の簡便な方法、例えば、宿主細胞内の酵素の異種コード配列の多重コピーが使用され得る。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、酵素の異種コード配列の多重コピー、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上、5種類以上、またはさらには10種類以上のコピーを含む。特定の態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1種または複数種の酵素の異種コード配列の多重コピー、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上などの多重コピーを含む。一部の場合では、酵素の異種コード配列の多重コピーが、宿主細胞と比べて2種類以上の異なる生物体源に由来する。例えば、遺伝子操作された宿主細胞が1つの異種コード配列の多重コピーを含み得、このとき、該コピーの各々が異なる生物体源に由来する。そのため、各コピーは、明示的な配列において、異種コード配列にコードされた関心対象の酵素の種間差に基づくいくらかの多様性を含み得る。
一部の特定の態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1種または複数種の酵素の多コピーの異種コード配列、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上などの多コピーを含む。一部の場合では、ある酵素の多コピーの異種コード配列が、宿主細胞と比較して2種類以上の異なる供給源生物体に由来する。例えば、遺伝子操作された宿主細胞が多コピーの1つの異種コード配列を含み得、このとき、該コピーの各々が異なる供給源生物体に由来する。そのため、各コピーは、明示的な配列において、異種コード配列にコードされた関心対象の酵素の種間差に基づくいくらかの多様性を含み得る。
遺伝子操作された宿主細胞の培地は、関心対象のBIAの生成について試料採取され、モニタリングされ得る。関心対象のBIAは、任意の簡便な方法を用いて観察および測定され得る。関心対象の方法としては、非限定的にLC-MS法（例えば、本明細書に記載のようなもの）が挙げられ、この場合、関心対象の試料は既知量の標準化合物との比較によって解析される。さらに、関心対象のBIAが観察および/または測定され得る他の方法も存在する。BIAの観察および/または測定の代替的な方法の例としては、とりわけ、GC-MS、UV-vis分光法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC、キャピラリー電気泳動が挙げられる。実体は、例えばm/zおよびMS/MS断片化パターンによって確認され得、化合物の定量または測定は、既知保持時間のLC図のピークおよび/または該化合物の既知量の標準の対応するLC-MS解析を参照することによるEIC MSピーク解析によって行なわれ得る。
さらに、遺伝子操作された宿主細胞の培養物は、関心対象の酵素、例えばテバインシンターゼ酵素の産生について試料採取され、モニタリングされ得る。関心対象の酵素は、任意の簡便な方法を用いて観察および測定され得る。関心対象の方法としては、酵素活性アッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一酸化炭素分光法およびウエスタンブロット解析が挙げられる。
方法
BIA生成のために宿主細胞を培養するための方法
上記に要約したように、本発明の一部の局面は、関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）を調製する方法を含む。さらに、本発明の一部の局面は、関心対象の酵素を調製する方法を含む。そのため、本発明の一部の局面は、遺伝子操作された宿主細胞を、1つまたは複数の宿主細胞改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）が機能的に発現されて該細胞が関心対象の出発化合物を生成物である関心対象の酵素および/またはBIAに変換するような条件下で培養することを含む。また、遺伝子操作された宿主細胞を、1つまたは複数の異種コード配列が機能的に発現されて関心対象の出発化合物が、生成物である酵素あるいは関心対象のBIAに変換されるようなタンパク質の産生に適した条件下で培養する工程を含む方法も提供する。一例では、該方法は、ベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）を調製する方法であって、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）を培養する工程;出発化合物を該細胞培養物に添加する工程;および、該BIAを該細胞培養物から回収する工程を含む、方法である。一部の例では、該方法は、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）を培養する工程;出発化合物を該細胞培養物に添加する工程;および、該酵素を該細胞培養物から回収する工程を含む、酵素を調製する方法である。
発酵培地には適当な炭素基質が含有され得る。本開示の方法を行なうのに適した炭素の供給源には多種多様な炭素含有基質が包含され得る。好適な基質としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）、またはその組合せが挙げられ得る。一部の場合では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物が使用され得る（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽）。一部の場合では、炭素基質が1炭素基質（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素基質（例えば、エタノール）であり得る。他の場合では、他の炭素含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸が使用され得る。
遺伝子操作された宿主細胞を培養する任意の簡便な方法が、関心対象の酵素および/またはBIAの生成のために使用され得る。使用される具体的なプロトコルは、例えば、遺伝子操作された宿主細胞、異種コード配列、関心対象の酵素、関心対象のBIAなどに応じてさまざまであり得る。細胞は、任意の簡便な環境、例えば、該細胞が1種または複数種の機能性の異種酵素を発現できる環境に存在させ得る。いくつかの態様では、細胞は、酵素発現を誘導性の条件下で、インビボでの関心対象の酵素および/またはBIAの生成を可能にすることに利用可能な適切な基質を用いて培養される。いくつかの態様では、機能性の該酵素が、インビトロ条件下での関心対象の酵素および/またはBIAの生成のために遺伝子操作された宿主から抽出される。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が多細胞宿主生物体に戻される。遺伝子操作された宿主細胞は任意の増殖期、例えば非限定的に静止期および対数増殖期などのものであり得る。また、培養自体は連続培養であってもよく、バッチ式培養であってもよい。
細胞は、適切な発酵培地中で14～40℃の温度にて培養され得る。細胞を、任意の簡便な速度（例えば、200 rpm）で振盪しながら培養してもよい。細胞は適当なpHで培養され得る。この発酵に好適なpH範囲はpH 5～9であり得る。発酵は、好気性、嫌気性または微好気性条件下で行なわれ得る。任意の適当な増殖培地が使用され得る。好適な増殖培地としては、非限定的に、一般的な市販の調製培地、例えば、合成規定（SD）最少培地または酵母エキスペプトンデキストロース（YEPD）富化培地が挙げられ得る。微生物に適切な任意の他の富化、規定または合成の増殖培地を使用してもよい。
細胞は、本質的に任意のサイズおよび形状の槽内で培養され得る。本開示の方法を行なうのに適した槽の例としては、非限定的に、マルチウェル振盪プレート、試験管、フラスコ（バッフル付きおよびバッフルなし）ならびにバイオリアクターが挙げられ得る。培養容量は、10マイクロリットルから10,000リットルより多くまでの範囲であり得る。
アルカロイドの生成に望ましい様式で代謝をモジュレートすることが公知である剤の、増殖培地に対する添加を含めてもよい。非限定的な一例では、異化代謝産物抑制をモジュレートするために環状アデノシン2'3'-一リン酸が増殖培地に添加され得る。
具体的な細胞型に対して任意の簡便な細胞培養条件が使用され得る。特定の態様では、1つまたは複数の改変を含む宿主細胞が、標準的な条件または容易に最適化される条件下で標準的な細胞培養培地と補給物を用いて培養される。一例として、標準的な増殖培地は、プラスミド維持のための選択圧が必要とされない場合、20 g/Lの酵母エキス、10 g/Lのペプトンおよび20 g/Lのデキストロース（YPD）を含有するものであり得る。プラスミドを含む宿主細胞は、1.7 g/Lの酵母窒素ベース、5 g/Lの硫酸アンモニウムおよび20 g/Lのデキストロースを含有しており、増殖と選択に必要とされる適切なアミノ酸を補給した合成の完全（SC）培地中で培養される。誘導性酵素発現に有用であり得る代替的な炭素源としては、非限定的に、スクロース、ラフィノースおよびガラクトースが挙げられる。細胞は、任意の簡便な温度（例えば、30℃）で任意の簡便な速度（例えば、200 rpm）にて振盪しながら、槽内、例えば試験管もしくはフラスコ内で1～1000 mLの範囲の容量で、またはより大容量でラボラトリーにて培養される。
培養容量を、例えば工業用プロセスの一部として、より大型の発酵槽内での培養のためにスケールアップしてもよい。工業用発酵プロセスは、密閉系バッチ、フェッドバッチもしくは連続恒成分条件下で、または任意の適当な発酵様式で行なわれ得る。一部の場合では、細胞が基質上に全細胞触媒として固定化され、アルカロイド生成のための発酵条件に供され得る。
バッチ式発酵は閉鎖系であり、この場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵プロセス中は変更されない。所望の生物体を発酵の開始時に培地中に播種する。一部の例では、バッチ式発酵は、pHおよび酸素濃度などの要素を制御するために系に対してなされる（が炭素に対してはしない）変更を伴って行なわれる。この型の発酵系では、系のバイオマスおよび代謝産物の組成が、発酵過程で連続的に変化する。細胞は典型的には誘導期から、次いで対数期（高増殖速度）、次いで静止期（増殖速度が低下または停止）、最終的に死滅期（未処理で放置した場合）と進行する。
連続発酵は開放系であり、この場合、規定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、加工処理のために等量の発酵培地がこの槽から連続的に除去される。連続発酵系は一般的に、定常状態の増殖条件を維持するために操作され、そのため、培地の除去による細胞減損が発酵中の増殖速度によって均衡されなければならない。連続発酵は一般的に、細胞が高い定細胞密度である条件で操作される。連続発酵により、目的生成物濃度および/または細胞増殖に影響する1つまたは複数の因子のモジュレーションが可能である。
液体培地としては、非限定的に、上記の付加的成分を有する富化または合成の規定培地が挙げられ得る。培地成分は水に溶解され、熱、圧力、濾過、放射線、化学薬品またはその任意の組合せによって滅菌され得る。いくつかの培地成分は、別個に調製され、滅菌され、次いで発酵槽内で合わされ得る。培養培地は、発酵全体を通して一定のpHが維持されることが補助されるように緩衝され得る。
プロセスパラメータ、例えば温度、溶存酸素、pH、撹拌、エアレーション速度および細胞密度が発酵過程でモニタリングまたは制御され得る。例えば、発酵プロセスの温度は、培養培地中に浸漬させた温度プローブによってモニタリングされ得る。培養温度は、ジャケット温度を調節することにより設定点に制御され得る。水が外部冷却機内で冷却され、次いでバイオリアクターのコントロールタワー内に流され、ジャケットに、槽内の設定点温度が維持されるのに必要とされる温度で循環され得る。
さらに、ガス流パラメータが発酵プロセス中にモニタリングされ得る。例えば、ガスはスパージャーから培地中に流され得る。本開示の方法に適したガスとしては、圧縮空気、酸素および窒素が挙げられ得る。ガス流は固定速度であってもよく、設定点の溶存酸素が維持されるように調節してもよい。
また、培養培地のpHもモニタリングされ得る。一例では、該pHが、槽内部の培養培地中に浸漬させたpHプローブによってモニタリングされ得る。pH制御を実施する場合、pHは、各溶液を培地に必要とされる速度で添加する酸ポンプおよび塩基ポンプによって調整され得る。pHを制御するために使用される酸溶液は硫酸または塩酸であり得る。pHを制御するために使用される塩基溶液は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化アンモニウムであり得る。
さらに、培養培地中の溶存酸素が、培養培地中に浸漬させた溶存酸素プローブによってモニタリングされ得る。溶存酸素調節を実施する場合、酸素レベルは、撹拌速度を増減させることにより調整され得る。また、溶存酸素レベルは、ガス流速を増減させることによっても調整され得る。ガスは圧縮空気、酸素または窒素であり得る。
また、撹拌速度も発酵プロセス中にモニタリングされ得る。一例では、撹拌機のモーターでアジテータが駆動され得る。撹拌機の速度は発酵全体を通して一貫したrpmに設定してもよく、設定した溶存酸素レベルが維持されるように動的に調節してもよい。
さらに、濁度が発酵プロセス中にモニタリングされ得る。一例では、細胞密度が濁度プローブを用いて測定され得る。代替的に、細胞密度は、試料をバイオリアクターから採取し、これを分光測光器で解析することにより測定され得る。さらに、試料をバイオリアクターから、滅菌試料採取装置によって間隔をあけて取り出してもよい。試料は、宿主細胞によって生成されるアルカロイドについて解析され得る。また、試料は、他の代謝産物および糖類、培養培地成分の枯渇または細胞密度についても解析され得る。
別の例では、フィードストックパラメータが発酵プロセス中にモニタリングされ得る。特に、外部のポンプを用いて発酵に加えられ得る糖類および他の炭素源、栄養物ならびに補因子などのフィードストック。また、他の成分、例えば非限定的に、消泡剤、塩類、キレート剤、界面活性剤および有機液を発酵中に添加してもよい。
宿主細胞内での異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するための任意の簡便なコドン最適化手法が、主題の宿主細胞および方法における使用のために適合され得、例えば、Gustafsson C., et al.（2004）Trends Biotechnol, 22, 346-353（これは参照によりその全体が組み入れられる）を参照のこと。
また、主題の方法に、出発化合物を該細胞培養物に添加する工程を含めてもよい。任意の簡便な添加方法が主題の方法における使用のために適合され得る。細胞培養物には、充分な量の関心対象の出発物質（例えば、本明細書に記載のようなもの）、例えばmM～μMの量、例えば約1～5 mMの出発化合物が補給され得る。出発物質の添加量、添加のタイミングおよび速度、添加する物質の形態などは、さまざまな要素に応じて異なり得ることは理解されよう。出発物質はそのままで添加してもよく、適当な溶媒（例えば、細胞培養培地、水または有機溶媒）に事前に溶解させてもよい。出発物質を濃縮形態（例えば、所望の濃度の10倍）で添加し、添加時の細胞培養培地の希薄化が最小限となるようにしてもよい。出発物質は1回または複数回のバッチ式で添加してもよく、長期間（例えば、数時間または数日間）にわたる連続添加によって添加してもよい。
生成物を発酵培地から単離するための方法
また、主題の方法に、関心対象の酵素および/またはBIAを細胞培養物から回収する工程を含めてもよい。分離および単離の任意の簡便な方法（例えば、クロマトグラフィー法または沈降法）が、関心対象の酵素および/またはBIAを細胞培養物から回収するための主題の方法における使用のために適合され得る。濾過法は、細胞培養物の可溶性画分を不溶性画分から分離するために使用され得る。一部の場合では、液体クロマトグラフィー法（例えば、逆相HPLC、サイズ排除、順相クロマトグラフィー）が、関心対象のBIAを細胞培養物の他の可溶性成分から分離するために使用され得る。一部の場合では、抽出法（例えば、液体抽出、pHに基づいた精製、固相抽出、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換など）が、関心対象の酵素および/またはBIAを細胞培養物の他の成分から分離するために使用され得る。
生成したアルカロイドは発酵培地から、当技術分野において公知の方法を用いて単離され得る。所望の生成物の最初の回収で発酵の直後（または一部の場合では発酵中に）、複数回の回収工程が行なわれ得る。このような工程により、アルカロイド（例えばBIA）が細胞、細胞デブリおよび老廃物から分離され得、他の栄養物、糖類および有機分子は、使用済み培養培地中に残存し得る。このプロセスは、BIA富化生成物を得るために使用され得る。
例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）生成物を有する生成物流が、遺伝子操作された酵母細胞と、栄養物および水を含むフィードストックをバッチ式反応器に供給することにより形成される。特に、遺伝子操作された酵母細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、遺伝子操作された酵母細胞を発酵に供して、BIA生成物と細胞材料とを含む溶液を生成させ得る。遺伝子操作された酵母細胞が発酵に供されたら、BIA生成物を細胞材料から分離するために少なくとも1つの分離ユニットが使用され、該BIA生成物を含む生成物流が得られ得る。特に、該生成物流には、BIA生成物ならびにさらなる成分、例えば清澄化した酵母培養培地が含まれ得る。さらに、BIA生成物は、1種または複数種の関心対象のBIA、例えば1種または複数種のBIA化合物を含み得る。
いろいろな方法を用いて、関心対象の酵素および/またはBIAを含むバイオリアクター培地から細胞が除去され得る。一例では、細胞は経時的な沈殿によって除去され得る。この沈殿プロセスを冷やすことにより、または清澄剤、例えばシリカの添加によって加速させてもよい。次いで、使用済み培養培地が反応器の上面から吸い上げられ得るか、または細胞が反応器の底面からデカンテーションされ得る。代替的に、細胞は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって除去され得る。また、細胞は、例えば連続フロー遠心分離による遠心分離または連続抽出装置の使用によっても除去され得る。
いくらかの貴重な関心対象の酵素および/またはBIAが細胞内部に存在している場合、細胞は透過処理または溶解され得、細胞デブリが上記のいずれかの方法によって除去され得る。細胞を透過処理するために使用される剤としては、非限定的に、有機溶媒（例えば、DMSO）または塩（例えば、酢酸リチウム）が挙げられ得る。細胞を溶解させるための方法としては、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの添加、またはビーズミリングもしくは超音波処理による機械的破壊が挙げられ得る。
関心対象の酵素および/またはBIAは清澄化した使用済み培養培地から、水性の該培養培地と非混和性である有機液の添加による液液抽出によって抽出され得る。一例では、液液抽出の使用は、他の加工処理工程に加えて用いられ得る。適当な有機液の例としては、非限定的に、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、クロロホルム、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、オレイン酸メチル、トルエン、オレイルアルコール、酪酸エチルが挙げられる。有機液は水性培地の容量の10％程度の少なさで添加してもよく、100％程度の多さで添加してもよい。
一部の場合では、有機液は発酵の開始時に添加され得るか、または発酵中の任意の時点で添加され得る。この抽出発酵プロセスにより、酵素および/またはBIAが該有機相に連続的に除去されることによって、宿主細胞からの関心対象の酵素および/またはBIAの収率が高まり得る。
アジテーションにより、該有機相が水性の該培養培地とエマルジョンを形成するようにしてもよい。2つの相がそれぞれの層に分離するのを促す方法としては、非限定的に、乳化破壊剤もしくは核生成剤の添加、またはpHの調整が挙げられ得る。また、エマルジョンを、例えば連続コニカルプレート遠心分離によって遠心分離し、2つの相に分離してもよい。
代替的に、該有機相は水性の該培養培地から、抽出後に物理的に除去され得るように単離してもよい。例えば、溶媒の膜内への封入であり得る。
例では、関心対象の酵素および/またはBIAは発酵培地から、吸着法を用いて抽出され得る。一例では、関心対象のBIAが、清澄化した使用済み培養培地から、例えばAmberlite（登録商標）XAD4などの樹脂またはBIAを吸着によって除去する別の剤の添加によって、抽出され得る。次いで、関心対象のBIAが該樹脂から有機溶媒を用いて放出され得る。好適な有機溶媒の例としては、非限定的に、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはアセトンが挙げられる。
また、関心対象のBIAを発酵培地から濾過を用いて抽出してもよい。高pHでは、関心対象のBIAは、バイオリアクター内で結晶様析出物を形成し得る。この析出物は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって直接除去され得る。また、この析出物を遠心分離および/またはデカンテーションによって収集してもよい。
上記の抽出法は、インサイチュー（バイオリアクター内）またはエクスサイチュー（ex situ）（例えば、培地がバイオリアクターから流れ出て抽出剤と接触され、次いで再循環されて槽内に戻る外部ループ内）のいずれかで行なわれ得る。代替的に、抽出法は、発酵が終了した後に、バイオリアクター槽から取り出した清澄化した培地を用いて行なわれ得る。
アルカロイド富化溶液から生成物を精製するための方法
後続の精製工程は、関心対象のBIA生成物が富化された発酵後の溶液を、関心対象の個々の生成物種を高純度で回収するための当技術分野において公知の方法を用いて処理することを伴い得る。
一例では、有機相中に抽出された関心対象のBIAは水溶液に移され得る。一部の場合では、有機溶媒が熱および/または真空によって蒸発され得、得られた粉末が適当なpHの水溶液中に溶解され得る。さらなる一例では、関心対象のBIAが有機相から、水相中への関心対象のBIAの抽出を促進させる適当なpHの水溶液の添加によって抽出され得る。次いで、水相はデカンテーション、遠心分離または別の方法によって除去され得る。
BIA含有溶液は、金属類を除去するために、例えば適当なキレート剤で処理することによってさらに処理され得る。関心対象のBIA含有溶液は、他の不純物、例えばタンパク質およびDNAを除去するために沈降によってさらに処理され得る。一例では、関心対象のBIA含有溶液は適切な沈降剤で、例えば、エタノール、メタノール、アセトンまたはイソプロパノールで処理される。代替的な一例では、DNAおよびタンパク質は透析によって、または低分子のアルカロイドを混入生体高分子から分離する他のサイズ排除法によって除去され得る。
さらなる例では、関心対象のBIAを含有している溶液は、連続クロスフロー濾過によって当技術分野において公知の方法を用いて高純度に抽出され得る。
該溶液が関心対象のBIAの混合物を含有している場合、これは酸-塩基処理に供され、当技術分野において公知の方法を用いて個々の関心対象のBIA種が得られ得る。このプロセスでは、水溶液のpHが、個々のBIAが析出するように調整される。
高純度小規模調製では、BIAは液体クロマトグラフィーによる1回の工程で精製され得る。
液体クロマトグラフィー質量分析（LCMS）法:
モルフィナン、ナル-オピオイド、およびノル-オピオイドを含む関心対象のBIA化合物は液体クロマトグラフィーを用いて分離され、質量分析を用いて検出および定量され得る。化合物の実体は特性溶出時間、質量電荷比（m/z）および断片化パターン（MS/MS）によって確認され得る。定量は、化合物のピーク面積を既知の参照標準化合物の標準曲線と比較することによって行なわれ得る。さらに、関心対象のBIAは、代替的な方法、例えばGC-MS、UV-vis分光法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLCおよびキャピラリー電気泳動によって検出され得る。
purpaldアッセイ法
脱メチル化反応のハイスループットスクリーニングには、purpaldアッセイが使用され得る。例えば、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される脱メチル化により、ホルムアルデヒドが、一般化学反応式:［基質］＋2-オキソグルタレート＋O2 ⇔［生成物］＋ホルムアルデヒド＋スクシネート＋CO2に示す生成物として生成する。アルカリ性条件でのpurpald試薬はホルムアルデヒドの存在下で色変化を生じ、これが、1 nMという低濃度まで分光測光器で510 nmにて定量され得る。
酵母由来アルカロイドAPI 対 植物由来API
清澄化した酵母培養培地（CYCM）中には複数種の不純物が含まれ得る。清澄化した酵母培養培地は真空および/または熱によって脱水され、アルカロイド富化粉末が得られ得る。この生成物は、ケシを栽培している国が輸出しAPI製造業者が購入する、けしがら濃縮物（concentrate of poppy straw）（CPS）またはアヘンと類似している。本発明の解釈上、CPSは、所望のアルカロイド生成物が最終的にさらに精製され得る任意の型の精製植物エキスの代表例である。表10および表11に、CYCMもしくはCPSのいずれかに特異的であり得るかまたは両方に存在し得る、この2種類の生成物中の不純物を明示している。一部のBIAは不純物として色素を有し得る一方、他のBIAはそれ自体が色素として分類され得る。したがって、このようなBIAは、不純物について非色素不純物に基づいて評価され得る。起源不明の生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、酵母系生産宿主に由来するのか植物系生産宿主に由来するのかを判定することができよう。
API等級の医薬品成分は高度に精製された分子である。そのため、APIの植物起源または酵母起源を示している可能性がある不純物（例えば、表10および表11に列記したもの）は、API段階の生成物には存在し得ない。実際、本発明の酵母株に由来するAPI生成物の多くは、従来の植物由来APIとおおむね区別不可能であり得る。しかしながら、一部の場合では、慣用的なアルカロイド化合物が化学合成アプローチを用いた化学修飾に供され得、これにより、かかる化学修飾を必要とする植物ベース生成物中の化学物質不純物が現れる場合があり得る。例えば、化学的誘導体化では多くの場合、化学合成プロセスに関連する一連の不純物が生じ得る。一部の特定の状況では、このような修飾が酵母系生産プラットフォーム内で生物学的に行なわれ、それにより、化学的誘導体化に付随する不純物の一部が酵母由来生成物中に存在することが回避され得る。特に、化学的誘導体化生成物のこのような不純物は、化学合成プロセスを用いて生成されたAPI生成物中には存在し得るが、酵母由来生成物を用いて生成されたAPI生成物中には非存在であり得る。代替的に、酵母由来生成物を化学的誘導生成物と混合した場合、生じる不純物は存在し得るが、化学的誘導生成物のみを含むAPIまたは主として化学的誘導生成物を含むAPIにおいて予測され得るものより少ない量であり得る。この例では、API生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、酵母系生産宿主に由来するのか従来の化学的誘導体化経路に由来するのかを判定することができよう。
化学的に誘導体化されたモルフィナンAPI中に存在し得るが生合成API中には存在し得ない不純物の非限定的な例としては、APIコデイン中のコデイン-O（6）-メチルエーテル不純物;APIオキシコドン中の8,14-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロコデイノン;およびAPIヒドロコドン中のテトラヒドロテバインが挙げられる。コデイン-O（6）-メチルエーテルはモルヒネの化学的過剰メチル化によって形成され得る。APIオキシコドン中の8,14-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロコデイノンはテバインの化学的過剰酸化によって形成され得る。さらに、APIヒドロコドン中のテトラヒドロテバインはテバインの化学的過剰還元によって形成され得る。
しかしながら、酵母由来化合物および植物由来化合物がどちらも化学合成アプローチによる化学修飾に供された場合、化学合成プロセスに付随する同じ不純物が生成物中に存在することが予測され得る。かかる状況では、出発物質（例えば、CYCMまたはCPS）は、上記のようにして解析され得る。
宿主細胞由来ナル-オピオイド 対 化学的誘導ナル-オピオイド
化学合成によって作製されるナル-オピオイド中には複数種の不純物が含まれ得る。このような不純物は、多くの異なる原因、例えば、未反応の出発物質、不完全な反応、副生成物の形成、中間体の残存、二量体化または分解によって生じ得る。未反応の出発物質の一例は、ナルトレキソンの調製において残存するオキシモルホンであり得る。不完全な反応により生じる不純物の一例は、テバインの不完全な3-O-脱メチル化により生じる3-O-メチルブプレノルフィンであり得る。化学修飾によりオフターゲット部位の官能基の付加または除去がもたらされ得る。例えば、ナルトレキソン合成において10-ヒドロキシナルトレキソンおよび10-ケトナルトレキソンが生じるC10の酸化、またはブプレノルフィン合成において6-O-デスメチルブプレノルフィンが得られる6-O-メチル基の除去。不純物は、反応中間体の残存、例えば、N-脱メチル化プロセス中に形成されるオキシモルホンN-オキシドなどのN-オキシドの残存により生じ得る。不純物の別の原因は二量体化である、2つのオピオイド分子、例えば、2つのブプレノルフィン分子（2,2'-ビスブプレノルフィン）、2つのナルトレキソン分子（2,2'-ビスナルトレキソン）または2つのナロキソン分子（2,2'-ビスナロキソン）のコンジュゲーションである。不純物は、出発物質、反応中間体または反応生成物の分解によっても生じ得る。化学合成において使用される極端な物理的条件は分解の存在をより起こりやすくする。分解により生じ得る不純物の一例は、ブプレノルフィン合成時の酸化条件によって生じるデヒドロブプレノルフィンである。
宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイドには、化学合成によって作製されるナル-オピオイドとは異なる不純物が含まれ得る。宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイド中に含まれ得る不純物は化学合成によって作製されるナル-オピオイド中より少ない。宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイドには化学合成によって作製されるナル-オピオイドにみられる一部の特定の不純物がない場合があり得る。例において、酵素合成のカギとなる特徴としては、（1）酵素が特異的な基質と残基を高い忠実度で標的化する;（2）酵素が、該分子の安定性を障害しない穏やかな細胞内生理学的条件で反応を行なう;および（3）酵素が、反応を終了へと推進する効率的な触媒となるように遺伝子操作されていることが挙げられ得る。
表12に、化学的に作製したナル-オピオイドに特異的であり得るいくつかの不純物を明示している。したがって、ナル-オピオイドは、表12のいずれかの不純物の有無を調べるために不純物について評価され得る。起源不明の生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、化学合成に由来するのか酵素的合成に由来するのかを判定することができよう。
宿主細胞の遺伝子操作方法
また、関心対象の酵素および/またはBIAを生成する目的のための宿主細胞の遺伝子操作方法も含む。宿主細胞内へのDNAの挿入は任意の簡便な方法を用いて行なわれ得る。該方法は、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞内に、該宿主細胞が酵素を機能的に発現し、関心対象の出発化合物を生成物である関心対象の酵素および/またはBIAに変換するように挿入するために使用される。
任意の簡便なプロモーターが、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法において使用され得る。異種コード配列の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいが、該プロモーターは遺伝子操作された宿主細胞内で活性であるものとする。異種コード配列は、その天然プロモーターによって発現されるものであってもよく、非天然プロモーターを使用してもよい。かかるプロモーターは、これが使用される宿主において低度から高度の強度であり得る。プロモーターは調節されていてもよく構成的であってもよい。特定の態様では、グルコース抑制型でないか、または培養培地中のグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターが使用される。関心対象のプロモーターとしては、非限定的に、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、枯草菌tsr遺伝子（フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター領域をコードしている）のプロモーターまたはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD、GAPDHもしくはTDH3）をコードしているサッカロミセス・セレビシエ遺伝子由来のプロモーター、パン酵母のADH1プロモーター、リン酸欠乏誘導型プロモーター、例えば、酵母のPHO5プロモーター、B.リケニフォルミス由来のアルカリホスファターゼプロモーター、酵母の誘導性プロモーター、例えば、Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、抑制性プロモーターMet25、tetO、および構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GPD）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH）、翻訳-伸長因子-1-αプロモーター（TEF）、シトクロムc-オキシダーゼプロモーター（CYC1）、MRP7プロモーターなどが挙げられる。また、ホルモン、例えばグルココルチコイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンにより誘導性のプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターも使用され得、非限定的に、グルコルチコイド応答エレメント（GRE）および甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）が挙げられ得る。これらおよび他の例は米国特許第7,045,290号に記載されており、これは参照により、これに引用された参考文献も含めて組み入れられる。構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGH）を含むさらなるベクターが使用され得る。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBどおり）もまた、遺伝子発現を駆動させるために使用することができよう。例えば大腸菌の宿主細胞に対して任意の簡便な適切なプロモーターが選択され得る。プロモーターの選択を、転写物、したがって酵素レベルを最適化して産生を最大限にするとともにエネルギー資源を最小限にするために使用してもよい。
任意の簡便なベクターが、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法において使用され得る。関心対象のベクターとしては、酵母および他の細胞における使用のためのベクターが挙げられる。酵母ベクターの型は、4つの一般カテゴリー:組込み型ベクター（YIp）、自律複製型高コピー数ベクター（YEpまたは2μプラスミド）、自律複製型低コピー数ベクター（YCpまたはセントロメアプラスミド）および大型断片のクローニング用ベクター（YAC）に分けられ得る。ベクターDNAは原核生物細胞または真核生物細胞内に、任意の簡便な形質転換またはトランスフェクション手法によって導入される。別の供給源のDNA（例えば、PCR生成二本鎖DNA産物、または合成の二本鎖もしくは一本鎖のオリゴヌクレオチド）を、ゲノム内への組込みによる酵母の遺伝子操作のために使用してもよい。任意の単一の形質転換事象は、宿主細胞を遺伝子改変するための1つまたはいくつかの核酸（ベクター、二本鎖または一本鎖DNA 断片）を含み得る。図11は、簡便なベクターの例を示す。
有用性
例えば上記のもののような本発明の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな用途における利用が見出される。関心対象の用途としては、非限定的に:研究用途および治療用途が挙げられる。本発明の方法は、さまざまな異なる用途、例えば、酵素および/またはBIAの生成が関心対象となる任意の簡便な用途における利用が見出される。
主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな治療用途における利用が見出される。関心対象の治療用途としては、BIAを含む医薬製剤品の調製が関心対象である用途が挙げられる。本明細書に記載の遺伝子操作された宿主細胞は、関心対象のBIAと関心対象の酵素を生成する。レチクリンは、最終生成物、例えばオピオイド生成物を生成するための遺伝子操作作業を含むBIAの合成における関心対象の主要な分岐点中間体である。主題の宿主細胞は、関心対象のBIA（レチクリンおよびBIA最終生成物を含む）の生成における利用が見出され得る単純で廉価な出発物質から関心対象のBIAを生成するために使用され得る。そのため、主題の宿主細胞は、治療活性な関心対象のBIAの供給における利用が見出される。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞および方法は、化学合成では収量が少なく、大規模生産には実行可能な手段でない商業規模の量のBIAの生産における利用が見出される。一部の特定の場合では、宿主細胞および方法は、治療製剤品用の関心対象のBIAの迅速生産を可能にする例えば5,000～200,000リットル容のバイオリアクター（発酵槽）を含み得る発酵施設内で使用される。かかる用途としては、発酵性炭素源、例えば、セルロース、デンプンおよび遊離糖からの関心対象のBIAの工業規模の生産が挙げられ得る。
主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな研究用途における利用が見出される。主題の宿主細胞および方法は、さまざまな関心対象の酵素および/またはBIAの生合成経路に対するさまざまな酵素の効果を解析するために使用され得る。また、遺伝子操作された宿主細胞は、今のところまだわかっていない治療的機能における関心対象の生理活性についての試験における利用が見出される関心対象の酵素および/またはBIAを生成するように遺伝子操作され得る。一部の場合では、さまざまな酵素をコードしているさまざまな異種コード配列を含めるという宿主細胞の遺伝子操作により、関心対象の酵素および/またはBIAへの高収量生合成経路が解明されている。一部の特定の場合では、研究用途としては、次いで所望の生成物にさらに化学修飾もしくは誘導体化され得る関心対象の治療用分子用の、または関心対象の治療活性の増大についてスクリーニング用の関心対象の酵素および/またはBIAの生成が挙げられる。一部の例では、宿主細胞株は、かかる経路において関心対象である酵素活性についてスクリーニングするために使用され、これにより、このような細胞株内で生成したBIAの代謝産物の変換により酵素の発見がもたらされ得る。
主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、植物に特殊な代謝産物の生産プラットフォームとして使用され得る。主題の宿主細胞および方法は、薬物ライブラリーの開発ならびに植物酵素の発見のプラットフォームとして使用され得る。例えば、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、興味対象の骨格分子、例えばプロトピンを生成する酵母株を採用し、該化合物の構造をコンビナトリアル生合成または化学的手段によってさらに機能性にすることにより、天然産物ベースの薬物のライブラリーの開発における利用が見出され得る。このようにして薬物ライブラリーを作成することにより、潜在的薬物ヒット（あれば）が既に、大規模での培養および生産に適した生産宿主に付随している。別の例として、このような主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、植物酵素の発見における利用が見出され得る。主題の宿主細胞により、新たな酵素活性を同定するために植物ESTライブラリーを発現させるための規定の代謝産物のクリーンなバックグラウンド（clean background）が提供される。主題の宿主細胞および方法により、酵母における植物酵素の機能性発現および活性増大のための発現方法および培養条件が提供される。
キットおよびシステム
本発明の局面は、本発明の方法において使用される1種または複数種の成分、例えば、本明細書に記載のような遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培養培地などを含み得るキットおよびシステムをさらに含む。いくつかの態様では、主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）と、以下のもの:出発化合物、異種コード配列および/または該配列を含むベクター、ベクター、増殖用フィードストック、発現系における使用に適した成分（例えば、細胞、クローニングベクター、マルチクローニングサイト（MCS）、双方向プロモーター、内部リボソーム進入部位（IRES）など）および培養培地から選択される1種または複数種の成分とを含む。
本明細書に記載の任意の成分、例えば、1つまたは複数の改変を含む宿主細胞、出発化合物、培養培地などがキット内に備えられ得る。異種コード配列、クローニングベクターおよび発現系の作製および使用における使用に適したさまざまな成分が、主題のキットにおいて利用が見出され得る。また、キットにチューブ、バッファーなど、および使用説明書を含めてもよい。キットの種々の試薬成分は、所望により、別々の容器内に存在させてもよく、該成分の一部または全部を単一の容器内で事前に合わせて試薬混合物にしておいてもよい。
また、関心対象の酵素および/またはBIAを生成するためのシステムであって、1つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）を含む遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、培養培地、発酵槽および発酵設備、例えば、宿主細胞の増殖条件を維持するのに適した装置、試料採取およびモニタリングの設備および成分などを含み得るシステムも提供する。酵母細胞の大規模発酵における使用に適したさまざまな要素が主題のシステムにおいて利用が見出され得る。
一部の場合では、システムは、遺伝子操作された宿主細胞の大規模発酵ならびに発酵させた宿主細胞によって生成される酵素および/またはBIA化合物のモニタリングおよび精製のための要素を含む。一部の特定の態様では、1種または複数種の出発化合物（例えば、本明細書に記載のようなもの）をシステムに、発酵槽内の遺伝子操作された宿主細胞によって関心対象の1種または複数種の所望のBIA生成物が生成される条件下で添加する。一部の場合では、宿主細胞が関心対象のBIA（例えば、本明細書に記載のようなもの）を生成させる。一部の特定の場合では、関心対象のBIA生成物がオピオイド生成物、例えばテバイン、コデイン、ネオピン、モルヒネ、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、オキシコドン、ヒドロモルホン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、ジヒドロモルヒネまたはオキシモルホンである。
一部の場合では、システムは、主題の宿主細胞によって生成される1種または複数種の関心対象の酵素および/またはBIA化合物をモニタリングおよびまたは解析するためのプロセスを含む。例えば、本明細書に記載のようなLC-MS解析のシステム、クロマトグラフィーのシステム、または試料が解析されて標準と比較され得る任意の簡便なシステム、例えば、本明細書に記載のようなもの。発酵培地は、発酵前および発酵中の任意の簡便な時点で試料採取および解析によってモニタリングされ得る。出発化合物の関心対象の酵素および/またはBIA生成物への変換が完了すると、発酵は停止され得、BIA生成物の精製が行なわれ得る。そのため、一部の場合では、主題のシステムは、関心対象の酵素および/またはBIA生成物をそれが生成された宿主細胞培地から精製するのに適した、精製要素を含む。精製要素としては、発酵によって生成された関心対象の酵素および/またはBIA生成物を精製するために使用され得る任意の簡便な手段、例えば非限定的に、シリカクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HICクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体抽出およびpH抽出法が挙げられ得る。一部の場合では、主題のシステムにより、該システムに1種または複数種の出発化合物を投入した後に関心対象の酵素および/またはBIA発酵産物の生成および単離がもたらされる。
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのようにして作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するために示し、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が行なわれる実験のすべて、または唯一の実験であることを表していることを意図するものでもない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確性が確保されるように努力したが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮されたい。特に記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
酵素リストの論考
宿主細胞は、関心対象のBIAおよび/または関心対象の酵素の生成をもたらす1つまたは複数の改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含むように遺伝子操作され得る。表3に、遺伝子操作された宿主細胞において関心対象のBIAの生成および/または関心対象の酵素の産生をもたらすような1つまたは複数の改変に作用され得る例示的な遺伝子を列記する。
表3に示す遺伝子の改変は、増殖に必要とされる最低限の栄養物を含有している培地が供給された遺伝子操作された宿主細胞から関心対象のBIAを生成するために使用され得る。この最少培地には炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン類および塩類が含有され得る。例えば、表3に示す遺伝子の改変は、糖質が供給された遺伝子操作された宿主細胞から関心対象のBIAを生成するために使用され得る。さらに、表3に示す1つまたは複数の遺伝子の改変は、薬物生産のために遺伝子操作され得る宿主細胞の生合成プロセスを増大させるために使用され得る。
さらに、遺伝子操作された宿主細胞において関心対象のBIAの生成および/または関心対象の酵素の産生をもたらすためのこのような改変の使用は、遺伝子によって産生され得る酵素の単なる同定からは容易にわかることではない。特に、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば酵母細胞内で再構築された合成経路は、単一の生物体において天然状態で一緒になって作用するものでないさまざまな酵素を含む。さらに、本明細書において論考した酵素のうちの一部のものは、その天然の状況ではBIAの生合成のために作用しない。さらに、本明細書に記載の酵素のうちの一部のものは、特定の宿主細胞、例えば酵母細胞において機能するように進化せず、一緒になって機能するように進化しない。このような場合、該酵素が、宿主細胞内、例えば酵母内の合成BIA経路の状況において、下流のBIA最終生成物を生成するために経路を通して十分なフラックスを有するのに十分な活性を示すであろうことは、自明ではないであろう。
例えば、植物酵素は多くの場合、異種微生物宿主、例えば酵母において機能的に発現させることが困難である。多くの場合、該酵素は、ミスフォールディングされ得る、宿主細胞内に正しく局在化され得ない、および/または不正確にプロセッシングされ得る。タンパク質の翻訳およびプロセッシングにおける酵母と植物間の違いにより、このような酵素が示す酵母宿主内における活性はかなり低いものから検出不可能なまでの程度となり得る。このような課題は一般的に、内膜に局在する酵素、例えばシトクロムP450について生じ、BIA経路内で強く示される。酵素活性が低い場合であっても、複雑なBIAを生成するように酵母を遺伝子操作することにはかなりの課題が提示され得、所望のBIA生成物の高レベルの蓄積を確保するために各工程で充分な活性が必要とされる。
さらに、一部の宿主細胞、例えば酵母には、BIA経路内の初期段階の前駆体（すなわち、チロシンからノルコクラウリンまでの中間体）の多くに対して作用し得る内因性酵素/経路が存在し、したがって、このような競合性の内因性経路を考慮すると、異種経路による充分なフラックスが存在して相当なBIA生成が達成され得るであろうことは容易に明らかでないかもしれない。例えば、酵母におけるErlich経路（Hazelwood, et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 2259-66; Larroy, et al. 2003. Chem. Biol. Interact. 143-144: 229-38; Larroy, et al. 2002. Eur. J. Biochem. 269: 5738-45）は、初期段階のBIA経路の中間体の多くを望ましくない生成物に変換し、フラックスを合成経路からそらすために作用する可能性がある主要な内因性経路である。
さらに、本明細書において論考し、表3に示した酵素の多くは、天然の植物宿主内では非常に特異的な調節ストラテジー下、例えば空間的調節下で機能を果たし得るが、これは、異種酵母宿主に移されると失われ得る。また、植物は、酵母細胞と非常に異なる、該酵素が機能を果たすように進化する生化学的環境、例えば、pH、レドックス状態、ならびに基質、共基質、補酵素および補因子利用能を提示する。天然宿主と異種酵母宿主間の生化学的環境および調節ストラテジーの違いを考慮すると、該酵素が酵母環境の状況下における場合で相当な活性を示すであろうことは自明でなく、さらに、該酵素が一緒になって、単純な前駆体、例えば糖を複雑なBIA化合物に指向するように動作するであろうことは自明でない。酵母宿主内で該酵素の活性が維持されることは特に重要であり、それは、該経路の多くが多くの反応工程（>10）を有しており、したがってこれらの工程が効率的でなければ所望の下流産物の蓄積が期待され得ないためである。
また、天然の植物宿主では、このような経路に付随する代謝産物が異なる細胞型および組織型にまたがって局在し得る。いくつかの例では、生合成に特殊化され得る細胞型および代謝産物の蓄積のために合成され得る細胞型が存在する。このような型の細胞の特殊化は、異種酵母宿主内で該経路を発現させた場合は失われ得、該細胞に対するこのような代謝産物の毒性の制御に重要な役割を果たし得る。したがって、酵母が、このような代謝産物を、このような化合物の毒性によって害されることなく生合成して蓄積させるように、成功裡に遺伝子操作され得るであろうことは自明でない。
一例として、天然の植物宿主では、酵素BBEが動的細胞内局在を有することが報告されている。特に、酵素BBEは、最初はER内から始まり、次いで液胞内に分取される（Bird and Facchini. 2001. Planta. 213: 888-97）。植物におけるBBEのER結合（Alcantara, et al. 2005. Plant Physiol. 138: 173-83）がBBE活性のための最適な塩基性pH（pH約8.8）を提供していることが示唆されている（Ziegler and Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69）。別の例として、サングイナリン生合成が植物細胞内の特殊な小胞内で起こるという証拠がある（Amann, et al. 1986. Planta. 167: 310-20）が、この小胞内には一部の中間体しか蓄積されない。これは、該中間体を他の酵素活性および/または毒性効果から隔離するために起こるのかもしれない。
別の例として、モルフィナン経路分岐内の生合成酵素がすべて、植物の維管束組織の一部である師部に局在する。師部内では、経路内酵素が2つの細胞型:すべての植物に一般的な篩要素、および特殊な二次代謝産物を作り出すある特定の植物にのみ存在する特殊な細胞型である乳管にさらに分けられ得る。上流酵素（すなわち、NCSからSalATまで）は主に篩要素内に存在し、下流酵素（すなわち、T6ODM、COR、CODM）はほとんどが乳管内に存在する（Onoyovwe, et al. 2013. Plant Cell. 25: 4110-22）。さらに、ノスカピン生合成経路の最終工程は乳管内で起こることが見出された（Chen and Facchini. 2014. Plant J. 77: 173-84）。この区分けは、中間体を単離または輸送し、最適なpHを提供し、補因子の供給を増強させることによる生合成の調節に非常に重要であると考えられるが、ケシの乳管の微小環境の性質はまだ究明中である（Ziegler and Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69）。さらに、該酵素のうちのいくつかは、植物の二次代謝に一般的な多酵素複合体または代謝チャネルとしての機能を果たし得ることが予測される（Kempe, et al. 2009. Phytochemistry. 70: 579-89; Allen, et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 1559-66）。異なる宿主に由来する生合成酵素を合わせた場合および/または生合成酵素を異種酵母細胞内で組換え発現させた場合、このような複合体またはチャネルが天然宿主内の場合のように形成されることは明白でない。さらなる一例において、オウレンでは、ベルベリンが根の組織内で生合成され、次いで、特殊なATP結合カセット輸送タンパク質の作用によって地下茎内に蓄積される（Shitan, et al. 2013. Phytochemistry. 91: 109-16）。ケシでは、モルフィナンアルカロイドがラテックス（乳管細胞の細胞質）中に蓄積される（Martin, et al. 1967. Biochemistry. 6: 2355-63）。
さらに、このような考慮事項がない場合であっても、本明細書に記載の経路内の工程のいくつかで、植物酵素がまだ特性評価されていないという場合もある。例えば、初期段階のベンジルイソキノリンアルカロイド骨格であるノルコクラウリンへのチロシンの変換はまだ特性評価されていない。また、本明細書に記載の通り、（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換はごく最近になって特性評価された。したがって、本明細書に記載の経路内の工程のいくつかで、通常、天然状態ではBIAの生合成のために一緒に存在しない酵素活性を一緒にすること、または再構築経路に使用される新たな酵素活性をゲノム配列情報から同定することにより代替的な生合成スキームをもたらした。
例えば、チロシンのドパミンへの二工程変換は、天然では一緒に存在せず、この経路の状況で、または植物酵素とともに機能を果たすように進化しなかった少なくとも5種類の哺乳動物酵素と1種の細菌酵素を合わせることにより行なわれ得る。このような場合では、このような酵素を、これが天然状態ではそのために進化しなかった化合物の生合成のために使用すること、および異種微生物宿主およびこの経路の状況において有効に機能を果たし得るであろうことは自明とはなり得ない。このような場合では、このような酵素を、これが天然状態ではそのために進化しなかった化合物の生合成のために使用すること、および異種微生物宿主およびこの経路の状況において有効に機能を果たし得るであろうことは自明とはなり得ない。
別の例として、近年まで、（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換を担う酵素は不明であった。融合型エピメラーゼ酵素が発見されたときでさえ、進化論的解析により、モルヒネ生成ポピーではエピメラーゼの反応のためのオキシダーゼとレダクターゼとの融合酵素が生じると示唆され、これはエピメラーゼ酵素が非融合型である非モルヒネ生成ポピーとは対照的であった。この解析に基づき、一部の学者は、オキシダーゼ部分とレダクターゼ部分の融合が（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換を効率的に触媒するのに必要であると考えた。本明細書において論考する遺伝子操作された分割型エピメラーゼを使用する新規な方法では、このエピマー化反応が酵母内でBIA合成経路の状況において行われ得、このエピマー化は、野生型エピメラーゼを用いて行われるエピマー化よりも高効率で行われ得る。
関心対象のBIAが生成および/または関心対象の酵素が産生するような改変の対象物である遺伝子の例を以下に論考する。さらに、該遺伝子を、関心対象のBIAおよび/または関心対象の酵素の産生に使用される経路を示す一連の図の状況において論考する。
［TLK1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素トランスケトラーゼの発現を改変し得る。トランスケトラーゼはTKL1遺伝子にコードされている。一例では、トランスケトラーゼは、図2に示すようなフルクトース-6-リン酸＋グリセルアルデヒド-3-リン酸 ⇔ キシロース-5-リン酸＋エリトロース-4-リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTKL1遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTKL1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTKL1遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TKL1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞において組込まれるように改変され得る。TKL1遺伝子はサッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TKL1遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［ZWF1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼはZWF1遺伝子にコードされている。一例では、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、図2に示すようなグルコース-6-リン酸→6-ホスホグルコノラクトンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のZWF1遺伝子のコード領域が欠失するように改変され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりZWF1遺伝子の機能性が無効になるように改変され得る。
［ARO4］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼの発現を改変し得る。DAHPシンターゼはARO4遺伝子にコードされている。一例では、DAHPシンターゼは、図2に示すようなエリトロース-4-リン酸＋ホスホエノールピルビン酸→DAHPの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞はARO4遺伝子を、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が組込まれるように改変し得る。特に、フィードバック阻害緩和変異（例えば、ARO4FBR）は、天然型ARO4遺伝子の本来の遺伝子座に特異的変異として;別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入される追加コピーとして;またはエピゾーマルベクター、例えば2μmまたはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。変異ARO4FBRの識別表示「FBR」は、フィードバック耐性の変異型および変異をいう。DAHPシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、例えば遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞である場合、天然酵母の転写調節下に存在し得る。代替的に、DAHPシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、遺伝子操作された宿主細胞に、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入され得る。一部の場合では、ARO4遺伝子はサッカロミセス・セレビシエに由来するものであり得る。一部の場合では、ARO4遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。ARO4遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性変異、K229LまたはQ166Kが挙げられる。
［ARO7］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コリスミ酸ムターゼの発現を改変し得る。コリスミ酸ムターゼはARO7遺伝子にコードされている。一例では、コリスミ酸ムターゼは、図2に示すようなコリスメート→プレフェネートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞はARO7遺伝子を、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が組込まれるように改変し得る。特に、フィードバック阻害緩和変異（例えば、ARO7FBR）は、天然型ARO7遺伝子の本来の遺伝子座に特異的変異として;別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入される追加コピーとして;またはエピゾーマルベクター、例えば2μmまたはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。変異ARO7FBRの識別表示「FBR」は、フィードバック耐性の変異型および変異をいう。コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、例えば遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞である場合、天然酵母の転写調節下に存在し得る。代替的に、コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、遺伝子操作された宿主細胞に、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入され得る。一部の場合では、ARO7遺伝子はサッカロミセス・セレビシエに由来するものであり得る。一部の場合では、ARO7遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。ARO7遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性変異またはT226Iが挙げられる。
［ARO10］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの発現を改変し得る。フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼはARO10遺伝子にコードされている。一例では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート→4-ヒドロキシフェニルアセテート（4HPA）の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO10遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO10遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO10遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、ARO10遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。ARO10遺伝子はサッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、ARO10遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［ADH2～7、SFA1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の発現を改変し得る。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アルコールデヒドロゲナーゼは、4HPA→チロソールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数のコード領域が欠失するように改変され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数の機能性が無効になるように改変され得る。
［ALD2～6］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルデヒドオキシダーゼ酵素の発現を改変し得る。アルデヒドオキシダーゼ酵素は、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アルデヒドオキシダーゼは、4HPA→ヒドロキシフェニル酢酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数のコード領域が欠失するように改変され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数の機能性が無効になるように改変され得る。
［ARO9］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を改変し得る。芳香族アミノトランスフェラーゼはARO9遺伝子にコードされている。一例では、芳香族アミノトランスフェラーゼは、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート＋L-アラニン←→チロシン＋ピルベートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO9遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO9遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO9遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、ARO9遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。ARO9遺伝子はサッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、ARO9遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［ARO8］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を改変し得る。芳香族アミノトランスフェラーゼはARO8遺伝子にコードされている。一例では、芳香族アミノトランスフェラーゼが、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート＋グルタメート⇔チロシン＋アルファ-ケトグルテレートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのARO8遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのARO8遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO8遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのARO8遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。ARO8遺伝子はサッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来し得る。一部の例では、ARO8遺伝子が天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TYR1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素プレフェン酸デヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。プレフェン酸デヒドロゲナーゼはTYR1遺伝子にコードされている。一例では、プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、図2に示すようなプレフェネート＋NADP＋→4-ヒドロキシフェニルピルベート＋CO2＋NADPHの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTYR1遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTYR1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYR1遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTYR1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。TYR1遺伝子はサッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来し得る。一部の例では、TYR1遺伝子が天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TYR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシナーゼの発現を改変し得る。チロシナーゼはTYR遺伝子にコードされている。一例では、チロシナーゼは、図2、12、および13に示すようなチロシン→L-DOPAの反応を触媒する。他の例では、チロシナーゼは、L-DOPA→ドパキノンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TYR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。TYR遺伝子は青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、ツクリタケ（Agaricus bisporus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TYR遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TyrH］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシンヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。チロシンヒドロキシラーゼはTyrH遺伝子にコードされている。一例では、チロシンヒドロキシラーゼは、図2、12、および13に示すようなチロシン→L-DOPAの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTyrH遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTyrH遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTyrH遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TyrH遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。TyrH遺伝子はヒト、ドブネズミ、ハツカネズミ（Mus musculus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TyrH遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［DODC］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素L-DOPAデカルボキシラーゼの発現を改変し得る。L-DOPAデカルボキシラーゼはDODC遺伝子にコードされている。一例では、L-DOPAデカルボキシラーゼは、図2、12、および13に示すようなL-DOPA→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDODC遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDODC遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDODC遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DODC遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。DODC遺伝子はシュードモナス・プチダ、ドブネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DODC遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TYDC］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシン/DOPAデカルボキシラーゼの発現を改変し得る。チロシン/DOPAデカルボキシラーゼはTYDC遺伝子にコードされている。一例では、チロシン/DOPAデカルボキシラーゼは、図2、12、および13に示すようなL-DOPA→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYDC遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYDC遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYDC遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TYDC遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。TYDC遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TYDC遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［MAO］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モノアミンオキシダーゼの発現を改変し得る。モノアミンオキシダーゼはMAO遺伝子にコードされている。一例では、モノアミンオキシダーゼは、図2および13に示すようなドパミン→3,4-DHPAの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMAO遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMAO遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのMAO遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、MAO遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、MAO遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。MAO遺伝子は大腸菌、ヒト、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、MAO遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［NCS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリンシンターゼの発現を改変し得る。ノルコクラウリンシンターゼはNCS遺伝子にコードされている。一例では、ノルコクラウリンシンターゼは、図12および13に示すような4HPA＋ドパミン→(S)-ノルコクラウリンの反応を触媒する。特に、図12は、本発明の態様による、ノルコクラウリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図12は、酵素TyrH、チロシンヒドロキシラーゼ；DODC、DOPAデカルボキシラーゼ；NCS、ノルコクラウリンシンターゼ（本明細書において論考したもの）；6OMT、6-O-メチルトランスフェラーゼ；CNMT、コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ；CYP80B1、シトクロムP450 80B1；CPR、シトクロムP450 NADPHレダクターゼ；4'OMT、3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ. L-DOPA、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン；および4-HPA、4-ヒドロキシフェニルアセチルアルデヒドの使用を示す。図12に示した酵素のうち、4-HPAおよびL-チロシンは酵母内で天然に合成される。示された他のすべての代謝産物は酵母内で天然に生成されない。さらに、TyrHはL-チロシンのL-DOPAへの変換を触媒すると示されているが、本明細書に記載のように他の酵素もまた、この工程を行なうために使用され得る。例えば、チロシナーゼもまた、L-チロシンのL-DOPAへの変換を行なうために使用され得る。また、他の酵素、例えばシトクロムP450オキシダーゼもまた、L-チロシンのL-DOPAへの変換を行なうために使用され得る。かかる酵素は、関連BIA前駆体化合物、例えばL-DOPAおよびL-チロシンに対してオキシダーゼ活性を示し得る。
さらに、ノルコクラウリンシンターゼは、図13に示すような3,4-DHPA＋ドパミン→(S)-ノルラウダノソリンの反応を触媒する。特に、図13は、本発明の態様による、ノルラウダノソリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図13は、酵素TyrH、チロシンヒドロキシラーゼ；DODC、DOPAデカルボキシラーゼ；maoA、モノアミンオキシダーゼ；NCS、ノルコクラウリンシンターゼ；6OMT、6-O-メチルトランスフェラーゼ；CNMT、コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ；4'OMT、3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ.L-DOPA、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン；および3,4-DHPA、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドの使用を示す。図13に示した酵素のうち、L-チロシンは酵母内で天然に合成される。図13に示された他の代謝産物は酵母内で天然に生成されない。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のNCS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のNCS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのNCS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、NCS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。さらに、ノルコクラウリンシンターゼはN-末端切断部を有し得る。一部の場合では、NCS遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。NCS遺伝子はオウレン、ケシ、パパヴェール・ブラクテアタム（Papver bracteatum）、サリシタム・フラバム（Thalicitum flavum）、コリダリス・サキシコラ（Corydalis saxicola）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、NCS遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。
［6OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは6OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは、図12に示すようなノルコクラウリン→コクラウリンの反応を触媒する。他の例では、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは、ノルラウダノソリン→3'ヒドロキシコクラウリンの反応、ならびに本明細書に詳述した他の反応、例えば図13に示したものを触媒する。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の6OMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の6OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーの6OMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、6OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。6OMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、6OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［CNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼはCNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼは、図12に示すようなコクラウリン→N-メチルコクラウリンの反応を触媒する。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ酵素が、3'ヒドロキシコクラウリン→3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンの反応を触媒し得る。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼが、本明細書に詳述した他の反応、例えば図13に示したものを触媒し得る。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCNMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCNMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCNMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CNMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CNMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［4'OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素4'-O-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。4'-O-メチルトランスフェラーゼは4'OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、4'-O-メチルトランスフェラーゼは、図12に示すような3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン→レチクリンの反応を触媒する。他の例では、4'-O-メチルトランスフェラーゼは、本明細書に詳述した他の反応、例えば図13に示したものを触媒する。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の4'OMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の4'OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーの4'OMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、4'OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。4'OMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、4'OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［CYP80B1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムP450 80B1の発現を改変し得る。シトクロムP450 80B1はCYP80B1遺伝子にコードされている。一例では、シトクロムP450 80B1は、図12に示すようなN-メチルコクラウリン→3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のシトクロムP450 80B1遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のシトクロムP450 80B1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのシトクロムP450 80B1遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、シトクロムP450 80B1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、CYP80B1遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。シトクロムP450 80B1遺伝子はケシ、ハナビシソウ（E. californica）、キバナカラマツソウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、P450 80B1遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［FOL2］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素GTPシクロヒドロラーゼの発現を改変し得る。GTPシクロヒドロラーゼはFOL2遺伝子にコードされている。一部の例では、GTPシクロヒドロラーゼは、図1に示すようなGTP→ジヒドロネオプテリン三リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のFOL2遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。また、遺伝子操作された宿主細胞は天然の調節を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のFOL2遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのFOL2遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、FOL2遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。FOL2遺伝子はサッカロミセス・セレビシエ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、FOL2遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［PTPS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素6-ピルボイルテトラヒドロビオプテリン（PTP）シンターゼの発現を改変し得る。ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼはPTPS遺伝子にコードされている。一部の例では、6-ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、図1に示すようなジヒドロネオプテリン三リン酸→PTPの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPTPS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPTPS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPTPS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PTPS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、PTPS遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。PTPS遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、PTPS遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。
［SepR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素セピアプテリンレダクターゼの発現を改変し得る。セピアプテリンレダクターゼはSepR遺伝子にコードされている。一部の例では、セピアプテリンレダクターゼは、図1に示すようなPTP→BH4の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSepR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSepR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSepR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SepR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SepR遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。SepR遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SepR遺伝子は天然に存在する遺伝子と72％類似しているものであり得る。
［PCD］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン（プテリン-4α-カルビノールアミン）デヒドラターゼの発現を改変し得る。4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼはPCD遺伝子にコードされている。一部の例では、4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、図1に示すような4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン→H2O＋キノノイドジヒドロプテリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPCD遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPCD遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPCD遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PCD遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、PCD遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。PCD遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、PCD遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。
［QDHPR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼの発現を改変し得る。キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼはQDHPR遺伝子にコードされている。一部の例では、キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、図1に示すようなキノノイドジヒドロプテリジン→BH4の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のQDHPR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のQDHPR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのQDHPR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、QDHPR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、QDHPR遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。QDHPR遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、QDHPR遺伝子は天然に存在する遺伝子と75％類似しているものであり得る。
［DHFR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現を改変し得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼはDHFR遺伝子にコードされている。一部の例では、ジヒドロ葉酸レダクターゼは、図1に示すような7,8-ジヒドロビオプテリン（BH2）→5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン（BH4）の反応を触媒する。この反応は、図12に示すようなチロシンのL-DOPAへの変換のための共基質としてBH4の回収に有用であり得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDHFR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDHFR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDHFR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DHFR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、DHFR遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。DHFR遺伝子はドブネズミ、ヒトまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DHFR遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［DRS-DRR］1-BIAのエピマー化に関して上記に論考したように、遺伝子操作された宿主細胞は、BIAエピメラーゼの発現を改変し得る。BIAエピメラーゼはDRS-DRR遺伝子にコードされている。また、一部の例では、DRS-DRRはCYP-CORとも称され得る。一部の例では、BIAエピメラーゼまたはBIAエピメラーゼの遺伝子操作された分割型もしくは遺伝子操作された融合型が、図14に示すような（S）-1-BIA→（R）-1-BIAの変換を触媒する。特に、図14は、本発明の態様によるL-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。図14は、酵素CPR、シトクロムP450レダクターゼ；DRS-DRR、デヒドロレチクリンシンターゼとデヒドロレチクリンレダクターゼ；SalSyn、サルタリジンシンターゼ；SalR、サルタリジンレダクターゼ；SalAT、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ；TS、テバインシンターゼ；T6ODM、テバイン6-O-デメチラーゼ；COR、コデイノンレダクターゼ；およびCODM、コデイン-O-デメチラーゼの使用を示す。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのDRS-DRR遺伝子または遺伝子操作されたDRS-DRR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRR遺伝子に遺伝子操作された融合エピメラーゼがコードされ得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRR遺伝子に遺伝子操作された分割型エピメラーゼがコードされ得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのDRS-DRR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDRS-DRR遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのDRS-DRR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。DRS-DRR遺伝子はハカマオニゲシ（Papaver bracteatum）、ケシ、アツミゲシ（Papaver setigerum）、クサノオウ（Chelidonium majus）または別の種に由来し得る。一部の例では、DRS-DRR遺伝子が天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［CPR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムP450レダクターゼの発現を改変し得る。シトクロムP450レダクターゼはCPR遺伝子にコードされている。一部の例では、シトクロムP450レダクターゼは、図14に示すような(R)-レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。さらに、シトクロムP450レダクターゼは、他の反応、例えば本出願の至る箇所の図に示したものを触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCPR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCPR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCPR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CPR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CPR遺伝子はハナビシソウ、ケシ、ヒト（H. sapiens）、S. セレビシエ、シロイヌナズナ（A. thaliana）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CPR遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［SalSyn］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンシンターゼの発現を改変し得る。サルタリジンシンターゼはSalSyn遺伝子にコードされている。一部の例では、サルタリジンシンターゼは、図14に示すような(R)-レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalSyn遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalSyn遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalSyn遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalSyn遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SalSyn遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。一部の例では、SalSynはN-末端が改変され得る。SalSyn遺伝子はケシ、ケシ属の種、クサノオウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalSyn遺伝子は天然に存在する遺伝子と78％類似しているものであり得る。
［SalR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンレダクターゼの発現を改変し得る。サルタリジンレダクターゼはSalR遺伝子にコードされている。一部の例では、サルタリジンレダクターゼは、図14に示すようなサルタリジノール→サルタリジンの反応を可逆的に触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SalR遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。SalR遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、ケシ属の種、クサノオウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalR遺伝子は天然に存在する遺伝子と80～100％類似しているものであり得る。
［SalAT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼはSalAT遺伝子にコードされている。一部の例では、アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼは、図14に示すようなアセチル-CoA＋サルタリジノール→CoA＋7-O-アセチルサルタリジノールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalAT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalAT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalAT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalAT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SalAT遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。SalAT遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、オニゲシ（Papaver orientale）、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalAT遺伝子は天然に存在する遺伝子と77～80％類似しているものであり得る。
［TS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素テバインシンターゼの発現を改変し得る。テバインシンターゼはTS遺伝子にコードされている。一部の例では、テバインシンターゼまたは遺伝子操作されたテバインシンターゼが、図14に示すような7-O-アセチルサルタリジノール→テバイン＋アセテートの反応を触媒する。一部の例では、7-O-アセチルサルタリジノール→テバイン＋アセテートの反応が自然に起こるが、テバインシンターゼがこの反応の一部分を触媒する。特に、図14は、本発明の態様によるL-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。図14は、酵素CPR、シトクロムP450レダクターゼ；DRS-DRR、デヒドロレチクリンシンターゼとデヒドロレチクリンレダクターゼ；SalSyn、サルタリジンシンターゼ；SalR、サルタリジンレダクターゼ；SalAT、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ；TS、テバインシンターゼ；T6ODM、テバイン6-O-デメチラーゼ；COR、コデイノンレダクターゼ；およびCODM、コデイン-O-デメチラーゼの使用を示す。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTS遺伝子または遺伝子操作されたTS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。一部の場合では、遺伝子操作されたTS遺伝子に遺伝子操作された融合酵素がコードされ得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTS遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。一部の場合では、TS遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。TS遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、オニゲシ（Papaver orientale）、ケシ属の種または別の種に由来し得る。一部の例では、TS遺伝子が天然に存在する遺伝子と75～80％類似しているものであり得る。
［T6ODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テバイン6-O-デメチラーゼの発現を改変し得る。テバイン6-OデメチラーゼはT6ODM遺伝子にコードされている。一部の例では、テバイン6-O-デメチラーゼは、図14、15、および16に示すようなテバイン→ネオピノンの反応を触媒する。ネオピノンが生成されたら、ネオピノンはコデイノンに変換され得る。ネオピノン→コデイノンの変換は自発的に起こり得る。代替的に、ネオピノン→コデイノンの変換は、触媒された反応の結果として起こり得る。他の例では、T6ODM酵素が、テバイン以外の基質のO-脱メチル化を触媒し得る。例えば、T6ODMはオリパビンをO-脱メチル化してモルヒノンを生成させ得る。代替的に、T6ODMは、1-ベンジルイソキノリン、プロトベルベリンまたはプロトピン類型のBIA、例えばそれぞれ、パパベリン、カナジンおよびアロクリプトピンのO-脱メチル化を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のT6ODM遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のT6ODM遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのT6ODM遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、T6ODM遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、T6ODM遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。T6ODM遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、T6ODM遺伝子は天然に存在する遺伝子と76.2％類似しているものであり得る。
［COR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデイノンレダクターゼの発現を改変し得る。コデイノンレダクターゼはCOR遺伝子にコードされている。一部の例では、コデイノンレダクターゼは、図14、15、および16に示すようなコデイノンのコデインへの反応を触媒する。一部の場合では、コデイノンレダクターゼは、ネオピノンのネオピンへの反応を触媒し得る。他の例では、CORは、他のモルフィナンの還元、例えば、ヒドロコドン→ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン→14-ヒドロキシコデイン、およびヒドロモルホン→ジヒドロモルヒネを触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCOR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCOR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCOR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、COR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、COR遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。付加的または代替的に、COR遺伝子は、ミトコンドリア、液胞、小胞体またはその組合せに対する標的化配列の付加を有するように改変され得る。COR遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と76～78％類似しているものであり得る。一例では、COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と76.8％、77.0％、77.3％または77.7％類似しているものであり得る。
［CODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデインO-デメチラーゼの発現を改変し得る。コデインO-デメチラーゼはCODM遺伝子にコードされている。一部の例では、コデインO-デメチラーゼは、図14、15、および16に示すようなコデインのモルヒネへの反応を触媒する。コデインO-デメチラーゼはまた、ネオピンのネオモルヒネへの反応も触媒し得る。コデインO-デメチラーゼはまた、テバインのオリパビンへの反応も触媒し得る。他の例では、CODMが、1-ベンジルイソキノリン、アポルフィンおよびプロトベルベリン類型のBIA、例えばそれぞれ、レチクリン、イソコリジンおよびスコウレリンのO-脱メチル化を触媒し得る。他の例では、CODM酵素が、プロトピン内のメチレンジオキシブリッジ構造を切断するためのO,O-デメチレン化反応を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCODM遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCODM遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCODM遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CODM遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、CODM遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。付加的または代替的に、CODM遺伝子は、ミトコンドリアに対する標的化配列の付加を有するように改変され得る。CODM遺伝子はケシ、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CODM遺伝子は天然に存在する遺伝子と75％類似しているものであり得る。一例では、CODM遺伝子が天然に存在する遺伝子と75.2％類似しているものであり得る。
［BBE］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ベルベリンブリッジ酵素の発現を改変し得る。ベルベリンブリッジ酵素はBBE遺伝子にコードされている。一部の例では、ベルベリンブリッジ酵素は、(S)-レチクリン→(S)-スコウレリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のBBE遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のBBE遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのBBE遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、BBE遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。BBE遺伝子はケシ、アザミゲシ、ハナビシソウ、ベルベリス・ストロニフェラ、サリクトラム・フラバム・グロウカム（Thalictrum flavum subsp. glaucum）、オウレン、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、BBE遺伝子は天然に存在する遺伝子と99％類似しているものであり得る。
［S9OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼはS9OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼは、S-アデノシル-L-メチオニン＋(S)-スコウレリン→S-アデノシル-L-ホモシステイン＋(S)-テトラヒドロコルンバミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のS9OMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のS9OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのS9OMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、S9OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、S9OMT遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。S9OMT遺伝子はサリクトラム・フラバム・グロウカム、オウレン、トウオウレン、ケシ、カラマツソウ属の種、オウレン属の種、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、S9OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。一例では、S9OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。
［CAS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素(S)-カナジンシンターゼの発現を改変し得る。(S)-カナジンシンターゼはCAS遺伝子にコードされている。一部の例では、(S)-カナジンシンターゼは、(S)-テトラヒドロコルンバミン→(S)-カナジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子を発現するように改変され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCAS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CAS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CAS遺伝子はサリクトラム・フラバム・グロウカム、オウレン、カラマツソウ属の種、オウレン属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CAS遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［STOX］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼの発現を改変し得る。(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼはSTOX遺伝子にコードされている。一部の例では、(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼは、(S)-テトラヒドロベルベリン＋2 O2→ベルベリン＋2 H2O2の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTOX遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTOX遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTOX遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STOX遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の例では、STOXはN-末端が改変され得る。一部の場合では、STOX遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。STOX遺伝子はベルベリス・ウィルソニエー、オウレン、メギ属の種、オウレン属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STOX遺伝子は天然に存在する遺伝子と78％類似しているものであり得る。
［TNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼはTNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、カナジン→N-メチルカナジンの反応を触媒する。一部の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、ノルオキシモルホン→ナロキソンの反応を触媒する。
他の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、スチロピン→cis-N-メチルスチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTNMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTNMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTNMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TNMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、TNMT遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。TNMT遺伝子はケシ、ハナビシソウ、ハカマオニゲシ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。一例では、TNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と81％類似しているものであり得る。
［CFS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ケイランチフォリンシンターゼの発現を改変し得る。ケイランチフォリンシンターゼはCFS遺伝子にコードされている。一例では、ケイランチフォリンシンターゼは、スコウレリン→ケイランチフォリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCFS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCFS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCFS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CFS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CFS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシ（A. mexicana）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CFS遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、CFS遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素スチロピンシンターゼの発現を改変し得る。スチロピンシンターゼはSTS遺伝子にコードされている。一例では、スチロピンシンターゼは、ケイランチフォリン→スチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。STS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STS遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、STS遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。
［MSH］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼはMSH遺伝子にコードされている。一例では、cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼは、cis-N-メチルスチロピン→プロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMSH遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMSH遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのMSH遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、MSH遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。MSH遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、MSH遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。さらに、MSH遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。
［P6H］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素プロトピン-6-ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。プロトピン-6-ヒドロキシラーゼはP6H遺伝子にコードされている。一例では、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼは、プロトピン→6-ヒドロキシプロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のP6H遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のP6H遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのP6H遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CFS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。P6H遺伝子はケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、P6H遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。さらに、P6H遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。
［DBOX］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼの発現を改変し得る。ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼはDBOX遺伝子にコードされている。一例では、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼは、ジヒドロサングイナリン→サングイナリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDBOX遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDBOX遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDBOX遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DBOX遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。DBOX遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DBOX遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。さらに、DBOX遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。
［morA］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒネデヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。モルヒネデヒドロゲナーゼはmorA遺伝子にコードされている。一部の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、図15に示すようなモルヒネ→モルヒノンの反応を触媒する。他の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、同じく図15に示すようなコデイノン→コデインの反応を触媒する。図15は、本発明の態様による、半合成オピオイド（opiod）の生成の生合成スキームを示す。特に、図15は、morA、モルヒネデヒドロゲナーゼ；およびmorB、モルヒネレダクターゼを組込むことによる酵母内でのテバインの拡張形質転換を示す。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorA遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorA遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのmorA遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、morA遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、morA遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。morA遺伝子はシュードモナス・プチダまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、morA遺伝子は天然に存在する遺伝子と73.7％類似しているものであり得る。
［morB］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒノンレダクターゼの発現を改変し得る。モルヒノンレダクターゼはmorB遺伝子にコードされている。一部の例では、モルヒノンレダクターゼは、図15に示すようなコデイノン→ヒドロコドンの反応を触媒する。他の例では、モルヒノンレダクターゼは、同じく図15に示すようなモルヒノン→ヒドロモルホンの反応を触媒する。他の例では、モルヒノンレダクターゼは、14-ヒドロキシコデイノン→オキシコドンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorB遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorB遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのmorB遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、morB遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、morB遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。morB遺伝子はシュードモナス・プチダまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、morB遺伝子は天然に存在する遺伝子と67.2％類似しているものであり得る。
［CYP80A1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素ベルバムニン（berbamunine）シンターゼを発現し得る。ベルバムニンシンターゼはシトクロムP450酵素80A1（CYP80A1）の遺伝子にコードされている。一部の例では、CYP80A1は、(S)-N-メチルコクラウリン＋(R)-N-メチルコクラウリン→ベルバムニンの反応を触媒する。他の例では、CYP80A1は、(R)-N-メチルコクラウリン＋(R)-N-メチルコクラウリン→ガテガウメリンの反応を触媒する。他の例では、CYP80A1は、(R)-N-メチルコクラウリン＋(S)-コクラウリン→2'ノルベルバムニンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP80A1遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP80A1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCYP80A1遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CYP80A1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、CYP80A1遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。CYP80A1遺伝子はベルベリス・ストロニフェラまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CYP80A1遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％類似しているものであり得る。
［PODA］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素プロトピンO-デアルキラーゼを発現し得る。プロトピンO-デアルキラーゼは遺伝子PODAにコードされている。一部の例では、PODAは、プロトベルベリンおよびプロトピン、例えば、カナジン、スチロピン、ベルベリン、クリプトピン、アロクリプトピンおよびプロトピンのO,O-脱メチル化を触媒する。一部の例では、PODAは、BIA、例えばテトラヒドロパパベリン、テトラヒドロパルマチンおよびクリプトピンのO-脱メチル化を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPODA遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPODA遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPODA遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PODA遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、PODA遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化され得る。PODA遺伝子はケシまたは他の種に由来するものであり得る。一部の例では、PODA遺伝子は天然に存在する遺伝子と70～100％類似しているものであり得る。
［BM3］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素BM3を発現し得る。BM3は、天然宿主内での脂肪酸への一酸素添加に関与している巨大菌シトクロムP450である。一部の場合では、BM3が、図9に示すようにオピオイドをN-脱メチル化してノル-オピオイドを生成させる。一部の場合では、宿主細胞が、BM3に加えて、図10に示すようなナル-オピオイドまたはノル-オピオイドの生成のための他の異種酵素を発現するように改変される。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのBM3遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのBM3遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのBM3遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのBM3遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。BM3は、可溶性であること、融合レダクターゼパートナータンパク質が付随していること、および新たな基質を受容するように容易に遺伝子操作され得ることなどの、生合成酵素としてのいくつかの利点を有する。さらに、表8は、BM3 N-デメチラーゼ変異体を示す。
前述の遺伝子の例は、宿主細胞内のいくつかの異なるプラットフォーム、例えばプラスミド（2μ、ARS/CEN）、YACまたはゲノムにより発現させることができる。また、前述の遺伝子配列の例は天然または所望の異種宿主（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）での発現のためにコドン最適化されたもののいずれかであり得る。
以下の実施例は、本発明の種々の態様の実例を示す目的で示しており、本発明をいかなる様式でも限定することを意図するものではない。表示されている場合、発現構築物は、使用される厳密なターミネーター配列が明記されていない場合であっても適当なプロモーター、遺伝子およびターミネーターが組み込まれると理解されたい。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現時点で好ましい代表的な態様であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の趣旨に包含される、本実施例における変更および他の使用は当業者に思いつくであろう。
実施例1:モルフィナンアルカロイド生成のための酵素の生物情報学的識別
OneKP（Matasci N et al. 2014. Data access for the 1,000 Plants (1KP) project. Gigascience 3:17）およびPhytometasyn（Xiao M et al. 2013. Transcriptome analysis based on next-generation sequencing of non-model plants producing specialized metabolites of biotechnological interest. J Biotechnol 166:122-34）植物トランスクリプトームデータベースを、仮定の酵素クラスのそれぞれに由来する代表的なバリアントのアミノ酸配列を用いてクエリーした。特に、関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイドを生成する多くの植物種を含む、基本の真正双子葉植物クレードを検索した。これらの検索から多数の配列を同定して、系統樹を確立することにより候補配列のリストを絞り込んだ。系統樹の確立において、モルフィナンアルカロイドを生成する植物種に由来する類似の公知かつ特徴決定された酵素からの配列を含めた。これらの参照配列は、配列間の関係の理解を深めること、およびさらに所望の活性を示す可能性が最も高い候補を同定するために配列間隙を束縛することに役立った。このアプローチを用いてBet v 1/PR10/major latexタンパク質クラスの酵素に関して作成された系統樹の一例を、図21に示す。
実施例2:分離型のDRS酵素とDRR酵素を形成するためにDRS-DRRが切断され得るアミノ酸位置.
ヒナゲシ由来のPbDRS-DRR対デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）およびデヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）の一次アミノ酸配列のアラインメントを、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を用いて作成した。ヒナゲシ由来のDRRとのアラインメントに基づき、本発明者らは、PbDRS-DRRをDRS酵素およびDRR酵素に分離する切断点を特定した。ここにはM569の位置に保存メチオニン残基がみられる（SEQ ID NO. 16）。この残基はSEQ ID NO. 18の1位に対応する。図17において、残基D568とM569の間の黒矢印はPbDRS-DRRが切断された部位を表す。PbDRS-DRRベースの分離型DRS酵素はD568の位置で終結するように設計した。点線の矢印は、ヒナゲシ由来のDRSまたはDRRのいずれにも保存されていないか、またはいずれとも相同でないPbDRS-DRR領域を示す。黒で囲んだK557から始まってD568で終わる配列のこれらの非保存残基の各々の後ろでの切断体を生成させ、DRSの各連続切断体の活性を、pDW21と同一の（TEF1プロモーターの制御下のDRRを有する）ベクター骨格においてアッセイした。このようなプラスミドで、別々のプラスミド上にPbSalSynを有する実施例1に記載のレポーター酵母株YA106を別々に形質転換した（DW24）。
遺伝子操作されたDRS-DRR（または分離型のDRSおよびDRR）酵素を有する酵母株の増殖のため、レポーター株を発現プラスミドで、標準的な分子生物学の手法を用いて形質転換し、シングルコロニーの酵母を固相寒天培地プレートから、選択条件（例えば、トリプトファンなしの合成完全2％デキストロース）下で単離した。コロニーを液体培養培地中に播種し、30℃で2日間培養した。次いで培養物を同じ組成の新鮮培地中で、または一部の場合では8％のマルトデキストリンを含有している液体合成完全培地中で継代培養した。高分子マルトデキストリンから単糖を放出させるため、クロコウジカビ（A.niger）由来のアミログルコシダーゼ（Sigma）をおよそ3 U/Lの濃度で添加した。酵母株を30℃でさらに3日間または4日間培養し、培養物を遠心分離によって分離し、サルタリジン濃度を上清み中で直接、LC-MSによって測定した。
プラスミドおよび株
Figure 2024037919000059
実施例3:グルコースと単純窒素源から（S）-レチクリンを生成するように遺伝子操作されたプラットフォーム酵母株
BIAのカギとなる分岐点中間体（S）-レチクリンをL-チロシンから生成するプラットフォーム酵母株を構築した（図12）。具体的には、4種類の多遺伝子発現構築物を酵母株のゲノム内に組み込んだ。この4つの構築物の組成を図18に示す。各構築物は、酵母プロモーターにより発現される4つまたは5つの遺伝子で構成されている。遺伝子は各遺伝子座に、模式図上部のアノテーションに明記したとおりのプロモーター、遺伝子のオープンリーディングフレームおよびターミネーターを含む完全発現カセットとして位置している。模式図には、所与の遺伝子を表す矢印の方向によって各発現カセットの向きを示している。選択マーカーをアノテーションにおいてイタリック体で示し、模式図においてグレーの矢印で示す。各選択マーカーは、遺伝子座からの該マーカーの除去を可能にするloxP部位に隣接する。さらに、各構築物は、該マーカーがCreレコンビナーゼによって除去され得るようにloxP部位に隣接した選択マーカーを有する。
第1の組込み構築物には、ドブネズミ（Rattus norvegicus）由来の4つの異種遺伝子をYBR197C遺伝子座内にG418選択マーカー（KanMX）と一緒に組み込む。RnPTPS、RnSepR、RnPCDおよびRnQDHPRが、図1に示すような酵母の内因性葉酸誘導体（folate）合成経路によるテトラヒドロビオプテリン（BH4）の合成および再生に必要とされる。各遺伝子は、酵母内での発現のためにコドン最適化される。
第2の組込み構築物には、4つの異種遺伝子をHIS3位座内にHIS5選択マーカーと一緒に組み込む。ドブネズミのチロシンヒドロキシラーゼ（RnTyrH）はチロシンをL-DOPAに、先の組込み構築物によって生成される共基質BH4を用いて変換する。RnTyrH遺伝子は、野生型または活性の向上を付与する改善された変異型（例えば、W166Y、R37EおよびR38E）の任意のものであり得る。第2のドブネズミ遺伝子RnDHFRは、ジヒドロビオプテリン（BH4の酸化生成物）をBH4に還元する酵素をコードしており、このようにして、この共基質の利用能が高まる。また、第3の構築物には、L-DOPAをドパミンに変換する酵素であるシュードモナス・プチダ由来のPpDODCを含める。第4の酵素はオウレン（Coptis japonica）由来のCjNCSであり、これは4-HPAとドパミンを縮合させてノルコクラウリンを作製する。各遺伝子は、酵母内での発現のためにコドン最適化される。
第3の組込み構築物には、植物由来の5つの異種遺伝子とLEU2選択マーカーを遺伝子座YDR514C内に組み込む。Ps6OMT、Ps4’OMTおよびPsCNMTはケシ由来のメチルトランスフェラーゼであり、天然植物のヌクレオチド配列として発現される。第4のケシ遺伝子yPsCPRv2は、酵母用にコドン最適化され、ハナビシソウ由来のシトクロムP450、EcCYP80A1の活性を補助するレダクターゼをコードしている。この構築物にコードされた酵素は、先の組込み構築物によって生成されるノルコクラウリンからレチクリンを生成させるための2つのO-メチル化、N-メチル化およびヒドロキシル化を行う。各遺伝子は、酵母内での発現のためにコドン最適化される。
最後の組込み構築物には、さらなるコピーのサッカロミセス・セレビシエ内因性遺伝子ARO4 Q166K、ARO7 T226I、TYR1およびARO10をARO4遺伝子座内にハイグロマイシン耐性選択マーカーと一緒に組み込む。ARO4 Q166KおよびARO7 T226Iは、各々が野生型配列と比べて単一塩基対置換をコードしているARO4およびARO10のフィードバック耐性変異型である。TYR1およびARO10は天然酵母遺伝子と同一であるが、強力なプロモーターの後ろ（behind）で発現される。Aro4pおよびAro7pは、チロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成における酵素である。このような酵素からフィードバック阻害を取り除くと内因性チロシンの生合成の上方調節がもたらされる。Tyr1pの過剰発現によりチロシンの生合成が上方調節され、したがってチロシン生成が上方調節される。Aro10pの過剰発現により4-HPAの生成が増大する。
プラットフォーム酵母株は、この4つの発現カセットのうちの任意の数を有するように構築され得る。具体的には、プラットフォーム酵母株を、組込み構築物1～4および組込み構築物1～3を有するように構築した。チロシン過剰生成構築物（構築物4）を除いた後者の株では、レチクリンの生合成を補助するために、さらなるチロシンが培養培地中に供給され得る。下流のBIAの生成およびBIA生合成へのフラックスの増大を補助するためのさらなる遺伝子改変をプラットフォーム株に組み込んでもよい。
酵母株を、専用のアミノ酸類欠損溶液を含む合成完全培地中で30℃にて培養した。培地の上清み中のBIA代謝産物を、48時間および96時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。
実施例4A:グルコースと単純窒素源からテバインを生成するように遺伝子操作されたプラットフォーム酵母株
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからのモルフィナンアルカロイドテバインの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例3に記載のプラットフォーム酵母株は、L-チロシンからモルフィナンアルカロイド生成物を生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図14）。
L-チロシンから（S）-レチクリンを生成させるプラットフォーム酵母株（実施例3の説明参照）を、生合成された（S）-レチクリンを最初のモルフィナンアルカロイドテバインに変換するための遺伝子操作された分割型エピメラーゼDRS-DRR、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノールアセチルトランスフェラーゼおよびテバインシンターゼが組み込まれるようにさらに遺伝子操作した（図14）。3つの発現カセット（PTDH3-yEcCFS1-26-yPbSS33-504、PTPI1-yPbSalR、PTEF1-yPsSalAT）を、bleR選択マーカーを有する組込み構築物内にアセンブリングし、プラットフォーム酵母株の遺伝子座TRP1内に組み込んだ。さらに3つの発現カセット（PTDH3-yPbDRS、PTEF1-yPbDRR、PPGK1-yPsTS）を、URA3選択マーカーを有する組込み構築物内にアセンブリングし、プラットフォーム酵母株の遺伝子座YPL250CΔ内に組み込んだ。この2つの構築物の組成を図19に示す。
組み込まれたカセットを有する酵母株を、専用の欠損溶液を含む合成完全培地中で30℃にて培養した。96時間の培養後、培地をBIA代謝産物についてLC-MS/MS解析によって解析した。
実施例4B:遺伝子操作された酵母株によるグルコースと単純窒素源からのテバインの生成
酵母株を、実施例3および4に記載のようにして、五環式モルフィナンアルカロイドテバインが単糖（例えば、グルコース）および標準的な増殖培地中に存在する窒素源から直接生成されるように遺伝子操作した。具体的には、CEN.PK株のサッカロミセス・セレビシエを、以下の異種酵素:TyrH、DODC、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、NCS、6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR、4OMT、DRS、DRR、SalSyn、SalR、SalATおよびTSが発現されるように酵母染色体内への組込みによって遺伝子操作した。この実施例では、SalSyn酵素は、そのリーダー配列がハナビシソウ（Eschscholzia californica）ケランチフォリン（chelanthifoline）シンターゼ（EcCFS）のN末端由来の83個のアミノ酸で置き換えられているように遺伝子操作される。この株に対して、BIA前駆体の蓄積を増大させるためのさらなる改変、例えば:ARO10の過剰発現、TYR1の過剰発現、フィードバック耐性ARO4（ARO4Q166K）の発現およびフィードバック耐性ARO7（ARO7T226I）の発現を行った。テバインシンターゼ活性（TS）、例えばSEQ ID NO.35（すなわち、TS1）、37（すなわち、TS2）をコードしているいろいろな変異体の酵素を有するか、最初の22個のアミノ酸のN末端切断体（すなわち、tTS1）を有するSEQ ID NO.35の変異体を有するか、テバインシンターゼ酵素（YA397）を有しない別個の遺伝子操作された酵母株を記載のようにして作製した。これらの酵素変異体の配列を表2に示す。
記載の酵母株を、2％のグルコースを含む2 mlの合成完全培地（酵母ニトロゲンベースおよびアミノ酸）中に播種し、30℃でおよそ4時間培養した。次いで、10 uLの各培養物を96ウェルプレート内の400 uLの新鮮培地に4連で移し、30℃でさらに48時間培養した。生産培地は、1×酵母ニトロゲンブロスおよびアミノ酸、20 mMのアスコルビン酸、300 mg/Lのチロシン、40 g/Lのマルトデキストリンおよび2単位/Lのアミラーゼを含有している。アミラーゼは、フェドバッチプロセスを模倣し、酵母が炭素源として使用できるようにグルコースを高分子マルトデキストリンから緩徐に放出させるために使用する。細胞を培地から遠心分離によって分離し、テバイン濃度を上清み中で直接、LC-MS/MS解析によって測定した。すべての遺伝子操作された酵母株が、増殖培地中に存在しているグルコースと単純窒素源からテバインを生成した（図22および23）。テバインシンターゼ活性を有する株は、記載の発酵条件下において、この活性を有しない株と比べて高いレベルのテバインを生成した。
実施例5:グルコースと単純窒素源から下流のモルフィナンアルカロイドを生成するように遺伝子操作された酵母株
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからの下流のモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例4に記載のプラットフォーム酵母株は、L-チロシンから下流のモルフィナンアルカロイド生成物を生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図14）。
L-チロシンからテバインを生成するプラットフォーム酵母株（実施例5の記載を参照のこと）を、生合成されたテバインを下流のモルフィナンアルカロイド、例えばモルヒネに変換するためのテバイン6-O-デメチラーゼ、コデイノンレダクターゼおよびコデイノン-O-デメチラーゼが組み込まれるようにさらに遺伝子操作した（図14）。3つの発現カセット（PADH1-T6ODM-TADH1、PHXT7-COR-TPGK1、PTEF1-CODM-TCYC1）をTRP1選択マーカーとともに直接アセンブリングし、テバインプラットフォーム酵母株のtrp1遺伝子座内に組み込んだ（Thodey et al.,2014）。
組み込まれたカセットを有する酵母株を、専用の欠損溶液を含む合成完全培地中で30℃にて培養した。96時間の培養後、培地をBIA代謝産物についてLC-MS/MS解析によって解析した。
実施例6:グルコースと単純窒素源から半合成オピオイドを生成するように遺伝子操作された酵母株
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからの下流のモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例4および5に記載の酵母株は、L-チロシンから半合成オピオイド生成物を生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図15）。
L-チロシンから下流のモルフィナンアルカロイドを生成する酵母株（実施例4の記載を参照のこと）を、生合成されたテバインを下流のモルフィナンアルカロイド、例えばモルヒネに変換するためのモルヒネデヒドロゲナーゼおよびモルヒノンレダクターゼが組み込まれるようにさらに遺伝子操作した（図15）。2つの発現カセット（PGPD-morA-TCYC1、PPGK1-morB-TPHO5）をKanMX選択マーカーとともに直接アセンブリングし、下流のモルフィナンアルカロイドを生成する酵母株のHO遺伝子座内に組み込んだ（Thodey et al.,2014）。
組み込まれたカセットを有する酵母株を、専用の欠損溶液を含む合成完全培地中で30℃にて培養した。96時間の培養後、培地をBIA代謝産物についてLC-MS/MS解析によって解析した。
実施例7:グルコースと単純窒素源からO-脱メチル化オピオイド化合物を生成するように遺伝子操作された微生物株
モルフィナンアルカロイドに対してO-デメチラーゼ活性を示した表4に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（サッカロミセス・セレビシエまたは大腸菌のいずれか）に組み込んだ（実施例5に記載のようにして）。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたL-チロシンが使用される。2分子のチロシンが改変され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに改変されて（S）-レチクリンを形成し、次いで、エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、（R）-レチクリンが生じる。（R）-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに改変された後、テバインシンターゼによって触媒される酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図14参照）。表3に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
図10は、本発明の態様による、微生物細胞内での生合成スキームを示す。細胞によって内因性的に生成された、および/または培養培地中に供給されたチロシンがオキシコドンに変換される（点線の矢印は多酵素工程を表す）。次いでオキシコドンは3-O-脱メチル化されてオキシモルホンとなり、N-脱メチル化されてノルオキシモルホンとなる。最後に、N-メチルトランスフェラーゼがSAMアナログからアリル炭素部分およびシクロプロピルメチル炭素部分を受容し、それぞれナロキソンおよびナルトレキソンを生成させる。
モルフィナンアルカロイド分子生成株におけるO-デメチラーゼ活性を検出するため、プラスミドベクターまたは染色体組込みカセットのいずれかにより候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ、細胞上清みを収集し、全オピオイドプロフィールを解析した（上記のとおり）。完全なBIA経路を有する株内でのオピオイド分子のO-脱メチル化をLC-MSによって検出した（上記のとおり）。具体的には、オキシコドンのオキシモルホンへの変換を検出した。生物触媒作用によるO-脱メチル化活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにオピオイド基質（図6参照）および酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。オピオイド分子のO-脱メチル化をLC-MSによって検出した。
実施例8:グルコースと単純窒素源からN-脱メチル化オピオイド化合物を生成するように遺伝子操作された微生物株
モルフィナンアルカロイドに対してN-デメチラーゼ活性を示した表5に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（サッカロミセス・セレビシエまたは大腸菌のいずれか）に組み込んだ（実施例6に記載のようにして）。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたL-チロシンが使用される。2分子のチロシンが改変され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに改変されて（S）-レチクリンを形成し、次いでエピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、（R）-レチクリンが生じる。（R）-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに改変された後、テバインシンターゼによって触媒される酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図14参照）。表3に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
モルフィナンアルカロイド分子生成株におけるN-デメチラーゼ活性を検出するため、プラスミドベクターまたは染色体組込みカセットのいずれかにより候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ、細胞上清みを収集し、全オピオイドプロフィールを解析した（上記のとおり）。完全なBIA経路を有する株内でのオピオイド分子のN-脱メチル化をLC-MSによって検出した（上記のとおり）。具体的には、オキシモルホンのノルオキシモルホンへの変換を検出した。生物触媒作用によるN-脱メチル化活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにオピオイド基質（図7参照）および酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。オピオイド分子のN-脱メチル化をLC-MSによって検出した。
実施例9:グルコースと単純窒素源からナル-オピオイド化合物を生成するように遺伝子操作された微生物株
モルフィナンアルカロイドに対してN-メチラーゼ活性を示した表6に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（サッカロミセス・セレビシエまたは大腸菌のいずれか）に組み込んだ（実施例6に記載のようにして）。図10は、前駆体分子テバインから最終ナル-オピオイド化合物のナロキソンおよびナルトレキソンまでの完全な反応スキームの一例を示す。このような株は、完全なBIA経路によるノル-オピオイド化合物の生成を担う、実施例8および9ならびに表3の酵素をさらに発現する。また、N-メチラーゼ酵素を、生合成経路がない微生物株内（例えば、S. セレビシエではCen.PK2または大腸菌ではBL21のいずれか）で発現させ、外来的に供給したいくつかの異なる基質分子の生物触媒作用能を有する株を作製した。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたチロシンが使用される。2分子のチロシンが改変され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに改変されて（S）-レチクリンを形成し、次いでエピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、（R）-レチクリンが生じる。（R）-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに改変された後、テバインシンターゼによって触媒される酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図14参照）。表3に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
ノル-オピオイドまでの完全なBIA経路（図10参照）を有する株におけるN-修飾活性を検出するため、候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ（上記のとおり）、SAMまたはSAMアナログ、例えば図8に列記したものとともにインキュベートした。完全なBIA経路を有する株内におけるノル-オピオイドまたは他のBIA分子の酵素的修飾を、上清み中でLC-MSによって検出した（上記のとおり）。生物触媒作用によるN-修飾活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにSAMまたはSAMアナログおよび酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。具体的には、ノルオキシモルホンのナロキソンおよびナルトレキソンへの変換（図8に示すようにSAMアナログであるアリル-SAMまたはシクロプロパン-SAMを使用）を検出した。ノル-オピオイドまたは他のBIA分子の修飾をLC-MSによって検出した。完全なBIA経路を有していない株における生物触媒作用によるN-修飾活性を検出するため、記載の異種酵素を発現しているCen.PK2株を選択培地中で培養し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにSAMまたはSAMアナログ、酵素機能に必要な補因子ならびにノル-オピオイド分子、例えば図8および表3に列記したものを外来的に供給した。このような化合物の修飾をLC-MSによって検出した。
（表３）酵素リスト
Figure 2024037919000060
Figure 2024037919000061
Figure 2024037919000062
Figure 2024037919000063
Figure 2024037919000064
Figure 2024037919000065
Figure 2024037919000066
Figure 2024037919000067
（表４）O-デメチラーゼ候補酵素
Figure 2024037919000068
Figure 2024037919000069
Figure 2024037919000070
（表５）N-デメチラーゼ候補酵素
Figure 2024037919000071
Figure 2024037919000072
Figure 2024037919000073
Figure 2024037919000074
Figure 2024037919000075
（表６）N-メチルトランスフェラーゼおよびN-修飾候補酵素
Figure 2024037919000076
Figure 2024037919000077
Figure 2024037919000078
Figure 2024037919000079
Figure 2024037919000080
（表７）BM3 N-デメチラーゼの変異体
Figure 2024037919000081
Figure 2024037919000082
Figure 2024037919000083
Figure 2024037919000084
Figure 2024037919000085
Figure 2024037919000086
Figure 2024037919000087
Figure 2024037919000088
（表８）pA24、pA25およびpA26の配列
Figure 2024037919000089
Figure 2024037919000090
Figure 2024037919000091
Figure 2024037919000092
（表９）テーラリング酵素
Figure 2024037919000093
（表１０）けしがら濃縮物および清澄化した酵母培養培地中に存在し得る不純物の比較.
Figure 2024037919000094
（表１１）清澄化した酵母培養培地（CYCM）中に存在する相違する分子群。けしがら濃縮物（CPS）とは異なり、酵母宿主株は、他の類型のアルカロイドが存在しないように所定の類型のアルカロイド分子（すなわち、一株につき1つの生合成経路のみ）を生成するように遺伝子操作され得る。したがって、CYCM中には、単一の生合成経路内の分子、例えば、1つまたは2つのカラムにまたがる分子のサブセットが含まれ得るが、CPS中には多くのカラムにおける分子のサブセットが含まれ得る.
Figure 2024037919000095
（表１２）化合物の化学合成調製物中に存在し得る不純物
Figure 2024037919000096
本発明の好ましい態様を本明細書において図示および記載してきたが、当業者にはかかる態様は一例とした示したものにすぎないことが明らかであろう。ここに、当業者には、本発明から逸脱することなく数多くの変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する種々の代替例が本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、およびこの特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにその均等物が特許請求の範囲に包含されることを意図する。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> ANTHEIA, INC.
<120> METHODS OF PRODUCING MORPHINAN ALKALOIDS AND DERIVATIVES
<150> US 62/628,264
<151> 2018-02-08
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 901
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 1
Met Glu Leu Gln Tyr Ile Ser Tyr Phe Gln Pro Thr Ser Ser Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Ser Val Val Val Leu
20 25 30
Arg Lys Thr Phe Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Thr
35 40 45
Lys Thr Ala Val Leu Ser His Gln Arg Gln Gln Ser Cys Ala Leu Pro
50 55 60
Ile Ser Gly Leu Leu His Ile Phe Met Asn Lys Asn Gly Leu Ile His
65 70 75 80
Val Thr Leu Gly Asn Met Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Ser Phe
85 90 95
Pro Thr Gly Ser His Arg Thr Leu Val Val Ser Ser Trp Glu Met Val
100 105 110
Lys Glu Cys Phe Thr Gly Asn Asn Asp Thr Ala Phe Ser Asn Arg Pro
115 120 125
Ile Pro Leu Ala Phe Lys Thr Ile Phe Tyr Ala Cys Gly Gly Ile Asp
130 135 140
Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Val Pro Tyr Gly Lys Tyr Trp Arg Glu Leu
145 150 155 160
Arg Lys Val Cys Val His Asn Leu Leu Ser Asn Gln Gln Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Arg His Leu Ile Ile Ser Gln Val Asp Thr Ser Phe Asn Lys Leu
180 185 190
Tyr Glu Leu Cys Lys Asn Ser Glu Asp Asn His Gly Asn Tyr Thr Thr
195 200 205
Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Met Val Arg Ile Asp Asp Trp Leu Ala
210 215 220
Glu Leu Ser Phe Asn Val Ile Gly Arg Ile Val Cys Gly Phe Gln Ser
225 230 235 240
Gly Pro Lys Thr Gly Ala Pro Ser Arg Val Glu Gln Phe Lys Glu Ala
245 250 255
Ile Asn Glu Ala Ser Tyr Phe Met Ser Thr Ser Pro Val Ser Asp Asn
260 265 270
Val Pro Met Leu Gly Trp Ile Asp Gln Leu Thr Gly Leu Thr Arg Asn
275 280 285
Met Lys His Cys Gly Lys Lys Leu Asp Leu Val Val Glu Ser Ile Ile
290 295 300
Asn Asp His Arg Gln Lys Arg Arg Phe Ser Arg Thr Lys Gly Gly Asp
305 310 315 320
Glu Lys Asp Asp Glu Gln Asp Asp Phe Ile Asp Ile Cys Leu Ser Ile
325 330 335
Met Glu Gln Pro Gln Leu Pro Gly Asn Asn Asn Pro Ser Gln Ile Pro
340 345 350
Ile Lys Ser Ile Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Gly Thr Asp Thr Thr
355 360 365
Lys Leu Thr Thr Ile Trp Thr Leu Ser Leu Leu Leu Asn Asn Pro His
370 375 380
Val Leu Asp Lys Ala Lys Gln Glu Val Asp Ala His Phe Arg Thr Lys
385 390 395 400
Arg Arg Ser Thr Asn Asp Ala Ala Ala Ala Val Val Asp Phe Asp Asp
405 410 415
Ile Arg Asn Leu Val Tyr Ile Gln Ala Ile Ile Lys Glu Ser Met Arg
420 425 430
Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Val Val Glu Arg Leu Ser Gly Glu Asp Cys
435 440 445
Val Val Gly Gly Phe His Val Pro Ala Gly Thr Arg Leu Trp Ala Asn
450 455 460
Val Trp Lys Met Gln Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro Leu Val
465 470 475 480
Phe Arg Pro Asp Arg Phe Leu Ser Asp Glu Gln Lys Met Val Asp Val
485 490 495
Arg Gly Gln Asn Tyr Glu Leu Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Val
500 505 510
Cys Pro Gly Val Ser Phe Ser Leu Asp Leu Met Gln Leu Val Leu Thr
515 520 525
Arg Leu Ile Leu Glu Phe Glu Met Lys Ser Pro Ser Gly Lys Val Asp
530 535 540
Met Thr Ala Thr Pro Gly Leu Met Ser Tyr Lys Val Ile Pro Leu Asp
545 550 555 560
Ile Leu Leu Thr His Arg Arg Ile Lys Pro Cys Val Gln Ser Ala Ala
565 570 575
Ser Glu Arg Asp Met Glu Ser Ser Gly Val Pro Val Ile Thr Leu Gly
580 585 590
Ser Gly Lys Val Met Pro Val Leu Gly Met Gly Thr Phe Glu Lys Val
595 600 605
Gly Lys Gly Ser Glu Arg Glu Arg Leu Ala Ile Leu Lys Ala Ile Glu
610 615 620
Val Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Glu Glu
625 630 635 640
Val Leu Gly Glu Ala Ile Ala Glu Ala Leu Gln Leu Gly Leu Val Lys
645 650 655
Ser Arg Asp Glu Leu Phe Ile Ser Ser Met Leu Trp Cys Thr Asp Ala
660 665 670
His Ala Asp Arg Val Leu Leu Ala Leu Gln Asn Ser Leu Arg Asn Leu
675 680 685
Lys Leu Glu Tyr Val Asp Leu Tyr Met Leu Pro Phe Pro Ala Ser Leu
690 695 700
Lys Pro Gly Lys Ile Thr Met Asp Ile Pro Glu Glu Asp Ile Cys Arg
705 710 715 720
Met Asp Tyr Arg Ser Val Trp Ala Ala Met Glu Glu Cys Gln Asn Leu
725 730 735
Gly Phe Thr Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Cys Lys Lys Leu
740 745 750
Gln Glu Leu Met Ala Thr Ala Asn Ile Pro Pro Ala Val Asn Gln Val
755 760 765
Glu Met Ser Pro Ala Phe Gln Gln Lys Lys Leu Arg Glu Tyr Cys Asn
770 775 780
Ala Asn Asn Ile Leu Val Ser Ala Ile Ser Val Leu Gly Ser Asn Gly
785 790 795 800
Thr Pro Trp Gly Ser Asn Ala Val Leu Gly Ser Glu Val Leu Lys Lys
805 810 815
Ile Ala Met Ala Lys Gly Lys Ser Val Ala Gln Val Ser Met Arg Trp
820 825 830
Val Tyr Glu Gln Gly Ala Ser Leu Val Val Lys Ser Phe Ser Glu Glu
835 840 845
Arg Leu Arg Glu Asn Leu Asn Ile Phe Asp Trp Glu Leu Thr Lys Glu
850 855 860
Asp His Glu Lys Ile Gly Glu Ile Pro Gln Cys Arg Ile Leu Ser Ala
865 870 875 880
Tyr Phe Leu Val Ser Pro Asn Gly Pro Phe Lys Ser Gln Glu Glu Leu
885 890 895
Trp Asp Asp Glu Ala
900

<210> 2
<211> 919
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<220>
<221> MOD_RES
<222> (209)..(209)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (226)..(226)
<223> Any amino acid
<400> 2
Met Glu Leu Gln Tyr Ile Ser Tyr Phe Gln Pro Thr Ser Ser Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Ser Val Val Val Leu
20 25 30
Arg Lys Thr Phe Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Thr
35 40 45
Lys Thr Ala Val Leu Ser His Gln Arg Gln Gln Ser Cys Ala Leu Pro
50 55 60
Ile Ser Gly Leu Leu His Ile Phe Met Asn Lys Asn Gly Leu Ile His
65 70 75 80
Val Thr Leu Gly Asn Met Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Ser Phe
85 90 95
Pro Thr Gly Ser His Arg Thr Leu Val Val Ser Ser Trp Glu Met Val
100 105 110
Lys Glu Cys Phe Thr Gly Asn Asn Asp Thr Ala Phe Ser Asn Arg Pro
115 120 125
Ile Pro Leu Ala Phe Lys Thr Ile Phe Tyr Ala Cys Gly Gly Ile Asp
130 135 140
Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Val Pro Tyr Gly Lys Tyr Trp Arg Glu Leu
145 150 155 160
Arg Lys Val Cys Val His Asn Leu Leu Ser Asn Gln Gln Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Arg His Leu Ile Ile Ser Gln Val Asp Thr Ser Phe Asn Lys Leu
180 185 190
Tyr Glu Leu Cys Lys Asn Ser Glu Asp Asn His Gly Asn Tyr Thr Thr
195 200 205
Xaa Leu Leu Leu Pro Gln Leu Ala Trp Arg Gln Pro Trp Lys Leu Tyr
210 215 220
Tyr Xaa Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Met Val Arg Ile Asp Asp Trp
225 230 235 240
Leu Ala Glu Leu Ser Phe Asn Val Ile Gly Arg Ile Val Cys Gly Phe
245 250 255
Gln Ser Gly Pro Lys Thr Gly Ala Pro Ser Arg Val Glu Gln Phe Lys
260 265 270
Glu Ala Ile Asn Glu Ala Ser Tyr Phe Met Ser Thr Ser Pro Val Ser
275 280 285
Asp Asn Val Pro Met Leu Gly Trp Ile Asp Gln Leu Thr Gly Leu Thr
290 295 300
Arg Asn Met Lys His Cys Gly Lys Lys Leu Asp Leu Val Val Glu Ser
305 310 315 320
Ile Ile Asn Asp His Arg Gln Lys Arg Arg Phe Ser Arg Thr Lys Gly
325 330 335
Gly Asp Glu Lys Asp Asp Glu Gln Asp Asp Phe Ile Asp Ile Cys Leu
340 345 350
Ser Ile Met Glu Gln Pro Gln Leu Pro Gly Asn Asn Asn Pro Ser Gln
355 360 365
Ile Pro Ile Lys Ser Ile Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Gly Thr Asp
370 375 380
Thr Thr Lys Leu Thr Thr Ile Trp Thr Leu Ser Leu Leu Leu Asn Asn
385 390 395 400
Pro His Val Leu Asp Lys Ala Lys Gln Glu Val Asp Ala His Phe Arg
405 410 415
Thr Lys Arg Arg Ser Thr Asn Asp Ala Ala Ala Ala Val Val Asp Phe
420 425 430
Asp Asp Ile Arg Asn Leu Val Tyr Ile Gln Ala Ile Ile Lys Glu Ser
435 440 445
Met Arg Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Val Val Glu Arg Leu Ser Gly Glu
450 455 460
Asp Cys Val Val Gly Gly Phe His Val Pro Ala Gly Thr Arg Leu Trp
465 470 475 480
Ala Asn Val Trp Lys Met Gln Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro
485 490 495
Leu Val Phe Arg Pro Asp Arg Phe Leu Ser Asp Glu Gln Lys Met Val
500 505 510
Asp Val Arg Gly Gln Asn Tyr Glu Leu Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg
515 520 525
Arg Val Cys Pro Gly Val Ser Phe Ser Leu Asp Leu Met Gln Leu Val
530 535 540
Leu Thr Arg Leu Ile Leu Glu Phe Glu Met Lys Ser Pro Ser Gly Lys
545 550 555 560
Val Asp Met Thr Ala Thr Pro Gly Leu Met Ser Tyr Lys Val Ile Pro
565 570 575
Leu Asp Ile Leu Leu Thr His Arg Arg Ile Lys Pro Cys Val Gln Ser
580 585 590
Ala Ala Ser Glu Arg Asp Met Glu Ser Ser Gly Val Pro Val Ile Thr
595 600 605
Leu Gly Ser Gly Lys Val Met Pro Val Leu Gly Met Gly Thr Phe Glu
610 615 620
Lys Val Gly Lys Gly Ser Glu Arg Glu Arg Leu Ala Ile Leu Lys Ala
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Ile Glu Val Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Glu Thr
645 650 655
Glu Glu Val Leu Gly Glu Ala Ile Ala Glu Ala Leu Gln Leu Gly Leu
660 665 670
Val Lys Ser Arg Asp Glu Leu Phe Ile Ser Ser Met Leu Trp Cys Thr
675 680 685
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690 695 700
Asn Leu Lys Leu Glu Tyr Val Asp Leu Tyr Met Leu Pro Phe Pro Ala
705 710 715 720
Ser Leu Lys Pro Gly Lys Ile Thr Met Asp Ile Pro Glu Glu Asp Ile
725 730 735
Cys Arg Met Asp Tyr Arg Ser Val Trp Ala Ala Met Glu Glu Cys Gln
740 745 750
Asn Leu Gly Phe Thr Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Cys Lys
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Lys Leu Gln Glu Leu Met Ala Thr Ala Asn Ile Pro Pro Ala Val Asn
770 775 780
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785 790 795 800
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Asn Gly Thr Pro Trp Gly Ser Asn Ala Val Leu Gly Ser Glu Val Leu
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Lys Lys Ile Ala Met Ala Lys Gly Lys Ser Val Ala Gln Val Ser Met
835 840 845
Arg Trp Val Tyr Glu Gln Gly Ala Ser Leu Val Val Lys Ser Phe Ser
850 855 860
Glu Glu Arg Leu Arg Glu Asn Leu Asn Ile Phe Asp Trp Glu Leu Thr
865 870 875 880
Lys Glu Asp His Glu Lys Ile Gly Glu Ile Pro Gln Cys Arg Ile Leu
885 890 895
Ser Ala Tyr Phe Leu Val Ser Pro Asn Gly Pro Phe Lys Ser Gln Glu
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Glu Leu Trp Asp Asp Glu Ala
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<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<220>
<221> MOD_RES
<222> (725)..(725)
<223> Any amino acid
<400> 3
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1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Ser Val Val Val Leu
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Arg Lys Thr Phe Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Thr
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Lys Thr Ala Val Leu Ser His Gln Arg Gln Gln Ser Cys Ala Leu Pro
50 55 60
Ile Ser Gly Leu Leu His Ile Phe Met Asn Lys Asn Gly Leu Ile His
65 70 75 80
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Ile Pro Leu Ala Phe Lys Thr Ile Phe Tyr Ala Cys Gly Gly Ile Asp
130 135 140
Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Val Pro Tyr Gly Lys Tyr Trp Arg Glu Leu
145 150 155 160
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165 170 175
Phe Arg His Leu Ile Ile Ser Gln Val Asp Thr Ser Phe Asn Lys Leu
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Tyr Glu Leu Cys Lys Asn Ser Glu Asp Asn His Gly Asn Tyr Thr Thr
195 200 205
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Gly Pro Lys Thr Gly Ala Pro Ser Arg Val Glu Gln Phe Lys Glu Ala
245 250 255
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260 265 270
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355 360 365
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Val Leu Asp Lys Ala Lys Gln Glu Val Asp Ala His Phe Arg Thr Lys
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Arg Arg Ser Thr Asn Asp Ala Ala Ala Ala Val Val Asp Phe Asp Asp
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Val Trp Lys Met Gln Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro Leu Val
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Phe Arg Pro Asp Arg Phe Leu Ser Asp Glu Gln Lys Met Val Asp Val
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His Ala Asp Arg Val Leu Leu Ala Leu Gln Asn Ser Leu Arg Asn Leu
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<210> 4
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<213> Papaver somniferum
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Any amino acid
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Tyr Gly Lys Tyr Trp Arg Glu Leu Arg Lys Val Cys Val His Asn Leu
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Val Leu Lys Gln Ile Ala Met Ala Lys Gly Lys Ser Val Ala Gln Val
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Ser Met Arg Trp Val Tyr Glu Gln Gly Ala Ser Leu Val Val Lys Ser
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<213> Papaver bracteatum
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770 775 780
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<211> 858
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<220>
<221> MOD_RES
<222> (822)..(822)
<223> Any amino acid
<400> 13
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Lys Val Cys Val His Asn Leu Leu Ser Asn Gln Gln Leu Leu Lys Phe
165 170 175
Arg His Leu Ile Ile Ser Gln Val Asp Thr Ser Phe Asn Lys Leu Tyr
180 185 190
Glu Leu Cys Lys Asn Ser Glu Asp Asn Gln Gly Met Val Arg Met Asp
195 200 205
Asp Trp Leu Ala Gln Leu Ser Phe Asn Val Ile Gly Arg Ile Val Cys
210 215 220
Gly Phe Gln Ser Asp Pro Lys Thr Gly Ala Pro Ser Arg Val Glu Gln
225 230 235 240
Phe Lys Glu Val Ile Asn Glu Ala Ser Tyr Phe Met Ser Thr Ser Pro
245 250 255
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340 345 350
Thr Asp Thr Thr Lys Leu Thr Thr Ile Trp Thr Leu Ser Leu Leu Leu
355 360 365
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370 375 380
Phe Arg Lys Lys Arg Arg Ser Thr Asp Asp Ala Ala Ala Ala Val Val
385 390 395 400
Asp Phe Asp Asp Ile Arg Asn Leu Val Tyr Ile Gln Ala Ile Ile Lys
405 410 415
Glu Ser Met Arg Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Val Val Glu Arg Leu Ser
420 425 430
Gly Glu Asp Cys Val Val Gly Gly Phe His Val Pro Ala Gly Thr Arg
435 440 445
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450 455 460
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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645 650 655
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<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 14
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245 250 255
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260 265 270
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500 505 510
Leu Val Leu Thr Arg Leu Ile Leu Glu Phe Glu Met Lys Ser Pro Ser
515 520 525
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<210> 16
<211> 889
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
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Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Val Ser Phe Ser Leu Asp Leu Met Gln
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Leu Val Leu Thr Arg Leu Ile Leu Glu Phe Glu Met Lys Ser Pro Ser
515 520 525
Gly Lys Val Asp Met Thr Ala Thr Pro Gly Leu Met Ser Tyr Lys Val
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Gln Leu Ala Ser Ser Glu Arg Asp Met Glu Ser Ser Gly Val Pro Val
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580 585 590
Phe Glu Lys Val Gly Lys Gly Ser Glu Arg Glu Arg Leu Ala Ile Leu
595 600 605
Lys Ala Ile Glu Val Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr
610 615 620
Glu Thr Glu Glu Val Leu Gly Glu Ala Ile Ala Glu Ala Leu Gln Leu
625 630 635 640
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885

<210> 17
<211> 568
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
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Gln Leu Ala Ser Ser Glu Arg Asp
565

<210> 18
<211> 321
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
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100 105 110
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115 120 125
Ile Thr Met Asp Ile Pro Glu Glu Asp Ile Cys Arg Met Asp Tyr Arg
130 135 140
Ser Val Trp Ser Ala Met Glu Glu Cys Gln Asn Leu Gly Phe Thr Lys
145 150 155 160
Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Cys Lys Lys Leu Gln Glu Leu Met
165 170 175
Ala Thr Ala Asn Ile Pro Pro Ala Val Asn Gln Val Glu Met Ser Pro
180 185 190
Ala Phe Gln Gln Lys Lys Leu Arg Glu Tyr Cys Asn Ala Asn Asn Ile
195 200 205
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210 215 220
Ser Asn Ala Val Leu Gly Ser Glu Val Leu Lys Gln Ile Ala Met Ala
225 230 235 240
Lys Gly Lys Ser Val Ala Gln Val Ser Met Arg Trp Val Tyr Glu Gln
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Asn Leu Asn Ile Phe Asp Trp Glu Leu Thr Lys Glu Asp Asn Glu Lys
275 280 285
Ile Gly Glu Ile Pro Gln Cys Arg Ile Leu Thr Ala Tyr Phe Leu Val
290 295 300
Ser Pro Asn Gly Pro Phe Lys Ser Gln Glu Glu Leu Trp Asp Asp Lys
305 310 315 320
Ala

<210> 19
<211> 682
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 19
ttcagttcga gtttatcatt atcaatactg ccatttcaaa gaatacgtaa ataattaata 60
gtagtgattt tcctaacttt atttagtcaa aaaattagcc ttttaattct gctgtaaccc 120
gtacatgccc aaaatagggg gcgggttaca cagaatatat aacatcgtag gtgtctgggt 180
gaacagttta ttcctggcat ccactaaata taatggagcc cgctttttaa gctggcatcc 240
agaaaaaaaa agaatcccag caccaaaata ttgttttctt caccaaccat cagttcatag 300
gtccattctc ttagcgcaac tacagagaac aggggcacaa acaggcaaaa aacgggcaca 360
acctcaatgg agtgatgcaa cctgcctgga gtaaatgatg acacaaggca attgacccac 420
gcatgtatct atctcatttt cttacacctt ctattacctt ctgctctctc tgatttggaa 480
aaagctgaaa aaaaaggttg aaaccagttc cctgaaatta ttcccctact tgactaataa 540
gtatataaag acggtaggta ttgattgtaa ttctgtaaat ctatttctta aacttcttaa 600
attctacttt tatagttagt ctttttttta gttttaaaac accaagaact tagtttcgaa 660
taaacacaca taaacaaaca aa 682

<210> 20
<211> 289
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 20
gagcgttggt tggtggatca agcccacgcg taggcaatcc tcgagcagat ccgccaggcg 60
tgtatatata gcgtggatgg ccaggcaact ttagtgctga cacatacagg catatatata 120
tgtgtgcgac gacacatgat catatggcat gcatgtgctc tgtatgtata taaaactctt 180
gttttcttct tttctctaaa tattctttcc ttatacatta ggacctttgc agcataaatt 240
actatacttc tatagacaca caaacacaaa tacacacact aaattaata 289

<210> 21
<211> 413
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 21
catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg gactccgcgc 60
atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct ctttcttcct 120
ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt 180
ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa 240
tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa gttaataaac 300
ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac tttttttact 360
tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaattac aaa 413

<210> 22
<211> 274
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 22
acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60
cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120
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ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240
agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttg 274

<210> 23
<211> 150
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 23
gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60
tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120
ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta 150

<210> 24
<211> 8014
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 24
cctcgccgca gttaattaaa gtcagtgagc gaggaagcgc gtaactataa cggtcctaag 60
gtagcgaatc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 120
agatcggcaa gtgcacaaac aatacttaaa taaatactac tcagtaataa cctatttctt 180
agcatttttg acgaaatttg ctattttgtt agagtctttt acaccatttg tctccacacc 240
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gtcagaaatc gagttccaat ccaaaagttc acctgtccca cctgcttctg aatcaaacaa 420
gggaataaac gaatgaggtt tctgtgaagc tgcactgagt agtatgttgc agtcttttgg 480
aaatacgagt cttttaataa ctggcaaacc gaggaactct tggtattctt gccacgactc 540
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cttaagttga ttacgaaaca cgccaaccaa gtatttcgga gtgcctgaac tatttttata 660
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tgtgctctgc aagccgcaaa ctttcaccaa tggaccagaa ctacctgtga aattaataac 840
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ccaatgccct ccctcttggc cctctccttt tcttttttcg accgaattaa ttcttaatcg 960
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aagaatatct tccactactg ccatctggcg tcataactgc aaagtacaca tatattacga 1080
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ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 1200
ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 1260
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aaagaaggta gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt 1560
caacaaaaag cgtactttac atatatattt attagacaag aaaagcagat taaatagata 1620
tacattcgat taacgataag taaaatgtaa aatcacagga ttttcgtgtg tggtcttcta 1680
cacagacaag gtgaaacaat tcggcattaa tacctgagag caggaagagc aagataaaag 1740
gtagtatttg ttggcgatcc ccctagagtc ttttacatct tcggaaaaca aaaactattt 1800
tttctttaat ttcttttttt actttctatt tttaatttat atatttatat taaaaaattt 1860
aaattataat tatttttata gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcact tttcggggaa 1920
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 1980
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 2040
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 2100
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggacgc gtagtctaga 2160
ccagccagga cagaaatgcc tcgacttcgc tgctacccaa ggttgccggg tgacgcacac 2220
cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt ggacataagc ctgttcggtt cgtaagctgt 2280
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ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag agcgagattc 2760
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ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat 3000
ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg 3060
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cgccgaagga tgtcgctgcc ggctgggcaa tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg 3180
tcatacttga agctagacag gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg gcctcgcgcg 3240
cagatcagtt ggaagaattt gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag gtagtcggca 3300
aataaccctc gagcattcaa ggcgccttga ttatttgacg tggtttgatg gcctccacgc 3360
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cgctttttaa gctggcatcc agaaaaaaaa agaatcccag caccaaaata ttgttttctt 3660
caccaaccat cagttcatag gtccattctc ttagcgcaac tacagagaac aggggcacaa 3720
acaggcaaaa aacgggcaca acctcaatgg agtgatgcaa cctgcctgga gtaaatgatg 3780
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ctgctctctc tgatttggaa aaagctgaaa aaaaaggttg aaaccagttc cctgaaatta 3900
ttcccctact tgactaataa gtatataaag acggtaggta ttgattgtaa ttctgtaaat 3960
ctatttctta aacttcttaa attctacttt tatagttagt ctttttttta gttttaaaac 4020
accaagaact tagtttcgaa taaacacaca taaacaaaca aaatggaact tcagtacttc 4080
tcctattttc aacccacttc atctgtcgta gccctactac tagcactagt gagtatttta 4140
tttagcgtag ttgttttgag gaagactttc agtaacaatt actccagccc cgcgtcaagt 4200
acggaaaccg ctgtgctgtg tcatcagagg caacagagtt gcgccctacc tatcagcggc 4260
cttcttcacg tgttcatgaa taagaacggc ctgattcatg tcaccttggg aaatatggct 4320
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tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 7380
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atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcagt 7920
ggaacgtgca ttatgaatta gttacgctag ggataacagg gtaatataga acccgaacga 7980
ccgagcgcag cggcggccgc gctgataccg ccgc 8014

<210> 25
<211> 7621
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 25
cctcgccgca gttaattaaa gtcagtgagc gaggaagcgc gtaactataa cggtcctaag 60
gtagcgaatc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 120
agatcggcaa gtgcacaaac aatacttaaa taaatactac tcagtaataa cctatttctt 180
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cgtcagtcca ccagctaaca taaaatgtaa gctttcgggg ctctcttgcc ttccaaccca 360
gtcagaaatc gagttccaat ccaaaagttc acctgtccca cctgcttctg aatcaaacaa 420
gggaataaac gaatgaggtt tctgtgaagc tgcactgagt agtatgttgc agtcttttgg 480
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cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt ggacataagc ctgttcggtt cgtaagctgt 2280
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gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaaac attatgaggg 2520
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atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga 2640
agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc 2700
ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag agcgagattc 2760
tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg cgttatccag 2820
ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg 2880
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tgtatgtata taaaactctt gttttcttct tttctctaaa tattctttcc ttatacatta 3600
ggacctttgc agcataaatt actatacttc tatagacaca caaacacaaa tacacacact 3660
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<210> 26
<211> 8187
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<211> 8580
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggacgc gtagtctaga 2160
ccagccagga cagaaatgcc tcgacttcgc tgctacccaa ggttgccggg tgacgcacac 2220
cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt ggacataagc ctgttcggtt cgtaagctgt 2280
aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg 2340
gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt gttatgactg tttttttggg gtacagtcta 2400
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gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaaac attatgaggg 2520
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atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga 2640
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ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg 3060
agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg 3120
cgccgaagga tgtcgctgcc ggctgggcaa tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg 3180
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cgctttttaa gctggcatcc agaaaaaaaa agaatcccag caccaaaata ttgttttctt 3660
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accaagaact tagtttcgaa taaacacaca taaacaaaca aaatggaact tcagtacttc 4080
tcctattttc aacccacttc atctgtcgta gccctactac tagcactagt gagtatttta 4140
tttagcgtag ttgttttgag gaagactttc agtaacaatt actccagccc cgcgtcaagt 4200
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gacaaatatg gccctatctt cagttttccg acaggcagcc accgtacttt agtagtcagt 4380
tcctgggaaa tggtgaaaga gtgtttcacc ggtaataacg acacggcatt ctccaacaga 4440
ccaatccctt tggcttttca aaccatattc tacgcctgtg gcggcattga ttcttacggt 4500
ttaagtagtg tcccgtatgg taaatactgg agggagttga gaaaggtgtg tgttcacaac 4560
ctgctgagta atcagcaatt gctgaagttc agacatctta taatctccca agtggatacg 4620
tcttttaaca agttgtatga gctgtgtaag aactctgaag ataatcaagg tatggtaagg 4680
atggatgatt ggctagctca actttccttt aacgtcatcg gtaggatcgt ttgcggattc 4740
cagtctgacc caaagacggg tgcaccttca agggtagaac agtttaagga agtcataaat 4800
gaggcgtcat attttatgtc aacaagtcca gtctccgata acgtaccaat gttgggatgg 4860
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gtagtggagt caattatcaa ggaccatagg caaaagagac gtttttcacg tacaaaaggt 4980
ggcgatgaga aggatgacga acaggacgac tttattgata tttgcttgag catcatggag 5040
cagccacagt tgcccgggaa caattctccc cctcaaattc cgatcaaatc tatcgtgcta 5100
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tacaattggg tctgatagag agccgtgacg agctgttcat cagctcaatg ctttggtgca 6600
ccgacgcaca tccagaccgt gtgctacttg ctctgcaaaa cagtctgaga aatctaaaac 6660
ttgaatatct agacctatat atgttgccgt ttcctgccag ccttaagccg ggcaaaatta 6720
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ttaaatctca ggaagagctt tgggatgaca aggcataaac aggccccttt tcctttgtcg 7320
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ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt ttttaatagt 7440
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cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa 7560
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ttcttcttcg tcataactta atgtttttat ttaaaatacc tcgcgagtgg caacactgaa 7740
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ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 7860
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 7920
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 7980
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 8040
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aacagggtaa tatagaaccc gaacgaccga gcgcagcggc ggccgcgctg ataccgccgc 8580

<210> 28
<211> 8456
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 28
cctcgccgca gttaattaaa gtcagtgagc gaggaagcgc gtaactataa cggtcctaag 60
gtagcgaatc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 120
agatcggcaa gtgcacaaac aatacttaaa taaatactac tcagtaataa cctatttctt 180
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tccgcttaca tcaacaccaa taacgccatt taatctaagc gcatcaccaa cattttctgg 300
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tgcctcgggc atccaagcag caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga 2460
gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaaac attatgaggg 2520
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ggcgacctcg cgggttttcg ctatttatga aaattttccg gtttaaggcg tttccgttct 7560
tcttcgtcat aacttaatgt ttttatttaa aatacctcgc gagtggcaac actgaaaata 7620
cccatggagc ggcgtaaccg tcgcacagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 7680
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 7740
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 7800
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 7860
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 7920
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 7980
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 8040
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 8100
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 8160
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 8220
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 8280
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 8340
aaaacgccag caacgcggca gtggaacgtg cattatgaat tagttacgct agggataaca 8400
gggtaatata gaacccgaac gaccgagcgc agcggcggcc gcgctgatac cgccgc 8456

<210> 29
<211> 8456
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 29
cctcgccgca gttaattaaa gtcagtgagc gaggaagcgc gtaactataa cggtcctaag 60
gtagcgaatc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 120
agatcggcaa gtgcacaaac aatacttaaa taaatactac tcagtaataa cctatttctt 180
agcatttttg acgaaatttg ctattttgtt agagtctttt acaccatttg tctccacacc 240
tccgcttaca tcaacaccaa taacgccatt taatctaagc gcatcaccaa cattttctgg 300
cgtcagtcca ccagctaaca taaaatgtaa gctttcgggg ctctcttgcc ttccaaccca 360
gtcagaaatc gagttccaat ccaaaagttc acctgtccca cctgcttctg aatcaaacaa 420
gggaataaac gaatgaggtt tctgtgaagc tgcactgagt agtatgttgc agtcttttgg 480
aaatacgagt cttttaataa ctggcaaacc gaggaactct tggtattctt gccacgactc 540
atctccatgc agttggacga tatcaatgcc gtaatcattg accagagcca aaacatcctc 600
cttaagttga ttacgaaaca cgccaaccaa gtatttcgga gtgcctgaac tatttttata 660
tgcttttaca agacttgaaa ttttccttgc aataaccggg tcaattgttc tctttctatt 720
gggcacacat ataataccca gcaagtcagc atcggaatct agagcacatt ctgcggcctc 780
tgtgctctgc aagccgcaaa ctttcaccaa tggaccagaa ctacctgtga aattaataac 840
agacatactc caagctgcct ttgtgtgctt aatcacgtat actcacgtgc tcaatagtca 900
ccaatgccct ccctcttggc cctctccttt tcttttttcg accgaattaa ttcttaatcg 960
gcaaaaaaag aaaagctccg gatcaagatt gtacgtaagg tgacaagcta tttttcaata 1020
aagaatatct tccactactg ccatctggcg tcataactgc aaagtacaca tatattacga 1080
tgctgttcta ttaaatgctt cctatattat atatatagta atgtcgtgat ctatggtgca 1140
ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 1200
ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 1260
ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 1320
gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 1380
agacggatcg cttgcctgta acttacacgc gcctcgtatc ttttaatgat ggaataattt 1440
gggaatttac tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat 1500
aaagaaggta gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt 1560
caacaaaaag cgtactttac atatatattt attagacaag aaaagcagat taaatagata 1620
tacattcgat taacgataag taaaatgtaa aatcacagga ttttcgtgtg tggtcttcta 1680
cacagacaag gtgaaacaat tcggcattaa tacctgagag caggaagagc aagataaaag 1740
gtagtatttg ttggcgatcc ccctagagtc ttttacatct tcggaaaaca aaaactattt 1800
tttctttaat ttcttttttt actttctatt tttaatttat atatttatat taaaaaattt 1860
aaattataat tatttttata gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcact tttcggggaa 1920
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 1980
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 2040
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 2100
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggacgc gtagtctaga 2160
ccagccagga cagaaatgcc tcgacttcgc tgctacccaa ggttgccggg tgacgcacac 2220
cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt ggacataagc ctgttcggtt cgtaagctgt 2280
aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg 2340
gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt gttatgactg tttttttggg gtacagtcta 2400
tgcctcgggc atccaagcag caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga 2460
gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaaac attatgaggg 2520
aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgcc atcgagcgcc 2580
atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga 2640
agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc 2700
ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag agcgagattc 2760
tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg cgttatccag 2820
ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg 2880
agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg 2940
ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat 3000
ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg 3060
agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg 3120
cgccgaagga tgtcgctgcc ggctgggcaa tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg 3180
tcatacttga agctagacag gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg gcctcgcgcg 3240
cagatcagtt ggaagaattt gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag gtagtcggca 3300
aataaccctc gagcattcaa ggcgccttga ttatttgacg tggtttgatg gcctccacgc 3360
acgttgtgat atgtagatga ttcagttcga gtttatcatt atcaatactg ccatttcaaa 3420
gaatacgtaa ataattaata gtagtgattt tcctaacttt atttagtcaa aaaattagcc 3480
ttttaattct gctgtaaccc gtacatgccc aaaatagggg gcgggttaca cagaatatat 3540
aacatcgtag gtgtctgggt gaacagttta ttcctggcat ccactaaata taatggagcc 3600
cgctttttaa gctggcatcc agaaaaaaaa agaatcccag caccaaaata ttgttttctt 3660
caccaaccat cagttcatag gtccattctc ttagcgcaac tacagagaac aggggcacaa 3720
acaggcaaaa aacgggcaca acctcaatgg agtgatgcaa cctgcctgga gtaaatgatg 3780
acacaaggca attgacccac gcatgtatct atctcatttt cttacacctt ctattacctt 3840
ctgctctctc tgatttggaa aaagctgaaa aaaaaggttg aaaccagttc cctgaaatta 3900
ttcccctact tgactaataa gtatataaag acggtaggta ttgattgtaa ttctgtaaat 3960
ctatttctta aacttcttaa attctacttt tatagttagt ctttttttta gttttaaaac 4020
accaagaact tagtttcgaa taaacacaca taaacaaaca aaatggaact tcagtacttc 4080
tcctattttc aacccacttc atctgtcgta gccctactac tagcactagt gagtatttta 4140
tttagcgtag ttgttttgag gaagactttc agtaacaatt actccagccc cgcgtcaagt 4200
acggaaaccg ctgtgctgtg tcatcagagg caacagagtt gcgccctacc tatcagcggc 4260
cttcttcacg tgttcatgaa taagaacggc ctgattcatg tcaccttggg aaatatggct 4320
gacaaatatg gccctatctt cagttttccg acaggcagcc accgtacttt agtagtcagt 4380
tcctgggaaa tggtgaaaga gtgtttcacc ggtaataacg acacggcatt ctccaacaga 4440
ccaatccctt tggcttttca aaccatattc tacgcctgtg gcggcattga ttcttacggt 4500
ttaagtagtg tcccgtatgg taaatactgg agggagttga gaaaggtgtg tgttcacaac 4560
ctgctgagta atcagcaatt gctgaagttc agacatctta taatctccca agtggatacg 4620
tcttttaaca agttgtatga gctgtgtaag aactctgaag ataatcaagg tatggtaagg 4680
atggatgatt ggctagctca actttccttt aacgtcatcg gtaggatcgt ttgcggattc 4740
cagtctgacc caaagacggg tgcaccttca agggtagaac agtttaagga agtcataaat 4800
gaggcgtcat attttatgtc aacaagtcca gtctccgata acgtaccaat gttgggatgg 4860
atcgaccaat tgaccggtct gacgaggaac atgaagcatt gtgggaagaa gcttgactta 4920
gtagtggagt caattatcaa ggaccatagg caaaagagac gtttttcacg tacaaaaggt 4980
ggcgatgaga aggatgacga acaggacgac tttattgata tttgcttgag catcatggag 5040
cagccacagt tgcccgggaa caattctccc cctcaaattc cgatcaaatc tatcgtgcta 5100
gacatgattg ggggtggtac cgacactacg aaacttacaa ccatatggac cctatcactt 5160
ttgttgaaca atcctcacgt gttagataaa gctaaacaag aggtcgacgc tcactttcgt 5220
aaaaagagaa gatcaacaga tgacgcagca gcggcagtcg ttgattttga cgacataaga 5280
aatttagtat acatccaagc catcattaaa gaaagtatga ggctttatcc agccagcccg 5340
gtggttgagc gtctttccgg cgaggattgc gttgttggag gttttcacgt gcctgctggt 5400
acgagactat gggctaacgt ttggaagatg caaagagatc ccaaagtttg ggacgatcct 5460
ctagtattca gacctgaaag gtttttgagc gacgagcaaa agatggtaga cgttcgtggc 5520
caaaactatg aacttctgcc attcggcgca ggaagaagaa tctgtccagg cgtttccttt 5580
agtcttgacc ttatgcaact tgtcctaacc aggttaatcc tagagttcga aatgaagtcc 5640
ccgtccggca aggtagatat gaccgcaact ccaggactaa tgtcttacaa ggtggttcca 5700
ttggacatat tgctgactca ccgtcgtatc aagtcatgcg ttcaattggc gtcttctgaa 5760
cgtgattaag cgaatttctt atgatttatg atttttatta ttaaataagt tataaaaaaa 5820
ataagtgtat acaaatttta aagtgactct taggttttaa aacgaaaatt cttattcttg 5880
agtaactctt tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtag agcgttggtt ggtggatcaa 5940
gcccacgcgt aggcaatcct cgagcagatc cgccaggcgt gtatatatag cgtggatggc 6000
caggcaactt tagtgctgac acatacaggc atatatatat gtgtgcgaca acacatgatc 6060
atatggcatg catgtgctct gtatgtatat aaaactcttg ttttcttctt ttctctaaat 6120
attctttcct tatacattag gacctttgca gcataaatta ctatacttct atagacacac 6180
aaacacaaat acacacacta aattaataat ggaaagttct ggggtgcctg tgatcacatt 6240
gtcctcaggt aaagtaatgc ccgtactggg catgggaacc ttcgaaaagg tgggtaaggg 6300
gtctgaacgt gagcgtttag ccattcttaa agcgatcgaa gttggttacc gttactttga 6360
taccgcagcg gcatatgaaa cggaagaagt tctaggggaa gccattgctg aagctttaca 6420
attgggtctg atagagagcc gtgacgagct gttcatcagc tcaatgcttt ggtgcaccga 6480
cgcacatcca gaccgtgtgc tacttgctct gcaaaacagt ctgagaaatc taaaacttga 6540
atatctagac ctatatatgt tgccgtttcc tgccagcctt aagccgggca aaattacgat 6600
ggatattcct gaggaggata tttgccgtat ggattatcgt tcagtctgga gcgccatgga 6660
agagtgtcaa aacttaggat ttactaaaag tattggtgta agcaactttt cttgcaagaa 6720
attacaagaa ttaatggcca ctgcaaatat cccgcccgcg gtaaatcaag tagagatgtc 6780
accagctttc caacagaaaa aactgaggga atattgtaac gcaaacaaca tattggtatc 6840
cgcagtaagc attctgggat caaacgggac gccctggggt agtaatgctg ttcttggaag 6900
cgaagttttg aaacagatcg cgatggcgaa aggcaaaagc gttgcgcaag tcagtatgag 6960
gtgggtctat gagcagggcg cgtctttagt agtcaagagt ttctctgaag aacgtttaag 7020
agaaaacctg aatatttttg actgggagct tacgaaagaa gacaatgaga agataggcga 7080
aatcccgcaa tgtagaatcc ttactgcgta cttccttgtc tccccgaacg gcccgtttaa 7140
atctcaggaa gagctttggg atgacaaggc ataaacaggc cccttttcct ttgtcgatat 7200
catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctcct cccacatccg ctctaaccga 7260
aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tatttttttt aatagttatg 7320
ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta caaacgcgtg 7380
tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 7440
ttaatttgta atcattatca ctttacgggt cctttccggt gatccgacag gttacggggc 7500
ggcgacctcg cgggttttcg ctatttatga aaattttccg gtttaaggcg tttccgttct 7560
tcttcgtcat aacttaatgt ttttatttaa aatacctcgc gagtggcaac actgaaaata 7620
cccatggagc ggcgtaaccg tcgcacagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 7680
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 7740
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 7800
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 7860
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 7920
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 7980
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 8040
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 8100
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 8160
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 8220
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 8280
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 8340
aaaacgccag caacgcggca gtggaacgtg cattatgaat tagttacgct agggataaca 8400
gggtaatata gaacccgaac gaccgagcgc agcggcggcc gcgctgatac cgccgc 8456

<210> 30
<211> 153
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 30
Met Ala Pro Arg Gly Val Ser Gly Leu Val Gly Lys Leu Ser Thr Glu
1 5 10 15
Leu Asp Val Asn Cys Asp Ala Glu Lys Tyr Tyr Asn Met Tyr Lys Asn
20 25 30
Gly Glu Asp Val Gln Lys Ala Val Pro His Leu Cys Met Asp Val Lys
35 40 45
Val Ile Ser Gly Asp Ala Thr Arg Ser Gly Cys Ile Lys Glu Trp Asn
50 55 60
Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser Val Glu Glu Thr Thr His
65 70 75 80
Asn Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg Val Phe Glu Gly Asp Met
85 90 95
Met Lys Asp Tyr Lys Lys Phe Asp Thr Ile Met Glu Val Asn Pro Lys
100 105 110
Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg Ser Ile Glu Tyr Glu Lys
115 120 125
Val Asn Glu Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp Tyr Leu Gln Phe Gly His
130 135 140
Gln Ala Met Glu Asp Met Asn Lys Tyr
145 150

<210> 31
<211> 144
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 31
Met Leu Val Gly Lys Leu Ser Thr Glu Leu Glu Val Asp Cys Asp Ala
1 5 10 15
Glu Lys Tyr Tyr Asn Met Tyr Lys His Gly Glu Asp Val Lys Lys Ala
20 25 30
Leu Cys Val Asp Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Pro Thr Arg Ser Gly
35 40 45
Cys Ile Lys Glu Trp Asn Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser
50 55 60
Val Glu Glu Thr Thr His Asn Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg
65 70 75 80
Val Phe Glu Gly Asp Met Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe Asp Thr Ile
85 90 95
Met Val Val Asn Pro Lys Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg
100 105 110
Ser Ile Glu Tyr Glu Lys Thr Asn Glu Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp
115 120 125
Tyr Leu Gln Phe Gly His Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn Lys Tyr Leu
130 135 140

<210> 32
<211> 141
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 32
Met Leu Val Gly Lys Leu Ser Thr Glu Leu Glu Val Asp Cys Asp Ala
1 5 10 15
Glu Lys Tyr Tyr Asn Met Tyr Lys His Gly Glu Asp Lys Arg Gln Cys
20 25 30
Val Asp Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Pro Thr Arg Ser Gly Cys Ile
35 40 45
Lys Glu Trp Asn Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser Val Glu
50 55 60
Glu Thr Thr His Asn Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg Val Phe
65 70 75 80
Glu Gly Asp Met Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe Asp Thr Ile Met Val
85 90 95
Val Asn Pro Lys Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg Ser Ile
100 105 110
Glu Tyr Glu Lys Thr Asn Glu Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp Tyr Leu
115 120 125
Gln Phe Gly His Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn Lys Tyr
130 135 140

<210> 33
<211> 147
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 33
Met Leu Val Gly Lys Leu Ser Thr Glu Leu Glu Val Asp Cys Asp Ala
1 5 10 15
Glu Lys Tyr Tyr Asn Met Tyr Lys His Gly Glu Asp Val Lys Lys Ala
20 25 30
Val Pro His Leu Cys Val Asp Val Lys Ile Ile Ser Gly Asp Pro Thr
35 40 45
Ser Ser Gly Cys Ile Lys Glu Trp Asn Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr
50 55 60
Ile Arg Ser Val Glu Glu Thr Thr His Asp Asp Glu Thr Lys Thr Leu
65 70 75 80
Arg His Arg Val Phe Glu Gly Asp Val Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe
85 90 95
Asp Thr Ile Met Val Val Asn Pro Lys Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val
100 105 110
Val Thr Arg Ser Ile Glu Tyr Glu Lys Thr Asn Glu Asn Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Phe Asp Tyr Leu Gln Phe Gly His Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn
130 135 140
Lys Tyr Leu
145

<210> 34
<211> 109
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 34
Met Val Lys Ile Ile Ser Gly Asp Pro Thr Ser Ser Gly Cys Ile Lys
1 5 10 15
Glu Trp Asn Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser Val Glu Glu
20 25 30
Thr Thr His Asp Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg Val Phe Glu
35 40 45
Gly Asp Val Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe Asp Thr Ile Met Val Val
50 55 60
Asn Pro Lys Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg Ser Ile Glu
65 70 75 80
Tyr Glu Lys Thr Asn Glu Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp Tyr Leu Gln
85 90 95
Phe Gly His Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn Lys Tyr Leu
100 105

<210> 35
<211> 180
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 35
Met Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Tyr Phe Arg Glu
1 5 10 15
Leu Ile Ile Lys Leu Leu Met Ala Pro Pro Gly Val Ser Gly Leu Val
20 25 30
Gly Lys Leu Ser Thr Glu Leu Glu Val Asn Cys Asp Ala Glu Lys Tyr
35 40 45
Tyr Asn Met Tyr Lys His Gly Glu Asp Val Gln Lys Ala Val Pro His
50 55 60
Leu Cys Val Asp Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Pro Thr Arg Ser Gly
65 70 75 80
Cys Ile Lys Glu Trp Asn Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser
85 90 95
Val Glu Glu Thr Thr His Asn Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg
100 105 110
Val Phe Glu Gly Asp Val Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe Asp Thr Ile
115 120 125
Met Val Val Asn Pro Lys Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg
130 135 140
Ser Ile Glu Tyr Glu Lys Thr Asn Asp Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp
145 150 155 160
Tyr Leu Gln Phe Gly His Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn Lys Tyr Leu
165 170 175
Arg Asp Ser Glu
180

<210> 36
<211> 164
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 36
Met Asn Phe Phe Ile Lys Asp His Leu Tyr Ile Cys Leu Val Gly Lys
1 5 10 15
Leu Ser Thr Glu Leu Glu Val Asp Cys Asp Ala Glu Lys Tyr Tyr Asn
20 25 30
Met Tyr Lys His Gly Glu Asp Val Lys Lys Ala Val Pro His Leu Cys
35 40 45
Val Asp Val Lys Ile Ile Ser Gly Asp Pro Thr Ser Ser Gly Cys Ile
50 55 60
Lys Glu Trp Asn Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser Val Glu
65 70 75 80
Glu Thr Thr His Asp Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg Val Phe
85 90 95
Glu Gly Asp Val Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe Asp Thr Ile Met Val
100 105 110
Val Asn Pro Lys Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg Ser Ile
115 120 125
Glu Tyr Glu Lys Thr Asn Glu Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp Tyr Leu
130 135 140
Gln Phe Gly His Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn Lys Tyr Leu Arg Asp
145 150 155 160
Ser Glu Ser Asn

<210> 37
<211> 160
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 37
Met Ala Pro Leu Gly Val Ser Gly Leu Val Gly Lys Leu Ser Thr Glu
1 5 10 15
Leu Glu Val Asp Cys Asp Ala Glu Lys Tyr Tyr Asn Met Tyr Lys His
20 25 30
Gly Glu Asp Val Lys Lys Ala Val Pro His Leu Cys Val Asp Val Lys
35 40 45
Ile Ile Ser Gly Asp Pro Thr Ser Ser Gly Cys Ile Lys Glu Trp Asn
50 55 60
Val Asn Ile Asp Gly Lys Thr Ile Arg Ser Val Glu Glu Thr Thr His
65 70 75 80
Asp Asp Glu Thr Lys Thr Leu Arg His Arg Val Phe Glu Gly Asp Val
85 90 95
Met Lys Asp Phe Lys Lys Phe Asp Thr Ile Met Val Val Asn Pro Lys
100 105 110
Pro Asp Gly Asn Gly Cys Val Val Thr Arg Ser Ile Glu Tyr Glu Lys
115 120 125
Thr Asn Glu Asn Ser Pro Thr Pro Phe Asp Tyr Leu Gln Phe Gly His
130 135 140
Gln Ala Ile Glu Asp Met Asn Lys Tyr Leu Arg Asp Ser Glu Ser Asn
145 150 155 160

<210> 38
<211> 400
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 38
Met Met Lys Val Cys Val Ser Ser Arg Glu Lys Ile Lys Pro Ser Arg
1 5 10 15
Pro Thr Pro Gly His Leu Lys Thr His Lys Leu Ser Phe Leu Asp Gln
20 25 30
Val Ala Ala Arg Ile Tyr Val Pro Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gly Asn
35 40 45
Lys Glu Asn Val Asp Thr Asp Thr Arg Cys Asn Ile Ile Lys Lys Ser
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Leu Thr Lys Phe Tyr Ile Leu Ala Gly Lys Ile Val
65 70 75 80
Asn Asp Glu Ile Glu Arg Phe Val Asn Cys Asn Asp Asp Gly Val Asp
85 90 95
Phe Cys Val Thr Lys Val Ser Asn Cys Gln Leu Phe Gln Val Ile Lys
100 105 110
Arg Pro Asp Ile Phe Asp Gln Val Thr Leu Phe Leu Pro Phe Asp Pro
115 120 125
Cys Asp Asn Glu Ile Thr Ala Ser Gly Asp Phe Leu Leu Ser Val Gln
130 135 140
Val Asn Val Phe Glu Asp Cys Arg Gly Met Val Ile Gly Leu Cys Ile
145 150 155 160
Asn His Lys Val Ala Asp Ala Ser Ser Ile Thr Thr Phe Val Asn Tyr
165 170 175
Trp Ala Thr Ile Ala Arg Gly Leu Val Leu Asn Val Asp Asp Arg Gln
180 185 190
Ile Gln Asp Pro Cys Phe Gln Val Gln Ser Ile Phe Pro Gln Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Ile Gly Phe Lys Ile Ser Ser Ser Ser Ile Asp Gly Thr Leu
210 215 220
Val Thr Lys Lys Phe Gly Phe Glu Ala Ser Lys Leu Ala Glu Leu Lys
225 230 235 240
Glu Arg Cys Lys Phe Ala Gly Ala Thr Glu Asp Ile Arg Gly Gly Tyr
245 250 255
Lys Pro Asn Arg Val Glu Ala Leu Ser Thr Phe Leu Trp Lys Cys Phe
260 265 270
Ile Asp Ile Asp Gln Ala Lys Thr Lys Ala Ala Ala Pro Ala Arg Val
275 280 285
Tyr Leu Ala Ser Asn Ala Val Asn Ile Arg Ser Arg Ile Val Pro Gln
290 295 300
Leu Pro Thr Ser Ser Phe Gly Asn Met Val Ala Ile Thr Asp Ala Ile
305 310 315 320
Phe Thr Val Asn Ser Asn Glu Asn Asn Gly Ile Asn Asp Pro Tyr Tyr
325 330 335
Pro Lys Leu Val Gln Lys Phe Arg Asp Ala Val Lys Arg Val Asp Gly
340 345 350
Glu Tyr Ile Glu Ala Leu Gln Ser Thr Asp Leu Leu Leu Asn Asn Val
355 360 365
Thr Lys Leu Phe Lys His Ile Leu Asn Gly Gln Thr Leu Ser Ile Ser
370 375 380
Phe Thr Ser Trp Cys Arg Phe Pro Phe Tyr Asp Thr Asp Leu Leu Asp
385 390 395 400

<210> 39
<211> 386
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 39
Met Lys Val Gln Val Ile Ser Lys Glu Leu Ile Lys Pro Ser Thr Pro
1 5 10 15
Thr Pro Pro Arg Leu Arg Asn Phe Lys Leu Ser Leu Leu Asp Gln Leu
20 25 30
Leu Pro Pro Phe Tyr Val Pro Ile Ile Ile Phe Tyr Pro Ala Asn Asp
35 40 45
Asp His Glu Ser Asn Asn Asn Asp Gln Cys Ile Lys Ala Asn Ile Leu
50 55 60
Lys Lys Ser Leu Ser Glu Thr Leu Thr Arg Phe Tyr Pro Ile Ala Gly
65 70 75 80
Arg Ile Arg Asp Lys Ile Leu Val Glu Cys Asn Asp Glu Gly Val His
85 90 95
Tyr Ile Glu Ala Lys Val Asn Ala Val Met Ser Asp Phe Met Ser Leu
100 105 110
Asp Val Ile His Gln Leu His Pro Ser Tyr Ile Thr Leu Asp Asp Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Ala Gln Leu Ala Val Gln Val Thr Met Phe Asp Cys Gly
130 135 140
Gly Ile Ala Leu Ser Ile Cys Ser Ser His Lys Ile Ile Asp Gly Cys
145 150 155 160
Thr Ser Thr Thr Phe Leu Asn Ser Trp Ala Ala Thr Ala Arg Ala Pro
165 170 175
Ser Asn Pro Glu Ile Val Tyr Pro Thr Phe Asp Ala Ala Ala Ile Phe
180 185 190
Pro Ala Gln Pro Ser Gly Val Gln Val Ser Thr Leu Glu Ser Asp Asp
195 200 205
Arg Leu Gln Gly Glu Asn Val Val Thr Lys Arg Phe Leu Phe Ser Ala
210 215 220
Ser Lys Ile Thr Ala Leu Arg Ala Arg Ile Ala Glu Ser Arg Ser Ser
225 230 235 240
Asn Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Ser Arg Ser Glu Ala Val Ser Ala Leu
245 250 255
Val Trp Lys Ser Phe Met Glu Thr Ser Arg Val Lys Val Thr Arg Glu
260 265 270
His Thr Phe Ser Ala Glu Ala Ser Thr Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile
275 280 285
Ala Asn Phe Val Val Asn Leu Arg Thr Arg Leu Asn Pro Pro Leu Pro
290 295 300
Asn Val Ser Phe Gly Asn Ile Ile Met Asp Ala Thr Ala Glu Ser Leu
305 310 315 320
Ile Ile Asp Asn Gly Glu Asn Thr Leu Gly Phe Val Glu Thr Leu Asp
325 330 335
Gly Leu Ile Ser Gln Leu Arg Leu Gly Val Thr Lys Met Asp Asp Glu
340 345 350
Tyr Val Arg Lys Leu Arg Glu Asp Asp Val Glu Phe Leu Lys Ser Leu
355 360 365
Asp Glu Ala Ser His Pro Ser Asn Gly Glu Gly Asp Gly Asn Gly Glu
370 375 380
Arg Val
385

<210> 40
<211> 525
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 40
Met Asn Asp Thr Met Lys Ile Glu Val Val Ser Lys Glu Ser Ile Lys
1 5 10 15
Pro Ser Tyr Pro Thr Pro Asn Asn Leu Lys Ile His Asn Leu Ser Asn
20 25 30
Leu Asp Gln Leu Ile Pro Ala Phe Tyr Met Asp His Ile Leu Tyr Tyr
35 40 45
Pro Ser Leu Asp Ser Asn Asp Ser Ser Leu Gly Asp Asp Glu Glu Asp
50 55 60
Lys Lys Met Ile Phe Ser Ala Ser Ser Arg His Arg Cys Asp Val Val
65 70 75 80
Lys Lys Ser Leu Ala Glu Thr Leu Thr Arg Tyr Tyr Pro Leu Ala Gly
85 90 95
Arg Ile Lys Asp Glu Lys Ser Val Glu Cys Asn Asp Glu Gly Val Asp
100 105 110
Tyr Ile Glu Ala Arg Val Val Gly Ile Thr Val Ser Gln Val Ile Gln
115 120 125
Leu Ala Ser Ser Asp Ile Glu Val Met Glu Pro Phe Leu Pro Tyr Glu
130 135 140
Pro Tyr Gly Gly Thr Gly Ser Ala Phe Arg Arg Ala Gly Ile His Ser
145 150 155 160
Asn Ser Lys Pro Leu Leu Lys Ile Gln Val Asn Val Phe Asp Cys Gly
165 170 175
Gly Met Val Ile Cys Leu Ser Gly Ser His Lys Val Ile Asp Ala Thr
180 185 190
Ser Ile Leu Asn Phe Val Asn Asp Trp Ala Ala Thr Ala Arg Gly Gly
195 200 205
Phe Asp Thr His Asp Asp Glu Leu Lys Val Ala Val Val Asp Lys Pro
210 215 220
Cys Tyr Ile Phe Ser Ser Met Phe Pro Pro Thr Ser Phe Gly Asn Gln
225 230 235 240
Glu Glu Lys Asp Thr Ala Asp Gln Ala Gln Leu Val Pro Asp Arg Ile
245 250 255
Glu Ile Val Thr Lys Arg Phe Val Phe Lys Asp Ser Ser Ile Ala Lys
260 265 270
Leu Lys Lys Lys Cys Ile His Val Asn Thr Asn Asn Gly Ser Asp His
275 280 285
Gln Val Asp Lys Gln Glu His Asn Met Gln Gln Met Pro Ser Arg Ile
290 295 300
Glu Ala Leu Thr Ser Leu Ile Trp Met Cys Phe Met Asp Val Asp Arg
305 310 315 320
Arg Phe Arg Val Lys Gln Ile Asp Asp Ala Val Ser Pro Val Asn Thr
325 330 335
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340 345 350
Ala Ile Asn Leu Arg Thr Arg Thr Ile Gln Pro Leu Pro Thr Asn Ser
355 360 365
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370 375 380
Thr Gly Ser Asp His Phe Asn Asn Glu Lys Gly Ile Arg Asp Gln Ser
385 390 395 400
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405 410 415
Val Asp Asn Lys His Ile Glu Ala Met Lys Arg Asn Leu Ala Ile Ser
420 425 430
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435 440 445
Gln Asn Thr Arg Glu Leu Leu Met Phe Ser Ser Trp Cys Arg Phe Pro
450 455 460
Ile Tyr Glu Ala Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Ser Trp Ala Ser Ile
465 470 475 480
Thr Lys Leu Leu Tyr Lys Asn Cys Val Met Phe Leu Asp Thr Ser Ser
485 490 495
Gly Asp Gly Ile Glu Ala Trp Val Ser Leu Lys Glu Glu Asp Met Val
500 505 510
Glu Phe Glu Arg His Glu Glu Leu Val Ala Leu Ala Ser
515 520 525

<210> 41
<211> 459
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 41
Met Lys Val Gln Val Ile Ser Lys Glu Ile Ile Lys Pro Ser Ser Pro
1 5 10 15
Thr Pro Pro His Leu Arg Asn Phe Lys Leu Ser Leu Leu Asp Gln Ile
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Leu Pro Pro Phe Tyr Val Pro Ile Val Met Phe Tyr Pro Ala Gly Asp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Gly Arg Ile Lys Asp Asn Ile Leu Ile Asp Cys Asn Asn Glu Gly
85 90 95
Val Asp Tyr Ile Glu Ala Lys Val Asn Gly Ile Met Ser Asp Phe Met
100 105 110
Ser Val Asp Val Val His Gln Leu His Pro Ser His Ile Met Leu Asp
115 120 125
Asp Val Ala Lys Glu Ala Gln Leu Ala Val Gln Val Asn Leu Phe Asp
130 135 140
Cys Gly Gly Ile Ala Ile Ser Ile Ser Met Ser His Lys Ile Val Asp
145 150 155 160
Ala Cys Thr Ala Ile Thr Phe Ile Asn Gly Trp Ala Ala Thr Ala Arg
165 170 175
Ala Ala Pro Lys Gln Glu Ile Val Cys Pro Thr Phe Asp Ser Ala Ala
180 185 190
Ile Phe Pro Ala Leu Pro Pro Gly Val Gln Val Ser Ser Leu Glu Ser
195 200 205
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210 215 220
Thr Ala Pro Lys Ile Ala Ser Leu Arg Ala Arg Ile Ala Glu Leu Arg
225 230 235 240
Ser Ser Ser Asp Gly Leu Ser Lys Tyr Pro Thr Arg Thr Glu Ala Leu
245 250 255
Ser Ala Leu Val Trp Lys Ser Phe Ile Arg Thr Ser Arg Val Lys Ala
260 265 270
Ala Arg Lys Tyr Ser Leu Ser Pro Ala Ser Thr Lys Pro Val Ile Lys
275 280 285
Ser Val Ala Asn Tyr Ala Val Asn Leu Arg Thr Arg Leu Asn Pro Pro
290 295 300
Leu Pro Gln Val Ser Phe Gly Asn Ile Leu Met Asp Ala Thr Ala Glu
305 310 315 320
Ser Thr Thr Thr Ile Asp Asp Asp Asp Ser His Glu Phe Ala Asp Thr
325 330 335
Leu Ala Gly Leu Ile Gly Gln Leu Arg Leu Gly Val Ser Arg Ile Asn
340 345 350
Gly Asp Tyr Ile Arg Lys Leu Gln Glu Gly Asp Leu Ala Phe Leu Lys
355 360 365
Ser Leu Asp Glu Ala Ser His Asp Ser Asn Gly Glu Lys Val Gln Ile
370 375 380
Cys Trp Ile Ser Ser Leu Cys Arg Phe Pro Phe Tyr Glu Ala Asp Phe
385 390 395 400
Gly Trp Gly Lys Pro Ser Trp Val Ala Leu Asn Thr Asn Ala Glu Tyr
405 410 415
Lys Asn Ser Leu Phe Leu Met Asp Thr Lys Cys Gly Thr Gly Ile Glu
420 425 430
Ala Trp Val Ser Leu Glu Glu Asp Asp Met Ala Ile Phe Glu Glu Asp
435 440 445
Gln Asp Leu Leu Gln Cys Val Lys Ser Ile Asn
450 455

<210> 42
<211> 477
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 42
Met Glu Asn Met Lys Val Glu Val Val Leu Lys Gln Thr Ile Lys Pro
1 5 10 15
Ser Thr Gln Thr Pro Leu His Ser Lys Thr Phe Asn Leu Ser Phe Leu
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35 40 45
Glu Ser Gly Asp Val Asn Asn Lys Asn Asn His Cys Asp Gly Tyr Lys
50 55 60
Asn Asn Leu Glu Glu Ala Cys Glu His Arg Val Ser Val Ile Lys Gln
65 70 75 80
Ser Leu Ser Glu Thr Leu Ala Arg Tyr Tyr Pro Leu Ala Gly Arg Met
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Lys Glu Asp Asn Leu Ala Val Glu Cys Asn Asp Glu Gly Val Glu Tyr
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Phe Glu Thr Arg Val Ser Asp Val Arg Leu Ser Gln Val Ile Lys Arg
115 120 125
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130 135 140
Ser Ser Cys Asp Asn Ser Met Ser Ile Pro Phe Asp Tyr Gly Phe Lys
145 150 155 160
Ser Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gln Val Asn Ile Phe Glu Cys Gly Gly
165 170 175
Ile Val Ile Gly Met Cys Met Ala His Arg Leu Ala Asp Ala Ser Thr
180 185 190
Met Phe Thr Phe Ile Thr Asp Trp Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ala Ile
195 200 205
Glu Asp Ile Lys Gly Pro Ser Phe Asp Phe Ser Tyr Thr Leu Phe Pro
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Gln Lys Asp Val Ile Asn Asn Phe Lys Pro Phe Asp Pro Met Leu Thr
225 230 235 240
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245 250 255
Ile Val Glu Leu Lys Arg Arg Asn Val Asn Asn Ile Val Cys Gln Asp
260 265 270
Thr Ser Gln Gln Asn Thr Ser Pro Cys Thr Arg Val Glu Ala Val Thr
275 280 285
Ser Phe Met Trp Lys Arg Tyr Met Asp Ser Val Arg Ala Lys Asn Gln
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Thr Gln Ala Thr Ser Val Glu Lys Tyr Gly Ala Leu Tyr Thr Val Asn
305 310 315 320
Leu Arg Ser Arg Ile Thr Pro Pro Leu Pro Ala Asn Ser Phe Gly Asn
325 330 335
Ile Tyr Thr Phe Thr Ile Ala Leu Ser Thr Pro Ser Asp Glu Asn Asp
340 345 350
Ile Asp Asp Gly Leu Arg Lys Asp Val Ser Ser Pro Asn Asp Leu Asn
355 360 365
Leu Val Gly Lys Val Arg Asp Ala Ile Lys Lys Ile Asp Asp Lys Tyr
370 375 380
Thr Arg Lys Leu Gln Ser Ser Glu Asp Glu Leu Val Asn Asp Val Lys
385 390 395 400
Pro Leu Thr Ser Gly Glu Ala Ile Phe Leu Gly Phe Ser Ser Trp Cys
405 410 415
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420 425 430
Val Ser Ile Gly Thr Met Ala Leu Arg Asn Thr Val Phe Leu Met Asp
435 440 445
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450 455 460
Asp Met Asp Asn Phe Glu Val Lys Leu Leu Ala Asp Gln
465 470 475

<210> 43
<211> 485
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 43
Met Glu Asn Met Lys Val Glu Val Val Leu Glu Gln Thr Ile Lys Pro
1 5 10 15
Ser Thr Gln Thr Pro Leu His Ser Lys Thr Phe Asn Leu Ser Phe Leu
20 25 30
Asp Gln His Leu Gly Pro Pro Ile Tyr Ile Pro Phe Thr Leu Tyr Tyr
35 40 45
Glu Ser Gly Asp Val Asn Asn Lys Asn Asn His Cys Asp Gly Tyr Lys
50 55 60
Asn Asn Leu Glu Glu Val Cys Glu His Arg Val Ser Val Ile Lys Gln
65 70 75 80
Ser Leu Ser Glu Thr Leu Ala Arg Tyr Tyr Pro Leu Ala Gly Arg Met
85 90 95
Lys Glu Asp Asn Leu Ala Val Glu Cys Asn Asp Glu Gly Val Glu Tyr
100 105 110
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115 120 125
Ser Pro Asn His Asn Ser Val Leu Arg Lys Phe Leu Pro Pro Cys Ile
130 135 140
Ser Ser Cys Asp Asn Ser Met Ser Ile Pro Phe Asp Tyr Gly Phe Lys
145 150 155 160
Ser Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gln Val Asn Ile Phe Glu Cys Gly Gly
165 170 175
Ile Val Ile Gly Met Cys Met Ala His Arg Leu Ala Asp Ala Ser Thr
180 185 190
Met Phe Thr Phe Ile Thr Asp Trp Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ala Ile
195 200 205
Glu Asp Ile Lys Gly Pro Ser Phe Asp Phe Ser Tyr Thr Leu Phe Pro
210 215 220
Gln Lys Asp Val Ile Asn Asn Phe Lys Pro Phe Asp Pro Met Leu Thr
225 230 235 240
Arg Glu Glu Asp Leu Val Thr Lys Tyr Phe Val Phe Pro Ala Ser Lys
245 250 255
Ile Val Glu Leu Lys Arg Arg Asn Val Asn Asn Ile Val Cys Gln Asp
260 265 270
Thr Ser Gln Gln Asn Thr Ser Pro Cys Thr Arg Val Glu Ala Val Thr
275 280 285
Ser Phe Met Trp Lys Arg Tyr Met Asp Ser Val Arg Ala Lys Asn Gln
290 295 300
Thr Gln Ala Thr Ser Val Glu Lys Tyr Gly Ala Leu Tyr Thr Val Asn
305 310 315 320
Leu Arg Ser Arg Ile Thr Pro Pro Leu Pro Ala Asn Ser Phe Gly Asn
325 330 335
Ile Tyr Thr Phe Thr Ile Ala Leu Ser Thr Pro Ser Asp Glu Asn Asp
340 345 350
Ile Asp Asp Gly Leu Arg Lys Asp Val Ser Ser Pro Asn Asp Leu Asn
355 360 365
Leu Val Gly Lys Val Arg Asp Ala Ile Lys Lys Ile Asp Asp Lys Tyr
370 375 380
Thr Arg Lys Leu Gln Ser Ser Glu Asp Glu Leu Val Asn Asp Val Lys
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Pro Leu Thr Ser Gly Glu Ala Ile Phe Leu Gly Phe Ser Ser Trp Cys
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420 425 430
Val Ser Ile Gly Thr Met Ala Leu Arg Asn Thr Val Phe Leu Met Asp
435 440 445
Thr Lys Ser Gly Asp Gly Ile Glu Ala Phe Val Asn Met Ala Lys Glu
450 455 460
Asp Met Asp Asn Phe Glu Val Lys Leu Leu Ala Asp Gln Leu Leu His
465 470 475 480
Val His Pro Thr Val
485

<210> 44
<211> 452
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 44
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Thr Pro Thr Pro Ile Gln Arg Lys Asn His Ser Leu Ser Leu Ile Asp
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Met Lys Pro Asp Glu Gln Leu Ser Gly Leu Leu Pro Ser Glu Ala Val
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275 280 285
Ser Val Ala Val Met Val Lys His Ala Val Asn Leu Arg Lys Arg Ile
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420 425 430
Leu Val Glu Glu Asp Met Ala Asn Phe Gln Leu Asn Leu Ser Glu Leu
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Leu Asp Arg Ile
450

<210> 45
<211> 451
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 45
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Val Asn Val Phe Glu Asp Cys Arg Gly Met Val Ile Gly Leu Cys Ile
145 150 155 160
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165 170 175
Trp Ala Thr Ile Ala Arg Gly Leu Val Leu Asn Val Asp Asp Arg Gln
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Lys Gly Ile Gly Phe Lys Ile Ser Ser Ser Ser Ile Asp Gly Thr Leu
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Val Thr Lys Lys Phe Gly Phe Glu Ala Ser Lys Leu Ala Glu Leu Lys
225 230 235 240
Glu Arg Cys Lys Phe Thr Thr Glu Pro Glu Asp Gly Tyr Lys Pro Thr
245 250 255
Arg Val Glu Ala Leu Ser Ala Phe Leu Trp Lys Cys Phe Ile Asp Ile
260 265 270
Asp Gln Ala Lys Leu Lys Gly Val Ala Arg Thr Lys Val Tyr Leu Ala
275 280 285
Thr Asn Ala Val Asn Met Arg Ser Arg Met Val Pro Gln Leu Pro Thr
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Asn Ile Ile Ser Ile Thr Asp Ala Val Phe Ser Ile
305 310 315 320
Asn Asn Asp Asp Ser Thr Gly Ile Asn Asp Pro Tyr Tyr Pro Lys Leu
325 330 335
Val Arg Lys Phe Arg Asp Ala Ile Lys Lys Ile Asp Arg Asp Tyr Ile
340 345 350
Glu Ala Leu Arg Ser Thr Asp Leu Leu Leu Asn Asn Met Met Lys Leu
355 360 365
Ile Glu His Val Leu Ser Gly His Thr Leu Ser Ile Tyr Phe Ser Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Ile Trp Val Ser Thr Cys Thr Ile Pro Gln Lys Asn Val Ile Val Leu
405 410 415
Met Asp Ser Asn Ser Ser Ala Asp Gly Ile Glu Ala Tyr Val Thr Leu
420 425 430
Ala Lys Glu Asp Met Gly Glu Leu Glu His His Glu Glu Leu Leu Ala
435 440 445
Leu Ile Ser
450

<210> 46
<211> 232
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 46
Met Gly Ala Met Lys Phe Phe Ser Phe Leu Ala Val Ala Met Val Leu
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Ser Leu Ala His Ile Gln Ala Gln Gln Gly Asn Trp Gly Asp Glu Thr
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180 185 190
Ser Gly Lys Ser Asn Ser Ser Pro Gly Lys Ser Asp Ser Asn Ser Gly
195 200 205
Ser Gln Ile Ser Leu Gly Ser Asn Leu Val Phe Val Ser Val Ile Ala
210 215 220
Tyr Val Thr Ile Ile Leu Ser Leu
225 230

<210> 47
<211> 224
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 47
Met Val Leu Ser Met Ser His Ser Gln Ala Gln Glu Gly Asn Trp Gly
1 5 10 15
Asp Glu Ser Val Pro Tyr Thr Met Gly Pro Glu Lys Met Thr Lys Leu
20 25 30
Arg Phe Tyr Phe His Asp Ile Ile Thr Gly Asn Ser Pro Thr Ala Val
35 40 45
Gln Ile Ala Gln Ala Thr Gly Thr Asn Thr Ser Ala Thr Met Phe Gly
50 55 60
Ala Leu Met Met Ile Asp Asp Pro Leu Thr Glu Gly Pro Asp Pro Asn
65 70 75 80
Ser Arg Leu Val Gly Arg Ala Gln Gly Phe Tyr Gly Ser Ala Gly Gln
85 90 95
Asn Glu Leu Ala Leu Ile Leu Gly Met Ser Leu Val Phe Thr Gly Asn
100 105 110
Glu Lys Phe Asn Gly Ser Thr Ile Ser Val Leu Ser Arg Asn Pro Val
115 120 125
Met His Thr Glu Arg Glu Phe Ala Ile Val Gly Gly Thr Gly Tyr Phe
130 135 140
Gln Phe Ala Arg Gly Phe Ile Ser Ala Lys Thr Tyr Ser Leu Val Gly
145 150 155 160
Pro Asn Ala Val Val Glu Tyr Asn Cys Thr Ile Val His Pro Ser Ser
165 170 175
Val Ser Glu Ser Gly Lys Ser Asp Ser Ser Ser Gly Lys Ser Asp Ser
180 185 190
Ser Ser Gly Ser Gln Ile Ser Leu Gly Thr Asn Leu Val Phe Leu Ser
195 200 205
Val Ile Ala Phe Val Thr Ile Ile Val Ser Pro Gln His Phe Ser Trp
210 215 220

<210> 48
<211> 210
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 48
Met Thr Lys Thr Val Leu Val Asp Asp Ile Pro Phe Pro Gln Asn Ile
1 5 10 15
Thr Thr Val Thr Thr Glu Lys Gln Leu Pro Leu Leu Gly Gln Gly Ile
20 25 30
Thr Asp Met Glu Ile His Phe Leu Gln Ile Lys Phe Thr Ala Ile Gly
35 40 45
Thr Ala Ile Gly Val Tyr Leu Glu Pro Glu Ile Ala Ser His Leu Gln
50 55 60
Gln Trp Lys Gly Lys Thr Gly Ala Glu Leu Ser Gln Asp Asp Glu Phe
65 70 75 80
Phe Ala Ala Val Val Ser Ala Ser Val Glu Lys Tyr Val Arg Val Val
85 90 95
Val Ile Lys Glu Ile Lys Gly Ser Gln Tyr Met Leu Gln Leu Glu Ser
100 105 110
Trp Val Arg Asp Glu Leu Ala Ala Ala Asp Lys Tyr Glu Asp Glu Glu
115 120 125
Glu Glu Ser Leu Asp Lys Val Ile Glu Phe Phe Gln Ser Lys Tyr Leu
130 135 140
Lys Gln Leu Ser Phe Ile Pro Ser His Phe Ser Ala Thr Thr Pro Ala
145 150 155 160
Val Ala Glu Ile Gly Leu Glu Ile Glu Gly Gln Lys Asp Leu Lys Ile
165 170 175
Lys Val Glu Asn Gly Asn Val Ile Glu Met Ile Gln Lys Trp Tyr Leu
180 185 190
Gly Gly Thr Arg Gly Val Ser Pro Ser Thr Thr Gln Ser Leu Ala Thr
195 200 205
Ser Leu
210

<210> 49
<211> 210
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 49
Met Pro Phe Leu Lys Ala Ile Glu Ile Glu Gly Cys Lys Phe Arg Pro
1 5 10 15
Phe Val Thr Pro Pro Gly Ser Thr Gln Ile Leu Phe Leu Ala Gly Ser
20 25 30
Gly Val Lys Glu Glu Phe Gly Asp Ser Lys Ser Met Lys Tyr Ser Ser
35 40 45
Cys Ala Ile Tyr Leu Gln Pro Thr Cys Ile Leu Tyr Leu Ala Lys Ala
50 55 60
Trp Ala Gln Lys Ser Val Val Asp Ile Thr Gln Ser Leu Asn Phe Phe
65 70 75 80
Met Asp Ile Ala Thr Gly Pro Phe Glu Lys Tyr Cys Arg Ile Thr Met
85 90 95
Leu Glu Thr Ala Lys Gly Glu Asp Tyr Ala Ala Met Ile Thr Lys Asn
100 105 110
Cys Glu Glu Met Leu Thr Asn Ser Lys Arg Tyr Ser Glu Thr Ala Lys
115 120 125
Ala Ala Leu Thr Lys Phe Ser Glu Ala Phe Asn Gly Arg Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Gly Ser Ser Ile His Val Thr Val Ser Thr Ser Asn Ser Val Thr
145 150 155 160
Leu Ala Phe Thr Glu Asp Gly Ser Thr Pro Lys Gln Gly Asp Val Thr
165 170 175
Leu Asp Cys Lys Glu Val Gly Glu Ala Phe Leu Met Ser Thr Ile Ser
180 185 190
Leu His Thr Thr Ile Arg Glu Ser Met Gly Ser Arg Ile Ser Gly Leu
195 200 205
Tyr Lys
210

<210> 50
<211> 166
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 50
Met Ala Pro Met Ala Gln Leu Ser Glu Ile Gln Val Glu Gln Phe Val
1 5 10 15
Phe Pro Pro Thr Met Thr Pro Pro Ser Ser Thr Glu Ser Leu Phe Leu
20 25 30
Gly Gly Ala Gly Val Arg Gly Leu Gln Ile Gln Asp Arg Phe Ile Lys
35 40 45
Phe Thr Ala Ile Gly Val Tyr Leu Ala Glu Glu Ala Ile Pro Ser Leu
50 55 60
Ser Pro Lys Trp Lys Ser Lys Ser Pro Glu Glu Leu Thr Asp Asp Val
65 70 75 80
Glu Phe Phe Met Asp Ile Val Thr Gly Pro Phe Glu Lys Phe Val Lys
85 90 95
Ile Thr Met Ile Leu Pro Leu Thr Gly Asp Gln Tyr Ala Glu Lys Val
100 105 110
Thr Glu Asn Cys Ile Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Asp Met Tyr Thr Asp
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Ala Val Glu Arg Phe Ile Glu Ile Phe Lys Asn Glu
130 135 140
Met Phe Pro Pro Ala Ser Ser Ile Leu Phe Thr Ile Ser Pro Ala Gly
145 150 155 160
Ser Leu Thr Val Gly Phe
165

<210> 51
<211> 160
<212> PRT
<213> Papaver rhoeas
<400> 51
Met Val Tyr Leu Glu Pro Glu Ile Ala Thr His Leu Lys Gln Trp Lys
1 5 10 15
Gly Lys Thr Gly Ala Glu Leu Ser Gln Asp Asp Asp Phe Phe Ser Ala
20 25 30
Val Val Ser Ala Pro Val Glu Lys Tyr Val Arg Val Val Val Ile Lys
35 40 45
Glu Ile Lys Gly Ser Gln Tyr Met Leu Gln Leu Glu Ser Trp Val Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Ala Ala Ala Asp Lys Tyr Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser
65 70 75 80
Leu Asp Lys Val Ile Glu Phe Phe Gln Ser Lys Tyr Leu Lys Gln His
85 90 95
Ser Val Ile Ile Thr Phe His Phe Ser Ala Thr Thr Pro Ala Val Ala
100 105 110
Glu Ile Gly Leu Glu Ile Glu Gly Gln Lys Asp Leu Lys Ile Lys Val
115 120 125
Glu Asn Gly Asn Val Val Glu Met Ile Gln Lys Trp Tyr Leu Gly Gly
130 135 140
Thr Arg Gly Val Ser Pro Ser Thr Thr Gln Ser Leu Ala Thr Ser Leu
145 150 155 160

<210> 52
<211> 206
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 52
Met Thr Lys Met Val Leu Val Asp Asp Ile Pro Phe Pro Gln Asn Ile
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Thr Ala Lys Gln Leu Pro Leu Leu Gly Gln Gly Ile
20 25 30
Thr Asp Met Glu Ile His Phe Leu Gln Ile Lys Phe Thr Ala Ile Gly
35 40 45
Val Tyr Leu Glu Pro Glu Ile Ala Ser His Leu Lys Gln Trp Lys Gly
50 55 60
Lys Thr Gly Ala Glu Leu Ser Gln Asp Asp Glu Phe Phe Ser Ala Ile
65 70 75 80
Val Ser Ala Pro Val Glu Lys Tyr Val Arg Val Val Val Ile Lys Glu
85 90 95
Ile Lys Gly Ser Gln Tyr Met Leu Gln Leu Glu Ser Trp Val Arg Asp
100 105 110
Glu Leu Ala Ala Ala Asp Lys Tyr Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Leu
115 120 125
Glu Lys Val Ile Glu Phe Phe Gln Ser Lys Tyr Leu Lys Gln His Ser
130 135 140
Val Ile Pro Phe His Phe Ser Ala Thr Thr Pro Ala Val Ala Glu Ile
145 150 155 160
Gly Leu Glu Ile Glu Gly His Lys Asp Leu Lys Met Lys Val Glu Asn
165 170 175
Gly Asn Val Val Glu Met Ile Gln Lys Trp Tyr Leu Ala Gly Thr Arg
180 185 190
Gly Val Ser Pro Ser Thr Thr Gln Ser Leu Ala Thr Ser Leu
195 200 205

<210> 53
<211> 216
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 53
Met Ala Pro Met Ala Gln Leu Ser Glu Ile Gln Val Glu Gln Phe Val
1 5 10 15
Phe Pro Pro Thr Met Thr Pro Pro Ser Ser Thr Glu Ser Leu Phe Leu
20 25 30
Gly Gly Ala Gly Val Arg Gly Leu Gln Ile Gln Asp Arg Phe Ile Lys
35 40 45
Phe Thr Ala Ile Gly Val Tyr Leu Ala Glu Glu Ala Ile Pro Ser Leu
50 55 60
Ser Pro Lys Trp Lys Ser Lys Thr Pro Glu Glu Leu Thr Asn Asp Val
65 70 75 80
Glu Phe Phe Met Asp Ile Val Thr Gly Pro Phe Glu Lys Phe Val Lys
85 90 95
Ile Thr Met Ile Leu Pro Leu Thr Gly Asp Gln Tyr Ala Glu Lys Val
100 105 110
Thr Glu Asn Cys Val Glu Tyr Leu Lys Ser Lys Asp Leu Tyr Thr Asp
115 120 125
Ala Glu Ala Lys Ala Val Glu Arg Phe Ile Glu Ile Phe Lys Asn Glu
130 135 140
Met Phe Pro Pro Ala Ser Ser Ile Leu Phe Thr Ile Ser Pro Thr Gly
145 150 155 160
Ser Leu Thr Val Gly Phe Ser Lys Asp Thr Ser Ile Pro Glu Ala Arg
165 170 175
Asn Ala Val Ile Glu Asn Lys Ala Leu Ser Glu Ser Ile Leu Glu Ser
180 185 190
Ile Ile Gly Lys Asn Gly Val Ser Pro Ala Ala Lys Gln Ser Leu Ala
195 200 205
Glu Arg Ile Ser Glu Leu Leu Lys
210 215

<210> 54
<211> 151
<212> PRT
<213> Panax ginseng
<400> 54
Met Gly Leu Thr Gly Lys Leu Ile Cys Gln Thr Gly Ile Lys Ser Asp
1 5 10 15
Gly Asp Val Phe His Glu Leu Phe Gly Thr Arg Pro His His Val Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Pro Ala Asn Ile Gln Gly Cys Asp Leu His Glu Gly Glu
35 40 45
Phe Gly Lys Val Gly Ser Val Val Ile Trp Asn Tyr Ser Ile Asp Gly
50 55 60
Asn Ala Met Ile Ala Lys Glu Glu Ile Val Ala Ile Asp Glu Glu Asp
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Phe Lys Val Val Glu Gly His Leu Phe Glu Glu Phe
85 90 95
Lys Ser Ile Val Phe Ser Val His Val Asp Thr Lys Gly Glu Asp Asn
100 105 110
Leu Val Thr Trp Ser Ile Asp Tyr Glu Lys Leu Asn Glu Ser Val Lys
115 120 125
Asp Pro Thr Ser Tyr Leu Asp Phe Leu Leu Ser Val Thr Arg Asp Ile
130 135 140
Glu Ala His His Leu Pro Lys
145 150

<210> 55
<211> 157
<212> PRT
<213> Arachis hypogaea
<400> 55
Met Gly Val Phe Thr Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ser Thr Val Pro Pro
1 5 10 15
Ala Lys Leu Tyr Asn Ala Met Lys Asp Ala Asp Ser Ile Thr Pro Lys
20 25 30
Ile Ile Asp Asp Val Lys Ser Val Glu Ile Val Glu Gly Asn Gly Gly
35 40 45
Pro Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Ile Val Glu Asp Gly Glu Thr Lys
50 55 60
Phe Ile Leu His Lys Val Glu Ser Ile Asp Glu Ala Asn Tyr Ala Tyr
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Val Val Gly Gly Val Ala Leu Pro Pro Thr Ala Glu Lys
85 90 95
Ile Thr Phe Glu Thr Lys Leu Val Glu Gly Pro Asn Gly Gly Ser Ile
100 105 110
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp Ala Lys Pro Asp
115 120 125
Glu Glu Glu Leu Lys Lys Gly Lys Ala Lys Gly Glu Gly Leu Phe Arg
130 135 140
Ala Ile Glu Gly Tyr Val Leu Ala Asn Pro Thr Gln Tyr
145 150 155

<210> 56
<211> 166
<212> PRT
<213> Hypericum perforatum
<400> 56
Met Gly Ile Asp Pro Phe Thr Met Ala Ala Tyr Thr Ile Val Lys Glu
1 5 10 15
Glu Glu Ser Pro Ile Ala Pro His Arg Leu Phe Lys Ala Leu Val Leu
20 25 30
Glu Arg His Gln Val Leu Val Lys Ala Gln Pro His Val Phe Lys Ser
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Glu Gly Asp Gly Gly Val Gly Thr Val Thr Lys Ile
50 55 60
Thr Phe Val Asp Gly His Pro Leu Thr Tyr Met Leu His Lys Phe Asp
65 70 75 80
Glu Ile Asp Ala Ala Asn Phe Tyr Cys Lys Tyr Thr Leu Phe Glu Gly
85 90 95
Asp Val Leu Arg Asp Asn Ile Glu Lys Val Val Tyr Glu Val Lys Leu
100 105 110
Glu Ala Val Gly Gly Gly Ser Lys Gly Lys Ile Thr Val Thr Tyr His
115 120 125
Pro Lys Pro Gly Cys Thr Val Asn Glu Glu Glu Val Lys Ile Gly Glu
130 135 140
Lys Lys Ala Tyr Glu Phe Tyr Lys Gln Val Glu Glu Tyr Leu Ala Ala
145 150 155 160
Asn Pro Glu Val Phe Ala
165

<210> 57
<211> 158
<212> PRT
<213> Lupinus luteus
<400> 57
Met Gly Val Phe Thr Phe Gln Asp Glu Tyr Thr Ser Thr Ile Ala Pro
1 5 10 15
Ala Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Val Thr Asp Ala Asp Ile Ile Ile Pro
20 25 30
Lys Ala Val Glu Thr Ile Gln Ser Val Glu Ile Val Glu Gly Asn Gly
35 40 45
Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Phe Ile Glu Gly Gly Glu Ser
50 55 60
Lys Tyr Val Leu His Lys Ile Glu Ala Ile Asp Glu Ala Asn Leu Gly
65 70 75 80
Tyr Asn Tyr Ser Ile Val Gly Gly Val Gly Leu Pro Asp Thr Ile Glu
85 90 95
Lys Ile Ser Phe Glu Thr Lys Leu Val Glu Gly Ala Asn Gly Gly Ser
100 105 110
Ile Gly Lys Val Thr Ile Lys Ile Glu Thr Lys Gly Asp Ala Gln Pro
115 120 125
Asn Glu Glu Glu Gly Lys Ala Ala Lys Ala Arg Gly Asp Ala Phe Phe
130 135 140
Lys Ala Ile Glu Ser Tyr Leu Ser Ala His Pro Asp Tyr Asn
145 150 155

<210> 58
<211> 161
<212> PRT
<213> Fragaria x ananassa
<400> 58
Met Ala Gly Val Phe Thr Tyr Glu Thr Glu Phe Thr Ser Val Ile Pro
1 5 10 15
Pro Pro Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Ala Asp Asn Leu Ile
20 25 30
Pro Lys Ile Ala Pro Gln Ala Val Lys Cys Ala Glu Ile Ile Glu Gly
35 40 45
Asp Gly Gly Val Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Gly Glu Gly Ser
50 55 60
Gln Phe Gly Ser Val Thr His Lys Ile Asp Gly Ile Asp Lys Glu Asn
65 70 75 80
Phe Val Tyr Ser Tyr Ser Leu Ile Glu Gly Asp Ala Leu Ser Asp Lys
85 90 95
Ile Glu Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Lys Leu Val Ser Ser Ser Asp Gly
100 105 110
Gly Ser Ile Ile Lys Ser Thr Ser Asn Tyr His Thr Lys Gly Asp Val
115 120 125
Glu Ile Lys Glu Glu His Val Lys Ala Gly Lys Glu Lys Phe Ser His
130 135 140
Leu Phe Lys Leu Val Glu Gly Tyr Leu Leu Ala Asn Pro Asn Glu Tyr
145 150 155 160
Cys

<210> 59
<211> 150
<212> PRT
<213> Actinidia deliciosa
<400> 59
Met Asp Leu Ser Gly Lys Met Val Lys Gln Val Glu Ile Leu Ser Asp
1 5 10 15
Gly Ile Val Phe Tyr Glu Ile Phe Arg Tyr Arg Leu Tyr Leu Ile Ser
20 25 30
Glu Met Ser Pro Val Asn Ile Gln Gly Val Asp Leu Leu Glu Gly Asn
35 40 45
Trp Gly Thr Val Gly Ser Val Ile Phe Phe Lys Tyr Thr Ile Asp Gly
50 55 60
Lys Glu Lys Thr Ala Lys Asp Ile Val Glu Ala Ile Asp Glu Glu Thr
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Phe Lys Ile Val Glu Gly Asp Leu Met Glu Leu Tyr
85 90 95
Lys Thr Phe Ile Ile Ile Val Gln Val Asp Thr Lys Gly Glu His Asn
100 105 110
Ser Val Thr Trp Thr Phe His Tyr Glu Lys Leu Lys Glu Asp Val Glu
115 120 125
Glu Pro Asn Thr Leu Met Asn Phe Cys Ile Glu Ile Thr Lys Asp Ile
130 135 140
Glu Thr Tyr His Leu Lys
145 150

<210> 60
<211> 164
<212> PRT
<213> Thalictrum flavum
<400> 60
Met Gly Ile Ile Asn Gln Val Ser Thr Val Thr Lys Val Ile His His
1 5 10 15
Glu Leu Glu Val Ala Ala Ser Ala Asp Asp Ile Trp Thr Val Tyr Ser
20 25 30
Trp Pro Gly Leu Ala Lys His Leu Pro Asp Leu Leu Pro Gly Ala Phe
35 40 45
Glu Lys Leu Glu Ile Ile Gly Asp Gly Gly Val Gly Thr Ile Leu Asp
50 55 60
Met Thr Phe Val Pro Gly Glu Phe Pro His Glu Tyr Lys Glu Lys Phe
65 70 75 80
Ile Leu Val Asp Asn Glu His Arg Leu Lys Lys Val Gln Met Ile Glu
85 90 95
Gly Gly Tyr Leu Asp Leu Gly Val Thr Tyr Tyr Met Asp Thr Ile His
100 105 110
Val Val Pro Thr Gly Lys Asp Ser Cys Val Ile Lys Ser Ser Thr Glu
115 120 125
Tyr His Val Lys Pro Glu Phe Val Lys Ile Val Glu Pro Leu Ile Thr
130 135 140
Thr Gly Pro Leu Ala Ala Met Ala Asp Ala Ile Ser Lys Leu Val Leu
145 150 155 160
Glu His Lys Ser

<210> 61
<211> 155
<212> PRT
<213> Vigna radiata
<400> 61
Met Val Lys Glu Phe Asn Thr Gln Thr Glu Leu Ser Val Arg Leu Glu
1 5 10 15
Ala Leu Trp Ala Val Leu Ser Lys Asp Phe Ile Thr Val Val Pro Lys
20 25 30
Val Leu Pro His Ile Val Lys Asp Val Gln Leu Ile Glu Gly Asp Gly
35 40 45
Gly Val Gly Thr Ile Leu Ile Phe Asn Phe Leu Pro Glu Val Ser Pro
50 55 60
Ser Tyr Gln Arg Glu Glu Ile Thr Glu Phe Asp Glu Ser Ser His Glu
65 70 75 80
Ile Gly Leu Gln Val Ile Glu Gly Gly Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Tyr Tyr Lys Thr Thr Phe Lys Leu Ser Glu Ile Glu Glu Asp Lys Thr
100 105 110
Leu Val Asn Val Lys Ile Ser Tyr Asp His Asp Ser Asp Ile Glu Glu
115 120 125
Lys Val Thr Pro Thr Lys Thr Ser Gln Ser Thr Leu Met Tyr Leu Arg
130 135 140
Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Ser Asn Gly Ser Ala
145 150 155

<210> 62
<211> 364
<212> PRT
<213> Papaver sp.
<400> 62
Met Glu Lys Ala Lys Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Met Glu Ile Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Val Cys Ala Asn Glu Asn Leu Leu Leu Pro Met Gly Ala Ser Val
35 40 45
Ile Asn Asp His Glu Thr Ile Pro Val Ile Asp Ile Glu Asn Leu Leu
50 55 60
Ser Pro Glu Pro Ile Ile Gly Lys Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Phe
65 70 75 80
Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp
85 90 95
Ala Ser Leu Val Asp Ser Val Lys Ser Glu Ile Gln Gly Phe Phe Asn
100 105 110
Leu Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys Tyr Glu Gln Glu Asp Gly Asp Val
115 120 125
Glu Gly Phe Gly Gln Gly Phe Ile Glu Ser Glu Asp Gln Thr Leu Asp
130 135 140
Trp Ala Asp Ile Phe Met Met Phe Thr Leu Pro Leu His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Pro His Leu Phe Ser Lys Leu Pro Val Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu
165 170 175
Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Asn Lys
180 185 190
Met Glu Lys Ala Leu Gln Val Gln Ala Ala Glu Ile Lys Gly Met Ser
195 200 205
Glu Val Phe Ile Asp Gly Thr Gln Ala Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Asn Leu Ala Ile Gly Leu Thr Ser His Ser Asp
225 230 235 240
Phe Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Ile Asn Glu Val Glu Gly Leu
245 250 255
Gln Ile Lys Arg Glu Gly Thr Trp Ile Ser Val Lys Pro Leu Pro Asn
260 265 270
Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly
275 280 285
Ile Tyr His Ser Val Asp His Arg Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Glu
290 295 300
Arg Leu Ser Ile Ala Thr Phe His Asp Pro Ser Leu Glu Ser Val Ile
305 310 315 320
Gly Pro Ile Ser Ser Leu Ile Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys
325 330 335
Ser Gly Ser Thr Tyr Gly Asp Leu Val Glu Glu Cys Lys Thr Arg Lys
340 345 350
Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Ser Met Arg Ile
355 360

<210> 63
<211> 360
<212> PRT
<213> Papaver sp.
<400> 63
Met Glu Thr Pro Ile Leu Ile Lys Leu Gly Asn Gly Leu Ser Ile Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Thr Cys Thr Gly Glu Ser Pro Leu Asn Asn Ile Gly Ala Ser Val
35 40 45
Thr Asp Asp Glu Thr Val Pro Val Ile Asp Leu Gln Asn Leu Leu Ser
50 55 60
Pro Glu Pro Val Val Gly Lys Leu Glu Leu Asp Lys Leu His Ser Ala
65 70 75 80
Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Leu Val Asn His Gly Val Asp Ala
85 90 95
Leu Leu Met Asp Asn Ile Lys Ser Glu Ile Lys Gly Phe Phe Asn Leu
100 105 110
Pro Met Asn Glu Lys Thr Lys Tyr Gly Gln Gln Asp Gly Asp Phe Glu
115 120 125
Gly Phe Gly Gln Pro Tyr Ile Glu Ser Glu Asp Gln Arg Leu Asp Trp
130 135 140
Thr Glu Val Phe Ser Met Leu Ser Leu Pro Leu His Leu Arg Lys Pro
145 150 155 160
His Leu Phe Pro Glu Leu Pro Leu Pro Phe Arg Glu Thr Leu Glu Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Lys Met Lys Lys Leu Ser Thr Val Val Phe Glu Met Leu
180 185 190
Glu Lys Ser Leu Gln Leu Val Glu Ile Lys Gly Met Thr Asp Leu Phe
195 200 205
Glu Asp Gly Leu Gln Thr Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Arg Pro Glu Leu Val Leu Gly Leu Thr Ser His Ser Asp Phe Ser Gly
225 230 235 240
Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Glu Gly Leu Gln Ile Arg
245 250 255
Lys Glu Glu Arg Trp Ile Ser Ile Lys Pro Leu Pro Asp Ala Phe Ile
260 265 270
Val Asn Val Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly Ile Tyr Arg
275 280 285
Ser Val Glu His Arg Ala Val Val Asn Ser Thr Lys Glu Arg Leu Ser
290 295 300
Ile Ala Thr Phe His Asp Ser Lys Leu Glu Ser Glu Ile Gly Pro Ile
305 310 315 320
Ser Ser Leu Val Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Tyr Glu Asp Ile Leu Lys Glu Asn Leu Ser Arg Lys Leu Asp Gly Lys
340 345 350
Ser Phe Leu Asp Tyr Met Arg Met
355 360

<210> 64
<211> 364
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 64
Met Glu Lys Ala Lys Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Leu Ser Ile Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Glu Leu Thr Phe Ala Glu Val Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Val Cys Thr Asn Asp Glu Asn Leu Leu Leu Met Thr Met Gly Ala
35 40 45
Ser Glu Ile Asp Asp Glu Thr Val Pro Val Ile Asp Leu Gln Asn Leu
50 55 60
Leu Ser Pro Glu Pro Ala Ile Gly Lys Ser Glu Leu Asp Trp Leu His
65 70 75 80
Tyr Ser Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Leu Val Asn His Gly Val
85 90 95
Asp Ala Leu Leu Val Asp His Val Lys Ser Glu Ile His Ser Phe Phe
100 105 110
Asn Leu Pro Leu Asn Glu Lys Thr Lys Tyr Gly Gln Arg Asp Gly Asp
115 120 125
Val Glu Gly Phe Gly Gln Ala Phe Leu Val Ser Glu Asn Gln Lys Leu
130 135 140
Asp Trp Ala Asp Met Phe Phe Ile Asn Thr Leu Pro Leu His Leu Arg
145 150 155 160
Lys Pro His Leu Phe Pro Asn Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu Thr Ile
165 170 175
Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Glu
180 185 190
Met Met Gly Lys Ala Ile Glu Val Ile Asp Ile Lys Glu Ala Ile Thr
195 200 205
Glu Met Phe Glu Asp Gly Met Gln Ser Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Glu Arg Val Ile Gly Ile Thr Pro His Ser Asp
225 230 235 240
Phe Asp Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Glu Gly Leu
245 250 255
Gln Ile Arg Lys Glu Asp Lys Trp Ile Ser Ile Lys Pro Leu Pro Asp
260 265 270
Ala Phe Ile Val Asn Val Gly Asp Ile Trp Glu Ile Met Thr Asn Gly
275 280 285
Val His Arg Ser Val Asp His Arg Gly Val Ile Asn Ser Thr Lys Glu
290 295 300
Arg Leu Ser Ile Ala Thr Phe His Ser Pro Lys Leu Glu Leu Glu Ile
305 310 315 320
Gly Pro Ile Ser Ser Leu Ile Arg Pro Glu Thr Pro Ala Val Phe Lys
325 330 335
Ser Ala Gly Arg Phe Glu Asp Leu Leu Lys Glu Gly Leu Ser Arg Lys
340 345 350
Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Cys Met Arg Met
355 360

<210> 65
<211> 294
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 65
Met Glu Lys Ala Lys Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Met Glu Ile Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Val Cys Ala Asn Glu Asn Leu Leu Leu Pro Met Gly Ala Ser Val
35 40 45
Ile Asn Asp His Glu Thr Ile Pro Val Ile Asp Ile Glu Asn Leu Leu
50 55 60
Ser Pro Glu Pro Ile Ile Gly Lys Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Phe
65 70 75 80
Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp
85 90 95
Ala Ser Leu Val Asp Ser Val Lys Ser Glu Ile Gln Gly Phe Phe Asn
100 105 110
Leu Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys Tyr Glu Gln Glu Asp Gly Asp Val
115 120 125
Glu Gly Phe Gly Gln Gly Phe Ile Glu Ser Glu Asp Gln Thr Leu Asp
130 135 140
Trp Ala Asp Ile Phe Met Met Phe Thr Leu Pro Leu His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Pro His Leu Phe Ser Lys Leu Pro Val Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu
165 170 175
Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Asn Lys
180 185 190
Met Glu Lys Ala Leu Gln Val Gln Ala Ala Glu Ile Lys Gly Met Ser
195 200 205
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210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Asn Leu Ala Ile Gly Leu Thr Ser His Ser Asp
225 230 235 240
Phe Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Ile Asn Glu Val Glu Gly Leu
245 250 255
Gln Ile Lys Arg Glu Gly Thr Trp Ile Ser Val Lys Pro Leu Pro Asn
260 265 270
Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly
275 280 285
Ile Tyr His Ser Val Asp
290

<210> 66
<211> 364
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 66
Met Glu Thr Ala Lys Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Met Ser Ile Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Ile Cys Thr Val Glu Asn Leu Gln Leu Pro Val Gly Ala Ser Val
35 40 45
Ile Asp Asp His Glu Thr Val Pro Val Ile Asp Ile Glu Asn Leu Ile
50 55 60
Ser Ser Glu Pro Val Thr Glu Lys Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Ser
65 70 75 80
Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp
85 90 95
Thr Ser Leu Val Asp Asn Val Lys Ser Asp Ile Gln Gly Phe Phe Asn
100 105 110
Leu Ser Met Asn Glu Lys Ile Lys Tyr Gly Gln Lys Asp Gly Asp Val
115 120 125
Glu Gly Phe Gly Gln Ala Phe Val Ala Ser Glu Asp Gln Thr Leu Asp
130 135 140
Trp Ala Asp Ile Phe Met Ile Leu Thr Leu Pro Leu His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Pro His Leu Phe Ser Lys Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu
165 170 175
Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Glu Lys
180 185 190
Met Glu Lys Ala Leu Gln Val Gln Ala Val Glu Ile Lys Glu Ile Ser
195 200 205
Glu Val Phe Lys Asp Met Thr Gln Val Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Glu Leu Ala Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp
225 230 235 240
Phe Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Glu Gly Leu
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Gln Ile Lys Asn Glu Gly Arg Trp Ile Ser Val Lys Pro Leu Pro Asn
260 265 270
Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Val Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly
275 280 285
Met Tyr Arg Ser Val Asp His Arg Ala Val Val Asn Ser Thr Lys Glu
290 295 300
Arg Leu Ser Ile Ala Thr Phe His Asp Pro Asn Leu Glu Ser Glu Ile
305 310 315 320
Gly Pro Ile Ser Ser Leu Ile Thr Pro Asn Thr Pro Ala Leu Phe Arg
325 330 335
Ser Gly Ser Thr Tyr Gly Glu Leu Val Glu Glu Phe His Ser Arg Lys
340 345 350
Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Ser Met Arg Met
355 360

<210> 67
<211> 369
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 67
Met Glu Thr Pro Lys Ser Ile Lys Leu Gly Gly Ser Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Gln Gln Ser Phe Ala Glu Val Pro Ala Arg
20 25 30
Tyr Val Arg Asp Asp Leu Glu Pro Leu Thr Asp Leu Ser Gly Val Ser
35 40 45
Met Ile Asp Gln Thr Ile Pro Val Ile Asp Leu Gln Lys Leu Gln Ser
50 55 60
Pro Val Pro Ile Ile Arg Glu Leu Glu Ser Glu Lys Leu His Ser Ala
65 70 75 80
Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp Ile
85 90 95
Leu Leu Val Glu Lys Thr Lys Ser Glu Ile Lys Asp Phe Phe Asn Leu
100 105 110
Pro Met Asp Glu Lys Lys Lys Phe Trp Gln Glu Glu Gly Asp Ile Gln
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Gly Phe Gly Gln Ala Phe Val Gln Ser Glu Asp Gln Lys Leu Asp Trp
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Ala Asp Ile Phe Leu Met Val Thr Leu Pro Arg His Thr Arg Asn Pro
145 150 155 160
Arg Leu Phe Pro Lys Leu Pro Leu Pro Leu Arg Asn Thr Met Asp Ser
165 170 175
Tyr Ser Ser Lys Leu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Leu Ile Glu Met Met
180 185 190
Gly Lys Ala Leu His Met Glu Thr Ser Val Leu Ala Glu Leu Phe Glu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln Ile Arg Lys
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260 265 270
Asn Ile Gly Asn Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly Ile Tyr Arg Ser
275 280 285
Val Glu His Arg Ala Thr Ile His Ser Thr Lys Glu Arg Leu Ser Val
290 295 300
Ala Ala Phe His Asn Pro Lys Val Gly Val Glu Ile Gly Pro Ile Val
305 310 315 320
Ser Met Ile Thr Pro Glu Ser Pro Ala Leu Phe Arg Thr Ile Glu Tyr
325 330 335
Asp Asp Tyr Gly Lys Lys Tyr Phe Ser Arg Lys Leu Asp Gly Lys Ser
340 345 350
Ser Leu Asp Phe Met Arg Ile Gly Glu Gly Asp Glu Glu Asn Lys Ala
355 360 365
Thr

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<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 68
Met Glu Thr Pro Lys Leu Ile Lys Leu Gly Gly Ser Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Leu Glu Leu Thr Lys Gln Ser Pro Ala Glu Val Pro Ala Arg
20 25 30
Tyr Ile Arg Asn Asp Leu Glu Pro Met Thr Asp Leu Ser Ser Ala Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Lys Ala Phe Val His Ser Glu Asp Glu Lys Leu Asp Trp Ala Asp Met
130 135 140
Phe Phe Ile Leu Thr Gln Pro Gln Tyr Met Arg Lys Pro Arg Val Phe
145 150 155 160
Pro Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Glu Thr Ile Glu Ser Tyr Ser Leu
165 170 175
Glu Leu Ser Lys Leu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Met Gly Lys Ala
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Gln Leu Asn Gln Val Asp Gly Leu Gln Ile Arg Lys Glu Glu Ile
245 250 255
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260 265 270
Asp Ile Leu Glu Ile Met Ser Asn Gly Val Tyr Arg Ser Val Glu His
275 280 285
Arg Ala Thr Ile Asn Ser Ser Lys Glu Arg Leu Ser Val Ala Ile Phe
290 295 300
Gln Ser Pro Lys His Gly Thr Glu Ile Gly Pro Ile Leu Ser Met Ile
305 310 315 320
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Leu Phe Lys Thr Ile Pro Tyr Glu Asp Tyr
325 330 335
Leu Arg Lys Phe Phe Ser Arg Lys Leu Gly Gly Lys Ser Phe Val Asp
340 345 350
Ser Met Arg Ile Gly Glu Ser Asp Glu Asp Asn Asn Thr Ala
355 360 365

<210> 69
<211> 366
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 69
Met Glu Thr Gln Lys Gln Glu Asn Phe Gly Ala Ser Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Asn Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Pro Glu Gln Val Pro Asp Arg
20 25 30
Tyr Ile Arg Ser Asp Gln Asp Ser Ser Thr Asn Ile Ser Cys Pro Ser
35 40 45
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50 55 60
Asp Pro Ile Ile Gly Glu Leu Glu Leu Glu Arg Leu His Ser Ala Cys
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Phe Gly Gln Ala Phe Val Phe Ser Glu Asp Gln Lys Leu Asp Trp Gly
130 135 140
Asp Val Phe Phe Ile Leu Thr Gln Pro Gln His Met Arg Lys Pro Arg
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Leu Phe Pro Lys Leu Pro Leu Pro Phe Arg Lys Thr Ile Glu Ser Tyr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln Ile Arg Lys Glu
245 250 255
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260 265 270
Ile Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Ser Asn Gly Ile Tyr Arg Ser Val
275 280 285
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290 295 300
Thr Phe His Ser Pro Arg Lys Asp Thr Glu Ile Gly Pro Ile Leu Ile
305 310 315 320
Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Arg Thr Ser Gly Phe Glu Asp Tyr
325 330 335
Phe Arg Lys Phe Phe Ala His Lys Leu Asn Gly Lys Ser Phe Leu Ser
340 345 350
Ser Ile Arg Ile Gly Glu Thr Asp Glu Gly Asn Asn Ala Thr
355 360 365

<210> 70
<211> 379
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 70
Met Glu Ala Pro Lys Leu Ile Met Leu Gly Gly Ser Leu Phe Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Leu Ala Glu Val Pro Val Arg
20 25 30
Tyr Val Arg Asp Asp Gln Asp Thr Leu Gly Asn Asn Ile Asn Ile Thr
35 40 45
Pro Met Ser Met Ile Asp Gln Ser Ile Pro Val Ile Asp Leu Glu Lys
50 55 60
Leu Leu Ser Pro Glu Pro Ile Val Gly Glu Leu Glu Leu Glu Arg Leu
65 70 75 80
His Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly
85 90 95
Val Asp Ser Leu Leu Val Glu Lys Val Lys Ser Glu Ile Glu Gly Phe
100 105 110
Phe Lys Leu Pro Met Asp Glu Lys Thr Lys Phe Trp Gln Glu Glu Gly
115 120 125
Asp Ile Glu Gly Phe Gly Gln Val Phe Val His Ser Gln Asp Gln Lys
130 135 140
Leu Asp Trp Gly Asp Met Phe Leu Met Gln Thr Leu Pro Arg His Thr
145 150 155 160
Arg Lys Pro Arg Leu Phe Pro Asn Leu Pro Leu Pro Leu Arg Gln Thr
165 170 175
Ile Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Leu Ser Lys Leu Val Leu Thr Leu Val
180 185 190
Asp Leu Met Gly Lys Ala Leu Gln Met Glu Ser Gly Val Leu Thr Glu
195 200 205
Leu Phe Glu Asn Gly Ile Gln Arg Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Gln Pro Glu Gln Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp Val
225 230 235 240
Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln
245 250 255
Ile Lys Lys Asp Lys Val Trp Val Pro Ile Lys Pro Leu Ala Asn Ala
260 265 270
Phe Val Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Glu Ile Met Ser Asn Gly Ile
275 280 285
Tyr Arg Ser Val Glu His Arg Ala Thr Ile Asn Ser Thr Lys Glu Arg
290 295 300
Leu Ser Ile Ala Thr Phe His Asn Pro Arg Ala Asp Arg Glu Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Pro Ser Met Ile Ser Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys Thr
325 330 335
Thr Gly Tyr Glu Glu Tyr Phe Lys Lys Phe Phe Ser Arg Lys Leu Glu
340 345 350
Gly Lys Ser Phe Leu Asp Ser Leu Arg Ile Arg Glu Gly Asp Glu His
355 360 365
Cys Gly Arg Leu Asp Val Lys Gly Pro Cys Asn
370 375

<210> 71
<211> 365
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 71
Met Glu Ile Pro Asn Pro Ile Lys Ile Gly Ser Ser Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Phe Ala Glu Val Pro Ala Arg
20 25 30
Tyr Ile Arg Asn Asp Val Asp Pro Leu Ile Thr Lys Leu Ser Asp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Asp Gln Thr Val Pro Val Ile Asp Leu Gln Lys Leu Leu
50 55 60
Ser Pro Glu Pro Ile Val Gly Glu Leu Glu Leu Glu Arg Leu His Ser
65 70 75 80
Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp
85 90 95
Asn Leu Leu Val Glu Lys Val Lys Ser Glu Ile Gln Gly Phe Phe Asn
100 105 110
Leu Pro Met Glu Glu Lys Lys Lys Phe Trp Gln Glu Glu Gly Asp Phe
115 120 125
Glu Gly Phe Gly Gln Met Phe Val Gln Ser Glu Glu Gln Lys Leu Asp
130 135 140
Trp Gly Asp Met Phe Phe Ile Leu Thr Gln Pro Gln His Met Arg Lys
145 150 155 160
Pro Arg Leu Phe Ser Lys Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu
165 170 175
Ser Tyr Ser Leu Glu Leu Ile Lys Leu Gly Leu Thr Ile Ile Lys Leu
180 185 190
Met Glu Lys Ala Leu Gln Ile Asp Ala Gly Val Met Ala Glu Leu Phe
195 200 205
Glu Asp Gly Ile His Thr Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Gln Pro Glu His Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp Gly Gly Gly
225 230 235 240
Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln Ile Arg
245 250 255
Arg Glu Asn Ile Trp Val Pro Ile Lys Pro Leu Pro Asn Ala Phe Val
260 265 270
Val Asn Ile Gly Asp Ile Leu Glu Ile Leu Ser Asn Gly Ile Tyr Arg
275 280 285
Ser Val Glu His Arg Ser Thr Val Asn Ala Thr Lys Glu Arg Leu Ser
290 295 300
Val Ala Thr Phe Gln Asn Pro Lys Gln Glu Ser Val Ile Gly Pro Asn
305 310 315 320
Met Ile Thr Pro Glu Arg Pro Ala Leu Phe Arg Lys Ile Val Tyr Lys
325 330 335
Asp Tyr Met Lys Lys Leu Phe Ser Arg Lys Leu Asp Gly Lys Ser Phe
340 345 350
Leu Asp Ser Leu Arg Ile Gly Glu Gly Asp Glu Arg Pro
355 360 365

<210> 72
<211> 349
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 72
Met Glu Thr Leu Lys Thr Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Phe Ile Pro
1 5 10 15
Asn Gly Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Leu Glu Glu Val Tyr Val Gly
20 25 30
Asn Asp Gln Asp Thr Met Leu Leu Ile Gly Gln Thr Ile Pro Val Ile
35 40 45
Asp Leu Gln Lys Leu Leu Ser Pro Glu Pro Ile Thr Gly Asp Met Glu
50 55 60
Leu Asp Lys Leu His Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val
65 70 75 80
Val Asn His Gly Val Asp Ile Leu Leu Val Glu Lys Val Lys Ser Glu
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Val His Asp Phe Phe Asn Ile Pro Met Asp Glu Lys Lys Pro Phe Trp
100 105 110
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115 120 125
Glu Asp Gln Gln Leu Asp Trp Gly Asp Met Phe Phe Met Val Thr Leu
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Pro Lys His Met Arg Lys Pro Arg Leu Phe Leu Lys Leu Pro Leu Pro
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Leu Arg Glu Thr Ile Glu Ser Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Gly
165 170 175
Val Thr Leu Val Glu Leu Met Gly Lys Ala Leu Gln Met Glu Asp Arg
180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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Phe Arg Thr Ile Gly Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Phe Phe Ser Arg
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Lys Leu Asp Gly Lys Ser Leu Leu Glu Ser Met Lys Ile
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<210> 73
<211> 379
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<220>
<221> MOD_RES
<222> (373)..(373)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (377)..(377)
<223> Any amino acid
<400> 73
Met Glu Ala Pro Lys Leu Ile Met Leu Gly Gly Ser Leu Phe Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Leu Ala Glu Val Pro Val Arg
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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Arg Lys Pro Arg Leu Phe Pro Asn Leu Pro Leu Pro Leu Arg Gln Thr
165 170 175
Ile Asp Ser Tyr Ser Ser Glu Leu Ser Lys Leu Val Leu Thr Leu Val
180 185 190
Asp Leu Met Gly Lys Ala Leu Gln Met Glu Ser Gly Val Leu Thr Glu
195 200 205
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210 215 220
Cys Pro Gln Pro Glu Gln Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp Val
225 230 235 240
Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln
245 250 255
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Thr Gly Tyr Glu Glu Tyr Phe Lys Lys Phe Phe Ser Arg Lys Leu Glu
340 345 350
Gly Lys Ser Phe Leu Asp Ser Leu Arg Ile Gly Glu Gly Asp Glu His
355 360 365
Cys Gly Arg Leu Xaa Val Lys Gly Xaa Cys Asn
370 375

<210> 74
<211> 362
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 74
Met Glu Thr Pro Lys Leu Met Lys Leu Gly Gly Ser Leu Phe Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Leu Ala Glu Val Pro Ala Arg
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35 40 45
Pro Met Ser Met Ile Asp Gln Ser Ile Pro Val Ile Asp Leu Glu Lys
50 55 60
Leu Leu Ser Pro Asp Leu Ile Val Gly Glu Leu Glu Leu Glu Arg Leu
65 70 75 80
His Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Asp Ala Glu Gly Phe Ala Gln Phe Phe Val Gln Ser Glu Asp Gln Lys
130 135 140
Leu Asp Tyr Ser Gly Asp Met Phe Phe Met Leu Asn Leu Pro Gln His
145 150 155 160
Met Arg Lys Pro Arg Leu Phe Leu Lys Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu
165 170 175
Thr Ile Glu Ser Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Gly Val Thr Leu
180 185 190
Val Glu Leu Met Gly Lys Ala Leu Gln Met Glu Asp Arg Ile Met Ser
195 200 205
Glu Leu Phe Asp Asp Gly Arg Gln Thr Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Glu Gln Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp
225 230 235 240
Pro Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Glu Leu Asn Glu Val Asn Gly Leu
245 250 255
Ile Arg Lys Glu Asn Ile Trp Val Pro Ile Ile Pro Leu Pro Asn Ala
260 265 270
Phe Ile Val Asn Ile Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Ser Asn Gly Ile
275 280 285
Tyr His Ser Val Glu His Arg Ala Thr Ile Asn Ser Thr Lys Glu Arg
290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
Gly Lys Ser Leu Leu Glu Ser Met Lys Ile
355 360

<210> 75
<211> 365
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 75
Met Glu Thr Pro Lys Leu Arg Asp Phe Gly Ser Phe Leu Pro Val Pro
1 5 10 15
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50 55 60
Ala Glu Pro Glu Met Glu Leu Glu Lys Leu His Ser Ala Cys Lys Glu
65 70 75 80
Trp Gly Phe Phe Arg Val Val Asn His Gly Val Asp Asn Leu Glu Ser
85 90 95
Val Lys Ser Glu Ile Glu Ser Phe Leu Asn Leu Pro Val Asn Ala Lys
100 105 110
Asn Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Gly Asp Asp Gln Gly Phe Gly Ser Arg
115 120 125
Phe Val Leu Ser Glu Glu Gln Lys Leu Asp Trp Gly Asp Phe Phe Tyr
130 135 140
Met Val Thr Arg Pro Leu Tyr Leu Arg Lys Pro His Leu Phe Pro Glu
145 150 155 160
Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Val
165 170 175
Ser Lys Leu Ala Met Ala Leu Phe Glu Met Met Gly Lys Ala Leu Lys
180 185 190
Ile Glu Thr Gly Val Met Thr Glu Ile Phe Glu Gly Gly Met Gln Ala
195 200 205
Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Val Ile
210 215 220
Gly Leu Asn Ala His Ser Asp Phe Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln
225 230 235 240
Leu Asn Glu Val Glu Gly Leu Glu Ile Arg Asn Lys Gly Glu Trp Val
245 250 255
Ser Val Lys Pro Leu Ala Asn Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp Val
260 265 270
Met Glu Ile Leu Thr Asn Gly Ile Tyr His Ser Val Glu His Arg Ala
275 280 285
Thr Ile Asn Ser Ser Lys Glu Arg Leu Ser Val Ala Thr Phe His Tyr
290 295 300
Pro Lys Leu Glu Thr Gly Ile Gly Pro Leu Pro Cys Met Ile Thr Pro
305 310 315 320
Lys Thr Pro Ala Leu Phe Gly Arg Ile Glu Arg Tyr Glu Leu Leu Leu
325 330 335
Arg Lys Tyr Tyr Ala Arg Lys Leu Asn Gly Lys Ser Thr Leu Asp Cys
340 345 350
Met Arg Ile Gly Asn Gly Phe Glu Asp Asp Asn Thr Ala
355 360 365

<210> 76
<211> 370
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 76
Met Glu Ala Pro Lys Leu Ile Met Leu Gly Gly Ser Leu Phe Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Leu Ala Glu Val Pro Ala Arg
20 25 30
Tyr Val Arg Asp Asp Gln Asp Thr Leu Gly Asn Asn Ile Asn Ile Thr
35 40 45
Pro Met Ser Met Ile Asp Gln Ser Ile Pro Val Ile Asp Leu Glu Lys
50 55 60
Leu Leu Ser Pro Glu Pro Ile Val Gly Glu Leu Glu Leu Glu Arg Leu
65 70 75 80
His Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly
85 90 95
Val Asp Ser Leu Leu Val Glu Lys Val Lys Ser Glu Ile Glu Gly Phe
100 105 110
Phe Glu Leu Pro Val Asp Glu Lys Lys Lys Phe Trp Gln Glu Glu Gly
115 120 125
Asp Ile Glu Gly Phe Gly Gln Ile Phe Val His Ser Glu Asp Gln Lys
130 135 140
Leu Asp Trp Ala Asp Met Phe Tyr Met Leu Thr Leu Pro Pro Asn Met
145 150 155 160
Arg Lys Pro Arg Leu Phe Pro Asn Leu Pro Leu Pro Leu Arg Gln Thr
165 170 175
Ile Asp Ser Tyr Ser Ser Glu Leu Ser Lys Leu Val Leu Thr Leu Val
180 185 190
Asp Leu Met Gly Lys Ala Leu Gln Met Glu Ser Gly Val Leu Thr Glu
195 200 205
Leu Phe Glu Asn Gly Ile Gln Arg Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Gln Pro Glu Gln Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Glu Val
225 230 235 240
Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln
245 250 255
Ile Arg Lys Glu Lys Ile Trp Val Pro Ile Lys Pro Leu Ser Asn Ala
260 265 270
Phe Ile Val Asn Ile Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Ser Asn Gly Ile
275 280 285
Tyr Arg Ser Val Glu His Arg Ala Thr Val Asn Ser Thr Lys Glu Arg
290 295 300
Leu Ser Val Ala Thr Phe His Ser Pro Arg Lys Asp Thr Glu Ile Gly
305 310 315 320
Pro Ile Leu Ile Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Arg Thr Ser Gly
325 330 335
Phe Glu Asp Tyr Phe Arg Lys Phe Phe Ala His Lys Leu Asn Gly Lys
340 345 350
Ser Phe Leu Ser Ser Ile Arg Ile Gly Glu Thr Asp Glu Gly Asn Asn
355 360 365
Ala Thr
370

<210> 77
<211> 313
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 77
Met Ser Met Ile Asp Gln Ser Ile Pro Val Ile Asp Leu Glu Lys Leu
1 5 10 15
Leu Ser Pro Glu Pro Ile Val Gly Glu Leu Glu Leu Glu Arg Leu His
20 25 30
Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val
35 40 45
Asp Ser Leu Leu Val Glu Lys Val Lys Ser Glu Ile Glu Gly Phe Phe
50 55 60
Glu Leu Pro Val Asp Glu Lys Lys Lys Phe Trp Gln Glu Glu Gly Asp
65 70 75 80
Ile Glu Gly Phe Gly Gln Ile Phe Val His Ser Glu Asp Gln Lys Leu
85 90 95
Asp Trp Ala Asp Met Phe Tyr Met Leu Thr Leu Pro Pro Asn Met Arg
100 105 110
Lys Pro Arg Leu Phe Pro Asn Leu Pro Leu Pro Leu Arg Gln Thr Ile
115 120 125
Asp Ser Tyr Ser Ser Glu Leu Ser Lys Leu Val Leu Thr Leu Val Asp
130 135 140
Leu Met Gly Lys Ala Leu Gln Met Glu Ser Gly Val Leu Thr Glu Leu
145 150 155 160
Phe Glu Asn Gly Ile Gln Arg Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys
165 170 175
Pro Gln Pro Glu Gln Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp Val Gly
180 185 190
Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln Ile
195 200 205
Arg Lys Glu Lys Ile Trp Val Pro Ile Lys Pro Leu Ser Asn Ala Phe
210 215 220
Ile Val Asn Ile Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Ser Asn Gly Ile Tyr
225 230 235 240
His Ser Val Glu His Arg Ala Thr Ile Asn Ser Thr Lys Glu Arg Leu
245 250 255
Ser Val Ala Met Phe Asn Ser Pro Lys Val Asp Thr Glu Ile Gly Pro
260 265 270
Ile His Ser Met Ile Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Arg Thr Ile
275 280 285
Gly Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Phe Phe Ser Arg Lys Leu Asp Gly
290 295 300
Lys Ser Leu Leu Glu Ser Met Lys Ile
305 310

<210> 78
<211> 365
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 78
Met Glu Thr Pro Lys Leu Val Lys Ser Ser Gly Ser Ser Leu Phe Leu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Ser Leu Pro Glu Val Pro
20 25 30
Ala Arg Tyr Ile Arg Thr Asn Leu Glu Pro Leu Ser Asn Val Ser Gly
35 40 45
Asp Ser Gln Ser Val Pro Val Ile Asp Leu Gln Lys Leu Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Pro Ile Ile Gly Glu Leu Glu Leu Asp Lys Leu His Ser Ala Cys
65 70 75 80
Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp Asn Leu
85 90 95
Val Met Glu Lys Ile Lys Thr Glu Ile Gln Gly Phe Phe Asn Leu Ser
100 105 110
Leu Asp Glu Lys Gln Lys Phe Trp Lys Lys Glu Gly Asp Ala Glu Gly
115 120 125
Phe Gly Gln Asn Phe Ile Glu Ser Glu Asp Gln Lys Leu Asp Trp Gly
130 135 140
Asp Thr Phe Gly Met Phe Thr Leu Pro Ile His Met Arg Asn Pro Arg
145 150 155 160
Leu Phe Pro Glu Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu Thr Ile Glu Ser Tyr
165 170 175
Ser Leu Asp Val Arg Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Leu Met Glu
180 185 190
Lys Ala Leu Lys Ile Lys Thr Ser Ala Met Ser Glu Leu Phe Glu Asp
195 200 205
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210 215 220
Glu His Val Ile Gly Leu Thr Pro His Ser Asp Ala Gly Gly Leu Thr
225 230 235 240
Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Gln Ile Lys Lys Asp
245 250 255
Lys Ile Trp Val Pro Ile Lys Pro Leu Pro Asn Ala Phe Val Val Asn
260 265 270
Ile Gly Asp Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly Ile Tyr Arg Ser Val
275 280 285
Glu His Arg Ala Thr Ile Asn Ser Ser Lys Glu Arg Leu Ser Val Ala
290 295 300
Ala Phe His Ser Pro Lys Gly Asp Thr Leu Ile Gly Pro Met Val Ser
305 310 315 320
Leu Ile Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Arg Thr Ile Gly Tyr Gln
325 330 335
Asp Tyr Met Lys Lys Phe Met Ser Arg Lys Leu Asp Gly Lys Ser Leu
340 345 350
Val Asn Ser Met Arg Ile Gly Glu Gly Asp Glu Asp Lys
355 360 365

<210> 79
<211> 356
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 79
Met Glu Thr Pro Thr Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Ala Thr Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Ile Cys Thr Asp Glu Asn Leu Leu Thr Met Gly Ala Ser Thr Thr
35 40 45
Asp Asn Glu Thr Val Pro Val Ile Asp Leu Gln Asn Leu Leu Ser Pro
50 55 60
Glu Pro Val Ile Gly Met Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Ser Ala Cys
65 70 75 80
Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Leu Val Asn His Gly Val Asp Ala Leu
85 90 95
Leu Val Asp Asn Glu Val Gln Gly Phe Phe Asn Leu Pro Met Asp Glu
100 105 110
Lys Thr Lys Tyr Gly Gln Lys Asp Gly Asp Asp Glu Gly Phe Gly Gln
115 120 125
Phe Phe Val Ile Ser Glu Asp Gln Lys Leu Asp Trp Ala Asp Val Phe
130 135 140
Tyr Met Ser Thr Leu Pro Leu His Ser Arg Lys Pro His Leu Phe Pro
145 150 155 160
Glu Leu Pro Leu Pro Leu Arg Glu Thr Met Glu Ser Tyr Ser Ser Glu
165 170 175
Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Asp Met Met Gly Lys Ala Leu
180 185 190
Gln Val Val Glu Ile Lys Gly Ile Thr Glu Leu Phe Glu Asp Gly Ala
195 200 205
Gln Gln Ile Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Gln Pro Glu Leu
210 215 220
Val Phe Gly Leu Thr Ser His Ser Asp Phe Asp Gly Leu Thr Ile Leu
225 230 235 240
Leu Gln Leu Gly Glu Val Glu Gly Leu Gln Ile Lys Lys Glu Glu Arg
245 250 255
Trp Ile Ser Ile Lys Pro Leu Pro Asp Ala Phe Ile Val Asn Val Gly
260 265 270
Asp Ile Leu Glu Ile Met Thr Asn Gly Ile Tyr Arg Ser Val Asp His
275 280 285
Arg Ala Val Val Asn Ser Ile Lys Glu Arg Leu Thr Ile Ala Thr Phe
290 295 300
His Asp Pro Arg Leu Glu Ala Glu Ile Gly Pro Ile Ser Ser Leu Ile
305 310 315 320
Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys Arg Gly Val Phe Glu Asp Leu
325 330 335
Leu Lys Glu Met Phe Leu Arg Lys Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp
340 345 350
Cys Met Arg Met
355

<210> 80
<211> 350
<212> PRT
<213> Papaver rhoeas
<400> 80
Gly Asn Gly Leu Ser Val Pro Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Gln Thr
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ile Pro Ser Arg Tyr Ile Cys Thr Asp Glu Asn Pro Leu
20 25 30
Ile Thr Gly Ala Ser Val Val Asp Asp Glu Thr Val Pro Val Ile Asn
35 40 45
Leu Gln Asn Leu Leu Ser Pro Glu Pro Val Ile Gly Lys Leu Glu Leu
50 55 60
Asp Lys Leu His Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val
65 70 75 80
Asn His Gly Val Asn Asp Ser Leu Val Asp Ser Val Lys Ser Glu Ile
85 90 95
Glu Gly Phe Phe Asn Leu Pro Ala Asn Glu Lys Leu Lys Tyr Gly Gln
100 105 110
Lys Asp Gly Asp Val Glu Gly Phe Gly Gln His Phe Val Val Ser Glu
115 120 125
Asp Gln Lys Leu Asp Trp Ala Asp Val Phe Tyr Met Val Thr Leu Pro
130 135 140
Val Arg Leu Arg Lys Pro His Leu Phe Pro Glu Leu Pro Leu Pro Leu
145 150 155 160
Arg Asp Thr Leu Asp Ser Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Lys Leu Ser Met
165 170 175
Val Leu Leu Glu Met Met Glu Lys Ala Leu Lys Leu Val Glu Cys Lys
180 185 190
Gly Ile Thr Asp Phe Phe Glu Asp Gly Phe Gln Gln Met Arg Met Asn
195 200 205
Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Glu Leu Val Thr Gly Leu Thr Ser
210 215 220
His Ser Asp Phe Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Asp Val
225 230 235 240
Glu Gly Leu Gln Ile Lys Lys Glu Glu Arg Trp Ile Ser Ile Lys Pro
245 250 255
Leu Pro Asn Ala Phe Ile Val Asn Ile Gly Asp Val Leu Glu Ile Met
260 265 270
Ser Asn Gly Ile Tyr Arg Ser Val Asp His Arg Ala Val Ile Asn Ser
275 280 285
Thr Lys Val Arg Met Ser Val Ala Thr Phe His Asp Pro Arg Leu Glu
290 295 300
Ala Val Ile Gly Pro Ile Ser Ser Leu Ile Thr Pro Glu Thr Pro Ala
305 310 315 320
Leu Phe Lys Arg Gly Val Phe Glu Asp Leu Leu Lys Glu Met Phe Leu
325 330 335
Arg Lys Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Cys Met Arg Ile
340 345 350

<210> 81
<211> 351
<212> PRT
<213> Papaver setigerum
<400> 81
Leu Met Lys Leu Ala Asn Gly Met Ser Val Pro Ile Val Gln Glu Leu
1 5 10 15
Ala Lys Leu Thr Val Gly Glu Ile Pro Ser Arg Tyr Ile Cys Thr Asp
20 25 30
Gly Asn Leu Leu Thr Met Gly Ala Ser Val Ile Asp Tyr Glu Thr Val
35 40 45
Pro Val Ile Asp Leu Gln Asn Leu Gln Ser Arg Glu Pro Val Ile Glu
50 55 60
Lys Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Ser Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe
65 70 75 80
Phe Gln Leu Leu Asn His Gly Val Asp Ala Ser Leu Met Asp Asn Val
85 90 95
Arg Ser Glu Ile Arg Gly Phe Phe Asn Leu Pro Ile Ser Asp Lys Met
100 105 110
Lys Tyr Gly Gln Lys Asp Gly Asp Glu Glu Gly Phe Gly Gln His Phe
115 120 125
Ile Val Ser Glu Asp Gln Lys Leu Asp Trp Val Asp Ala Phe Met Met
130 135 140
Phe Thr Leu Pro Leu His Ser Arg Asn Pro Arg Leu Thr Pro Glu Phe
145 150 155 160
Pro Gln Pro Leu Arg Glu Thr Val Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys
165 170 175
Lys Leu Ser Val Leu Leu Phe Glu Leu Met Glu Lys Ala Leu Gln Val
180 185 190
Lys Gly Ile Thr Glu Met Phe Glu Asp Gly Leu Gln Ser Ile Arg Met
195 200 205
Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Glu Leu Ala Ile Gly Leu Thr
210 215 220
Ser His Ser Asp Phe Asp Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln Leu Asn Glu
225 230 235 240
Val Glu Gly Leu Gln Ile Lys Lys Glu Glu Arg Trp Ile Ser Ile Lys
245 250 255
Pro Leu Pro Asn Ala Phe Ile Val Asn Val Gly Asp Val Leu Glu Val
260 265 270
Met Thr Asn Gly Ile Tyr Arg Ser Val Asp His Arg Ala Val Val Asn
275 280 285
Ser Thr Lys Glu Arg Leu Ser Ile Ala Thr Phe His Asp Pro Glu Leu
290 295 300
Glu Ser Glu Ile Gly Pro Ile Ala Ser Leu Ile Thr Pro Glu Thr Pro
305 310 315 320
Ala Leu Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Asp Leu Leu Lys Glu Asn Leu
325 330 335
Ser Thr Lys Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Cys Ile Arg Met
340 345 350

<210> 82
<211> 497
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Met Gly Leu Glu Ala Leu Val Pro Leu Ala Val Ile Val Ala Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Asp Leu Met His Arg Arg Gln Arg Trp Ala Ala Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Gly Pro Leu Pro Leu Pro Gly Leu Gly Asn Leu Leu His
35 40 45
Val Asp Phe Gln Asn Thr Pro Tyr Cys Phe Asp Gln Leu Arg Arg Arg
50 55 60
Phe Gly Asp Val Phe Ser Leu Gln Leu Ala Trp Thr Pro Val Val Val
65 70 75 80
Leu Asn Gly Leu Ala Ala Val Arg Glu Ala Leu Val Thr His Gly Glu
85 90 95
Asp Thr Ala Asp Arg Pro Pro Val Pro Ile Thr Gln Ile Leu Gly Phe
100 105 110
Gly Pro Arg Ser Gln Gly Val Phe Leu Ala Arg Tyr Gly Pro Ala Trp
115 120 125
Arg Glu Gln Arg Arg Phe Ser Val Ser Thr Leu Arg Asn Leu Gly Leu
130 135 140
Gly Lys Lys Ser Leu Glu Gln Trp Val Thr Glu Glu Ala Ala Cys Leu
145 150 155 160
Cys Ala Ala Phe Ala Asn His Ser Gly Arg Pro Phe Arg Pro Asn Gly
165 170 175
Leu Leu Asp Lys Ala Val Ser Asn Val Ile Ala Ser Leu Thr Cys Gly
180 185 190
Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Arg Phe Leu Arg Leu Leu Asp Leu
195 200 205
Ala Gln Glu Gly Leu Lys Glu Glu Ser Gly Phe Leu Arg Glu Val Leu
210 215 220
Asn Ala Val Pro Val Leu Leu His Ile Pro Ala Leu Ala Gly Lys Val
225 230 235 240
Leu Arg Phe Gln Lys Ala Phe Leu Thr Gln Leu Asp Glu Leu Leu Thr
245 250 255
Glu His Arg Met Thr Trp Asp Pro Ala Gln Pro Pro Arg Asp Leu Thr
260 265 270
Glu Ala Phe Leu Ala Glu Met Glu Lys Ala Lys Gly Asn Pro Glu Ser
275 280 285
Ser Phe Asn Asp Glu Asn Leu Arg Ile Val Val Ala Asp Leu Phe Ser
290 295 300
Ala Gly Met Val Thr Thr Ser Thr Thr Leu Ala Trp Gly Leu Leu Leu
305 310 315 320
Met Ile Leu His Pro Asp Val Gln Arg Arg Val Gln Gln Glu Ile Asp
325 330 335
Asp Val Ile Gly Gln Val Arg Arg Pro Glu Met Gly Asp Gln Ala His
340 345 350
Met Pro Tyr Thr Thr Ala Val Ile His Glu Val Gln Arg Phe Gly Asp
355 360 365
Ile Val Pro Leu Gly Val Thr His Met Thr Ser Arg Asp Ile Glu Val
370 375 380
Gln Gly Phe Arg Ile Pro Lys Gly Thr Thr Leu Ile Thr Asn Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Leu Lys Asp Glu Ala Val Trp Glu Lys Pro Phe Arg Phe His
405 410 415
Pro Glu His Phe Leu Asp Ala Gln Gly His Phe Val Lys Pro Glu Ala
420 425 430
Phe Leu Pro Phe Ser Ala Gly Arg Arg Ala Cys Leu Gly Glu Pro Leu
435 440 445
Ala Arg Met Glu Leu Phe Leu Phe Phe Thr Ser Leu Leu Gln His Phe
450 455 460
Ser Phe Ser Val Pro Thr Gly Gln Pro Arg Pro Ser His His Gly Val
465 470 475 480
Phe Ala Phe Leu Val Thr Pro Ser Pro Tyr Glu Leu Cys Ala Val Pro
485 490 495
Arg

<210> 83
<211> 1049
<212> PRT
<213> Bacillus megaterium
<400> 83
Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
20 25 30
Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg
35 40 45
Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
50 55 60
Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Ala Lys Phe Ala Arg
65 70 75 80
Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Val Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn
85 90 95
Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
100 105 110
Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Ser Glu
130 135 140
Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn
145 150 155 160
Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Ile
165 170 175
Ser Met Val Arg Ala Ala Asp Glu Val Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
180 185 190
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu
195 200 205
Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
210 215 220
Lys Ala Arg Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr Gln Met Leu Asn
225 230 235 240
Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Gly Asn Ile Arg
245 250 255
Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
275 280 285
Gln Lys Val Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
290 295 300
Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn
305 310 315 320
Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala
325 330 335
Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
340 345 350
Glu Val Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Val Trp
355 360 365
Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
370 375 380
Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala
385 390 395 400
Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly
405 410 415
Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
420 425 430
Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Lys Gly Phe Val Val Lys
435 440 445
Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
450 455 460
Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn
465 470 475 480
Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly
485 490 495
Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
500 505 510
Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
515 520 525
Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
530 535 540
Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val
545 550 555 560
Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala
565 570 575
Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
580 585 590
Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
595 600 605
Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
610 615 620
Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys
625 630 635 640
Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu
645 650 655
Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
660 665 670
Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
675 680 685
Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
690 695 700
Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly
705 710 715 720
Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu
725 730 735
Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
755 760 765
Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
770 775 780
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785 790 795 800
Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
805 810 815
Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
820 825 830
Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
835 840 845
Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
850 855 860
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900 905 910
Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
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Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
930 935 940
Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
945 950 955 960
Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
965 970 975
Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
980 985 990
Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
995 1000 1005
Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln
1010 1015 1020
Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu
1025 1030 1035
Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1040 1045

<210> 84
<211> 503
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Met Ala Leu Ile Pro Asp Leu Ala Met Glu Thr Trp Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Val Leu Leu Tyr Leu Tyr Gly Thr His Ser His Gly Leu
20 25 30
Phe Lys Lys Leu Gly Ile Pro Gly Pro Thr Pro Leu Pro Phe Leu Gly
35 40 45
Asn Ile Leu Ser Tyr His Lys Gly Phe Cys Met Phe Asp Met Glu Cys
50 55 60
His Lys Lys Tyr Gly Lys Val Trp Gly Phe Tyr Asp Gly Gln Gln Pro
65 70 75 80
Val Leu Ala Ile Thr Asp Pro Asp Met Ile Lys Thr Val Leu Val Lys
85 90 95
Glu Cys Tyr Ser Val Phe Thr Asn Arg Arg Pro Phe Gly Pro Val Gly
100 105 110
Phe Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu Glu Trp Lys Arg
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr Ser Gly Lys Leu Lys Glu
130 135 140
Met Val Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Val Leu Val Arg Asn Leu
145 150 155 160
Arg Arg Glu Ala Glu Thr Gly Lys Pro Val Thr Leu Lys Asp Val Phe
165 170 175
Gly Ala Tyr Ser Met Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Phe Gly Val Asn
180 185 190
Ile Asp Ser Leu Asn Asn Pro Gln Asp Pro Phe Val Glu Asn Thr Lys
195 200 205
Lys Leu Leu Arg Phe Asp Phe Leu Asp Pro Phe Phe Leu Ser Ile Thr
210 215 220
Val Phe Pro Phe Leu Ile Pro Ile Leu Glu Val Leu Asn Ile Cys Val
225 230 235 240
Phe Pro Arg Glu Val Thr Asn Phe Leu Arg Lys Ser Val Lys Arg Met
245 250 255
Lys Glu Ser Arg Leu Glu Asp Thr Gln Lys His Arg Val Asp Phe Leu
260 265 270
Gln Leu Met Ile Asp Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Glu Ser His Lys
275 280 285
Ala Leu Ser Asp Leu Glu Leu Val Ala Gln Ser Ile Ile Phe Ile Phe
290 295 300
Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ser Ser Val Leu Ser Phe Ile Met Tyr Glu
305 310 315 320
Leu Ala Thr His Pro Asp Val Gln Gln Lys Leu Gln Glu Glu Ile Asp
325 330 335
Ala Val Leu Pro Asn Lys Ala Pro Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln
340 345 350
Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro
355 360 365
Ile Ala Met Arg Leu Glu Arg Val Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn
370 375 380
Gly Met Phe Ile Pro Lys Gly Val Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala
385 390 395 400
Leu His Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro
405 410 415
Glu Arg Phe Ser Lys Lys Asn Lys Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Ile Tyr
420 425 430
Thr Pro Phe Gly Ser Gly Pro Arg Asn Cys Ile Gly Met Arg Phe Ala
435 440 445
Leu Met Asn Met Lys Leu Ala Leu Ile Arg Val Leu Gln Asn Phe Ser
450 455 460
Phe Lys Pro Cys Lys Glu Thr Gln Ile Pro Leu Lys Leu Ser Leu Gly
465 470 475 480
Gly Leu Leu Gln Pro Glu Lys Pro Val Val Leu Lys Val Glu Ser Arg
485 490 495
Asp Gly Thr Val Ser Gly Ala
500

<210> 85
<211> 502
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Met Ala Leu Ile Pro Asp Leu Ala Met Glu Thr Trp Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Val Leu Leu Tyr Leu Tyr Gly Thr His Ser His Gly Leu
20 25 30
Phe Lys Lys Leu Gly Ile Pro Gly Pro Thr Pro Leu Pro Phe Leu Gly
35 40 45
Asn Ile Leu Ser Tyr His Lys Gly Phe Cys Met Phe Asp Met Glu Cys
50 55 60
His Lys Lys Tyr Gly Lys Val Trp Gly Phe Tyr Asp Gly Gln Gln Pro
65 70 75 80
Val Leu Ala Ile Thr Asp Pro Asp Met Ile Lys Thr Val Leu Val Lys
85 90 95
Glu Cys Tyr Ser Val Phe Thr Asn Arg Arg Pro Phe Gly Pro Val Gly
100 105 110
Phe Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu Glu Trp Lys Arg
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr Ser Gly Lys Leu Lys Glu
130 135 140
Met Val Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Val Leu Val Arg Asn Leu
145 150 155 160
Arg Arg Glu Ala Glu Thr Gly Lys Pro Val Thr Leu Lys Asp Val Phe
165 170 175
Gly Ala Tyr Ser Met Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Phe Gly Val Asn
180 185 190
Ile Asp Ser Leu Asn Asn Pro Gln Asp Pro Phe Val Glu Asn Thr Lys
195 200 205
Lys Leu Leu Arg Phe Asp Phe Leu Asp Pro Phe Phe Leu Ser Ile Ile
210 215 220
Phe Pro Phe Leu Ile Pro Ile Leu Glu Val Leu Asn Ile Cys Val Phe
225 230 235 240
Pro Arg Glu Val Thr Asn Phe Leu Arg Lys Ser Val Lys Arg Met Lys
245 250 255
Glu Ser Arg Leu Glu Asp Thr Gln Lys His Arg Val Asp Phe Leu Gln
260 265 270
Leu Met Ile Asp Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Glu Ser His Lys Ala
275 280 285
Leu Ser Asp Leu Glu Leu Val Ala Gln Ser Ile Ile Phe Ile Phe Ala
290 295 300
Gly Tyr Glu Thr Thr Ser Ser Val Leu Ser Phe Ile Met Tyr Glu Leu
305 310 315 320
Ala Thr His Pro Asp Val Gln Gln Lys Leu Gln Glu Glu Ile Asp Ala
325 330 335
Val Leu Pro Asn Lys Ala Pro Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met
340 345 350
Glu Tyr Leu Asp Met Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile
355 360 365
Ala Met Arg Leu Glu Arg Val Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly
370 375 380
Met Phe Ile Pro Lys Gly Val Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu
385 390 395 400
His Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu
405 410 415
Arg Phe Ser Lys Lys Asn Lys Asp Asn Ile Asp Pro Tyr Ile Tyr Thr
420 425 430
Pro Phe Gly Ser Gly Pro Arg Asn Cys Ile Gly Met Arg Phe Ala Leu
435 440 445
Met Asn Met Lys Leu Ala Leu Ile Arg Val Leu Gln Asn Phe Ser Phe
450 455 460
Lys Pro Cys Lys Glu Thr Gln Ile Pro Leu Lys Leu Ser Leu Gly Gly
465 470 475 480
Leu Leu Gln Pro Glu Lys Pro Val Val Leu Lys Val Glu Ser Arg Asp
485 490 495
Gly Thr Val Ser Gly Ala
500

<210> 86
<211> 534
<212> PRT
<213> Menispermum canadense
<400> 86
Met Ile Met Met Phe Ile Asp Tyr Tyr Ser Ser Trp Leu Pro Gln Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gln Ser Ile Leu Leu Ala Val Ser Leu Val Ile Phe Ile
20 25 30
Asn Leu Phe Leu Thr Arg Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Lys Ser His Thr
35 40 45
Asn Ile Ile His Pro Pro Lys Ala Ala Gly Ala Leu Pro Val Ile Gly
50 55 60
His Leu Tyr Thr Leu Phe Arg Gly Leu Ser Ala Gly Val Pro Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
His Leu Gly Val Tyr Pro Thr Leu Val Val Thr Cys Arg Glu Leu Ala
100 105 110
Lys Glu Cys Phe Thr Thr Asn Asp Gln Thr Phe Ala Thr Arg Pro Ser
115 120 125
Thr Cys Ala Gly Lys Tyr Ile Gly Tyr Asn Tyr Ala Phe Phe Gly Phe
130 135 140
Ala Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Arg Glu Ala Arg Lys Ile Ala Thr Val
145 150 155 160
Glu Leu Leu Ser Asn Tyr Arg Leu Asp Ser Leu Arg His Val Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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Phe Asp Gln Val Thr Leu Asn Val Ile Leu Met Met Val Val Gly Lys
210 215 220
Arg Cys Val Thr Thr Gly Gly Asn Glu Glu Glu Val Arg Val Val Lys
225 230 235 240
Val Leu His Glu Phe Phe Lys His Leu Gly Thr Leu Ser Val Ser Asp
245 250 255
Val Val Pro Tyr Val Glu Trp Met Asp Leu Asp Gly Asn Ile Gly Arg
260 265 270
Met Lys Ser Thr Ala Lys Glu Leu Asp Cys Ile Leu Gly Arg Trp Leu
275 280 285
Glu Glu His Arg Arg Glu Arg Arg Ser Asp Phe Met Asp Ala Met Leu
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Ala Met Val Glu Gly Ile Lys Ile Pro Tyr Tyr Asp Ser Asp Thr Val
305 310 315 320
Ile Lys Ala Ile Cys Leu Asn Leu Leu Asn Ala Gly Ser Asp Thr Leu
325 330 335
Gly Ile Thr Met Thr Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Asn Asn Arg His
340 345 350
Val Leu Lys Lys Val Lys Asp Glu Leu Asp Val His Val Gly Lys Asn
355 360 365
Arg Gln Val Glu Glu Leu Asp Val Lys Asn Leu Val Tyr Leu His Ala
370 375 380
Val Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Pro Ala Pro Leu Gly Val
385 390 395 400
Pro His Glu Ala Met Glu Asp Cys Val Val Gly Gly Phe His Val Ala
405 410 415
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420 425 430
Ser Val Trp Ser Asp Pro Leu Ala Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Asp
435 440 445
Asn Asn Thr Val Asp Val Arg Gly Gln His Phe Gln Leu Leu Pro Phe
450 455 460
Gly Ser Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Ile Thr Phe Ala Leu Gln Val
465 470 475 480
Ala His Leu Thr Leu Ala Arg Leu Leu His Gly Phe Glu Trp Asp Thr
485 490 495
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Glu Val Tyr Thr Gln Asn
530

<210> 87
<211> 527
<212> PRT
<213> Nigella sativa
<400> 87
Met Leu Ser Ile His Asp Ser Thr Met Val Phe Leu Gln Leu Gln Ala
1 5 10 15
Ile Cys Gly Ile Phe Gly Phe Ile Phe Ile Ile Thr Trp Trp Thr Arg
20 25 30
Trp Lys Ser Ser Asn Lys Met Lys Ala Pro Glu Val Ala Gly Ala Trp
35 40 45
Pro Val Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Gly Gly Arg Pro Leu Tyr
50 55 60
Gln Leu Leu Gly Asp Met Ser Asp Lys Tyr Gly Pro Ala Phe Thr Leu
65 70 75 80
Arg Met Gly Ile Gln Lys Ala Leu Val Val Ser Ser Trp Glu Val Ala
85 90 95
Lys Glu Cys Leu Thr Thr Asn Asp Arg Ala Leu Ala Thr Arg Pro Ser
100 105 110
Ser Ala Gly Gly Lys Tyr Met Gly Tyr Asn Asn Ala Leu Ile Pro Phe
115 120 125
Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Arg Asp Met Arg Lys Ile Ala Thr Leu
130 135 140
Glu Leu Leu Ser Asn His Arg Leu Glu Glu Leu Lys His Val Arg Glu
145 150 155 160
Met Glu Ile Asn Thr Cys Ile Ser Asp Met Tyr Lys Leu Cys Gln Val
165 170 175
Glu Asp Gly Val Glu Ile Lys Pro Ile Ser Val Asp Leu Ser Gln Trp
180 185 190
Phe Ala Asp Leu Thr Phe Asn Val Val Val Met Met Ile Thr Gly Lys
195 200 205
Arg Tyr Ile Gly Ser Thr Asp Ala Gly Asp Met Asn Glu Ile Arg His
210 215 220
Phe Gln Ala Ala Leu Val Lys Phe Met Arg Leu Leu Arg Ile Ser Leu
225 230 235 240
Leu Val Asp Val Phe Pro Val Leu Gln Trp Ile Asn Tyr Gly Gly Phe
245 250 255
Lys Gly Val Met Lys Ser Thr Ala Arg Asp Ile Asp Ser Val Leu Glu
260 265 270
Asn Trp Leu Gln Glu His Gln Arg Lys Arg Leu Ser Pro Asp Phe Asn
275 280 285
Gly Asn His Asp Phe Ile Asp Val Met Ile Ser Thr Leu Glu Gly Thr
290 295 300
Glu Phe Ser Asp Tyr Asp His Asn Thr Ile Ile Lys Ala Ile Ser Met
305 310 315 320
Ala Met Val Val Gly Gly Thr Asp Thr Thr Thr Thr Thr Leu Ile Trp
325 330 335
Ala Ile Ser Leu Leu Leu Asn Asn Pro Asn Ala Met Lys Lys Val Gln
340 345 350
Glu Glu Leu Glu Ile His Val Gly Lys Glu Arg Asn Val Asp Gly Ser
355 360 365
Asp Ile Gln His Leu Val Tyr Leu Gln Ala Val Val Lys Glu Thr Leu
370 375 380
Arg Leu Tyr Pro Pro Val Pro Leu Ser Val Met His Gln Ala Met Glu
385 390 395 400
Asp Cys Val Ile Gly Ser Tyr Asn Ile Gln Ala Gly Thr Arg Val Leu
405 410 415
Phe Asn Leu Trp Lys Leu His Arg Asp Ser Ser Val Trp Ser Asp Pro
420 425 430
Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Thr Ser His Val Asp Val Asp
435 440 445
Val Arg Gly Gln His Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg
450 455 460
Ser Cys Pro Gly Ile Ser Phe Ala Leu Gln Val Ile His Leu Thr Ile
465 470 475 480
Ala Arg Leu Phe His Gly Phe Asn Leu Thr Thr Pro Gly Asn Ser Ser
485 490 495
Val Asp Met Ser Glu Ile Ser Gly Ala Thr Leu Ser Lys Val Thr Pro
500 505 510
Leu Glu Val Leu Val Thr Pro Arg Leu Ser Ser Lys Leu Tyr Asn
515 520 525

<210> 88
<211> 525
<212> PRT
<213> Hydrastis canadensis
<400> 88
Met Asp Ser Leu Leu Gln Leu Gln Ile Ile Gly Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ile Phe Thr Tyr Lys Leu Leu Lys Val Ile Cys Arg Ser Pro Met Thr
20 25 30
Asp Gly Met Glu Ala Pro Glu Pro Pro Gly Ala Trp Pro Ile Ile Gly
35 40 45
His Leu His Leu Leu Gly Gly Gln Asp Pro Ile Ala Arg Thr Leu Gly
50 55 60
Val Met Thr Asp Lys Tyr Gly Pro Ile Leu Lys Leu Arg Leu Gly Val
65 70 75 80
His Thr Gly Leu Val Val Ser Asn Trp Glu Leu Ala Lys Glu Cys Phe
85 90 95
Thr Thr Asn Asp Arg Val Leu Ala Ser Arg Pro Met Gly Ala Ala Gly
100 105 110
Lys Tyr Leu Gly Tyr Asn Tyr Ala Ile Phe Gly Leu Ala Pro His Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Ser Glu Val Arg Lys Ile Val Leu Arg Glu Leu Leu Ser
130 135 140
Asn Gln Ser Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Ile Ser Glu Ile Asn
145 150 155 160
Thr Cys Leu Lys Asn Leu Phe Ser Leu Asn Asn Gly Asn Thr Pro Ile
165 170 175
Lys Val Asp Met Lys Gln Trp Phe Glu Arg Pro Met Phe Asn Val Val
180 185 190
Thr Met Met Ile Ala Gly Lys Arg Tyr Phe Ser Met Glu Asn Asp Asn
195 200 205
Glu Ala Met Asn Phe Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Met Tyr Leu Thr
210 215 220
Gly Val Phe Val Val Ser Asp Ala Leu Pro Tyr Leu Glu Trp Leu Asp
225 230 235 240
Leu Gln Gly His Val Ser Ala Met Lys Arg Thr Ala Lys Glu Leu Asp
245 250 255
Ile His Val Gly Lys Trp Leu Glu Glu His Arg Arg Ala Lys Leu Leu
260 265 270
Gly Glu Thr Lys Asn Glu Asp Asp Phe Val Asp Val Leu Leu Thr Ile
275 280 285
Leu Pro Glu Asp Leu Lys Asp Asn Gln Thr Tyr Ile His Asp Arg Asp
290 295 300
Thr Ile Ile Lys Ala Thr Ala Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Asp
305 310 315 320
Thr Thr Ala Ile Thr Leu Thr Trp Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asn Asn
325 330 335
Pro Asp Val Leu Lys Arg Ala Gln Asp Glu Leu Asp Lys His Val Gly
340 345 350
Lys Glu Lys Leu Val Lys Glu Ser Asp Ile Ile Asn Leu Val Tyr Leu
355 360 365
Gln Ala Ile Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Ala Pro Leu
370 375 380
Leu Leu Pro His Glu Ala Met Glu Asp Cys Thr Val Gly Gly Tyr His
385 390 395 400
Val Pro Lys Gly Thr Arg Ile Phe Val Asn Ile Trp Lys Leu Gln Arg
405 410 415
Asp Pro Arg Val Trp Phe Asp Pro Asn Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe
420 425 430
Leu Thr Thr His Ala Asn Val Asp Phe Lys Gly Gln His Phe Glu Tyr
435 440 445
Ile Pro Phe Ser Ser Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly Ile Thr Phe Ser
450 455 460
Thr Gln Ile Met His Leu Thr Leu Ala His Leu Leu His Glu Phe Asn
465 470 475 480
Ile Val Thr Pro Thr Lys Ser Asn Ala Gly Val Asp Met Thr Glu Ser
485 490 495
Leu Gly Ile Thr Met Pro Lys Ala Thr Pro Leu Glu Val Leu Leu Thr
500 505 510
Pro Arg Leu Pro Ser Asn Leu Tyr Asn Gln Tyr Arg Asp
515 520 525

<210> 89
<211> 550
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 89
Met Asn Leu Leu Ile Phe Phe Gln Phe Leu Leu Gln Phe Gln Val Leu
1 5 10 15
Val Gly Leu Ser Val Leu Leu Ala Phe Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Ser
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Ile Asn Lys Phe Lys Gly Lys Gly Ala Leu Leu Ala
35 40 45
Pro Gln Ala Ala Gly Ala Trp Pro Ile Val Gly His Leu Pro Gln Leu
50 55 60
Val Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg Ile Leu Gly Ala Met Ala Asp Asn
65 70 75 80
Tyr Gly Pro Ile Phe Met Leu Arg Phe Gly Val His Pro Thr Val Val
85 90 95
Val Ser Ser Trp Glu Met Thr Lys Glu Cys Phe Thr Thr Asn Asp Arg
100 105 110
His Leu Ala Ser Arg Pro Ser Asn Ala Ala Ser Gln Tyr Leu Ile Tyr
115 120 125
Glu Val Tyr Ala Leu Phe Gly Phe Ser Leu Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp
130 135 140
Arg Asp Ala Arg Lys Ile Ala Thr Leu Glu Leu Leu Ser His Arg Arg
145 150 155 160
Leu Glu Leu Leu Lys His Val Pro Tyr Thr Glu Ile Asp Thr Cys Ile
165 170 175
Lys Gln Leu His Arg Leu Trp Thr Lys Asn Asn Lys Asn Gln Asn Asn
180 185 190
Pro Glu Leu Lys Val Glu Met Asn Gln Phe Phe Thr Asp Leu Thr Met
195 200 205
Asn Val Ile Leu Lys Leu Val Val Gly Lys Arg Phe Phe Asn Val Asp
210 215 220
Asp Ala Ala Asp His Glu Lys Glu Glu Ala Arg Lys Ile Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ile Phe Glu Phe Phe Lys Leu Thr Glu Gly Ser Val Ser Ala Gly Ala
245 250 255
Leu Pro Leu Leu Asn Trp Leu Asp Leu Asn Gly Gln Lys Arg Ala Met
260 265 270
Lys Arg Thr Ala Lys Lys Met Asp Ser Ile Ala Glu Lys Leu Leu Asp
275 280 285
Glu His Arg Gln Lys Arg Leu Ser Lys Glu Gly Val Lys Gly Thr His
290 295 300
Asp His Asn Asp Phe Met Asp Val Leu Leu Ser Ile Leu Asp Ala Asp
305 310 315 320
Gln Gly Asp Tyr Ser His His Pro Phe Asn Tyr Ser Arg Asp His Val
325 330 335
Ile Lys Ala Thr Thr Leu Ser Met Ile Leu Ser Ser Met Ser Ile Ser
340 345 350
Val Ser Leu Ser Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Asn Asn Arg His Val
355 360 365
Leu Lys Lys Ala Gln Asp Glu Leu Asp Met Asn Val Gly Lys Asp Arg
370 375 380
Gln Val Glu Glu Gly Asp Ile Lys Asn Leu Val Tyr Leu Gln Ala Ile
385 390 395 400
Val Lys Glu Thr Phe Arg Met Tyr Pro Ala Asn Pro Leu Leu Leu Pro
405 410 415
His Glu Ala Ile Glu Asp Cys Lys Ile Gly Gly Phe Asn Val Pro Ala
420 425 430
Gly Thr Arg Val Val Val Asn Ala Trp Lys Leu Gln His Asp Pro Arg
435 440 445
Val Trp Ser Asn Pro Ser Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Asn Asp
450 455 460
Gln Ala Ala Lys Val Val Asp Val Arg Gly Gln Asn Phe Glu Tyr Leu
465 470 475 480
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly Ile Ser Phe Ser Leu
485 490 495
Gln Thr Ile His Met Ser Leu Ala Arg Leu Val Gln Ala Phe Glu Leu
500 505 510
Gly Thr Pro Ser Asn Glu Arg Ile Asp Met Thr Glu Gly Ser Gly Leu
515 520 525
Thr Met Pro Lys Thr Thr Pro Leu His Val Leu Leu Asn Pro Arg Leu
530 535 540
Pro Leu Pro Leu Tyr Glu
545 550

<210> 90
<211> 537
<212> PRT
<213> Glaucium flavum
<400> 90
Met Glu Leu Ile Asn Ser Leu Glu Ile Gln Pro Ile Thr Ile Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Thr Val Ser Ile Leu Leu Tyr Lys Ile Ile Trp Asn
20 25 30
His Gly Ser Arg Lys Asn Asn Lys Ser Asn Lys Asn Asn Arg Lys Thr
35 40 45
Ser Ser Ser Ala Gly Val Val Glu Ile Pro Gly Ala Trp Pro Ile Ile
50 55 60
Gly His Leu His Leu Phe Asn Gly Ser Glu Gln Met Phe His Lys Leu
65 70 75 80
Gly Ser Leu Ala Asp Gln Tyr Gly Pro Ala Pro Phe Phe Ile Arg Phe
85 90 95
Gly Ser Arg Lys Tyr Val Val Val Ser Asn Trp Glu Leu Val Lys Thr
100 105 110
Cys Phe Thr Ala Gln Ser Gln Ile Phe Val Ser Arg Pro Pro Met Leu
115 120 125
Ala Met Asn Ile Leu Phe Phe Pro Lys Asp Ser Leu Ser Tyr Ile Gln
130 135 140
His Gly Asp His Trp Arg Glu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Thr Lys Leu
145 150 155 160
Leu Ser Ser His Arg Val Glu Thr Gln Lys His Leu Ile Ala Ser Glu
165 170 175
Val Asp Tyr Cys Phe Lys Gln Leu Tyr Lys Leu Ser Asn Asn Gly Glu
180 185 190
Phe Thr Leu Val Arg Leu Asn Thr Trp Cys Glu Asp Met Ala Leu Asn
195 200 205
Val His Val Arg Met Ile Ala Gly Met Lys Asn Tyr Val Ala Ala Pro
210 215 220
Gly Ser Gly Glu Tyr Gly Gly Gln Ala Arg Arg Tyr Arg Lys Ala Leu
225 230 235 240
Glu Glu Ala Leu Asp Leu Leu Asn Gln Phe Thr Ile Thr Asp Val Val
245 250 255
Pro Trp Leu Gly Trp Leu Asp His Phe Arg Asp Val Val Gly Arg Met
260 265 270
Lys Arg Cys Gly Ala Glu Leu Asp Ser Ile Phe Ala Thr Trp Val Glu
275 280 285
Glu His Arg Val Lys Arg Ala Ser Gly Lys Gly Gly Asp Val Glu Pro
290 295 300
Asp Phe Ile Asp Leu Cys Trp Glu Ser Met Glu Gln Leu Pro Gly Asn
305 310 315 320
Asp Pro Ala Thr Val Ile Lys Leu Met Cys Lys Glu His Ile Phe Asn
325 330 335
Gly Ser Gly Thr Ser Ser Leu Thr Leu Ala Trp Ile Leu Ser Leu Ile
340 345 350
Met Asn Asn Pro Tyr Val Ile Lys Lys Ala Arg Glu Glu Leu Glu Lys
355 360 365
His Val Gly Asn His Arg Gln Val Glu Glu Ser Asp Leu Pro Asn Leu
370 375 380
Leu Tyr Ile Gln Ala Ile Ile Lys Glu Gly Met Arg Leu Tyr Thr Pro
385 390 395 400
Gly Pro Phe Ile Asp Arg Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Glu Ile Asn Gly
405 410 415
Val His Ile Pro Ala Gly Thr Cys Leu Tyr Val Asn Leu Trp Lys Ile
420 425 430
His Arg Asp Pro Asn Val Tyr Glu Asp Pro Leu Glu Phe Lys Pro Glu
435 440 445
Arg Phe Leu Lys Asn Asn Ser Asp Leu Asp Leu Lys Gly Gln Asn Tyr
450 455 460
Gln Leu Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Val Ser
465 470 475 480
Leu Ala Leu Pro Leu Met Tyr Leu Thr Val Ser Arg Leu Ile His Gly
485 490 495
Phe Asp Met Lys Leu Pro Lys Gly Val Glu Lys Ala Asp Met Thr Ala
500 505 510
His Gly Gly Val Ile Asn Gln Arg Ala Tyr Pro Leu Glu Val Leu Leu
515 520 525
Lys Pro Arg Leu Thr Phe Gln Gln Ala
530 535

<210> 91
<211> 568
<212> PRT
<213> Stylophorum diphyllum
<400> 91
Met Thr Ile Gly Ala Leu Ala Leu Leu Ser Phe Ile Tyr Phe Leu Arg
1 5 10 15
Val Ser Val Ile Lys Arg Thr Lys Tyr Thr Asn Thr Ala Val Thr Ala
20 25 30
Thr Asn Lys Leu Glu Asn Asp Glu Asp Glu Ala Asn His Ser Lys Arg
35 40 45
Val Val Ala Pro Pro Glu Val Ala Gly Ala Trp Pro Ile Leu Gly His
50 55 60
Leu Pro Gln Leu Val Gly Leu Lys Gln Pro Leu Phe Arg Val Leu Gly
65 70 75 80
Asp Met Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Ile Val Arg Phe Gly Met
85 90 95
Tyr Pro Thr Leu Val Val Ser Ser Trp Glu Met Ala Lys Glu Cys Phe
100 105 110
Thr Thr Asn Asp Arg Val Leu Ala Ser Arg Pro Ala Ser Ala Ser Gly
115 120 125
Lys Tyr Leu Thr Tyr Asn Tyr Ala Met Phe Gly Phe Thr Asn Gly Pro
130 135 140
Tyr Trp Arg Glu Ile Arg Lys Ile Ser Met Leu Glu Leu Leu Ser His
145 150 155 160
Arg Arg Val Glu Leu Leu Lys His Val Pro Ser Thr Glu Ile Asp Ser
165 170 175
Ser Ile Lys Gln Leu Tyr His Leu Trp Val Glu Asn Gln Asn Gln Asn
180 185 190
Lys Gln Gly Asp His Gln Val Lys Val Asp Met Ser Gln Leu Leu Arg
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Asp Leu Thr Leu Asn Ile Val Leu Lys Leu Val Val Gly Lys Arg Leu
210 215 220
Phe Asn Asn Asn Asp Met Asp His Glu Gln Asp Glu Ala Ala Arg Lys
225 230 235 240
Leu Gln Lys Thr Met Val Glu Leu Ile Lys Val Ala Gly Ala Ser Val
245 250 255
Ala Ser Asp Ala Leu Pro Phe Leu Gly Trp Leu Asp Val Asp Gly Leu
260 265 270
Lys Arg Thr Met Lys Arg Ile Ala Lys Glu Ile Asp Val Ile Ala Glu
275 280 285
Arg Trp Leu Gln Glu His Arg Gln Lys Lys Leu Thr Ser Asn Asp Lys
290 295 300
Gly Gly Ser Asn Asn Ile Gln Gly Gly Gly Gly Asp Asn Asp Phe Met
305 310 315 320
Asp Val Met Leu Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ser Asn Phe Phe Ile Asn
325 330 335
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340 345 350
Ala Gly Ser Asp Thr Thr Thr Leu Ser Leu Thr Trp Ala Leu Thr Leu
355 360 365
Leu Ala Thr Asn Pro Gly Ala Leu Arg Lys Ala Gln Asp Glu Leu Asp
370 375 380
Thr Lys Val Gly Arg Asp Arg Gln Val Asp Glu Arg Asp Ile Lys Asn
385 390 395 400
Leu Val Tyr Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Thr Leu Arg Met Tyr Pro
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450 455 460
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465 470 475 480
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515 520 525
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530 535 540
Gly Leu Thr Ile Ser Lys Val Thr Pro Leu Glu Leu Leu Leu Thr Pro
545 550 555 560
Arg Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Ile
565

<210> 92
<211> 561
<212> PRT
<213> Stylophorum diphyllum
<400> 92
Phe Cys Gln Phe Gln Gly Ile Val Gly Ile Leu Leu Ala Phe Leu Thr
1 5 10 15
Phe Leu Tyr Tyr Leu Trp Arg Ala Ser Ile Thr Gly Leu Arg Thr Lys
20 25 30
Pro Lys His Asn Asp Phe Lys Val Thr Lys Ala Ala Pro Glu Ala Asp
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Gly Ala Trp Pro Ile Val Gly His Phe Ala Gln Phe Ile Gly Pro Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Phe Met Val Arg Phe Gly Met Tyr Pro Thr Leu Val Val Ser Ser Trp
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Glu Met Ala Lys Glu Cys Phe Thr Thr Asn Asp Arg Phe Leu Ala Ser
100 105 110
Arg Pro Ala Ser Ala Ala Gly Lys Tyr Leu Thr Tyr Asp Phe Ala Met
115 120 125
Leu Ser Phe Ser Phe Tyr Gly Pro Tyr Trp Arg Glu Ile Arg Lys Ile
130 135 140
Ser Met Leu Glu Leu Leu Ser His Arg Arg Val Glu Leu Leu Lys His
145 150 155 160
Val Pro Ser Thr Glu Ile Asp Ser Ser Ile Lys Gln Leu Tyr His Leu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Glu Gln Asp Glu Ala Ala Arg Lys Leu Gln Lys Thr Met Val Glu Leu
225 230 235 240
Ile Lys Val Ala Gly Ala Ser Val Ala Ser Asp Ala Leu Pro Phe Leu
245 250 255
Gly Trp Leu Asp Val Asp Gly Leu Lys Arg Thr Met Lys Arg Ile Ala
260 265 270
Lys Glu Ile Asp Val Ile Ala Glu Arg Trp Leu Gln Glu His Arg Gln
275 280 285
Lys Lys Leu Thr Ser Asn Asp Lys Gly Gly Ser Asn Asn Ile Gln Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Asp Asn Asp Phe Met Asp Val Met Leu Ser Ile Leu Asp
305 310 315 320
Asp Asp Ser Asn Phe Phe Ile Asn Tyr Asn Arg Asp Thr Val Ile Lys
325 330 335
Ala Thr Ser Leu Thr Met Ile Leu Ala Gly Ser Asp Thr Thr Thr Leu
340 345 350
Ser Leu Thr Trp Ala Leu Thr Leu Leu Ala Thr Tyr Pro Leu Cys Ala
355 360 365
Leu Arg Lys Ala Gln Asp Glu Leu Asp Thr Lys Val Gly Arg Asp Arg
370 375 380
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485 490 495
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545 550 555 560
Ile

<210> 93
<211> 561
<212> PRT
<213> Chelidonium majus
<400> 93
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1 5 10 15
Leu Ala Phe Leu Thr Phe Phe Tyr Tyr Leu Trp Arg Val Ser Ile Thr
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Asp Lys Phe Leu Ala Ser Arg Pro Thr Ser Ala Gly Gly Lys Tyr Leu
115 120 125
Thr Tyr Asp Phe Ala Met Phe Gly Phe Ser Phe Tyr Gly Pro Tyr Trp
130 135 140
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Leu

<210> 94
<211> 561
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 94
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Tyr

<210> 95
<211> 567
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 95
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Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Pro Leu Ser Leu Pro His Glu Ala Met
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565

<210> 96
<211> 558
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 96
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1 5 10 15
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Thr Thr Leu Val Ser Leu Thr Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Thr Asn
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530 535 540
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545 550 555

<210> 97
<211> 571
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 97
Met Met Asp Leu Ala Met Phe Ile Asp Gln Tyr Phe Ser Leu Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ala Gly Leu Leu Ala Leu Leu Ser Phe Phe Tyr Tyr Leu Trp Ile
20 25 30
Ser Thr Leu Trp Ser Pro Arg Asn Pro Lys Leu Ser Ser Val Ser Pro
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Pro Glu Val Ala Gly Ala Trp Pro Ile Leu Gly His Leu Pro Gln Leu
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100 105 110
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115 120 125
Ala Leu Phe Gly Phe Ser Thr Tyr Gly Pro Tyr Trp Arg Glu Ile Arg
130 135 140
Lys Ile Ala Thr Leu His Leu Leu Ser His Arg Arg Leu Glu Leu Leu
145 150 155 160
Lys His Val Pro Asp Leu Glu Val Thr Asn Cys Met Lys His Leu His
165 170 175
Arg Arg Trp Ile Asp Ser Gln Asn Gln Ile Lys Gln Asn Asp Ala Ala
180 185 190
Ala Gly Ser Val Lys Val Asp Met Gly Arg Val Phe Gly Glu Leu Thr
195 200 205
Leu Asn Val Val Leu Lys Leu Val Ala Gly Lys Ser Ile Phe Phe Lys
210 215 220
Asn Asp Asn Thr Arg Gln Tyr Asp Ser Lys Asp Gly His Asn Lys Glu
225 230 235 240
Glu Glu Glu Gly Lys Lys Leu His Lys Thr Ile Ile Asp Phe Tyr Ser
245 250 255
Leu Ala Gly Ala Ser Val Ala Ser Asp Val Leu Pro Phe Leu Gly Trp
260 265 270
Leu Asp Val Asp Gly Gln Lys Lys Arg Met Lys Arg Val Ala Lys Asp
275 280 285
Met Asp Phe Ile Ala Ala Lys Trp Leu Glu Glu His Arg His Gln Lys
290 295 300
Arg Gln Thr Val Leu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Gly Ser Ser Asn His
305 310 315 320
Asp Asp Ala Lys Asp Phe Met Asp Val Leu Met Ser Ile Leu Asp Gly
325 330 335
Glu Asn Asp Asp Leu Phe Phe Gly Tyr Ser Arg Asp Thr Val Ile Lys
340 345 350
Thr Thr Cys Leu Gln Leu Ile Ala Ala Ala Ala Asp Thr Thr Ser Val
355 360 365
Thr Met Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Ile Thr Asn Pro Thr Ile Leu
370 375 380
Arg Lys Ala Gln Asp Glu Leu Asp Thr Lys Val Gly Lys Asp Arg Asn
385 390 395 400
Ile Glu Glu Arg Asp Ile Asn Asp Leu Val Tyr Leu Gln Ala Ile Val
405 410 415
Lys Glu Thr Leu Arg Met Tyr Pro Ala Gly Pro Leu Asn Val Pro His
420 425 430
Glu Ala Ile Ala Asp Cys Asn Ile Gly Gly Tyr Glu Val Arg Ala Gly
435 440 445
Thr Arg Leu Leu Val Asn Leu Trp Lys Met His Arg Asp Pro Arg Val
450 455 460
Trp Ser Asn Pro Ser Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Pro Gln Leu
465 470 475 480
Asp Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Ala Asn Leu Asp Phe Arg Gly Gln
485 490 495
Asp Phe Glu Tyr Leu Pro Phe Ser Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly
500 505 510
Ile Asp Phe Ser Leu Gln Thr Leu His Met Thr Leu Ala Arg Leu Leu
515 520 525
His Gly Phe Asp Phe Asn Asn Asp Ser Ala Gly Ile Ile Ile Asp Met
530 535 540
Glu Glu Gly Ser Gly Leu Thr Met Pro Lys Leu Thr Pro Leu Glu Ile
545 550 555 560
Tyr Leu Cys Pro Arg Leu Pro Ala Lys Leu Tyr
565 570

<210> 98
<211> 361
<212> PRT
<213> Thalictrum flavum
<400> 98
Met Ala Val Glu Gly Lys Gln Val Ala Pro Lys Lys Ala Ile Ile Val
1 5 10 15
Glu Leu Leu Lys Lys Leu Glu Leu Gly Leu Val Pro Asp Asp Glu Ile
20 25 30
Lys Lys Leu Ile Arg Ile Gln Leu Gly Arg Arg Leu Gln Trp Gly Cys
35 40 45
Lys Ser Thr Tyr Glu Glu Gln Ile Ala Gln Leu Val Asn Leu Thr His
50 55 60
Ser Leu Arg Gln Met Lys Ile Ala Thr Glu Val Glu Thr Leu Asp Asp
65 70 75 80
Gln Met Tyr Glu Val Pro Ile Asp Phe Leu Lys Ile Met Asn Gly Ser
85 90 95
Asn Leu Lys Gly Ser Cys Cys Tyr Phe Lys Asn Asp Ser Thr Thr Leu
100 105 110
Asp Glu Ala Glu Ile Ala Met Leu Glu Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gln
115 120 125
Ile Lys Asp Gly His Ser Val Leu Asp Leu Gly Cys Gly Gln Gly Ala
130 135 140
Leu Thr Leu Tyr Val Ala Gln Lys Tyr Lys Asn Ser Arg Val Thr Ala
145 150 155 160
Val Thr Asn Ser Val Ser Gln Lys Glu Phe Ile Glu Glu Glu Ser Arg
165 170 175
Lys Arg Asn Leu Ser Asn Val Glu Val Leu Leu Ala Asp Ile Thr Thr
180 185 190
His Lys Met Pro Asp Thr Tyr Asp Arg Ile Leu Val Val Glu Leu Phe
195 200 205
Glu His Met Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Leu Arg Lys Ile Lys Glu Trp
210 215 220
Met Ala Lys Asp Gly Leu Leu Phe Val Glu His Ile Cys His Lys Thr
225 230 235 240
Phe Ala Tyr His Tyr Glu Pro Ile Asp Glu Asp Asp Trp Phe Thr Glu
245 250 255
Tyr Val Phe Pro Ala Gly Thr Met Ile Ile Pro Ser Ala Ser Phe Phe
260 265 270
Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Val Val Asn His Trp Thr Leu Ser
275 280 285
Gly Lys His Phe Ser Arg Thr Asn Glu Glu Trp Leu Lys Arg Leu Asp
290 295 300
Ala Asn Val Glu Leu Ile Lys Pro Met Phe Val Thr Ile Thr Gly Gln
305 310 315 320
Cys Arg Gln Glu Ala Met Lys Leu Ile Asn Tyr Trp Arg Gly Phe Cys
325 330 335
Leu Ser Gly Met Glu Met Phe Gly Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met
340 345 350
Ala Ser His Val Leu Phe Lys Lys Lys
355 360

<210> 99
<211> 358
<212> PRT
<213> Coptis japonica
<400> 99
Met Ala Val Glu Ala Lys Gln Thr Lys Lys Ala Ala Ile Val Glu Leu
1 5 10 15
Leu Lys Gln Leu Glu Leu Gly Leu Val Pro Tyr Asp Asp Ile Lys Gln
20 25 30
Leu Ile Arg Arg Glu Leu Ala Arg Arg Leu Gln Trp Gly Tyr Lys Pro
35 40 45
Thr Tyr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Ile Gln Asn Leu Thr His Ser Leu
50 55 60
Arg Gln Met Lys Ile Ala Thr Glu Val Glu Thr Leu Asp Ser Gln Leu
65 70 75 80
Tyr Glu Ile Pro Ile Glu Phe Leu Lys Ile Met Asn Gly Ser Asn Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Cys Cys Tyr Phe Lys Glu Asp Ser Thr Thr Leu Asp Glu
100 105 110
Ala Glu Ile Ala Met Leu Asp Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Ile Gln
115 120 125
Asp Gly Gln Ser Val Leu Asp Leu Gly Cys Gly Gln Gly Ala Leu Thr
130 135 140
Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys Asn Cys Arg Val Thr Ala Val Thr
145 150 155 160
Asn Ser Val Ser Gln Lys Glu Tyr Ile Glu Glu Glu Ser Arg Arg Arg
165 170 175
Asn Leu Leu Asn Val Glu Val Lys Leu Ala Asp Ile Thr Thr His Glu
180 185 190
Met Ala Glu Thr Tyr Asp Arg Ile Leu Val Ile Glu Leu Phe Glu His
195 200 205
Met Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Leu Arg Lys Ile Ser Glu Trp Ile Ser
210 215 220
Lys Asp Gly Leu Leu Phe Leu Glu His Ile Cys His Lys Thr Phe Ala
225 230 235 240
Tyr His Tyr Glu Pro Leu Asp Asp Asp Asp Trp Phe Thr Glu Tyr Val
245 250 255
Phe Pro Ala Gly Thr Met Ile Ile Pro Ser Ala Ser Phe Phe Leu Tyr
260 265 270
Phe Gln Asp Asp Val Ser Val Val Asn His Trp Thr Leu Ser Gly Lys
275 280 285
His Phe Ser Arg Thr Asn Glu Glu Trp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Asn
290 295 300
Leu Asp Val Ile Lys Pro Met Phe Glu Thr Leu Met Gly Asn Glu Glu
305 310 315 320
Glu Ala Val Lys Leu Ile Asn Tyr Trp Arg Gly Phe Cys Leu Ser Gly
325 330 335
Met Glu Met Phe Gly Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met Ala Ser His
340 345 350
Val Leu Phe Lys Lys Lys
355

<210> 100
<211> 351
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 100
Met Gln Leu Lys Ala Lys Glu Glu Leu Leu Arg Asn Met Glu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Ile Pro Asp Gln Glu Ile Arg Gln Leu Ile Arg Val Glu Leu Glu
20 25 30
Lys Arg Leu Gln Trp Gly Tyr Lys Glu Thr His Glu Glu Gln Leu Ser
35 40 45
Gln Leu Leu Asp Leu Val His Ser Leu Lys Gly Met Lys Met Ala Thr
50 55 60
Glu Met Glu Asn Leu Asp Leu Lys Leu Tyr Glu Ala Pro Met Glu Phe
65 70 75 80
Leu Lys Ile Gln His Gly Ser Asn Met Lys Gln Ser Ala Gly Tyr Tyr
85 90 95
Thr Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Ile Ala Met Leu Asp
100 105 110
Leu Tyr Met Glu Arg Ala Gln Ile Lys Asp Gly Gln Ser Val Leu Asp
115 120 125
Leu Gly Cys Gly Leu Gly Ala Val Ala Leu Phe Gly Ala Asn Lys Phe
130 135 140
Lys Lys Cys Gln Phe Thr Gly Val Thr Ser Ser Val Glu Gln Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Ile Glu Gly Lys Cys Lys Glu Leu Lys Leu Thr Asn Val Lys Val
165 170 175
Leu Leu Ala Asp Ile Thr Thr Tyr Glu Thr Glu Glu Arg Phe Asp Arg
180 185 190
Ile Phe Ala Val Glu Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Gln Leu Leu
195 200 205
Leu Lys Lys Ile Ser Glu Trp Met Lys Asp Asp Gly Leu Leu Phe Val
210 215 220
Glu His Val Cys His Lys Thr Leu Ala Tyr His Tyr Glu Pro Val Asp
225 230 235 240
Ala Glu Asp Trp Tyr Thr Asn Tyr Ile Phe Pro Ala Gly Thr Leu Thr
245 250 255
Leu Ser Ser Ala Ser Met Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Val
260 265 270
Val Asn Gln Trp Thr Leu Ser Gly Lys His Tyr Ser Arg Ser His Glu
275 280 285
Glu Trp Leu Lys Asn Met Asp Lys Asn Ile Val Glu Phe Lys Glu Ile
290 295 300
Met Arg Ser Ile Thr Lys Thr Glu Lys Glu Ala Ile Lys Leu Leu Asn
305 310 315 320
Phe Trp Arg Ile Phe Cys Met Cys Gly Ala Glu Leu Phe Gly Tyr Lys
325 330 335
Asn Gly Glu Glu Trp Met Leu Thr His Leu Leu Phe Lys Lys Lys
340 345 350

<210> 101
<211> 358
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 101
Met Gly Ser Ile Asp Glu Val Lys Lys Glu Ser Ala Gly Glu Thr Leu
1 5 10 15
Gly Arg Leu Leu Lys Gly Glu Ile Lys Asp Glu Glu Leu Lys Lys Leu
20 25 30
Ile Lys Phe Gln Phe Glu Lys Arg Leu Gln Trp Gly Tyr Lys Ser Ser
35 40 45
His Gln Glu Gln Leu Ser Phe Asn Leu Asp Phe Ile Lys Ser Leu Lys
50 55 60
Lys Met Glu Met Ser Gly Glu Ile Glu Thr Met Asn Lys Glu Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Leu Pro Ser Glu Phe Leu Glu Ala Val Phe Gly Lys Thr Val Lys
85 90 95
Gln Ser Met Cys Tyr Phe Thr His Glu Ser Ala Thr Ile Asp Glu Ala
100 105 110
Glu Glu Ala Ala His Glu Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Ile Lys Asp
115 120 125
Gly Gln Thr Val Leu Asp Ile Gly Cys Gly Gln Gly Gly Leu Val Leu
130 135 140
Tyr Ile Ala Gln Lys Tyr Lys Asn Cys His Val Thr Gly Leu Thr Asn
145 150 155 160
Ser Lys Ala Gln Val Asn Tyr Leu Leu Lys Gln Ala Glu Lys Leu Gly
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180 185 190
Asp Lys Thr Tyr Asp Arg Leu Leu Met Ile Glu Ala Ile Glu His Met
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210 215 220
Glu Ser Leu Leu Phe Val Asp His Val Cys His Lys Thr Phe Ala His
225 230 235 240
Phe Phe Glu Ala Val Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Ser Gly Phe Ile Phe
245 250 255
Pro Pro Gly Cys Ala Thr Ile Leu Ala Ala Asn Ser Leu Leu Tyr Phe
260 265 270
Gln Asp Asp Val Ser Val Val Asp His Trp Val Val Asn Gly Met His
275 280 285
Met Ala Arg Ser Val Asp Ile Trp Arg Lys Ala Leu Asp Lys Asn Met
290 295 300
Glu Ala Ala Lys Glu Ile Leu Leu Pro Gly Leu Gly Gly Ser His Glu
305 310 315 320
Thr Val Asn Gly Val Val Thr His Ile Arg Thr Phe Cys Met Gly Gly
325 330 335
Tyr Glu Gln Phe Ser Met Asn Asn Gly Asp Glu Trp Met Val Ala Gln
340 345 350
Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355

<210> 102
<211> 350
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 102
Met Gly Ser Ser Ala Gly Glu Ile Met Gly Arg Leu Met Lys Gly Glu
1 5 10 15
Ile Glu Asp Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Arg His Gln Trp Asp Arg
20 25 30
Arg Ile Glu Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His Glu Lys Gln Leu Ala Phe
35 40 45
Asn Leu Asp Phe Ile Lys Gly Leu Lys Glu Met Val Met Ser Gly Glu
50 55 60
Ile Asp Thr Met Asn Lys Glu Thr Tyr Glu Leu Pro Thr Ala Phe Leu
65 70 75 80
Glu Ala Val Phe Gly Lys Thr Val Lys Gln Ser Cys Cys Tyr Phe Lys
85 90 95
Asp Glu Asn Ser Thr Ile Asp Glu Ala Glu Glu Ala Ala His Glu Leu
100 105 110
Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Ile Lys Asp Gly Gln Thr Val Leu Asp Ile
115 120 125
Gly Cys Gly Gln Gly Gly Leu Val Leu Tyr Ile Ala Glu Lys Tyr Lys
130 135 140
Asn Cys His Val Thr Gly Leu Thr Asn Ser Lys Ala Gln Ala Asn Tyr
145 150 155 160
Ile Glu Gln Gln Ala Glu Lys Leu Glu Leu Thr Asn Val Asp Val Ile
165 170 175
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180 185 190
Leu Val Val Glu Thr Ile Glu His Met Lys Asn Ile Gln Leu Phe Met
195 200 205
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210 215 220
His Ile Ser His Lys Thr Phe Asn His Asn Phe Glu Ala Leu Asp Glu
225 230 235 240
Asp Asp Trp Tyr Ser Gly Phe Ile Phe Pro Lys Gly Cys Val Thr Ile
245 250 255
Leu Ser Ser Ser Thr Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Ala Leu
260 265 270
Asp His Trp Val Val Asn Gly Met His Met Ala Arg Ser Val Glu Ala
275 280 285
Trp Arg Lys Lys Leu Asp Glu Thr Ile Glu Ala Ala Arg Glu Ile Leu
290 295 300
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325 330 335
Gly Glu Glu Trp Met Ile Thr Gln Ile Leu Phe Lys Lys Lys
340 345 350

<210> 103
<211> 363
<212> PRT
<213> Papaver somniferum
<400> 103
Met Ser Thr Thr Met Glu Thr Thr Lys Ile Ser Gln Gln Asp Asp Leu
1 5 10 15
Trp Lys Asn Met Glu Leu Gly Gln Ile Ser Asp Glu Glu Val Arg Arg
20 25 30
Leu Met Lys Ile Gly Ile Glu Lys Arg Ile Lys Trp Gly Thr Lys Pro
35 40 45
Thr Gln Gln Glu Gln Leu Ala Gln Leu Leu Asp Phe Asn Lys Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Met Lys Met Ala Thr Glu Ile Asp Thr Leu Glu Asn His Lys
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Thr Pro Glu Ser Phe Asn Gln Ile Ile Gly Gly Lys Glu
85 90 95
Ser Ala Gly Leu Phe Thr Asp Glu Thr Thr Thr Thr Met Glu Glu Ala
100 105 110
Asn Thr Lys Met Met Asp Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gly Leu Lys Asp
115 120 125
Gly His Thr Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Leu Leu Val Leu
130 135 140
His Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Lys Ser Lys Ile Thr Gly Ile Thr Asn
145 150 155 160
Thr Ser Ser His Lys Glu Tyr Ile Leu Lys Gln Cys Lys Asn Leu Asn
165 170 175
Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile Leu Ala Asp Val Thr Lys Val Asp Ile
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
His Trp Glu Pro Leu Ser Glu Asp Asp Trp Tyr Ala Lys Asn Phe Phe
245 250 255
Pro Ser Gly Thr Leu Val Ile Pro Ser Ala Thr Cys Leu Leu Tyr Phe
260 265 270
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275 280 285
Phe Ala Arg Ser Asn Glu Val Ile Leu Lys Arg Ile Asp Gly Lys Ile
290 295 300
Glu Glu Val Lys Asp Ile Phe Met Ser Phe Tyr Gly Ile Gly Arg Glu
305 310 315 320
Glu Ala Val Lys Leu Ile Asn Trp Trp Arg Leu Leu Cys Ile Thr Ala
325 330 335
Asn Glu Leu Phe Lys Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Leu Ile Ser Gln
340 345 350
Leu Leu Phe Lys Lys Lys Leu Met Thr Cys Ile
355 360

<210> 104
<211> 356
<212> PRT
<213> Thalictrum flavum
<400> 104
Met Glu Thr Lys Gln Thr Lys Lys Glu Ala Val Ala Asn Leu Ile Lys
1 5 10 15
Arg Ile Glu His Gly Glu Val Ser Asp Glu Glu Ile Arg Gly Met Met
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Lys Ile Gln Val Gln Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Val Ser Gln Lys Glu Phe Ile Met Asp Gln Cys Lys Lys Leu Asp Leu
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180 185 190
Ile Thr Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Val Ala Leu Ile Glu His Met Lys
195 200 205
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210 215 220
Gly Leu Leu Phe Val Glu His His Cys His Lys Val Phe Ala Tyr Gln
225 230 235 240
Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Thr Glu Tyr Ile Phe Pro
245 250 255
Ser Gly Thr Leu Val Met Ser Ser Ser Ser Ile Leu Leu Tyr Phe Gln
260 265 270
Glu Asp Val Ser Val Val Asn His Trp Thr Leu Ser Gly Lys His Pro
275 280 285
Ser Leu Gly Phe Lys Gln Trp Leu Lys Arg Leu Asp Asp Asn Ile Asp
290 295 300
Glu Val Lys Glu Ile Phe Glu Ser Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Lys Ala
305 310 315 320
Met Lys Phe Ile Thr Tyr Trp Arg Val Phe Cys Ile Ala His Ser Gln
325 330 335
Met Tyr Ser Thr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met Leu Ser Gln Val Leu
340 345 350
Phe Lys Lys Lys
355

<210> 105
<211> 358
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 105
Met Gly Ser Ile Asp Glu Val Lys Lys Glu Ser Ala Gly Glu Thr Leu
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Gly Arg Leu Leu Lys Gly Glu Ile Lys Asp Glu Glu Leu Lys Lys Leu
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Ile Lys Phe Gln Phe Glu Lys Arg Leu Gln Trp Gly Tyr Lys Ser Ser
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115 120 125
Gly Gln Thr Val Leu Asp Ile Gly Cys Gly Gln Gly Gly Leu Val Leu
130 135 140
Tyr Ile Ala Arg Lys Tyr Lys Lys Cys His Val Thr Gly Leu Thr Asn
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Ser Lys Ala Gln Val Asn Tyr Leu Leu Lys Gln Ala Glu Lys Leu Gly
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180 185 190
Asp Lys Thr Tyr Asp Arg Leu Leu Met Ile Glu Ala Ile Glu His Met
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Lys Asn Leu Gln Leu Phe Met Lys Lys Leu Ser Thr Trp Met Thr Glu
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Glu Ser Leu Leu Phe Val Asp His Val Cys His Lys Thr Phe Ala His
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Glu Ala Ala Lys Glu Ile Leu Leu Pro Gly Leu Gly Gly Ser His Glu
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Tyr Glu Gln Phe Ser Met Asn Asp Gly Asp Glu Trp Met Val Ala Gln
340 345 350
Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355

<210> 106
<211> 358
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 106
Met Gly Ser Ile Glu Glu Val Lys Lys Glu Ser Ala Glu Glu Thr Leu
1 5 10 15
Gly Arg Leu Leu Arg Gly Glu Ile Asn Asp Glu Glu Leu Lys Lys Leu
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Ile Lys Tyr Gln Leu Glu Lys Arg Leu Gln Trp Gly Tyr Lys Ser Ser
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Leu Ser Gly Cys Tyr Phe Lys His Glu Ser Ser Thr Ile Asp Glu Ala
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Tyr Val Ala Gln Lys Tyr Lys Asn Cys His Val Thr Gly Leu Thr Asn
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Ser Lys Glu Gln Val Asn Tyr Ile Leu Lys Gln Ala Glu Lys Leu Gly
165 170 175
Leu Arg Asn Val Asp Val Ile Leu Ala Asp Val Thr Gln Tyr Glu Ser
180 185 190
Asp Lys Thr Tyr Asp Arg Ile Leu Val Ile Gly Val Val Glu His Met
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Lys Asn Met Gln Leu Phe Ile Lys Lys Leu Ser Thr Trp Met Ala Glu
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Asp Ser Leu Leu Phe Val Asp His Ser Cys His Lys Thr Phe Asn His
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Phe Phe Glu Ala Leu Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Ser Gly Tyr Ile Phe
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Pro Pro Gly Cys Ala Thr Phe Leu Ser Ala Asp Ser Leu Leu Tyr Phe
260 265 270
Gln Asp Asp Val Ser Val Val Asp His Trp Val Val Asn Gly Met His
275 280 285
Phe Ala Arg Thr Val Asp Ala Trp Arg Lys Lys Leu Asp Lys Asn Met
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Glu Ala Val Lys Glu Ile Leu Leu Pro Gly Leu Gly Gly Asn His Glu
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Tyr Val Gln Phe Ser Leu Asn Asp Gly Asp Glu Trp Met Asn Ala Gln
340 345 350
Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355

<210> 107
<211> 368
<212> PRT
<213> Argemone mexicana
<400> 107
Met Cys Leu Phe Phe Ala Glu Lys Met Gly Leu Met Ala Glu Ala Asn
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Gly Leu Ile Pro Asp Glu Glu Ile Arg Lys Leu Ile Arg Val Gln Leu
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Ser Gln Leu Leu His Leu Val His Ser Leu Lys Lys Met Lys Ile Ala
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Phe Val Gln Ile Gln His Gly Ser Thr Ile Lys Glu Ser Ser Gly Leu
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Phe Lys Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Ile Ala Met Leu
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Asp Leu Tyr Thr Lys Arg Ala Lys Ile Glu Asp Gly Gln Ser Val Leu
130 135 140
Asp Leu Gly Cys Gly Leu Gly Ala Val Thr Leu Tyr Val Ala Gln Lys
145 150 155 160
Phe Lys Asn Cys Tyr Val Thr Gly Ile Thr Ser Ser Val Glu Gln Lys
165 170 175
Asp Phe Ile Glu Gly Arg Cys Lys Glu Leu Lys Leu Ser Asn Val Lys
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Val Ile Leu Ala Asp Ile Thr Thr Tyr Glu Thr Glu Glu Lys Tyr Asn
195 200 205
Arg Ile Phe Ala Val Glu Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Glu Leu
210 215 220
Leu Leu Arg Lys Ile Ser Glu Trp Met Lys Gln Asp Gly Leu Leu Phe
225 230 235 240
Ile Glu His Val Cys His Lys Thr Leu Ala Tyr His Tyr Glu Pro Leu
245 250 255
Asp Glu Glu Asp Trp Tyr Thr Asn Tyr Ile Phe Pro Ala Gly Thr Leu
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Ala Thr Leu Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ala
275 280 285
Val Val Asp Gln Trp Thr Leu Ser Gly Lys His Tyr Ser Arg Ser His
290 295 300
Glu Glu Trp Leu Lys Arg Ile Asp Gly Asn Ile Glu Glu Val Lys Glu
305 310 315 320
Ile Met Lys Ser Ile Thr Lys Ser Glu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu
325 330 335
Asn Phe Trp Arg Ile Phe Cys Met Cys Gly Ala Glu Leu Phe Gly Tyr
340 345 350
Lys Asn Gly Glu Glu Trp Met Met Thr His Ile Leu Phe Lys Lys Lys
355 360 365

<210> 108
<211> 364
<212> PRT
<213> Glaucium flavum
<400> 108
Met Asp Leu Met Ala Thr Ser Lys Gln Val Lys Lys Lys Glu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Lys Asn Met Glu Leu Gly Leu Val Pro Asp Glu Glu Ile Arg Arg
20 25 30
Leu Ile Arg Ile Glu Leu Glu Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr Lys Pro
35 40 45
Thr His Gln Gln Gln Leu Ala Gln Leu Leu Asp Leu Val His Ser Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Glu Ala Pro Phe Ser Phe Val Gln Ile Lys His Gly Ser Thr Ile
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100 105 110
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115 120 125
Asp Gly Gln Ser Val Leu Asp Leu Gly Cys Gly Leu Gly Ala Val Thr
130 135 140
Leu His Val Ala Lys Lys Tyr Lys Asn Cys His Val Thr Gly Leu Thr
145 150 155 160
Asn Ser Val Glu Gln Lys Asp Phe Ile Glu Gly Lys Cys Lys Glu Leu
165 170 175
Asn Leu Ser Asn Val Lys Val Ile Leu Ala Asp Val Thr Ser His Glu
180 185 190
Met Glu Asp Lys Phe Asp Arg Ile Phe Ala Val Glu Leu Ile Glu His
195 200 205
Met Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Leu Arg Arg Ile Ser Lys Trp Met Lys
210 215 220
Asp Asp Gly Leu Leu Phe Ile Glu His Val Cys His Lys Thr Phe Ala
225 230 235 240
Tyr His Tyr Glu Pro Ile Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Thr Glu Tyr Ile
245 250 255
Phe Pro Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Leu Tyr
260 265 270
Phe Gln Asp Asp Val Ser Val Val Asn His Trp Thr Leu Ser Gly Lys
275 280 285
His Tyr Ser Arg Ser His Glu Glu Trp Leu Lys Arg Ile Asp Gly Asn
290 295 300
Met Asp Ala Val Lys Glu Ile Met Lys Ser Ile Thr Lys Thr Glu Glu
305 310 315 320
Glu Ala Val Lys Leu Ile Asn Phe Trp Arg Ile Phe Cys Met Cys Gly
325 330 335
Ala Glu Leu Phe Gly Tyr Lys Asp Gly Glu Glu Trp Met Met Ser His
340 345 350
Val Leu Phe Lys Lys Lys Gln Leu Leu Gln Gln Cys
355 360

<210> 109
<211> 353
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 109
Met Val Asp Leu Lys Val Glu Lys Glu Glu Leu Leu Lys Ser Met Glu
1 5 10 15
Leu Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Ile Arg Lys His Ile Arg Ser Gln
20 25 30
Leu Glu Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr Lys Pro Asn His Glu Gln Gln
35 40 45
Leu Ala Gln Leu Leu Asp Val Ile His Ser Leu Lys Lys Met Lys Ile
50 55 60
Ser Lys Glu Tyr Glu Ser Phe Asp Leu Arg Leu Tyr Glu Ala Pro Phe
65 70 75 80
Asp Phe His Lys Ile Gln Leu Gly Thr His Leu Lys Glu Ser Cys Ser
85 90 95
Tyr Tyr Lys Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Gly Ala Met
100 105 110
Leu Asp Leu Tyr Thr Gln Lys Ala Lys Ile Glu Asp Gly Gln Ser Ile
115 120 125
Leu Asp Leu Gly Cys Gly Val Gly Ala Val Thr Leu Phe Val Ala Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Asp Phe Ile Glu Asn Lys Cys Lys Glu Leu Asn Leu Thr Asn Val
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Arg Val Ile Ile Gly Asp Val Thr Ala Tyr Glu Met Glu Glu Thr Phe
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Asp Arg Ile Phe Ala Ile Glu Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Glu
195 200 205
Leu Leu Leu Arg Lys Ile Ser Lys Trp Met Lys Asp Asp Gly Leu Leu
210 215 220
Phe Ile Glu His Val Cys His Lys Ile Leu Ala Tyr Pro Tyr Glu Pro
225 230 235 240
Ile Asp Glu Glu Asp Trp Phe Thr Glu Tyr Ile Phe Pro Gly Gly Thr
245 250 255
Leu Thr Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val
260 265 270
Ser Val Val Glu His Ser Ser Leu Asn Gly Lys His Tyr Ser Arg Ser
275 280 285
His Gly Glu Trp Leu Lys Asn Ile Asp Ala Asn Ile Asp Glu Val Lys
290 295 300
Gly Ile Met Arg Ser Ile Thr Lys Thr Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu
305 310 315 320
Val Asn Phe Trp Arg Ile Phe Cys Met Cys Gly Ile Glu Leu Phe Gly
325 330 335
Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met Val Ser His Ile Leu Leu Lys Lys
340 345 350
Lys

<210> 110
<211> 359
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 110
Met Ala Ala Asp Leu Val Val Lys Lys Trp Asn Asn Lys Lys Glu Leu
1 5 10 15
Ile Asp Glu Met Glu Leu Gly Leu Val Gly Asp Glu Glu Ile Arg Glu
20 25 30
Leu Ile Arg Asn Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr Lys Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Tyr Glu Ala Pro Phe Ser Phe Asn Lys Ile Gln Leu Gly Ser Ser
85 90 95
Leu Lys Glu Ser Ser Cys Tyr Tyr Lys His Asp Glu Thr Thr Leu Asp
100 105 110
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115 120 125
Lys Asp Gly Gln Ser Val Leu Asp Leu Gly Cys Gly Leu Gly Ser Leu
130 135 140
Thr Leu Tyr Val Ala Asn Lys Tyr Pro Asn Cys Lys Val Thr Gly Thr
145 150 155 160
Thr Ala Ser Leu Trp His Lys Asp Phe Ile Glu Ser Lys Cys Lys Glu
165 170 175
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180 185 190
Glu Met Glu Glu Arg Phe Asp Arg Ile Leu Ala Ile Gly Leu Ile Glu
195 200 205
His Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ser Lys Trp Leu
210 215 220
Lys Asp Asp Gly Phe Leu Phe Ile Gln His Val Cys His Lys Thr Leu
225 230 235 240
Ala Tyr Pro Leu Val Pro Val Asp Glu Glu Asp Trp Ile Gly Glu Tyr
245 250 255
Ile Phe Pro Gly Gly Thr Leu Thr Met Pro Ser Ala Ser Leu Leu Leu
260 265 270
Tyr Phe Gln Asp Glu Leu Ser Val Val Asp His Ser Thr Leu Asn Gly
275 280 285
Lys His Phe Ser Arg Thr His Glu Glu Trp Leu Lys Asn Ile Asp Ala
290 295 300
Lys Ile Asp Glu Val Lys Glu Ile Leu Lys Ser Val Thr Lys Thr Glu
305 310 315 320
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325 330 335
Gly Val Glu Met Phe Gly Tyr Asn Glu Gly Glu Glu Trp Met Leu Ser
340 345 350
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355

<210> 111
<211> 353
<212> PRT
<213> Chelidonium majus
<400> 111
Met Ala Ser Gly Lys Val Val Asp Leu Leu Lys Arg Leu Asp Ser Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Glu Ile Gln Leu Gly Ser Thr Leu Lys Glu Ser Cys Leu Tyr Phe
85 90 95
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100 105 110
Leu Tyr Leu Glu Arg Ala Gln Ile Lys Asp Gly Gln Ile Ile Leu Asp
115 120 125
Leu Gly Cys Gly Leu Gly Ala Leu Ala Phe His Ile Ala Gln Lys Tyr
130 135 140
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Phe Ile Glu Glu Lys Cys Lys Ile Leu Asn Val Ser Asn Val Lys Val
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Phe Ile Pro Ser Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Val
260 265 270
Val Asn His Trp Thr Leu Ser Gly Lys His Phe Ser Arg Ser Asn Glu
275 280 285
Glu Trp Leu Lys Arg Met Asp Asn Lys Ile Asp Glu Val Lys Glu Ile
290 295 300
Tyr Lys Ala Ala Ala Ser Glu Thr Lys Asp Asp Asp Ile Met Lys Leu
305 310 315 320
Ile Arg Leu Trp Arg Phe Leu Ser Ile Ser Ala Ala Glu Met Phe Gly
325 330 335
Tyr Lys Asp Gly Glu Glu Trp Met Ile Ser Gln Val Leu Phe Lys Lys
340 345 350
Lys

<210> 112
<211> 366
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 112
Met Ala Ser Leu Val Glu Glu Gly Ser Phe Val Asn Asn Lys Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Glu Arg Val Ser Glu Leu Val Lys Arg Leu Lys Asn Gly Leu
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Val Ser Asp Glu Glu Leu Arg Lys Leu Met Arg Val Glu Leu Glu Lys
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Tyr Leu Glu Arg Ala Gln Ile Lys Asp Gly Gln Ser Ile Leu Asp Leu
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Ile Ala Ile Gly Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Leu
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His Leu Cys His Lys Thr Phe Gly Tyr His Asn Glu Pro Leu Asp Glu
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260 265 270
Ile Pro Ser Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Val Val
275 280 285
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305 310 315 320
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<213> Glaucium flavum
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Leu Arg Lys Leu Ile Arg Phe Glu Leu Glu Arg Arg Leu Lys Trp Gly
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Leu Ala Tyr His Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Thr
245 250 255
Glu Tyr Phe Phe Pro Ala Gly Thr Leu Thr Ile Ile Ser Ser Ser Phe
260 265 270
Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Ile Val Asn His Trp Ser Leu
275 280 285
Ser Gly Lys His Phe Ser Arg Ser Asn Glu Glu Trp Leu Lys Arg Met
290 295 300
Asp Met Lys Ile Asp Glu Val Lys Glu Ile Leu Glu Ala Ala Phe Glu
305 310 315 320
Asn Lys Asp His Asp Ile Thr Lys Leu Ile Asn His Trp Arg Phe Leu
325 330 335
Ala Ile Asn Ala Thr Glu Met Phe Gly Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp
340 345 350
Met Val Ser Gln Val Leu Phe Lys Lys Lys
355 360

<210> 114
<211> 365
<212> PRT
<213> Sanguinaria canadensis
<400> 114
Met Ala Ser Asp His Glu Val Ser Asn Lys Glu Leu Lys Lys Lys Lys
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Ile Gly Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Leu Lys Lys
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225 230 235 240
Cys His Lys Thr Leu Ala Tyr His Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Asp Asp
245 250 255
Trp Tyr Thr Glu Tyr Phe Phe Pro Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ile Ser
260 265 270
Ser Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Val Ser Val Val Asp His
275 280 285
Trp Thr Leu Ser Gly Lys His Phe Ser Arg Ser Asn Glu Glu Trp Leu
290 295 300
Lys Arg Met Asp Glu Lys Ile Asp Glu Val Lys Glu Ile Phe Glu Ser
305 310 315 320
Val Ser Asp Ser Lys Asp Asp Asp Val Thr Lys Leu Ile Asn His Trp
325 330 335
Arg Phe Phe Cys Ile Ser Ser Ala Glu Met Phe Gly Tyr Asn Asn Gly
340 345 350
Glu Glu Trp Met Ile Ser Gln Val Leu Phe Lys Lys Lys
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<213> Corydalis chelanthifolia
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Arg Phe Glu Leu Glu Arg Arg Leu Gln Trp Gly Tyr Lys Ser Ile His
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210 215 220
Asn Tyr Glu Leu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Lys Trp Met Lys Gln Asp
225 230 235 240
Gly Leu Leu Phe Ile Glu His Phe Cys His Lys Thr Leu Ala Tyr His
245 250 255
Tyr Lys Pro Ile Asp Glu Asp Asp Trp Phe Thr Asn Leu Leu Tyr Pro
260 265 270
Asn Gly Thr Val Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp
275 280 285
Val Ser Val Val Asp His Trp Ser Leu Ser Gly Lys His Phe Ser Arg
290 295 300
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Lys Lys Leu
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<210> 116
<211> 373
<212> PRT
<213> Corydalis chelanthifolia
<400> 116
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50 55 60
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65 70 75 80
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Gly Thr Leu Thr Ser Ala Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Leu
275 280 285
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Tyr Asn Asp Gly Glu Glu Trp Met Ile Ser His Phe Leu Phe Lys Asn
355 360 365
Lys Lys Gln Ile Glu
370

<210> 117
<211> 366
<212> PRT
<213> Corydalis chelanthifolia
<400> 117
Met Ala Thr Ser Asp Gln Glu Val Lys Thr Ser Lys Met Glu Met Ile
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Ala Asp Leu Leu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Leu Val Pro Asp Asp Glu
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Ile Arg Ser Leu Ile Arg Val Glu Leu Glu Arg Arg Leu Lys Trp Gly
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275 280 285
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325 330 335
Cys Ile Ser Ser Ala Glu Met Phe Ala Tyr Asn Asp Gly Glu Glu Trp
340 345 350
Met Asn Ser His Val Leu Phe Lys Lys Lys Lys Gln Ile Gln
355 360 365

<210> 118
<211> 359
<212> PRT
<213> Corydalis chelanthifolia
<400> 118
Met Ala Gly Ser Gly Ala Asn Lys Glu Met Ile Ala Asp Leu Leu Lys
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Arg Leu Glu Val Gly Leu Val Pro Asp Glu Glu Ile Arg Ser Leu Ile
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130 135 140
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Val Ser Gln Lys Glu Phe Ile Glu Glu Lys Ser Lys Thr Leu Asn Leu
165 170 175
Pro Asn Val Lys Val Ile Leu Ala Asp Ile Thr Thr Leu Glu Met Asp
180 185 190
Asp Thr Tyr Asp Cys Leu Phe Ala Ile Gly Leu Ile Glu His Met Lys
195 200 205
Asn Tyr Glu Leu Leu Leu Arg Lys Leu Ser Asn Trp Met Lys Gln Asp
210 215 220
Ser Leu Leu Phe Ile Asp His Val Cys His Lys Thr Leu Ala Tyr His
225 230 235 240
Tyr Glu Pro Ile Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Thr Asn Leu Leu Phe Pro
245 250 255
Ala Gly Thr Leu Thr Leu Val Ser Ala Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln
260 265 270
Asp Asp Leu Ser Leu Val Asp His Trp Ser Met Ser Gly Lys His Phe
275 280 285
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Lys Ile Arg Glu Ile Val Lys Ser Ile Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val
305 310 315 320
Val Lys Leu Ile Asn His Trp Arg Met Leu Cys Ile Asn Ser Ser Glu
325 330 335
Met Phe Gly Phe Asn Asp Gly Glu Glu Trp Met Asn Ser His Val Leu
340 345 350
Phe Lys Lys Lys Lys Gln Ile
355

<210> 119
<211> 353
<212> PRT
<213> Sanguinaria canadensis
<400> 119
Met Glu Met Ile Ala Asp Leu Leu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Leu Val
1 5 10 15
Pro Asp Asp Glu Ile Arg Ser Leu Ile Arg Val Glu Leu Glu Arg Arg
20 25 30
Leu Lys Trp Gly Tyr Lys Ser Thr His Gln Glu Gln Leu Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asn Leu Ala His Ser Ile Lys Lys Met Lys Ile Ala Ser Thr Glu
50 55 60
Met Asp Gly Leu Thr Ser Thr Met Tyr Glu Val Pro Ile Ser Leu Val
65 70 75 80
Gln Ile Gln Leu Gly Ser His Leu Lys Glu Ser Cys Leu Tyr Phe Lys
85 90 95
Asp Glu Thr Thr Thr Val Asp Glu Ala Glu Ile Ala Met Met Asp Leu
100 105 110
Tyr Leu Glu Arg Ala Gln Ile Lys Asp Gly Gln Ser Ile Leu Asp Leu
115 120 125
Gly Cys Gly Leu Gly Ser Val Cys Phe His Ile Ala Arg Lys Tyr Thr
130 135 140
Ser Cys Asn Ile Thr Ala Val Thr Asn Ser Val Ser Gln Lys Glu Phe
145 150 155 160
Ile Glu Glu Lys Ser Lys Thr Leu Asn Val Pro Asn Val Lys Val Leu
165 170 175
Leu Ala Asp Ile Thr Thr Leu Glu Met Asp Asp Thr Phe Asp Cys Leu
180 185 190
Phe Ala Ile Gly Leu Ile Glu His Met Glu Asn Tyr Glu Leu Leu Leu
195 200 205
Arg Lys Leu Ser Asp Trp Met Lys Gln Asp Gly Leu Leu Phe Ile Asp
210 215 220
His Val Cys His Lys Thr Leu Ser Tyr His Phe Glu Pro Met Asp Glu
225 230 235 240
Asp Asp Trp Tyr Thr Asn Leu Leu Phe Pro Ala Gly Thr Leu Thr Leu
245 250 255
Val Ser Ala Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Leu Ser Leu Val
260 265 270
Asp His Trp Ser Met Ser Gly Lys His Phe Ser Arg Thr Asn Lys Glu
275 280 285
Trp Leu Lys Asn Ile Asp Gly Lys Met Asp Lys Ile Arg Glu Ile Val
290 295 300
Lys Ser Ile Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val Val Lys Leu Ile Asn His
305 310 315 320
Trp Arg Met Leu Cys Ile Asn Ser Ser Glu Met Phe Gly Phe Asn Asp
325 330 335
Gly Glu Glu Trp Met Asn Ser His Val Leu Phe Lys Lys Lys Lys Gln
340 345 350
Ile

<210> 120
<211> 363
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 120
Met Cys Thr Thr Met Asp Thr Thr Lys Ile Ser Gln Gln Asp Asp Leu
1 5 10 15
Trp Lys Asn Met Glu Leu Gly Leu Ile Ser Asp Glu Glu Val Arg Arg
20 25 30
Leu Met Lys Ile Glu Thr Glu Lys Arg Ile Lys Trp Gly Thr Lys Pro
35 40 45
Thr Gln Gln Glu Gln Leu Ala Gln Leu Leu Asp Phe Asn Lys Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Met Lys Met Ala Thr Glu Val His Ala Leu Glu Asn His Lys
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Ile Pro Asp Ser Phe Asn Gln Ile Ile Gly Gly Lys Glu
85 90 95
Ser Ala Gly Leu Phe Thr Asp Glu Ala Thr Thr Thr Ile Glu Glu Ala
100 105 110
Asn Thr Lys Met Met Asp Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gly Leu Lys Asp
115 120 125
Gly Gln Thr Ile Leu Asp Ile Gly Cys Gly Ala Gly Leu Leu Val Leu
130 135 140
His Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asn Cys Lys Ile Thr Gly Val Thr Asn
145 150 155 160
Thr Ser Trp His Lys Glu His Ile Leu Glu Gln Cys Lys Asn Leu Asn
165 170 175
Leu Ser Asn Val Glu Val Ile Leu Ala Asp Val Thr Thr Val Asp Ile
180 185 190
Glu Arg Thr Phe Asp Arg Val Phe Val Ile Gly Leu Ile Glu His Met
195 200 205
Lys Asn Phe Glu Leu Phe Leu Arg Lys Ile Ser Lys Trp Met Lys Asp
210 215 220
Asp Gly Leu Leu Phe Leu Glu His Leu Cys His Lys Ser Phe Ser Asp
225 230 235 240
His Trp Glu Pro Leu Ser Glu Asp Asp Trp Tyr Ala Lys Asn Phe Phe
245 250 255
Pro Ser Gly Thr Leu Val Ile Pro Ser Ala Thr Cys Leu Leu Tyr Phe
260 265 270
Gln Glu Asp Val Thr Val Lys Asp His Trp Leu Leu Ser Gly Asn Asn
275 280 285
Phe Ala Arg Ser Asn Glu Ala Ile Leu Lys Arg Ile Asp Ser Lys Ile
290 295 300
Glu Glu Val Lys Asp Ile Phe Met Ser Phe Tyr Gly Ile Gly Glu Glu
305 310 315 320
Glu Ala Val Lys Leu Ile Asn Trp Trp Arg Leu Leu Cys Ile Thr Ala
325 330 335
Asn Glu Leu Phe Lys Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Leu Ile Ser Gln
340 345 350
Leu Leu Phe Lys Lys Lys Leu Met Thr Cys Ile
355 360

<210> 121
<211> 366
<212> PRT
<213> Papaver bracteatum
<400> 121
Met Val Lys Gly Asp Gln Phe Gln Thr Thr Thr Met Glu Glu Thr Lys
1 5 10 15
Ile Ser Gln Glu Asn Asp Leu Trp Thr Asn Met Glu Leu Gly Leu Ile
20 25 30
Pro Asp Glu Glu Val Arg Arg Leu Met Lys Ile Glu Ile Glu Lys Arg
35 40 45
Ile Glu Trp Gly Met Lys Pro Thr Gln His Gln Gln Leu Ala Gln Leu
50 55 60
Leu Asp Phe Thr Lys Ser Leu Arg Gly Met Lys Met Ala Thr Glu Leu
65 70 75 80
Asp Lys Leu Asp Ser Lys Leu Tyr Glu Thr Pro His Ser Phe Asn Gln
85 90 95
Ile Val Asn Gly Ser Thr Leu Lys Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Thr Asp
100 105 110
Val Thr Thr Thr Met Asp Glu Ala Ser Ile Lys Met Met Asp Leu Tyr
115 120 125
Cys Glu Arg Ala Asn Ile Lys Asp Gly Gln Thr Ile Leu Asp Leu Gly
130 135 140
Cys Gly Pro Gly Pro Leu Val Leu His Ile Ala Lys Lys Tyr Ser Asn
145 150 155 160
Cys Lys Ile Thr Gly Val Thr Asn Ala Phe Ser Gln Arg Glu Tyr Ile
165 170 175
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Leu Ser Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile Leu
180 185 190
Ala Asp Val Thr Ser Leu Asp Leu Glu Thr Thr Phe Asp Arg Val Phe
195 200 205
Val Ile Gly Phe Ile Glu His Met Lys Asn Phe Glu Leu Phe Leu Arg
210 215 220
Lys Ile Ser Lys Trp Met Lys Asp Asp Ala Val Leu Phe Leu Glu His
225 230 235 240
Phe Cys His Lys Ser Phe Ser Tyr His Gly Glu Pro Leu Ser Glu Asp
245 250 255
Asp Trp Tyr Ala Lys Asn Phe Phe Ala Pro Gly Thr Leu Val Ile Pro
260 265 270
Ser Ala Thr Cys Leu Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Leu Ala Val Ile Asp
275 280 285
His Trp Phe Leu Ser Gly Asn His Phe Ala Arg Thr Asn Glu Glu Met
290 295 300
Leu Lys Gly Ile Asp Gly Lys Ile Glu Glu Ile Lys Asp Ile Phe Met
305 310 315 320
Ser Phe Tyr Gly Ile Asn Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Ile Asn Trp
325 330 335
Trp Arg Leu Phe Cys Ile Thr Gly Ala Glu Met Phe Ser Tyr Asn Asn
340 345 350
Gly Glu Glu Trp Phe Ile Ser Gln Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355 360 365

<210> 122
<211> 364
<212> PRT
<213> Eschscholzia californica
<400> 122
Met Ala Leu Glu Gln Glu Asp Ser Met Ser Val Pro Glu Arg Asn Glu
1 5 10 15
Gly Val Ala Asp Leu Ile Lys Arg Met Glu Leu Gly Leu Val Asn Asp
20 25 30
Glu Glu Ile Arg Arg Leu Met Arg Ile Gln Ile Glu Asn Arg Leu Lys
35 40 45
Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His Asp Gln Gln Leu Ala Gln His Leu His
50 55 60
Phe Ile Asn Ser Leu Lys Glu Met Lys Met Ala Thr Glu Met Asp Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Gln Val Tyr Glu Ser Pro Asn Ser Phe Gln Gln Ile Met
85 90 95
Cys Gly Arg Ser Met Lys Glu Ser Ala Gly Leu Phe Met Asp Asp Val
100 105 110
Thr Thr Val Glu Glu Ala His Ile Arg Met Met Asp Leu Tyr Cys Asp
115 120 125
Lys Ala Thr Phe Glu Asp Gly Gln Lys Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly
130 135 140
His Gly Ser Val Val Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys Gly Cys Gln
145 150 155 160
Val Thr Gly Val Thr Asn Ser Ser Ala Gln Lys Gln Tyr Ile Leu Glu
165 170 175
Gln Cys Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile Leu Ala Asp
180 185 190
Val Thr Thr Leu Glu Met Glu Glu Lys Phe Asp Arg Val Ile Ile Ile
195 200 205
Gly Leu Ile Glu His Met Lys Asn Phe Lys Leu Phe Phe Gln Lys Val
210 215 220
Ser Lys Trp Met Lys Glu Gly Gly Leu Leu Phe Leu Glu Asn Tyr Phe
225 230 235 240
His Lys Asp Phe Ala Tyr His Cys Glu Lys Ile Asp Glu Asp Asp Trp
245 250 255
Tyr Asp Gly Tyr Ile Phe Pro Pro Gly Ser Leu Leu Met Pro Ser Ala
260 265 270
Ser Thr Leu Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Leu Thr Val Ala Asp His Trp
275 280 285
Val Leu Pro Gly Thr His Phe Ala Lys Thr Phe Glu Glu Phe Leu Lys
290 295 300
Lys Ile Asp Leu Arg Ile Glu Glu Val Arg Glu Ile Phe Glu Ala Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Ile Ser Lys Glu Glu Ala Met Lys Leu Ser Asn Tyr Trp Arg
325 330 335
Asn Phe Cys Ile Ser Ala Met Glu Ile Phe Asn Tyr Asn Asn Gly Gln
340 345 350
Glu Trp Met Ile Ser His Leu Leu Tyr Thr Lys Lys
355 360

<210> 123
<211> 368
<212> PRT
<213> Chelidonium majus
<400> 123
Met Glu Thr Gly Lys Asn Asn Gln Asn Met Lys Thr Thr Ile Asp Asp
1 5 10 15
Leu Trp Asn Gln Met Met Leu Gly Ile Val Pro Asp Lys Glu Ile Arg
20 25 30
Arg Leu Met Lys Ile Glu Leu Lys Lys Arg Leu Asp Trp Gly Tyr Arg
35 40 45
Pro Thr His Gln Gln Gln Leu Ser Gln Leu Leu Asp Phe Ala Lys Gly
50 55 60
Leu Cys Asn Tyr Cys Trp Thr Ala Leu Arg Cys Met Lys Met Ser Ala
65 70 75 80
Glu Phe Asp Thr Leu Asp Ser Lys Val Tyr Glu Thr Pro Lys Ser Phe
85 90 95
Gln Gln Ile Met Cys Gly Thr Thr Ile Lys Glu Ser Ser Gly Leu Phe
100 105 110
Met Asn Glu Ser Thr Thr Leu Asp Gln Ala Gln Ile Ser Met Leu Asp
115 120 125
Leu Tyr Phe Asp Lys Ala Lys Ile Lys Asp Gly Gln Ser Ile Leu Asp
130 135 140
Leu Gly Cys Gly His Gly Ala Leu Ile Leu Tyr Leu Ala Gln Lys Tyr
145 150 155 160
Gln Asn Cys Asn Ile Thr Gly Val Thr Asn Ser Leu Ser Gln Lys Glu
165 170 175
Phe Ile Val Glu Lys Cys Lys Lys Leu Gly Leu Ser Asn Val Glu Ile
180 185 190
Leu Leu Ala Asp Val Thr Lys Leu Glu Met Glu Asp Met Phe Asp Arg
195 200 205
Val Phe Val Ile Gly Leu Ile Glu His Met Lys Asn Phe Glu Leu Phe
210 215 220
Leu Arg Lys Ile Ser Glu Trp Met Lys Pro Asp Gly Leu Leu Phe Leu
225 230 235 240
Glu His Tyr Cys His Lys Ser Phe Ala His Gln Trp Glu Pro Ile Asp
245 250 255
Glu Glu Asp Trp Phe Ser Lys Tyr Ile Phe Pro Pro Gly Thr Val Ile
260 265 270
Ile Pro Ser Ala Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Val Lys Val
275 280 285
Ile Asp His Trp Thr Leu Ser Gly Asn His Phe Ala Arg Thr Gln Glu
290 295 300
Glu Trp Leu Lys Gly Ile Asp Gly His Ile Asp Glu Val Glu Lys Thr
305 310 315 320
Phe Glu Ser Phe Tyr Gly Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Lys Leu Ile
325 330 335
Asn Phe Trp Arg Val Phe Cys Leu Ser Gly Val Glu Met Phe Gly Tyr
340 345 350
Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met Ile Ser His Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355 360 365

<210> 124
<211> 361
<212> PRT
<213> Glaucium flavum
<400> 124
Met Thr Met Glu Ala Asn Asn Ala Lys Lys Glu Ala Ile Glu Asn Leu
1 5 10 15
Trp Glu Gln Met Met Met Gly Leu Val Pro Asp His Glu Ile Thr Arg
20 25 30
Leu Met Lys Ser Glu Leu Gln Lys Arg Leu Asn Trp Gly Tyr Lys Pro
35 40 45
Thr His Gln Gln Gln Ile Ser Gln Leu Leu Asp Phe Ala Lys Ser Leu
50 55 60
Arg Arg Met Glu Met Ser Leu Asp Phe Asp Asn Leu Glu Leu Asp Thr
65 70 75 80
Lys Met Tyr Glu Thr Pro Glu Ser Phe Gln Leu Ile Met Ser Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Lys Glu Ser Ser Gly Leu Phe Thr Asp Glu Thr Ala Thr Leu
100 105 110
Asp Gln Thr Gln Ile Arg Met Met Asp Leu Tyr Leu Glu Lys Ala Lys
115 120 125
Ile Lys Asp Gly Gln Ser Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly His Gly Ala
130 135 140
Leu Ile Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Arg Asn Cys Asn Val Thr Gly
145 150 155 160
Val Thr Asn Ser Ile Ala Gln Lys Glu Phe Ile Phe Lys Gln Cys Lys
165 170 175
Lys Leu Gly Leu Ser Asn Val Glu Met Val Leu Ala Asp Val Thr Lys
180 185 190
Cys Glu Met Lys Ala Thr Phe Asp His Ile Phe Val Ile Gly Leu Ile
195 200 205
Glu His Met Lys Asn Phe Glu Leu Phe Leu Arg Lys Val Ser Glu Trp
210 215 220
Met Lys Ser Asp Gly Leu Leu Phe Met Glu His Tyr Cys His Lys Ser
225 230 235 240
Phe Ala Tyr Gln Trp Glu Pro Met Asp Asp Asp Asp Leu Phe Ser Lys
245 250 255
Tyr Val Phe Pro Pro Gly Ser Ala Ile Ile Pro Ser Ala Ser Phe Leu
260 265 270
Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Leu Thr Val Val Asp His Trp Thr Leu Ser
275 280 285
Gly Asn His Phe Ala Arg Thr His Gln Glu Trp Leu Lys Arg Ile Asp
290 295 300
Ser Gln Ser Asp Glu Ile Lys Gly Ile Phe Glu Ser Phe Tyr Gly Ile
305 310 315 320
Ser Lys Glu Glu Ala Val Lys Leu Ile Asn Tyr Trp Arg Val Phe Cys
325 330 335
Leu Phe Gly Val Glu Met Phe Gly Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met
340 345 350
Ile Ser His Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355 360

<210> 125
<211> 363
<212> PRT
<213> Corydalis chelanthifolia
<400> 125
Met Glu Val Val Ala Thr Ser Ser Ala Arg Asn Pro Lys Lys Glu Ile
1 5 10 15
Val Asp Leu Trp Lys Arg Met Glu Leu Gly Leu Ile Pro Asp Glu Glu
20 25 30
Ile Arg Asp Leu Met Lys Ile Gly Leu Glu Lys Arg Leu Lys Trp Gly
35 40 45
Tyr Lys Pro Thr His Glu Gln Gln Leu Ser Gln Leu Leu His Phe Ala
50 55 60
Lys Ser Leu Arg Ser Met Lys Met Ala Ser Glu Met Glu Thr Leu Asp
65 70 75 80
Asp Gln Met Tyr Glu Thr Pro Thr Ala Phe Gln Gln Leu Met Cys Gly
85 90 95
Ser Thr Ile Lys Glu Ser Ala Gly Phe Phe Lys Asp Glu Ser Thr Thr
100 105 110
Leu Asp Glu Ala Glu Ile Lys Met Leu Asp Leu Tyr Cys Glu Lys Ala
115 120 125
Arg Ile Glu Asp Gly Gln Lys Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly His Gly
130 135 140
Ala Val Met Leu His Ile Ala Gln Lys Tyr Lys Asn Cys Asn Val Thr
145 150 155 160
Gly Val Thr Asn Ser Ile Ser Gln Gln Gln Phe Ile Val Gln Arg Ser
165 170 175
Lys Glu Leu Asn Leu Ser Asn Val Asn Met Ile Leu Ala Asp Val Thr
180 185 190
Met Leu Glu Met Asp Ala Thr Tyr Asp Arg Ile Phe Ile Ile Gly Leu
195 200 205
Ile Glu His Met Lys Asn Phe Glu Leu Phe Leu Arg Lys Ile Ser Lys
210 215 220
Trp Ile Thr Lys Glu Gly Leu Leu Phe Leu Glu His Tyr Cys His Lys
225 230 235 240
Thr Phe Ala Tyr Gln Cys Glu Pro Val Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Asn
245 250 255
Met Phe Ile Phe Pro Pro Gly Thr Leu Ile Leu Pro Ser Ala Ser Phe
260 265 270
Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Leu Ile Val Val Asp Arg Trp Thr Leu
275 280 285
Asn Gly Asn His Tyr Ala Arg Thr Gln Glu Glu Trp Leu Lys Arg Ile
290 295 300
Asp Ala Asn Val Asp Gly Val Lys Gln Met Phe Glu Ser Val Cys Asp
305 310 315 320
Gly Asn Lys Glu Glu Ala Val Lys Leu Met Asn Phe Trp Arg Ile Phe
325 330 335
Cys Ile Ser Gly Ala Glu Met Leu Ala Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp
340 345 350
Met Ile Ser His Tyr Leu Phe Lys Lys Arg Asn
355 360

<210> 126
<211> 357
<212> PRT
<213> Nigella sativa
<400> 126
Met Glu Ala Thr Gln Ile Thr Lys Lys Gln Gly Val Ala Glu Leu Ile
1 5 10 15
Lys Arg Ile Glu Asn Gly Gln Val Pro Asp Glu Glu Ile Thr Arg Met
20 25 30
Met Lys Ile Gln Ile Gln Lys Arg Leu Lys Leu Gly Tyr Lys Ser Thr
35 40 45
His Glu Gln Gln Leu Ala Gln Leu Leu His Phe Val His Ser Leu Gln
50 55 60
Lys Met Glu Met Ala Glu Glu Val Asp Thr Leu Asp Ser Glu Leu Tyr
65 70 75 80
Glu Ile Pro Leu Pro Phe Leu His Ile Met Cys Gly Lys Ala Leu Lys
85 90 95
Phe Ser Pro Gly Tyr Phe Lys Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ser
100 105 110
Glu Val Asn Met Leu Asp Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Ile Glu Asp
115 120 125
Gly Gln Thr Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly His Gly Ser Leu Thr Leu
130 135 140
His Val Ala Lys Lys Tyr Arg Gly Cys Lys Val Thr Gly Ile Thr Asn
145 150 155 160
Ser Val Ser Gln Lys Asp Phe Ile Met Glu Glu Cys Lys Lys Leu Asn
165 170 175
Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile Leu Glu Asp Val Thr Lys Phe Glu Thr
180 185 190
Gly Thr Thr Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Val Ala Leu Ile Glu His Met
195 200 205
Lys Asn Tyr Glu Leu Phe Leu Lys Lys Val Ser Ala Trp Met Ala Gln
210 215 220
Asp Gly Leu Leu Phe Val Glu His His Cys His Lys Val Phe Ala Tyr
225 230 235 240
Lys Tyr Glu Pro Ile Asp Asp Asp Asp Trp Tyr Thr Glu Tyr Ile Phe
245 250 255
Pro Thr Gly Thr Leu Val Met Ser Ser Ser Ser Ile Leu Leu Tyr Phe
260 265 270
Gln Glu Asp Val Ser Val Val Asn His Trp Thr Leu Ser Gly Lys His
275 280 285
Pro Ser Leu Gly Phe Lys Gln Trp Leu Lys Arg Ile Asp Asp Asn Ile
290 295 300
Asp Glu Ile Lys Glu Ile Phe Glu Ser Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Lys
305 310 315 320
Ala Thr Lys Phe Ile Thr Tyr Trp Arg Val Phe Cys Ile Ala His Ser
325 330 335
Glu Met Tyr Ala Thr Asn Gly Gly Glu Glu Trp Met Leu Ser Gln Val
340 345 350
Leu Phe Lys Arg Lys
355

<210> 127
<211> 349
<212> PRT
<213> Sanguinaria canadensis
<400> 127
Met Gly Gly Val Ala Asp Leu Leu Lys Lys Met Glu Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Pro Glu Glu Glu Ile Arg Arg Leu Met Arg Ile Ile Ile Glu Lys Arg
20 25 30
Leu Glu Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His Ala Glu Gln Leu Asp His Leu
35 40 45
Thr Asn Phe Ile Gln Cys Leu Arg Gly Met Lys Met Ala Asp Glu Ile
50 55 60
Asp Ala Leu Asp Ala Lys Met Tyr Glu Ile Pro Leu Pro Phe Met Gln
65 70 75 80
Thr Ile Cys Gly Ser Thr Leu Lys Phe Ser Pro Gly Tyr Phe Lys Asp
85 90 95
Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ser Glu Ile His Met Met Asp Leu Tyr
100 105 110
Cys Glu Arg Ala Glu Val Lys Asp Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Gly
115 120 125
Cys Gly His Gly Gly Phe Val Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys Asn
130 135 140
Ser Ile Val Thr Gly Val Thr Asn Ser Val Ala Glu Lys Glu Phe Ile
145 150 155 160
Met Thr Gln Cys Lys Lys Leu Cys Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile Leu
165 170 175
Ala Asp Val Thr Lys Phe Glu Pro Glu Thr Thr Tyr Asp Arg Val Phe
180 185 190
Ala Ile Ala Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Glu Leu Val Leu Glu
195 200 205
Lys Leu Ser Lys Trp Val Ala Gln Asp Gly Phe Leu Phe Val Glu His
210 215 220
His Cys His Lys Val Phe Pro Tyr Lys Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Asp
225 230 235 240
Asp Trp Tyr Thr Glu Tyr Ile Phe Pro Gly Gly Thr Ile Val Leu Pro
245 250 255
Ser Ala Ser Ile Leu Leu Tyr Phe Gln Lys Asp Val Ser Val Val Asn
260 265 270
His Trp Ser Leu Asn Gly Lys His Pro Ala Arg Gly Phe Lys Glu Trp
275 280 285
Leu Lys Arg Leu Asp Glu Asn Met Asp Ala Val Lys Ala Ile Phe Glu
290 295 300
Pro Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Glu Ala Met Lys Trp Ile Thr Tyr Trp
305 310 315 320
Arg Val Phe Cys Ile Thr His Ser Glu Met Tyr Ala Tyr Asn Asn Gly
325 330 335
Glu Glu Trp Met Leu Ser Gln Val Leu Phe Lys Arg Lys
340 345

<210> 128
<211> 350
<212> PRT
<213> Jeffersonia diphylla
<400> 128
Met Ser Lys Gly Val Ala Lys Leu Val Glu Arg Met Glu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Val Ser Asp Asp Glu Val Arg Arg Leu Met Arg Ile Leu Ile Glu Lys
20 25 30
Arg Leu Lys Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His Glu Glu Gln Leu Thr Tyr
35 40 45
Leu Thr Asn Phe Ile Gln Gly Leu Lys Gly Met Lys Ile Ala Glu Glu
50 55 60
Ile Asp Ala Leu Asp Ala Lys Met Tyr Glu Ile Pro Ile Ala Phe Met
65 70 75 80
Gln Ile Leu Cys Gly Tyr Ser Leu Lys Phe Ser Pro Gly Phe Phe Glu
85 90 95
Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ser Glu Thr Ile Met Met Asp Leu
100 105 110
Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Val Gln Asp Gly Gln Ser Ile Leu Asp Leu
115 120 125
Gly Cys Gly His Gly Gly Phe Val Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys
130 135 140
Asn Cys Lys Val Thr Gly Val Thr Asn Ser Val Ser Glu Thr Glu Tyr
145 150 155 160
Ile Met Glu Gln Cys Lys Lys Leu Gly Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile
165 170 175
Ile Ala Asp Val Thr Lys Phe Glu Pro Glu Val Thr Tyr Asp Arg Val
180 185 190
Phe Ala Ile Ala Leu Ile Glu His Met Lys Asn Tyr Glu Leu Val Leu
195 200 205
Gln Lys Leu Ser Lys Trp Val Ala Gln Asp Gly Phe Leu Phe Val Asp
210 215 220
His His Cys His Lys Val Phe Pro Tyr Lys Tyr Glu Pro Ile Asp Glu
225 230 235 240
Asp Asp Trp Tyr Thr Gln Tyr Ile Phe Pro Gly Gly Thr Leu Val Leu
245 250 255
Pro Ser Ala Ser Ile Leu Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Val Ser Ile Val
260 265 270
Asn His Trp Thr Leu Ser Gly Asn His Pro Ala Arg Gly Phe Lys Glu
275 280 285
Trp Leu Lys Arg Leu Asp Asp Asn Met Asp Glu Ile Lys Ala Ile Phe
290 295 300
Glu Pro Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Glu Ala Met Lys Trp Ile Thr Tyr
305 310 315 320
Trp Arg Val Phe Cys Ile Thr His Ser Glu Met Tyr Ala Tyr Asn Gly
325 330 335
Gly Glu Glu Trp Met Ile Ser Gln Val Leu Phe Lys Arg Lys
340 345 350

<210> 129
<211> 357
<212> PRT
<213> Berberis thunbergii
<400> 129
Met Glu Val Lys Gln Ala Gly Lys Glu Gly Val Thr Glu Leu Leu Val
1 5 10 15
Lys Arg Met Glu Leu Gly Leu Val Pro Glu Glu Glu Ile Arg Arg Leu
20 25 30
Met Arg Ile Gln Ile Gln Lys Arg Leu Asp Trp Gly Tyr Lys Pro Thr
35 40 45
His Glu Glu Gln Leu Ala His Leu Thr Lys Phe Ile Gln Asn Ile Arg
50 55 60
Gly Met Lys Met Ala Asp Glu Ile Asp Ala Leu Asp Ala Lys Met Tyr
65 70 75 80
Glu Ile Pro Leu Pro Phe Leu Gln Thr Ile Cys Gly Lys Thr Leu Lys
85 90 95
Phe Ser Pro Gly Tyr Phe Lys Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ser
100 105 110
Glu Thr Leu Met Met Asp Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Val Lys Asp
115 120 125
Gly Gln Ser Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly His Gly Gly Phe Val Leu
130 135 140
His Leu Ala Gln Lys Tyr Arg Asn Ser Val Val Thr Gly Val Thr Asn
145 150 155 160
Ser Val Ser Glu Thr Glu Tyr Ile Lys Glu Gln Cys Lys Lys Leu Gly
165 170 175
Leu Ser Asn Val Glu Ile Ile Ile Ala Asp Val Thr Lys Phe Glu Pro
180 185 190
Glu Val Thr Tyr Asp Arg Val Phe Ala Ile Ala Leu Ile Glu His Met
195 200 205
Lys Asn Tyr Ala Leu Val Leu Asn Lys Ile Ser Lys Trp Val Ala Gln
210 215 220
Asp Gly Tyr Leu Phe Val Glu His His Cys His Lys Val Phe Pro Tyr
225 230 235 240
Lys Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Thr Asn Tyr Ile Phe
245 250 255
Pro Gly Gly Thr Leu Ile Leu Pro Ser Ala Ser Ile Leu Leu Tyr Phe
260 265 270
Gln Glu Asp Val Thr Val Leu Asn His Trp Ser Leu Ser Gly Lys His
275 280 285
Pro Ser Arg Gly Phe Ile Glu Trp Leu Lys Arg Leu Asp Glu Asn Ile
290 295 300
Asp Val Ile Met Gly Ile Phe Glu Pro Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Glu
305 310 315 320
Ala Thr Lys Trp Ile Asn Tyr Trp Arg Val Phe Cys Met Thr His Ser
325 330 335
Glu Met Tyr Ala Tyr Gly Asn Gly Glu Glu Trp Met Leu Ser Gln Val
340 345 350
Leu Leu Lys Arg Lys
355

<210> 130
<211> 339
<212> PRT
<213> Mahonia aquifolium
<400> 130
Met Glu Leu Gly Leu Val Pro Glu Lys Glu Ile Arg Arg Leu Met Arg
1 5 10 15
Ile Gln Ile Gln Lys Arg Leu Glu Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His Glu
20 25 30
Glu Gln Leu Ala His Leu Thr Lys Phe Ile Gln Asn Ile Arg Gly Met
35 40 45
Lys Met Ala Asp Glu Ile Asp Ala Leu Asp Ala Lys Met Tyr Glu Ile
50 55 60
Pro Leu Pro Phe Leu Gln Thr Ile Cys Gly Lys Thr Leu Lys Phe Ser
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Lys Asp Glu Ser Thr Thr Leu Asp Glu Ser Glu Thr
85 90 95
Leu Met Met Asp Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Gln Val Lys Asp Gly Gln
100 105 110
Ser Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly His Gly Gly Phe Val Leu His Leu
115 120 125
Ala Gln Lys Tyr Arg Asn Ser Ile Val Thr Gly Val Thr Asn Ser Val
130 135 140
Ser Glu Thr Glu Tyr Ile Lys Glu Gln Cys Lys Lys Leu Gly Leu Ser
145 150 155 160
Asn Val Glu Ile Ile Ile Ala Asp Val Thr Lys Phe Glu Pro Glu Val
165 170 175
Thr Tyr Asp Arg Val Phe Ala Ile Ala Leu Ile Glu His Met Lys Asn
180 185 190
Tyr Ala Leu Val Leu Asn Lys Ile Ser Lys Trp Val Ala Gln Asp Gly
195 200 205
Tyr Leu Phe Val Glu His His Cys His Lys Val Phe Pro Tyr Lys Tyr
210 215 220
Glu Pro Leu Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Thr Asn Tyr Ile Phe Pro Gly
225 230 235 240
Gly Thr Leu Ile Leu Pro Ser Ala Ser Ile Leu Leu Tyr Phe Gln Glu
245 250 255
Asp Val Thr Val Leu Asn His Trp Ser Leu Ser Gly Lys His Pro Ser
260 265 270
Arg Gly Phe Ile Glu Trp Leu Lys Arg Leu Asp Glu Asn Ile Asp Val
275 280 285
Ile Met Gly Ile Phe Glu Pro Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Glu Ala Thr
290 295 300
Lys Trp Ile Asn Tyr Trp Arg Val Phe Cys Ile Thr His Ser Glu Met
305 310 315 320
Tyr Ala Tyr Gly Asn Gly Glu Glu Trp Met Leu Ser Gln Val Leu Leu
325 330 335
Lys Arg Lys

<210> 131
<211> 355
<212> PRT
<213> Menispermum canadense
<220>
<221> MOD_RES
<222> (86)..(86)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (96)..(96)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (127)..(127)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (138)..(138)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (153)..(153)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (292)..(292)
<223> Any amino acid
<400> 131
Met Asp Lys Ala Asn Glu Arg Glu Leu Lys Arg Ala Glu Leu Phe Lys
1 5 10 15
Lys Leu Glu Asp Asp Leu Val Thr Tyr Asp Glu Ile Lys Gln Val Met
20 25 30
Arg Thr Glu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His
35 40 45
Gln Gln Gln Leu Ala His Leu Leu Asp Phe Ala His Ala Leu Glu Gly
50 55 60
Met Lys Ile Ala Asn Glu Val Glu Thr Leu Ala Ser Glu Val Tyr Glu
65 70 75 80
Thr Pro Leu Pro Phe Xaa Glu Ile Val Leu Gly Pro Ala Lys Lys Xaa
85 90 95
Ser Ser Cys Leu Phe Glu Asp Glu Ser Thr Thr Leu Glu Gln Ala Glu
100 105 110
Ile Ala Met Leu Asp Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Gln Ile Arg Xaa Gly
115 120 125
Met Ser Val Leu Asp Leu Gly Cys Gly Xaa Gly Ser Val Gly Leu His
130 135 140
Ile Ala Arg Lys Tyr Lys Asn Cys Xaa Val Thr Cys Ile Thr Asn Ser
145 150 155 160
Ile Ser Gln Lys Gln Tyr Ile Glu Asn Gln Cys Lys Leu Tyr Asn Leu
165 170 175
Ser Asn Val Lys Ile Ile Leu Ala Asp Ile Val Ala His Asp Thr Asp
180 185 190
Asp Thr Phe Asp Val Val Leu Val Ile Gly Val Ile Glu His Met Lys
195 200 205
Asn Tyr Ala Leu Leu Leu Asn Lys Ile Ser Lys Trp Met Ala Lys Asp
210 215 220
Gly Leu Leu Phe Val Glu His Leu Cys His Lys Thr Phe Pro Tyr His
225 230 235 240
Phe Glu Pro Leu Asp Glu Asp Asp Trp Tyr Ser Asn Phe Val Phe Pro
245 250 255
Thr Gly Thr Leu Thr Met Pro Ser Val Ser Phe Leu Leu Tyr Phe Gln
260 265 270
Ala Asp Val Ser Ile Leu Asn His Trp Ile Leu Ser Gly Lys Asn Phe
275 280 285
Ser Arg Thr Xaa Glu Glu Phe Leu Lys Arg Ile Asp Ala Asn Val Asp
290 295 300
Ala Ile Lys Asp Gly Leu Lys Pro Ser Leu Gly Ser Glu Gly Val Ala
305 310 315 320
Lys Leu Ile Ser Tyr Trp Arg Gly Phe Cys Leu Thr Gly Met Glu Met
325 330 335
Phe Gly Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met Val Ser Gln Val Leu Phe
340 345 350
Lys Asn Lys
355

<210> 132
<211> 366
<212> PRT
<213> Tinospora cordifolia
<400> 132
Met Glu Asp Asn Asn Asn Leu Leu Gln Glu Glu Met Asn Val Val Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gln Arg Pro Glu Leu Gly Leu Val Pro Asp Glu Lys Ile Arg
20 25 30
Lys Leu Thr Arg Leu Gln Leu Gln Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr Lys
35 40 45
Pro Thr His Glu Ala Gln Leu Ser His Leu Phe Gln Phe Ile His Ser
50 55 60
Leu Pro Ser Leu Asn Met Glu Ser Glu Asp Glu Asn Pro Lys Ser Trp
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Thr Pro Thr Ser Phe Leu Gln Leu Leu Tyr Gly Asp Cys
85 90 95
Ile Lys Glu Ser Asp Thr Tyr Tyr Lys Glu Asp Thr Ala Thr Leu Glu
100 105 110
Glu Ala Val Ile Asn Met Leu Glu Leu Tyr Cys Glu Arg Ala Arg Ile
115 120 125
Thr Glu Gly Leu Ser Val Leu Asp Leu Gly Cys Gly Tyr Gly Ala Leu
130 135 140
Thr Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys Ser Cys Lys Val Thr Gly Val
145 150 155 160
Thr Ser Ser Ile Ser Gln Lys Gln Tyr Ile Met Glu Lys Cys Lys Lys
165 170 175
Leu Asn Leu Thr Asn Val Glu Ile Ile Leu Ala Asp Val Ala Thr Ile
180 185 190
Glu Ile Glu Ala Ala Ser Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Leu Gly Ile Phe
195 200 205
Glu His Val Asn Asp Tyr Lys Leu Phe Leu Gly Lys Leu Ser Lys Trp
210 215 220
Met Lys Gln Asp Gly Leu Leu Phe Val Glu Tyr Leu Cys His Lys Thr
225 230 235 240
Phe Pro Tyr Gln Asn Lys Pro Leu Asp Lys Gly Asp Lys Trp Tyr Asn
245 250 255
Glu Tyr Val Phe Pro Ser Gly Gly Leu Ile Ile Pro Ser Ala Ser Phe
260 265 270
Ile Leu Tyr Phe Gln Asn Asp Val Ser Val Val Arg Gln Trp Thr Gln
275 280 285
Gly Gly Gln His Ser Ala Arg Thr Phe Glu Glu Leu Leu Lys Arg Ile
290 295 300
Asp Gly Asn Ile Asp Lys Ile Lys Glu Ile Phe Ile Glu Ser Tyr Gly
305 310 315 320
Ser Lys Glu Asp Ala Val Arg Phe Ile Asn Tyr Trp Arg Val Phe Leu
325 330 335
Ile Thr Gly Val Glu Met Phe Ser Tyr Asn Asp Gly Glu Glu Trp Met
340 345 350
Gly Ala His Phe Leu Phe Lys Lys Lys Phe Ile Met Gln Glu
355 360 365

<210> 133
<211> 359
<212> PRT
<213> Cissampelos mucronata
<400> 133
Met Glu Val Lys Gln Ser Lys Gly Asp Glu Leu Arg Ser Arg Val Ala
1 5 10 15
Glu Leu Leu Glu Arg Pro Glu Leu Gly Leu Val Pro Asp Glu Glu Ile
20 25 30
Arg Arg Leu Ala Lys Ala Arg Leu Glu Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr
35 40 45
Lys Ala Thr His Gly Glu Gln Leu Ser Ser Leu Leu Gln Phe Val Glu
50 55 60
Ser Leu Pro Ser Leu Asn Met Ala Ser Glu Asp Asp Ser Pro Lys Ala
65 70 75 80
Trp Leu Tyr Glu Thr Pro Thr Ser Phe Leu Gln Leu Ile Tyr Gly Asp
85 90 95
Ile Ile Lys Glu Ser Gly Ser Tyr Tyr Lys Asp Glu Ser Thr Thr Leu
100 105 110
Glu Glu Ala Met Ile His Asn Met Asn Leu Cys Cys Glu Arg Ala Asn
115 120 125
Ile Lys Glu Gly Gln Ser Val Val Asp Leu Gly Cys Gly Tyr Gly Ala
130 135 140
Phe Ile Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys Thr Cys Arg Val Thr Gly
145 150 155 160
Ile Thr Ser Ser Ile Ser Gln Lys His Tyr Ile Met Glu Gln Cys Lys
165 170 175
Lys Leu Asn Leu Ser Asn Val Glu Val Ile Leu Ala Asp Val Ala Thr
180 185 190
Ile Lys Leu Asp Ala Thr Phe Asp Arg Val Phe Ala Ala Gly Met Phe
195 200 205
Glu His Val Asn Asp Tyr Lys Ser Phe Leu Arg Lys Ile Thr Asn Trp
210 215 220
Met Lys Pro Asp Gly Arg Leu Phe Val Glu His Leu Cys Asn Lys Thr
225 230 235 240
Phe Pro Tyr Gln Asn Lys Pro Leu Asp Asp Gly Asp Asn Trp Gly Glu
245 250 255
Tyr Val Phe Pro Ser Gly Gly Leu Ile Ile Pro Ser Ala Ser Leu Leu
260 265 270
Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Val Ser Ile Val Asn His Trp Thr Phe Ser
275 280 285
Gly Lys His Ala Ala Asn Lys Phe Glu Glu Leu Leu Lys Arg Ile Asp
290 295 300
Ala Lys Ile Asp Ala Ile Lys Arg Ile Phe Asn Glu Cys Tyr Gly Ser
305 310 315 320
Lys Asp Ser Ile Arg Phe Ile Asn Tyr Trp Arg Val Phe Leu Ile Thr
325 330 335
Ala Ala Glu Met Phe Gly Tyr Asn Asn Gly Glu Glu Trp Met Gly Val
340 345 350
His Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355

<210> 134
<211> 352
<212> PRT
<213> Cocculus trilobus
<400> 134
Gly Leu Lys Ser Ser Val Ala Glu Leu Leu Glu Arg Pro Glu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Asp Gly Glu Ile Arg Lys Leu Thr Lys Thr Arg Leu Ala
20 25 30
Lys Arg Leu Glu Trp Gly Tyr Lys Ala Thr His Glu Asp Gln Leu Ser
35 40 45
His Leu Leu Arg Phe Ile His Ser Leu Pro Ser Leu Asn Met Ala Ser
50 55 60
Glu Asp Asp Ser Pro Lys Ala Trp Leu Tyr Glu Thr Pro Thr Ser Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Thr Tyr Tyr
85 90 95
Lys Asp Glu Ser Ser Thr Leu Glu Glu Ala Ile Ile His Asn Met Asp
100 105 110
Leu Cys Cys Glu Arg Ala Arg Ile Lys Glu Gly Gln Ser Val Leu Asp
115 120 125
Leu Gly Cys Gly Tyr Gly Ala Phe Thr Leu His Val Ala Gln Lys Tyr
130 135 140
Lys Ser Cys Ser Val Thr Gly Ile Thr Ser Ser Ile Ser Gln Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Ile Met Glu Gln Cys Lys Lys Leu Asn Leu Ser Asn Val Glu Val
165 170 175
Ile Leu Ala Asp Val Ala Thr Ile Lys Met Asn Thr Thr Phe Asp Arg
180 185 190
Val Phe Ala Leu Gly Met Phe Glu His Ile Asn Asp Tyr Lys Leu Phe
195 200 205
Leu Arg Arg Ile Ser Asn Trp Met Lys His Asp Gly Leu Leu Phe Val
210 215 220
Glu His Leu Cys Asn Lys Thr Phe Ala Tyr Gln Asn Lys Pro Leu Asp
225 230 235 240
Asp Gly Asp Asp Trp Phe Asn Glu Tyr Val Phe Pro Ser Ala Gly Leu
245 250 255
Ile Ile Pro Ser Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Val Ser
260 265 270
Ile Val His His Trp Thr Phe Ser Gly Lys His Ala Ala Tyr Lys Phe
275 280 285
Glu Glu Leu Leu Glu Arg Ile Asp Ala Lys Ile Glu Ala Ile Lys Glu
290 295 300
Ile Phe Ile Glu Cys Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Ala Ile Arg Phe Ile
305 310 315 320
Asn Tyr Trp Arg Val Phe Leu Ile Thr Ala Ala Glu Met Phe Ala Tyr
325 330 335
Arg Asp Gly Glu Glu Trp Met Gly Ser His Val Leu Phe Lys Lys Lys
340 345 350

<210> 135
<211> 364
<212> PRT
<213> Cissampelos mucronata
<400> 135
Met Glu Ala Lys Gln His Glu Ser Asn Asn Asn Ile Asp Glu Glu Leu
1 5 10 15
Lys Asn Arg Val Asn Ile Gly Glu Gln Glu Glu Arg Pro Gly Phe Glu
20 25 30
Asp Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ala Lys Ala Gln Leu Ala Lys Arg Leu
35 40 45
Lys Trp Gly Tyr Lys Pro Thr His Glu Gln Gln Leu Ser His Leu Leu
50 55 60
Gln Phe Leu Gln Ser Leu Pro Ser Leu Asn Met Ala Ser Glu Asp Glu
65 70 75 80
Ser Ser Lys Ala Trp Leu Tyr Glu Thr Pro Thr Ser Phe Leu Gln Leu
85 90 95
Leu Phe Gly Asn Val Ile Lys Phe Ser Gly Tyr Tyr Tyr Lys His Glu
100 105 110
Ser Ser Thr Phe Glu Glu Ser Met Ile His Asn Met Asp Leu Cys Cys
115 120 125
Glu Arg Ala Asn Ile Lys Glu Gly Gln Asn Val Ile Asp Leu Gly Cys
130 135 140
Gly Tyr Gly Ala Phe Val Leu His Val Ala Gln Lys Tyr Lys Ser Cys
145 150 155 160
Ser Val Thr Gly Ile Thr Cys Ser Ile Thr Gln Lys His His Ile Met
165 170 175
Glu Glu Cys Lys Lys Leu Asn Leu Cys Asn Val Lys Val Ile Leu Ala
180 185 190
Asp Val Ala Thr Ile Glu Leu Gly Thr Ala Phe Asp Arg Val Phe Ala
195 200 205
Phe Gly Met Phe Glu Glu Ile Asn Asp Tyr Lys Leu Ile Leu Arg Lys
210 215 220
Ile Ser Asn Trp Met Lys Pro Asp Gly Leu Phe Phe Val Glu His Leu
225 230 235 240
Cys His Lys Thr Leu Ala Tyr Gln Asn Lys Leu Ile Asp Asp Gln Asp
245 250 255
Trp Tyr Glu Glu Tyr Ile Phe Pro Ser Gly Gly Leu Ile Val Pro Ser
260 265 270
Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Phe Gln Asp Asp Leu Ser Val Val Tyr His
275 280 285
Trp Thr Tyr Asn Gly Lys His Gly Ala Arg Ser Phe Glu Lys Met Leu
290 295 300
Glu Arg Thr Asp Ala Asn Ile Asp Thr Ile Lys Asp Met Phe Thr Glu
305 310 315 320
Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Lys Ala Ile Lys Phe Ile Asn Tyr Trp Arg
325 330 335
Val Phe Phe Ile Thr Ala Ala Glu Met Phe Ala Tyr Asn Asp Gly Glu
340 345 350
Glu Trp Met Cys Ser Gln Leu Leu Phe Lys Lys Lys
355 360

<210> 136
<211> 364
<212> PRT
<213> Cissampelos mucronata
<400> 136
Met Glu His Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu
1 5 10 15
Glu Gln Leu Glu Arg Pro Glu Leu Gly Leu Val Lys Asp Glu Asp Ile
20 25 30
Lys Thr Leu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Lys Arg Leu Lys Trp Gly Tyr
35 40 45
Lys Pro Thr Tyr Ala Glu Gln Leu Ser Asn Leu Leu Gln Phe Ala Gln
50 55 60
Ser Leu Pro Ser Leu Lys Met Glu Asn Val Asp Asp Gln Gly Ser Ser
65 70 75 80
Lys Gln Trp Leu Tyr Gly Val Pro Ser Glu Phe Leu Gln Ile Ile Tyr
85 90 95
Gly Gly Ile Ile Lys Met Ser Gly Ser Tyr Tyr Glu Asp Glu Ser Thr
100 105 110
Thr Leu Glu Glu Ser Met Ile Lys Asp Met Asp Ser Cys Cys Glu Lys
115 120 125
Ala Asn Val Lys Glu Gly His Ser Val Leu Asp Ile Gly Cys Gly Tyr
130 135 140
Gly Ser Leu Ile Ile His Ile Ala Lys Lys Tyr Arg Thr Cys Asn Val
145 150 155 160
Thr Gly Ile Thr Asn Phe Val Glu Gln Lys Gln Tyr Ile Met Glu Glu
165 170 175
Cys Lys Lys Leu Asn Leu Ser Asn Val Glu Val Ile Val Gly Asp Gly
180 185 190
Thr Thr Ile Asn Leu Asn Thr Thr Thr Phe Asp Arg Val Phe Val Thr
195 200 205
Gly Met Leu Glu Glu Ile Asn Asp Tyr Lys Leu Phe Leu Lys Ser Val
210 215 220
Ser Asp Trp Met Lys Pro Asp Gly Leu Leu Leu Val Thr His Phe Cys
225 230 235 240
His Lys Thr Phe Ala Tyr Gln Asn Asn Lys Ala Leu Asp Asp Glu Asp
245 250 255
Trp His Asn Glu Tyr Ile Phe Pro Ser Gly Asn Leu Ile Val Pro Ser
260 265 270
Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Phe Gln Glu Asp Leu Ser Val Val Ser His
275 280 285
Trp Ala Thr Asn Gly Thr His Thr Gly Arg Thr Cys Lys Lys Leu Val
290 295 300
Glu Arg Ile Asp Ala Asn Ile Glu Lys Ile Lys Glu Ile Phe Ser Glu
305 310 315 320
Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Ala Ile Arg Met Ile Asn Tyr Trp Arg
325 330 335
Val Leu Cys Ile Thr Gly Ala Glu Met Tyr Thr Cys Lys Asp Gly Glu
340 345 350
Glu Trp Met Asp Val Tyr Tyr Leu Phe Lys Lys Lys
355 360

<210> 137
<211> 1049
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 137
Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
20 25 30
Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg
35 40 45
Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
50 55 60
Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Ala Arg
65 70 75 80
Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Val Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn
85 90 95
Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
100 105 110
Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Ser Glu
130 135 140
Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn
145 150 155 160
Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Ile
165 170 175
Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Val Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
180 185 190
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu
195 200 205
Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
210 215 220
Lys Ala Arg Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr Gln Met Leu Asn
225 230 235 240
Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Gly Asn Ile Arg
245 250 255
Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
275 280 285
Gln Lys Val Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
290 295 300
Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn
305 310 315 320
Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala
325 330 335
Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
340 345 350
Glu Val Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Val Trp
355 360 365
Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
370 375 380
Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala
385 390 395 400
Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly
405 410 415
Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
420 425 430
Asp Ile Lys Glu Thr Ala Thr Leu Lys Pro Lys Gly Phe Val Val Lys
435 440 445
Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
450 455 460
Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn
465 470 475 480
Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly
485 490 495
Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
500 505 510
Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
515 520 525
Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
530 535 540
Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val
545 550 555 560
Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala
565 570 575
Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
580 585 590
Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
595 600 605
Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
610 615 620
Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys
625 630 635 640
Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu
645 650 655
Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
660 665 670
Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
675 680 685
Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
690 695 700
Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly
705 710 715 720
Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu
725 730 735
Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
755 760 765
Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
770 775 780
Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr
785 790 795 800
Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
805 810 815
Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
820 825 830
Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
835 840 845
Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
850 855 860
Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys
865 870 875 880
Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu
885 890 895
Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg
900 905 910
Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
915 920 925
Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
930 935 940
Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
945 950 955 960
Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
965 970 975
Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
980 985 990
Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
995 1000 1005
Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln
1010 1015 1020
Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu
1025 1030 1035
Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1040 1045

<210> 138
<211> 1049
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
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Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
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Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr
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Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
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Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys
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Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu
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Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
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Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
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Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
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Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
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Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
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Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu
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1040 1045

<210> 142
<211> 3150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 142
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<210> 143
<211> 3150
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 146
<211> 3150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 146
atgaccatca aagaaatgcc acaacctaag actttcggtg aattgaagaa tttgcctttg 60
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<210> 147
<211> 5372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 147
cctcgccgca gttaattaaa gtcagtgagc gaggaagcgc gtaactataa cggtcctaag 60
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<210> 148
<211> 4977
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 148
aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 60
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aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 2400
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tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat 3660
caccaaggta gtcggcaaat aaccctcgag cattcaaggc gccttgatta tttgacgtgg 3720
tttgatggcc tccacgcacg ttgtgatatg tagatgagag cgttggttgg tggatcaagc 3780
ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca 3840
ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat atatatatgt gtgcgacaac acatgatcat 3900
atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat 3960
tctttcctta tacattagga cctttgcagc ataaattact atacttctat agacacacaa 4020
acacaaatac acacactaaa ttaataacag gccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat 4080
tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc gaaaaggaag 4140
gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg ttagtattaa 4200
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acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct ttaatttgta 4320
atcattatca ctttacgggt cctttccggt gatccgacag gttacggggc ggcgacctcg 4380
cgggttttcg ctatttatga aaattttccg gtttaaggcg tttccgttct tcttcgtcat 4440
aacttaatgt ttttatttaa aatacctcgc gagtggcaac actgaaaata cccatggagc 4500
ggcgtaaccg tcgcacagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4560
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4620
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 4680
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 4740
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 4800
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taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcg 4977

<210> 149
<211> 5079
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 149
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 60
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 120
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tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 240
agcaacgcgg cagtggaacg tgcattatga attagttacg ctagggataa cagggtaata 300
tagaacccga acgaccgagc gcagcggcgg ccgcgctgat accgccgccc tcgccgcagt 360
taattaaagt cagtgagcga ggaagcgcgt aactataacg gtcctaaggt agcgaatcct 420
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatag atcggcaagt 480
gcacaaacaa tacttaaata aatactactc agtaataacc tatttcttag catttttgac 540
gaaatttgct attttgttag agtcttttac accatttgtc tccacacctc cgcttacatc 600
aacaccaata acgccattta atctaagcgc atcaccaaca ttttctggcg tcagtccacc 660
agctaacata aaatgtaagc tttcggggct ctcttgcctt ccaacccagt cagaaatcga 720
gttccaatcc aaaagttcac ctgtcccacc tgcttctgaa tcaaacaagg gaataaacga 780
atgaggtttc tgtgaagctg cactgagtag tatgttgcag tcttttggaa atacgagtct 840
tttaataact ggcaaaccga ggaactcttg gtattcttgc cacgactcat ctccatgcag 900
tggagccaat caattcttgc ggtcaacttt ggacgatatc aatgccgtaa tcattgacca 960
gagccaaaac atcctcctta agttgattac gaaacacgcc aaccaagtat ttcggagtgc 1020
ctgaactatt tttatatgct tttacaagac ttgaaatttt ccttgcaata accgggtcaa 1080
ttgttctctt tctattgggc acacatataa tacccagcaa gtcagcatcg gaatctagag 1140
cacattctgc ggcctctgtg ctctgcaagc cgcaaacttt caccaatgga ccagaactac 1200
ctgtgaaatt aataacagac atactccaag ctgcctttgt gtgcttaatc acgtatactc 1260
acgtgctcaa tagtcaccaa tgccctccct cttggccctc tccttttctt ttttcgaccg 1320
aattaattct taatcggcaa aaaaagaaaa gctccggatc aagattgtac gtaaggtgac 1380
aagctatttt tcaataaaga atatcttcca ctactgccat ctggcgtcat aactgcaaag 1440
tacacatata ttacgatgct gttctattaa atgcttccta tattatatat atagtaatgt 1500
cgtgatctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 1560
cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 1620
tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 1680
ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 1740
ataataatgg tttcttagac ggatcgcttg cctgtaactt acacgcgcct cgtatctttt 1800
aatgatggaa taatttggga atttactctg tgtttattta tttttatgtt ttgtatttgg 1860
attttagaaa gtaaataaag aaggtagaag agttacggaa tgaagaaaaa aaaataaaca 1920
aaggtttaaa aaatttcaac aaaaagcgta ctttacatat atatttatta gacaagaaaa 1980
gcagattaaa tagatataca ttcgattaac gataagtaaa atgtaaaatc acaggatttt 2040
cgtgtgtggt cttctacaca gacaaggtga aacaattcgg cattaatacc tgagagcagg 2100
aagagcaaga taaaaggtag tatttgttgg cgatccccct agagtctttt acatcttcgg 2160
aaaacaaaaa ctattttttc tttaatttct ttttttactt tctattttta atttatatat 2220
ttatattaaa aaatttaaat tataattatt tttatagcac gtgatgaaaa ggacccaggt 2280
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 2340
aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 2400
aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 2460
cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 2520
ggacgcgtag tctagaccag ccaggacaga aatgcctcga cttcgctgct acccaaggtt 2580
gccgggtgac gcacaccgtg gaaacggatg aaggcacgaa cccagtggac ataagcctgt 2640
tcggttcgta agctgtaatg caagtagcgt atgcgctcac gcaactggtc cagaaccttg 2700
accgaacgca gcggtggtaa cggcgcagtg gcggttttca tggcttgtta tgactgtttt 2760
tttggggtac agtctatgcc tcgggcatcc aagcagcaag cgcgttacgc cgtgggtcga 2820
tgtttgatgt tatggagcag caacgatgtt acgcagcagg gcagtcgccc taaaacaaag 2880
ttaaacatta tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt 2940
ggcgccatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta cggctccgca 3000
gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg 3060
cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct 3120
ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt 3180
ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg caatgacatt 3240
cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa 3300
gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt 3360
cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc 3420
gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca 3480
gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccggct gggcaatgga gcgcctgccg 3540
gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct agacaggctt atcttggaca agaagaagat 3600
cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgtcc actacgtgaa aggcgagatc 3660
accaaggtag tcggcaaata accctcgagc attcaaggcg ccttgattat ttgacgtggt 3720
ttgatggcct ccacgcacgt tgtgatatgt agatgactcg taggaacaat ttcgggcccc 3780
tgcgtgttct tctgaggttc atcttttaca tttgcttctg ctggataatt ttcagaggca 3840
acaaggaaaa attagatggc aaaaagtcgt ctttcaagga aaaatcccca ccatctttcg 3900
agatcccctg taacttattg gcaactgaaa gaatgaaaag gaggaaaata caaaatatac 3960
tagaactgaa aaaaaaaaag tataaataga gacgatatat gccaatactt cacaatgttc 4020
gaatctattc ttcatttgca gctattgtaa aataataaaa catcaagaac aaacaagctc 4080
aacttgtctt ttctaagaac aaagaataaa cacaaaaaca aaaagttttt ttaattttaa 4140
tcaaaaaaca ggcccctttt cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca 4200
ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt 4260
ctaggtccct atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca 4320
aatttttctt ttttttctgt acaaacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt 4380
gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgt aatcattatc actttacggg 4440
tcctttccgg tgatccgaca ggttacgggg cggcgacctc gcgggttttc gctatttatg 4500
aaaattttcc ggtttaaggc gtttccgttc ttcttcgtca taacttaatg tttttattta 4560
aaatacctcg cgagtggcaa cactgaaaat acccatggag cggcgtaacc gtcgcacagg 4620
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 4680
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4740
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4800
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4860
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4920
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4980
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 5040
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcga 5079

<210> 150
<211> 21
<212> PRT
<213> Papaver rhoeas
<400> 150
Thr Gln Gly Leu Met Ser Tyr Lys Val Val Pro Leu Asp Ile Leu Leu
1 5 10 15
Thr Arg Arg Met Leu
20

<210> 151
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 151
Thr Pro Gly Leu Met Ser Tyr Lys Val Val Pro Leu Asp Ile Leu Leu
1 5 10 15
Thr His Arg Arg Ile Lys Ser Cys Val Gln Leu Ala Ser Ser Glu Arg
20 25 30
Asp Met Glu Ser Ser Gly Val Pro Val Ile Thr Leu Ser Ser Gly Lys
35 40 45
Val Met Pro Val Leu Gly Met Gly Thr Phe Glu Lys
50 55 60

<210> 152
<211> 27
<212> PRT
<213> Papaver rhoeas
<400> 152
Met Asp Ser Ser Gly Val Pro Val Ile Pro Leu Ser Ser Gly Lys Gly
1 5 10 15
Met Pro Ala Leu Ala Leu Gly Thr Phe Glu Thr
20 25

<210> 153
<211> 900
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 153
Met Glu Leu Gln Tyr Ile Ser Tyr Phe Gln Pro Thr Ser Ser Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Ser Val Val Val Leu
20 25 30
Arg Lys Thr Phe Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Thr
35 40 45
Lys Thr Ala Val Leu Ser His Gln Arg Gln Gln Ser Cys Ala Leu Pro
50 55 60
Ile Ser Gly Leu Leu His Ile Phe Met Asn Lys Asn Gly Leu Ile His
65 70 75 80
Val Thr Leu Gly Asn Met Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Ser Phe
85 90 95
Pro Thr Gly Ser His Arg Thr Leu Val Val Ser Ser Trp Glu Met Val
100 105 110
Lys Glu Cys Phe Thr Gly Asn Asn Asp Thr Ala Phe Ser Asn Arg Pro
115 120 125
Ile Pro Leu Ala Phe Lys Thr Ile Phe Tyr Ala Cys Gly Gly Ile Asp
130 135 140
Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Val Pro Tyr Gly Lys Tyr Trp Arg Glu Leu
145 150 155 160
Arg Lys Val Cys Val His Asn Leu Leu Ser Asn Gln Gln Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Arg His Leu Ile Ile Ser Gln Val Asp Thr Ser Phe Asn Lys Leu
180 185 190
Tyr Glu Leu Cys Lys Asn Ser Glu Asp Asn Gln Gly Asn Tyr Pro Thr
195 200 205
Thr Thr Thr Ala Ala Gly Met Val Arg Ile Asp Asp Trp Leu Ala Glu
210 215 220
Leu Ser Phe Asn Val Ile Gly Arg Ile Val Cys Gly Phe Gln Ser Gly
225 230 235 240
Pro Lys Thr Gly Ala Pro Ser Arg Val Glu Gln Phe Lys Glu Ala Ile
245 250 255
Asn Glu Ala Ser Tyr Phe Met Ser Thr Ser Pro Val Ser Asp Asn Val
260 265 270
Pro Met Leu Gly Trp Ile Asp Gln Leu Thr Gly Leu Thr Arg Asn Met
275 280 285
Lys His Cys Gly Lys Lys Leu Asp Leu Val Val Glu Ser Ile Ile Asn
290 295 300
Asp His Arg Gln Lys Arg Arg Phe Ser Arg Thr Lys Gly Gly Asp Glu
305 310 315 320
Lys Asp Asp Glu Gln Asp Asp Phe Ile Asp Ile Cys Leu Ser Ile Met
325 330 335
Glu Gln Pro Gln Leu Pro Gly Asn Asn Asn Pro Ser Gln Ile Pro Ile
340 345 350
Lys Ser Ile Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Gly Thr Asp Thr Thr Lys
355 360 365
Leu Thr Thr Ile Trp Thr Leu Ser Leu Leu Leu Asn Asn Pro His Val
370 375 380
Leu Asp Lys Ala Lys Gln Glu Val Asp Ala His Phe Arg Thr Lys Arg
385 390 395 400
Arg Ser Thr Asn Asp Ala Ala Ala Ala Val Val Asp Phe Asp Asp Ile
405 410 415
Arg Asn Leu Val Tyr Ile Gln Ala Ile Ile Lys Glu Ser Met Arg Leu
420 425 430
Tyr Pro Ala Ser Pro Val Val Glu Arg Leu Ser Gly Glu Asp Cys Val
435 440 445
Val Gly Gly Phe His Val Pro Ala Gly Thr Arg Leu Trp Ala Asn Val
450 455 460
Trp Lys Met Gln Arg Asp Pro Lys Val Trp Asp Asp Pro Leu Val Phe
465 470 475 480
Arg Pro Asp Arg Phe Leu Ser Asp Glu Gln Lys Met Val Asp Val Arg
485 490 495
Gly Gln Asn Tyr Glu Leu Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Val Cys
500 505 510
Pro Gly Val Ser Phe Ser Leu Asp Leu Met Gln Leu Val Leu Thr Arg
515 520 525
Leu Ile Leu Glu Phe Glu Met Lys Ser Pro Ser Gly Lys Val Asp Met
530 535 540
Thr Ala Thr Pro Gly Leu Met Ser Tyr Lys Val Ile Pro Leu Asp Ile
545 550 555 560
Leu Leu Thr His Arg Arg Ile Lys Pro Cys Val Gln Ser Ala Ala Ser
565 570 575
Glu Arg Asp Met Glu Ser Ser Gly Val Pro Val Ile Thr Leu Gly Ser
580 585 590
Gly Lys Val Met Pro Val Leu Gly Met Gly Thr Phe Glu Lys Val Gly
595 600 605
Lys Gly Ser Glu Arg Glu Arg Leu Ala Ile Leu Lys Ala Ile Glu Val
610 615 620
Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Glu Glu Val
625 630 635 640
Leu Gly Glu Ala Ile Ala Glu Ala Leu Gln Leu Gly Leu Val Lys Ser
645 650 655
Arg Asp Glu Leu Phe Ile Ser Ser Met Leu Trp Cys Thr Asp Ala His
660 665 670
Ala Asp Arg Val Leu Leu Ala Leu Gln Asn Ser Leu Arg Asn Leu Lys
675 680 685
Leu Glu Tyr Val Asp Leu Tyr Met Leu Pro Phe Pro Ala Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Gly Lys Ile Thr Met Asp Ile Pro Glu Glu Asp Ile Cys Arg Met
705 710 715 720
Asp Tyr Arg Ser Val Trp Ala Ala Met Glu Glu Cys Gln Asn Leu Gly
725 730 735
Phe Thr Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Cys Lys Lys Leu Gln
740 745 750
Glu Leu Met Ala Thr Ala Asn Ile Pro Pro Ala Val Asn Gln Val Glu
755 760 765
Met Ser Pro Ala Phe Gln Gln Lys Lys Leu Arg Glu Tyr Cys Asn Ala
770 775 780
Asn Asn Ile Leu Val Ser Ala Ile Ser Val Leu Gly Ser Asn Gly Thr
785 790 795 800
Pro Trp Gly Ser Asn Ala Val Leu Gly Ser Glu Val Leu Lys Lys Ile
805 810 815
Ala Met Ala Lys Gly Lys Ser Val Ala Gln Val Ser Met Arg Trp Val
820 825 830
Tyr Glu Gln Gly Ala Ser Leu Val Val Lys Ser Phe Ser Glu Glu Arg
835 840 845
Leu Arg Glu Asn Leu Asn Ile Phe Asp Trp Glu Leu Thr Lys Glu Asp
850 855 860
His Glu Lys Ile Gly Glu Ile Pro Gln Cys Arg Ile Leu Ser Ala Tyr
865 870 875 880
Phe Leu Val Ser Pro Asn Gly Pro Phe Lys Ser Gln Glu Glu Leu Trp
885 890 895
Asp Asp Glu Ala
900

Claims (73)

  1. (i) エピメラーゼと、
    (ii) テバインシンターゼと、
    (iii) (a) 基質阻害緩和変異、(b) 生成物阻害緩和変異、(c) 補因子回復促進機構、(d) フィードバック阻害緩和変異、(e) 転写モジュレーション改変、および (f) 不活性化変異からなる群より選択される少なくとも１つの改変と
    を含む遺伝子操作された非植物細胞であって、
    該遺伝子操作された非植物細胞内で、該遺伝子操作された非植物細胞が、プロモルフィナン分子の前駆体を、(i) モルフィナンアルカロイドと、(ii) ナル-オピオイドアルカロイドと、(iii) ノル-オピオイドアルカロイドとからなる群より選択されるアルカロイド生成物に変換する、遺伝子操作された非植物細胞。
  2. エピメラーゼが遺伝子操作されたエピメラーゼである、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  3. 遺伝子操作されたエピメラーゼが分割型エピメラーゼである、請求項2に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  4. 遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-1-ベンジルイソキノリン前駆体を(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換する、請求項2または3に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  5. 遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-レチクリンを(R)-レチクリンに変換する、請求項2～4のいずれか一項に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  6. 前記遺伝子操作された非植物細胞内の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド分子の少なくとも50%が(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換される、請求項4または5に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  7. テバインシンターゼが遺伝子操作されたテバインシンターゼである、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  8. プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞に与えられる、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  9. プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  10. プロモルフィナン分子の前駆体が、レチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、コクラウリン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ノルレチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、4’-O’-メチルラウダノソリン、L-Dopa、チロシン、ドパミン、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、ヒドロキシフェニルピルビン酸、プレフェネート、コリスメート、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸（EPSP）、3-デオキシ-D-アラビノヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）、エリトロース-4-リン酸（E4P）、ホスホエノールピルビン酸（PEP）、およびグルコースからなる群より選択される、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  11. 前記遺伝子操作された非植物細胞内の四環性プロモルフィナン前駆体分子の少なくとも50%がテバインに変換される、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  12. 四環性プロモルフィナン分子が、サルタリジン、サルタリジノール、またはサルタリジノール-7-O-アセテートからなる群より選択される、請求項11に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  13. プロモルフィナン分子の前駆体が、式I:
    Figure 2024037919000097
    の(S)-基質またはその塩であり、式中:
    R1、R2、R3およびR4は独立して、水素およびメチルから選択され;
    R5は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される、
    請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  14. R1、R2、R3、R4およびR5のうちの少なくとも1つが水素である、請求項13に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  15. プロモルフィナン分子の前駆体が、式II:
    Figure 2024037919000098
    の化合物またはその塩である(S)-基質であり、式中:
    R3は、水素およびC1～C4アルキルから選択され;
    R6およびR7は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1～C4アシル、C1～C4アルキルおよびC1～C4アルコキシから選択され;
    nは0、1、2、3または4であり;
    n’は0、1、2、3、4または5である、
    請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  16. プロモルフィナン分子の前駆体がチロシンである、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  17. プロモルフィナン分子の前駆体が糖である、前記請求項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  18. (i) BIA生成改変、(ii) O-脱メチル化改変、(iii) N-脱メチル化改変、および (iv) N-結合型改変からなる群より選択される少なくとも１つの改変をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  19. モルフィナンアルカロイド生成物が、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、またはオキシモルホンである、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  20. ナル-オピオイドアルカロイド生成物が、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン（axelopran）、ベベンプラン（bevenpran）、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミン、またはジプレノルフィンである、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  21. ノル-オピオイドアルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノン、またはノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンである、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  22. 細菌細胞または真菌細胞である、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  23. 細菌細胞が、アナベナ属（Anabaena）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アセトバクター属（Acetobacter）、アセトバクテリウム属（Acetobacterium）、バチルス属（Bacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブラキバクテリウム属（Brachybacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ハフニア属（Hafnia）、ハロモナス属（Halomonas）、クレブシエラ属（Klebsiella）、コクリア属（Kocuria）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leucononstoc）、マクロコッカス属（Macrococcus）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロセラ属（Methylocella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ムーレラ属（Moorella）、オエノコッカス属（Oenococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、プロテウス属（Proteus）、シュードアルテロモナス属（Pseudoalteromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、セラチア属（Serratia）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、ワイセラ属（Weissella）、およびザイモモナス属（Zymomonas）からなる群より選択される属に由来する、請求項22に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  24. 細菌細胞が、アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アルスロバクター・アリライテンシス（Arthrobacter arilaitensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス（Brachybacterium tyrofermentans）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium divergens）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Corynebacterium flavescens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、グルコナセトバクター・エウロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコナセトバクター・ホハンナエ（Gluconacetobacter johannae）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongata）、コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）、ラクトバチルス・アシディファリナエ（Lactobacillus acidifarinae）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ロイコノストク・シトレウム（Leuconostoc citreum）、マクロコッカス・カセオリティカス（Macrococcus caseolyticus）、マイクロバクテリウム・フォリオルム（Microbacterium foliorum）、ミクロコッカス・ライレ（Micrococcus lylae）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Propionibacterium acidipropionici）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、サイクロバクター・セラー（Psychrobacter celer）、スタフィロコッカス・コンディメンティ（Staphylococcus condimenti）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Streptomyces griseus）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）、ワイセラ・チバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・コレエンシス（Weissella koreensis）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）・ビフィドゥム（bifidum）/ブレーベ（breve）/ロンガム（longum）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、シュードアルテロモナス・シトレア（Pseudoalteromonas citrea）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、クロストリジウム（Clostridium）・リュングダリイ（ljungdahlii）/アセティカム（aceticum）/アセトブチリカム（acetobutylicum）/ベエイジェリンキー（beijerinckii）/ブチリカム（butyricum）、およびムーレラ（Moorella）・テモセルム（themocellum）/サーモアセチカ（thermoacetica）からなる群より選択される、請求項22に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  25. 真菌細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ピキア属（Pichia）、およびアスペルギルス属（Aspergillus）からなる群より選択される属に由来する、請求項22に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  26. 真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）およびアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）からなる群より選択される、請求項22に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  27. 前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも50%多いアルカロイド生成物を生成する、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  28. 前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも2倍多いアルカロイド生成物を生成する、請求項1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  29. プロモルフィナン分子の前駆体をテバインまたはその誘導体に変換する方法であって、
    プロモルフィナン分子の前駆体を少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、該少なくとも1種の酵素がテバインシンターゼを含み、プロモルフィナン分子の少なくとも1種の前駆体が、該変換が起こる遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、工程
    を含み、
    ここで、プロモルフィナン分子の前駆体を少なくとも1種の酵素と接触させる工程が、プロモルフィナン分子の前駆体をテバインまたはその誘導体に変換する、
    方法。
  30. プロモルフィナン分子の前駆体のテバインへの変換が、遺伝子操作された非植物細胞内で起こる、請求項29に記載の方法。
  31. プロモルフィナン分子の前駆体が、遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、請求項29に記載の方法。
  32. 遺伝子操作された非植物細胞が細菌細胞または真菌細胞である、請求項29～31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 細菌細胞が、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、マクロコッカス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属からなる群より選択される属に由来する、請求項31に記載の方法。
  34. 細菌細胞が、アルスロバクター・ニコチアナエ、アセトバクター・アセチ、アルスロバクター・アリライテンシス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、バチルス・スファエリカス、バチルス・ステアロサーモフィラス、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス、ブレビバクテリウム・リネンス、カルノバクテリウム・ディバージェンス、コリネバクテリウム・フラベセンス、エンテロコッカス・フェシウム、グルコナセトバクター・エウロパエウス、グルコナセトバクター・ホハンナエ、グルコノバクター・オキシダンス、ハフニア・アルベイ、ハロモナス・エロンガタ、コクリア・リゾフィラ、ラクトバチルス・アシディファリナエ、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス、ロイコノストク・シトレウム、マクロコッカス・カセオリティカス、マイクロバクテリウム・フォリオルム、ミクロコッカス・ライレ、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・アシディラクティシ、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・フルオレッセンス、サイクロバクター・セラー、スタフィロコッカス・コンディメンティ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトマイセス・グリゼウス、テトラジェノコッカス・ハロフィルス、ワイセラ・チバリア、ワイセラ・コレエンシス、ザイモモナス・モビリス、コリネバクテリウム・グルタミクム、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム/ブレーベ/ロンガム、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・カゼイ、シュードアルテロモナス・シトレア、シュードモナス・プチダ、クロストリジウム・リュングダリイ/アセティカム/アセトブチリカム/ベエイジェリンキー/ブチリカム、およびムーレラ・テモセルム/サーモアセチカからなる群より選択される、請求項31に記載の方法。
  35. 真菌細胞が、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に由来する、請求項31に記載の方法。
  36. 真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウスおよびアスペルギルス・ニデュランスからなる群より選択される、請求項31に記載の方法。
  37. 少なくとも1種の酵素が、該少なくとも1種の酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することによって生成される、請求項29に記載の方法。
  38. プロモルフィナン分子の前駆体を細胞培養物に添加する工程をさらに含む、請求項29に記載の方法。
  39. テバインまたはその誘導体を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項38に記載の方法。
  40. 少なくとも1種の酵素がテバインシンターゼを含む、請求項29～39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 少なくとも1種の酵素が、遺伝子操作されたテバインシンターゼ、遺伝子操作されたSalAT、形成性操作（DIR）タンパク質、またはカルコンイソメラーゼ（CHI）を含む、請求項29～39のいずれか一項に記載の方法。
  42. テバインシンターゼ酵素がBet v 1フォールド（fold）タンパク質である、請求項40に記載の方法。
  43. テバインシンターゼが、SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、35、36、および37からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の方法。
  44. テバインシンターゼが、プロモルフィナン分子の前駆体の少なくとも50%をテバインに変換する、請求項29に記載の方法。
  45. 遺伝子操作された非植物細胞が、プロモルフィナン分子の前駆体の少なくとも90%をテバインに変換する、請求項29に記載の方法。
  46. (i) エピメラーゼと、
    (ii) テバインシンターゼと、
    (iii) チロシンヒドロキシラーゼ（TyrH）、L-DOPA-デカルボキシラーゼ（DODC）、ノルコクラウリンシンターゼ（NCS）、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）、シトクロムP450 80B1（CYP80B1）、シトクロムP450レダクターゼ（CPR）、4’-O-メチルトランスフェラーゼ（4’OMT）、モノアミンオキシダーゼ（MAO）、トランスケトラーゼ（TKL1）、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（ZWF1）、五官能性AROMタンパク質（ARO1）、二官能性コリスミ酸シンターゼ（ARO2）、3-デオキシ-7-ホスホヘプツロン酸シンターゼ（ARO3）、3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ（ARO4）、コリスミ酸ムターゼ（ARO7）、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（TYR1）、芳香族アミノトランスフェラーゼ8（ARO8）、芳香族アミノトランスフェラーゼ9（ARO9）、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ARO10）、チロシナーゼ（TYR）からなる群より選択される少なくとも1種の酵素の改変と
    を含む遺伝子操作された非植物細胞であって、
    該遺伝子操作された非植物細胞内で、該遺伝子操作された非植物細胞が、プロモルフィナン分子の前駆体を、(i) モルフィナンアルカロイドと、(ii) ナル-オピオイドアルカロイドと、(iii) ノル-オピオイドアルカロイドとからなる群より選択されるアルカロイド生成物に変換する、遺伝子操作された非植物細胞。
  47. エピメラーゼが遺伝子操作されたエピメラーゼである、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  48. 遺伝子操作されたエピメラーゼが分割型エピメラーゼである、請求項47に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  49. 遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-1-ベンジルイソキノリン前駆体を(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換する、請求項47または48に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  50. 遺伝子操作されたエピメラーゼが(S)-レチクリンを(R)-レチクリンに変換する、請求項47～49のいずれか一項に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  51. 前記遺伝子操作された非植物細胞内の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド分子の少なくとも50%が(R)-1-ベンジルイソキノリン生成物に変換される、請求項49または50に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  52. テバインシンターゼが遺伝子操作されたテバインシンターゼである、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  53. プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞に与えられる、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  54. プロモルフィナン分子の前駆体が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で生成される、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  55. プロモルフィナン分子の前駆体が、レチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、コクラウリン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ラウダノソリン、メチルノルラウダノソリン、ノルレチクリン、3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、4’-O’-メチルラウダノソリン、L-Dopa、チロシン、ドパミン、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、ヒドロキシフェニルピルビン酸、プレフェネート、コリスメート、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸（EPSP）、3-デオキシ-D-アラビノヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）、エリトロース-4-リン酸（E4P）、ホスホエノールピルビン酸（PEP）、およびグルコースからなる群より選択される、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  56. 前記遺伝子操作された非植物細胞内の四環性プロモルフィナン前駆体分子の少なくとも50%がテバインに変換される、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  57. 四環性プロモルフィナン分子が、サルタリジン、サルタリジノール、またはサルタリジノール-7-O-アセテートからなる群より選択される、請求項56に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  58. プロモルフィナン分子の前駆体が、式I:
    Figure 2024037919000099
    の(S)-基質またはその塩であり、式中:
    R1、R2、R3およびR4は独立して、水素およびメチルから選択され;
    R5は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される、
    請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  59. R1、R2、R3、R4およびR5のうちの少なくとも1つが水素である、請求項57に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  60. プロモルフィナン分子の前駆体が、式II:
    Figure 2024037919000100
    の化合物またはその塩である(S)-基質であり、式中:
    R3は、水素およびC1～C4アルキルから選択され;
    R6およびR7は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1～C4アシル、C1～C4アルキルおよびC1～C4アルコキシから選択され;
    nは0、1、2、3または4であり;
    n’は0、1、2、3、4または5である、
    請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  61. プロモルフィナン分子の前駆体がチロシンである、請求項46～60のいずれか一項に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  62. プロモルフィナン分子の前駆体が糖である、請求項46～60のいずれか一項に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  63. (i) BIA生成改変、(ii) O-脱メチル化改変、(iii) N-脱メチル化改変、および (iv) N-結合型改変からなる群より選択される少なくとも１つの改変をさらに含む、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  64. モルフィナンアルカロイド生成物が、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、またはオキシモルホンである、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  65. ナル-オピオイドアルカロイド生成物が、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン、ベベンプラン、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミン、またはジプレノルフィンである、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  66. ノル-オピオイドアルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノン、またはノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンである、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  67. 細菌細胞または真菌細胞である、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  68. 細菌細胞が、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、マクロコッカス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属からなる群より選択される属に由来する、請求項67に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  69. 細菌細胞が、アルスロバクター・ニコチアナエ、アセトバクター・アセチ、アルスロバクター・アリライテンシス、バチルス・セレウス、バチルス・コアグランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、バチルス・スファエリカス、バチルス・ステアロサーモフィラス、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス、ブレビバクテリウム・リネンス、カルノバクテリウム・ディバージェンス、コリネバクテリウム・フラベセンス、エンテロコッカス・フェシウム、グルコナセトバクター・エウロパエウス、グルコナセトバクター・ホハンナエ、グルコノバクター・オキシダンス、ハフニア・アルベイ、ハロモナス・エロンガタ、コクリア・リゾフィラ、ラクトバチルス・アシディファリナエ、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス、ロイコノストク・シトレウム、マクロコッカス・カセオリティカス、マイクロバクテリウム・フォリオルム、ミクロコッカス・ライレ、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・アシディラクティシ、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・フルオレッセンス、サイクロバクター・セラー、スタフィロコッカス・コンディメンティ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトマイセス・グリゼウス、テトラジェノコッカス・ハロフィルス、ワイセラ・チバリア、ワイセラ・コレエンシス、ザイモモナス・モビリス、コリネバクテリウム・グルタミクム、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム/ブレーベ/ロンガム、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・カゼイ、シュードアルテロモナス・シトレア、シュードモナス・プチダ、クロストリジウム・リュングダリイ/アセティカム/アセトブチリカム/ベエイジェリンキー/ブチリカム、およびムーレラ・テモセルム/サーモアセチカからなる群より選択される、請求項67に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  70. 真菌細胞が、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に由来する、請求項67に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  71. 真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス、およびアスペルギルス・ニデュランスからなる群より選択される、請求項67に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  72. 前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも50%多いアルカロイド生成物を生成する、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
  73. 前記遺伝子操作された非植物細胞よりも少ない1つまたは複数の改変を有する同等の細胞より少なくとも2倍多いアルカロイド生成物を生成する、請求項46に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
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