JP7266966B2 - エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法 - Google Patents

エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7266966B2
JP7266966B2 JP2017558387A JP2017558387A JP7266966B2 JP 7266966 B2 JP7266966 B2 JP 7266966B2 JP 2017558387 A JP2017558387 A JP 2017558387A JP 2017558387 A JP2017558387 A JP 2017558387A JP 7266966 B2 JP7266966 B2 JP 7266966B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
genetically engineered
gene
engineered host
host cell
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017558387A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018515093A5 (ja
JP2018515093A (ja
Inventor
クリスティーナ ディー． スモルク
ステファニー ガラニー
アイシス トレンチャード
キャサリン ソーディー
ヤンラン リ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=57248432&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP7266966(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of JP2018515093A publication Critical patent/JP2018515093A/ja
Publication of JP2018515093A5 publication Critical patent/JP2018515093A5/ja
Priority to JP2021088222A priority Critical patent/JP2021129587A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7266966B2 publication Critical patent/JP7266966B2/ja
Priority to JP2024010647A priority patent/JP2024038497A/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01247—Codeinone reductase (NADPH) (1.1.1.247)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/99—Racemaces and epimerases (5.1) acting on other compounds (5.1.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

相互参照
合衆国法典第３５巻１１９条（ｅ）の下で、本出願は、２０１５年５月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１５９，１２２号及び２０１５年６月１１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１７４，４７５号の出願日に対する優先権を主張し、これらの出願の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
加えて、本出願は、ＵＳ２０１４－０２７３１０９としてここに公開する米国仮特許出願番号第１４／２１１，６１１号、この出願は、２０１４年３月１４日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１０１８を有する；ＷＯ２０１４／１４３７４４としてここに公開するＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７８３３、この出願は、２０１４年３月１４日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１０１８ＷＯを有する；米国特許出願番号第１５／０３１，６１８号、この出願は、２０１６年４月２２日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１０７８を有する；ＷＯ２０１５／０６６６４２としてここに公開する出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６３７３８、この出願は、２０１４年１１月３日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１０７８ＷＯを有する；米国仮特許出願番号第６２／０８０，６１０号、この出願は、２０１４年１１月１７日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１１６９ＰＲＶを有する；米国仮特許出願番号第６２／１０７，２３８号、これは２０１５年１月２３日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１１６９ＰＲＶ２を有する；出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６０８９１、この出願は２０１５年１１月１６日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１１６９ＷＯを有する；米国仮特許出願番号第６２／１５６，７０１号、これは、２０１５年５月４日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１２２１ＰＲＶを有する；及び出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３０８０８、この出願は、２０１６年５月４日に出願され、代理人整理番号ＳＴＡＮ－１２２１ＷＯを有する、に関連し、これらの出願の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
連邦政府資金による研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約番号ＡＴ００７８８６の下で、政府の支援を伴ってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞における多様なベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の産生方法を提供する。本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において産生される多様なアルカロイドの組成物をさらに提供する。加えて、本開示は、遺伝子操作された宿主細胞におけるエピメラーゼの産生方法を提供する。特定の場合では、本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリン（ｂｅｎｙｚｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）アルカロイドへの（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマー化を通して多様なアルカロイド産物を産生するための方法を提供する。さらに特定の場合では、本開示は、（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンのエピマー化を通して多様なアルカロイド産物を産生するための方法を提供する。
本発明のある態様は、遺伝子操作していない細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明の別の態様は、野生型ＴｙｒＨを発現する細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明の追加の態様は、本明細書に提供するようなチロシンヒドロキシラーゼ活性を増加させる突然変異を伴わない野生型ＴｙｒＨを発現する細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞を提供する。具体的には、遺伝子操作された非植物細胞は、基質阻害軽減突然変異；生産物阻害軽減突然変異；及び補因子回収促進機構からなる群より選択される、少なくとも１つの改変を有する。
本発明の追加の態様は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドにエピマー化する方法を提供する。該方法は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させる工程を含む。（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させることが、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する。
本発明の別の態様は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピメラーゼを産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。エピメラーゼは、表１に記載するような、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明のさらなる態様は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスであって、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをエピメラーゼと、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに十分な量で接触させる工程を含む、前記プロセスを提供する。
本発明の別の態様では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心をエピマー化する方法を提供する。該方法は、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させる工程を含む。１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させる工程は、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の立体化学を、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の反対の立体化学へと反転させる。
いくつかの例では、遺伝子操作された非植物細胞は、表２に列挙する酵素の群より選択される酵素をそれぞれコードする複数のコード配列を含む。いくつかの例では、異種コード配列は、作動可能に連結してよい。作動可能に連結している異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド産物及び／またはエピメラーゼ産物を産生する、同一の経路内にあってよい。
本発明の追加の態様では、ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。ビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、遺伝子操作された非植物細胞内に存在するカップリング酵素を使用して産生される。加えて、遺伝子操作された非植物細胞は、遺伝子操作された非植物細胞内で少なくとも１つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの産生に使用される少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含む。さらに、少なくとも１つのカップリング酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内で２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりビスベンジルイソキノリンアルカロイドを形成する。
[本発明1001]
（Ｓ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1つの酵素と接触させる工程であって、前記（Ｓ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する、前記工程
を含む、前記（Ｓ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドにエピマー化する方法。
[本発明1002]
前記少なくとも1つの酵素が、前記少なくとも1つの酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することにより産生される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
（Ｓ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に加える工程
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記（Ｒ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を前記細胞培養物から回収する工程
をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記少なくとも1つの酵素がオキシダーゼを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つの酵素がレダクターゼを含む、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記少なくとも1つの酵素がエピメラーゼを含む、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記エピメラーゼが、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含む、本発明1007または1008の方法。
[本発明1010]
前記オキシダーゼドメインがシトクロムＰ450オキシダーゼ様ドメインである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、遺伝子操作された酵母細胞である、本発明1007～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記（Ｓ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドが（Ｓ）－レチクリンである、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記（Ｒ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドが（Ｒ）－レチクリンである、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記（Ｓ）－1－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、Ｌ－チロシンから始まる代謝経路により、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、本発明1001～1014のいずれかの方法。

参照による組込み
本明細書中で言及する全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的に及び個別に参照により組込まれると示されている場合と同じ程度に参照により本明細書に組込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
本発明の実施形態に係る、テトラヒドロビオプテリンの合成、再循環、及び再生経路の例を示す。 本発明の実施形態に係る、４－ＨＰＡ、ドパミン、及び３，４－ＤＨＰＡへのグルコースの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイド形成の概略的な例を示す。 本発明の実施形態に係る、ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素のアミノ酸配列を示す。 本発明の実施形態に係る、ノルコクラウリンを介したレチクリンへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す 本発明の実施形態に係る、ノルラウダノソリンを介したレチクリンへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、モルフィナンアルカロイドへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、プロトベルベリン、フタリドイソキノリン、及びベルベリンアルカロイド産物へのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、ノスカピン、ノスカピノイド、及びフタリドイソキノリンアルカロイド産物へのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、サンギナリン及びベンゾフェナントリジンアルカロイドへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、ノスカピンへのカナジンの変換のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、半合成オピオイドの産生のための生合成スキームを示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株における糖からのノルコクラウリン産生を向上させるチロシンヒドロキシラーゼ突然変異体を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株における糖からのレチクリン産生を向上させるチロシンヒドロキシラーゼ突然変異体を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるチロシンヒドロキシラーゼによるＬ－ドパ産生を向上させるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の共発現を示す。 図１５（Ａ）は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株においてチロシンヒドロキシラーゼによりＬ－ドパ産生を向上させる培地への抗酸化剤の添加を示す。図１５（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る、ＢＨ４レベルを増加させる培地への抗酸化剤の添加を示す。 図１６（Ａ）は、本発明の実施形態に係る、ビスＢＩＡへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。図１６（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る、ビスＢＩＡを生合成するように遺伝子操作された酵母菌株を示す。 本発明の実施形態に係る、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ－コデイノンレダクターゼ様（ＣＹＰ－ＣＯＲ）融合体の系統樹を示す。 図１８（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る、（Ｓ）－レチクリンをサルタリジンに変換するように遺伝子操作された酵母菌株のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 本発明の実施形態に係る、ラセミノルラウダノソリンを（Ｒ）－レチクリンに変換するように遺伝子操作された酵母菌株のキラルＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図２０（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る、植物ではなく酵母において異種発現されるときに観察されるタンパク質のＮ結合型グリコシル化を取り除くサルタリジンシンターゼの遺伝子操作された融合体を示す。 図２１（Ａ）及び２１（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る、ケイランチホリンシンターゼ－サルタリジンシンターゼ融合設計を示す。 本発明の実施形態に係る、酵母における活性を向上させるサルタリジンシンターゼコドン最適化及び遺伝子操作された融合体を示す。 図２３（Ａ）及び２３（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母がテバインへの（Ｒ）－レチクリンの変換及びテバインへのｒａｃ－ノルラウダノソリンの変換を触媒する、小規模バッチ発酵のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 本発明の実施形態に係る、ランダム突然変異誘発及びスクリーニングを通して酵母において増強された活性を呈するＣＯＤＭ酵素バリアントの生成を示す。 図２５（Ａ）、２５（Ｂ）、及び２５（C）は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母によるテバインへの（Ｒ）－レチクリンの変換のための発酵最適化を示す。 本発明の実施形態に係る、Ｌ－チロシンからの重要な分岐点中間体であるレチクリンの産生のための酵母プラットフォーム菌株を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるテバイン及びヒドロコドン産生を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるテバイン及びヒドロコドン産生を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるテバイン及びヒドロコドン産生を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるテバイン及びヒドロコドン産生を示す。 本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株において２つのコピーから３つのコピーへとＮＣＳ遺伝子のコピー数を増加させることによるベンジルイソキノリンアルカロイドレチクリンの増加した産生を示す。
発明の詳細な説明
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において多様なベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を産生するための方法を提供する。本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において産生される多様なアルカロイドの組成物をさらに提供する。加えて、本開示は、遺伝子操作された宿主細胞においてエピメラーゼを産生するための方法を提供する。特定の場合では、本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリン（ｂｅｎｙｚｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）アルカロイドへの（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマー化を通して多様なアルカロイド産物を産生するための方法を提供する。さらに特定の場合では、本開示は、（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンのエピマー化を通して多様なアルカロイド産物を産生するための方法を提供する。
目的のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）
目的のＢＩＡを産生する宿主細胞を提供する。いくつかの例では、宿主細胞の遺伝子操作された菌株、例えば、本発明の遺伝子操作された菌株は、目的のベンジルイソキノリンアルカロイドならびに前駆体ＢＩＡ、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、プロトピン、ベンゾフェナントリジン、プロモルフィナン、モルフィナン、セコベルベリン、フタリドイソキノリン、アポルフィン、ビスベンジルイソキノリン、及びその他を含むがこれらに限定されない、いくつかの構造的クラスにわたるそれらの改変物を産生するためのプラットフォームを提供する。これらのクラスはそれぞれ、そのクラスのメンバーへと導き得る遺伝子操作された宿主細胞生合成経路の任意の好都合なメンバーの、それらのクラスの生合成前駆体、中間体及び代謝産物を含むと意図される。化合物の非限定的な例を、これらの構造的クラスのそれぞれについて以下に示す。いくつか場合では、所与の例の構造はそれ自身がベンジルイソキノリンアルカロイドとして特徴づけられても、特徴づけられなくてもよい。本化学実体は、単一エナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマーの混合物、及び中間体混合物を含む、全ての可能な異性体を含むと意図される。
ＢＩＡ前駆体には、ノルコクラウリン（ＮＣ）及びノルラウダノソリン（ＮＬ）、ならびにＮＣ及びＮＬ前駆体、例えば、チロシン、チラミン、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４－ＨＰＡ）、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸（４－ＨＰＰＡ）、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ドパ）、３，４－ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（３，４－ＤＨＰＡ）、及びドパミンが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＢＩＡ前駆体は、３，４－ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（３，４－ＤＨＰＡ）及びドパミンである。ある特定の例では、１つまたは複数のＢＩＡ前駆体は、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４－ＨＰＡ）及びドパミンである。具体的には、ＮＬ及びＮＣは、ピクテ・スペングラー縮合反応を介して前駆体分子から、それぞれ合成されてよく、この反応は、自発的に起こり得るかまたは任意の好都合な酵素により触媒され得る。
ベンジルイソキノリンには、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、コクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、４’－Ｏ－メチルノルラウダノソリン、４’－Ｏ－メチル－ラウダノソリン、Ｎ－メチルノルコクラウリン、ラウダノソリン、Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、パパベリン、ラウダニン、ラウダノシン、テトラヒドロパパベリン、１，２－ジヒドロパパベリン、及びオリエンタリンが含まれ得るが、これらに限定されない。
プロトベルベリンには、スコウレリン、ケイランチホリン、スチロピン、ナンジニン、ジャトロリジン、ステホリジン、ジスクレタミン、シス－Ｎ－メチルスチロピン、テトラヒドロコルンバミン、パルマチン、テトラヒドロパルマチン、コルンバミン、カナジン、Ｎ－メチルカナジン、１－ヒドロキシカナジン、ベルベリン、Ｎ－メチル－オフィオカルピン、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン、及び１－ヒドロキシ－１０－Ｏ－アセチル－Ｎ－メチルカナジンが含まれ得るが、これらに限定されない。
プロトピンには、プロトピン、６－ヒドロキシプロトピン、アロクリプトピン、クリプトピン、ムラミン、及びタリクトリシンが含まれ得るが、これらに限定されない。
ベンゾフェナントリジンには、ジヒドロサンギナリン、サンギナリン、ジヒドロケイリルビン、ケイリルビン、ジヒドロマルカピン、マルカピン、及びケレリトリンが含まれ得るが、これらに限定されない。
プロモルフィナンには、サルタリジン、サルタリジノール、及びサルタリジノール－７－Ｏ－アセテートが含まれ得るが、これらに限定されない。
モルフィナンには、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルフィノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルフィン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、１４－ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、１４－ヒドロキシコデイン、モルフィノン、ヒドロモルフォン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、及びオキシモルフォンが含まれ得るが、これらに限定されない。
セコベルベリンには、４’－Ｏ－デスメチルマクラントアルデヒド、４’－Ｏ－デスメチルパパベロキシン、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン、パパベロキシン、及び３－Ｏ－アセテイルパパベロキシンが含まれ得るが、これらに限定されない。
フタリドイソキノリンには、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、ノスカピン、カプノイジン、アドルミン、（＋）または（－）－ビククリン、カプノイジン、カルルミン、コルレジン、コルルミジン、デクンベニン、５’－Ｏ－デメチルナルコチン、（＋）または（－）－αまたはβ－ヒドラスチン、及びハイパコウミンが含まれ得るが、これらに限定されない。
アポルフィンには、マグノフロリン、コリツベリン、アポモルヒネ、ボルジン、イソボルジン、イソテバイン、イソコリツベリン、及びグラウフィンが含まれ得るが、これらに限定されない。
ビスベンジルイソキノリンには、ベルバムニン、グアットガウメリン、ダウリシン、及びリエンシニンが含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明の遺伝子操作された菌株により産生され得る他の化合物には、ロエアジン、パビン、イソパビン、及びクラリンが含まれ得るが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された菌株は、ジヒドロネオプテリン三リン酸、６－ピルボイルテトラヒドロプテリン、５，６，７，８－テトラヒドロビオプテリン、７，８－ジヒドロビオプテリン、テトラヒドロビオプテリン４ａ－カルビノールアミン、キノノイドジヒドロビオプテリン、及びビオプテリンを含むがこれらに限定されない、テトラヒドロビオプテリン合成に関連する化合物を産生するためのプラットフォームを提供し得る。
宿主細胞
任意の好都合な細胞を、主題の宿主細胞及び方法に使用してよい。いくつかの場合では、宿主細胞は非植物細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は、微生物細胞であることを特徴としてよい。ある特定の場合では、宿主細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、または酵母細胞である。任意の好都合なタイプの宿主細胞は、主題のＢＩＡ産生細胞の産生において使用してよい。例えば、ＵＳ２００８／０１７６７５４、及びＵＳ２０１４／０２７３１０９を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が組込まれる。目的の宿主細胞には、細菌細胞、例えば、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｉｕｍ）細胞、昆虫細胞、例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ） Ｓ２及びスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） Ｓｆ９細胞、ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、宿主細胞は、酵母細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。いくつかの場合では、宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドなどの目的のＢＩＡを産生するように遺伝子操作された酵母の菌株に由来する。いくつかの例では、宿主細胞は、目的の酵素を産生するように遺伝子操作された酵母の菌株に由来する。いくつかの例では、宿主細胞は、エピメラーゼを産生するように遺伝子操作された酵母の菌株に由来する。エピメラーゼは、オキシダーゼ及びレダクターゼを有してよい。加えて、エピメラーゼは、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換することができ得る。さらに、エピメラーゼは、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへと変換するために使用されるようにオキシダーゼまたはレダクターゼ活性を保持するより小さい酵素へと分離され得る。
Ｓｍｏｌｋｅ ｅｔ ａｌ．によりＵＳ２００８／０１７６７５４及びＵＳ２０１４／０２７３１０９にて記載されている宿主細胞はいずれも、主題の細胞及び方法での使用に適用してよい。ある特定の実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）種であってよい。ある特定の実施形態では、酵母細胞は、シゾサッカロミセス・ポンベ種であってよい。ある特定の実施形態では、酵母細胞は、ピキア・パストリス種であってよい。酵母は、宿主細胞として目的の対象であり、それはシトクロムＰ４５０タンパク質がそれらの活性が維持されるように小胞体膜内に適切に折り畳まれることができるからである。例では、シトクロムＰ４５０タンパク質は、いくつかの目的の生合成経路に関与する。追加の例では、シトクロムＰ４５０タンパク質は、目的のＢＩＡの産生に関与する。さらなる例では、シトクロムＰ４５０タンパク質は、オキシダーゼ及びレダクターゼを有するエピメラーゼなどの、目的の酵素の産生に関与する。
本発明で使用される目的の酵母菌株には、ＣＥＮ．ＰＫ（遺伝子型：ＭＡＴａ／α ｕｒａ３－５２／ｕｒａ３－５２ｔｒｐ１－２８９／ｔｒｐ１－２８９ ｌｅｕ２－３＿１１２／ｌｅｕ２－３＿１１２ ｈｉｓ３ Δ１／ｈｉｓ３ Δ１ ＭＡＬ２－８Ｃ／ＭＡＬ２－８Ｃ ＳＵＣ２／ＳＵＣ２）、Ｓ２８８Ｃ、Ｗ３０３、Ｄ２７３－１０Ｂ、Ｘ２１８０、Ａ３６４Ａ、Σ１２７８Ｂ、ＡＢ９７２、ＳＫ１及びＦＬ１００が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の場合では、酵母株は、Ｓ２８８Ｃ（ＭＡＴα；ＳＵＣ２ ｍａｌ ｍｅｌ ｇａｌ２ ＣＵＰ１ ｆｌｏ１ ｆｌｏ８－１ ｈａｐ１）、ＢＹ４７４１（ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０；ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７４２（ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０；ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７４３（ＭＡＴａ／ＭＡＴα；ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１；ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０；ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５；ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０；ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０）、及びＷＡＴ１１またはＷ（Ｒ）、Ｗ３０３－Ｂ株の誘導体（ＭＡＴａ；ａｄｅ２－１；ｈｉｓ３－１１、－１５；ｌｅｕ２－３、－１１２；ｕｒａ３－１；ｃａｎＲ；ｃｙｒ＋）、これらは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ） ＮＡＤＰＨ－Ｐ４５０レダクターゼＡＴＲ１及び酵母ＮＡＤＰＨ－Ｐ４５０レダクターゼＣＰＲ１をそれぞれ発現する、のいずれかである。別の実施形態では、酵母細胞は、Ｗ３０３α（ＭＡＴα；ｈｉｓ３－１１、１５ｔｒｐ１－１ ｌｅｕ２－３ ｕｒａ３－１ ａｄｅ２－１）である。目的の追加の酵母株の同一性及び遺伝子型は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ（ｗｅｂ．ｕｎｉ－ｆｒａｎｋｆｕｒｔ．ｄｅ／ｆｂ１５／ｍｉｋｒｏ／ｅｕｒｏｓｃａｒｆ／ｃｏｌ＿ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で見出され得る。
宿主細胞に対する遺伝子改変
宿主細胞は、目的のＢＩＡの産生を提供する１つまたは複数の改変（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多くの改変）を含むように遺伝子操作されてよい。加えてまたはあるいは、宿主細胞は、目的の酵素の産生を提供する１つまたは複数の改変（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多くの改変）を含むように遺伝子操作されてよい。いくつかの場合では、改変は、遺伝子改変、例えば、遺伝子もしくはその断片の突然変異、付加、もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写制御である。本明細書で用いるとき、「突然変異」という用語は、基準配列またはモチーフと比べて、アミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換を指す。突然変異は、元来の遺伝子座での天然型遺伝子に対する定向突然変異として取り込まれてよい。いくつかの場合では、突然変異は、別々の遺伝子座での遺伝子組込みとして導入された遺伝子の追加のコピーとして、またはエピソーマルベクター、例えば２μもしくは動原体プラスミド上の追加のコピーとして取り込まれてよい。ある特定の例では、酵素の基質阻害されたコピーは、天然の細胞転写制御下にある。いくつかの例では、酵素の基質阻害されたコピーは、それを合成のプロモーターの制御下に置くことで、タンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的制御と共に導入される。いくつかの例では、１つまたは複数の改変の対象は、天然型遺伝子であってよい。いくつかの例では、１つまたは複数の改変の対象は、天然でない遺伝子であってよい。いくつかの例では、天然でない遺伝子は、宿主細胞に挿入されてよい。さらなる例では、天然でない遺伝子は、宿主細胞に挿入される前に、１つまたは複数の改変により変異されてよい。
遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の目的のＢＩＡを過剰産生し得る。過剰産生とは、対照細胞（例えば、未改変細胞）と比べて、細胞の、目的のＢＩＡ分子の産生が向上しているまたは増加していることを意味する。産生の向上または増加とは、対照が目的のＢＩＡを産生しない場合のいくらかの量の目的のＢＩＡの産生、ならびに、対照が目的のＢＩＡをいくらか産生する状況における約１０％以上、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上の増加の両方を指す。
遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを過剰産生し得る。いくつかの場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを産生しない場合にいくらかの量の目的の（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを産生してよく、ならびに対照が目的の（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをいくらか産生する状況において、約１０％以上、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上に増加させて産生してよい。
遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをさらに過剰産生し得る。いくつかの場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイド産を産生しない場合にいくらかの量の目的の（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを産生してよく、ならびに対照が目的の（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをいくらか産生する状況において、約１０％以上、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上に増加して産生してよい。遺伝子操作された宿主細胞は、モルフィナン、プロトベルベリン、ノスカピノイド、及びベンゾフェナントリジンアルカロイドのうちの１つまたは複数をさらに過剰産生し得る。
いくつかの場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のような）を欠く対照宿主細胞と比べて、（Ｒ）－レチクリンの量を増加させて産生することができる。ある特定の例では、増加した量の（Ｒ）－レチクリンとは、対照宿主細胞と比べて約１０％以上、例えば、対照宿主細胞と比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、約２倍以上、約５倍以上、またはさらには約１０倍以上である。いくつかの場合では、（Ｒ）－レチクリンは、遺伝子操作された宿主細胞内でのエピマー化反応の産物である。これらの場合では、（Ｓ）－レチクリンは、エピマー化反応の基質であってよい。
加えて、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の目的の酵素を過剰産生し得る。過剰産生とは、対照細胞（例えば、未改変細胞）と比べて、細胞の、目的の酵素の産生が向上しているまたは増加していることを意味する。産生の向上または増加とは、対照が産生しない場合のいくらかの量の目的の酵素の産生、ならびに、対照が目的の酵素をいくらか産生する状況における、約１０％以上、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上の増加の両方を指す。
遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数のＣＹＰ－ＣＯＲ酵素を過剰産生し得る。いくつかの場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がＣＹＰ－ＣＯＲ酵素を産生しない場合にいくらかの量のＣＹＰ－ＣＯＲ酵素を産生してよく、ならびに対照がＣＹＰ－ＣＯＲ酵素をいくらか産生する状況において、約１０％以上、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上に増加させて産生してよい。
遺伝子操作された宿主細胞は、ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素に由来する１つまたは複数の酵素を過剰産生し得る。いくつかの場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がＣＹＰ－ＣＯＲ酵素に由来する酵素を産生しない場合にいくらかの量のＣＹＰ－ＣＯＲ酵素に由来する酵素を産生してよく、ならびに対照がＣＹＰ－ＣＯＲ酵素に由来する酵素をいくらか産生する状況において、約１０％以上、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、例えば、２倍以上、例えば、５倍以上、例えば、１０倍以上に増加させて産生してよい。
加えて、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数のビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスＢＩＡ）を過剰産生し得る。具体的には、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のような）を欠く対照宿主細胞と比べて、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスＢＩＡ）の量を増加させて産生することができる。ある特定の例では、増加した量のビスＢＩＡとは、対照宿主細胞と比べて約１０％以上、例えば、対照宿主細胞と比べて約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約８０％以上、約１００％以上、約２倍以上、約５倍以上、またはさらには約１０倍以上である。いくつかの場合では、ビスＢＩＡは、遺伝子操作された宿主細胞内でのエピマー化反応の産物である少なくとも１つのＢＩＡモノマー、またはその誘導体から形成される。遺伝子操作された宿主細胞は、セファランチン、ファングキノリン、リエンシニン、ネフェリン、ツボクラリン、ダウリシン、テトランドリン、クリン、ベルバムニン、グアッテガウメリン、２’－ノルベルバムニン、及びベルバミンのうちの１つまたは複数をさらに過剰産生し得る。
いくつかの場合では、１つまたは複数（例えば、２つ以上、３つ以上、または４つ以上の）の改変は、生合成酵素遺伝子における基質阻害軽減突然変異；生合成酵素遺伝子における生産物阻害軽減突然変異；補因子回収促進機構；生合成酵素遺伝子におけるフィードバック阻害軽減突然変異；生合成酵素遺伝子の転写調節改変；酵素遺伝子における不活性化突然変異；エピマー化改変；ビスＢＩＡ生成改変；及び酵素をコードする異種コード配列から選択してよい。１つまたは複数の改変を含む細胞は、遺伝子操作された細胞と称してよい。
基質阻害軽減突然変異
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の基質阻害軽減突然変異（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多く）を細胞の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対して天然である（例えば、未改変細胞中に存在する）。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対して天然でない。本明細書で用いるとき、「基質阻害軽減突然変異」という用語は、細胞の基質阻害制御機構を軽減させる突然変異を指す。
基質阻害を軽減する突然変異は、対照細胞と比べて目的の細胞における調節された酵素の阻害を低下させ、調節された化合物またはその下流生合成産物のレベルを増加させる。いくつかの場合では、調節された酵素の阻害の軽減は、阻害のＩＣ５０が、２倍以上、例えば、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上、またはさらに多く増加することを意味する。増加したレベルとは、対照細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルの１１０％以上である、例えば、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上、例えば、少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上であるまたはさらに多い、遺伝子操作された宿主細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルを意味する。
目的のＢＩＡ、またはその前駆体のレベルの調節を対象とする遺伝子操作された宿主細胞における様々な基質阻害制御機構及び生合成酵素は、基質阻害軽減の標的とされ得る。遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に１つまたは複数の基質阻害軽減突然変異を含んでよい。１つまたは複数の突然変異は、生合成酵素が調節制御を受ける任意の好都合な生合成酵素遺伝子内に位置してよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、１つまたは複数のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードする。ある特定の例では、１つまたは複数の基質阻害軽減突然変異は、ＴｙｒＨである生合成酵素遺伝子内に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の基質阻害軽減突然変異を、表２に記載の遺伝子のうちの１つなどの１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含んでよい。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の基質阻害軽減突然変異は、ＴｙｒＨ遺伝子内に存在する。ＴｙｒＨ遺伝子は、チロシンをＬ－ドパに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードする。しかしながら、ＴｙｒＨは、その基質であるチロシンにより阻害される。ヒトまたはラットにおいてみられるものなどの哺乳類チロシンヒドロキシラーゼ活性は、基質阻害を緩和するＴｙｒＨ遺伝子に対する突然変異を通して向上することができる。具体的には、チロシンからの基質阻害は、ＴｙｒＨ遺伝子内の点突然変異Ｗ１６６Ｙにより緩和することができる。ＴｙｒＨ遺伝子内の点突然変異Ｗ１６６Ｙは、チロシンのＬ－ドパへの反応を触媒するチロシンヒドロキシラーゼの補助基質である、ＢＨ４の結合も改善し得る。ＴｙｒＨの突然変異体は、糖からＢＩＡを産生するように酵母菌株内で発現されるとき（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載されているものなど）、ＢＩＡの産生を有意に向上させることができる。
任意の好都合な数及び型の突然変異を使用して、基質阻害制御機構を軽減し得る。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、またさらには１５個以上の基質阻害軽減突然変異、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の基質阻害軽減突然変異を、遺伝子操作された宿主細胞内の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含んでよい。
補因子回収促進機構
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の補因子回収促進機構（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多く）を細胞の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である（例えば、未改変細胞中に存在する）。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。本明細書で用いるとき、「補因子回収促進機構」という用語は、細胞の補因子回収制御機構を促進する機構を指す。
目的のＢＩＡ、またはその前駆体のレベルの調節を対象とする遺伝子操作された宿主細胞における様々な補因子回収制御機構及び生合成酵素は、補因子回収促進の標的とされ得る。遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に１つまたは複数の補因子回収促進機構を含んでよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする異種コード配列を含んでよい。ＤＨＦＲが発現されるとき、それは、７，８－ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）をテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）に変換し、それによりＢＨ４をＴｙｒＨ補助基質として回収する。いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の補因子回収促進機構を、表２に記載の遺伝子のうちの１つなどの１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含んでよい。
任意の好都合な数及び型の機構を使用して、補因子回収制御機構を促進し得る。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、またさらには１５個以上の補因子回収促進機構、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の補因子回収促進機構を、遺伝子操作された宿主細胞内の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含んでよい。
生産物阻害軽減突然変異
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の生産物阻害軽減突然変異（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多く）を細胞の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である（例えば、未改変細胞中に存在する）。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。本明細書で用いるとき、「生産物阻害軽減突然変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞の短期及び／または長期生産物阻害制御機構を軽減する突然変異を指す。短期生産物阻害は、補助基質結合部位で競合的結合が生じる細胞の制御機構である。長期生産物阻害は、所望の経路から離れた化合物の不可逆的な結合が生じる細胞の制御機構である。
生産物阻害を軽減する突然変異は、対照細胞と比べて目的の細胞における調節された酵素の阻害を低下させ、調節された化合物またはその下流生合成産物のレベルを増加させる。いくつかの場合では、調節された酵素の阻害の軽減は、阻害のＩＣ５０が、２倍以上、例えば、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上、またはさらに多く増加することを意味する。増加したレベルとは、対照細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルの１１０％以上である、例えば、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上、例えば、少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上であるまたはさらに多い、遺伝子操作された宿主細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルを意味する。
目的のＢＩＡのレベルの調節を対象とする遺伝子操作された宿主細胞における様々な生産物阻害制御機構及び生合成酵素は、生産物阻害軽減の標的とされ得る。遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に１つまたは複数の生産物阻害軽減突然変異を含んでよい。突然変異は、生合成酵素が調節制御を受ける任意の好都合な生合成酵素遺伝子内に位置してよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、１つまたは複数のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードする。ある特定の例では、１つまたは複数の生産物阻害軽減突然変異は、ＴｙｒＨである生合成酵素遺伝子内に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の生産物阻害軽減突然変異を、表２に記載の遺伝子のうちの１つなどの１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の生産物阻害軽減突然変異は、ＴｙｒＨ遺伝子内に存在する。ＴｙｒＨ遺伝子は、チロシンをＬ－ドパに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードする。ＴｙｒＨは、水酸化反応を触媒するために、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を補助基質として必要とする。いくつかの微生物菌株、例えば、サッカロミセス・セレビシエは、天然にはＢＨ４を産生しないが、遺伝子操作してこの基質を、図１に示すように、４つの酵素合成及び再循環経路を通して産生することができる。図１は、本発明の実施形態に係る、テトラヒドロビオプテリンの合成、再循環、及び再生経路の例を示す。図１は、酵素ＰＴＰＳ、ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ；ＳｅｐＲ、セピアプテリンレダクターゼ；ＰＣＤ、プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素；ＱＤＨＰＲ、ジヒドロプテリジンレダクターゼ；及びＤＨＦＲ、ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を提供する。図１に示す酵素のうち、酵母は、内因性ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを合成する。ＧＴＰ及びジヒドロネオプテリン三リン酸は、酵母において天然に合成される。加えて、図１の他の代謝産物は、酵母において天然に産生されない。
ＴｙｒＨは、その産物であるＬ－ドパ、ならびに他のカテコールアミン、特にドパミンにより阻害される。ヒトまたはラットからなどの哺乳類チロシンヒドロキシラーゼ活性は、生産物阻害を緩和する突然変異を通して向上することができる。例えば、短期生産物阻害、例えば、補助基質結合部位での競合的結合は、ＴｙｒＨ遺伝子上の点突然変異Ｗ１６６Ｙにより緩和することができる。具体的には、ＴｙｒＨ遺伝子上の点突然変異Ｗ１６６Ｙは、補助基質の結合を改善し得る。加えて、補助基質結合部位での競合的結合を緩和する短期生産物阻害は、ＴｙｒＨ遺伝子上の点突然変異Ｓ４０Ｄにより改善され得る。短期生産物阻害は、ＴｙｒＨ遺伝子上のＲ３７Ｅ、Ｒ３８Ｅの接合突然変異によっても改善され得る。具体的には、Ｒ３７Ｅ、Ｒ３８Ｅ突然変異は、ドパミンの存在下でチロシンヒドロキシラーゼ活性を一緒に特異的に向上し得る。
加えて、長期生産物阻害は、ＴｙｒＨ遺伝子上の点突然変異により緩和され得る。長期生産物阻害緩和は、チロシンヒドロキシラーゼ活性の生産物阻害因子として作用するカテコールアミンの存在が少ないように、活性部位におけるカテコールアミンの鉄への不可逆的な結合を含み得る。長期生産物阻害は、ＴｙｒＨ遺伝子内の、それぞれ、突然変異Ｅ３３２Ｄ及びＹ３７１Ｆにより緩和することができる。
突然変異の組み合わせを作製して（例えば、一度に２つもしくは３つまたはさらに多くの突然変異）複数のタイプの基質及び生産物阻害を緩和して、ＴｙｒＨの活性をさらに向上させることができる。ＴｙｒＨの突然変異体は、糖からＢＩＡを産生するように酵母菌株内で発現されるとき（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載されるものなど）、ＢＩＡの産生を有意に向上させることができる。
任意の好都合な数及び型の突然変異を使用して、生産物阻害制御機構を軽減し得る。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、またさらには１５個以上の生産物阻害軽減突然変異、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の生産物阻害軽減突然変異を、遺伝子操作された宿主細胞の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含んでよい。
フィードバック阻害軽減突然変異
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多く）を細胞の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの場合では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である（例えば、未改変細胞中に存在する）。加えてまたはあるいは、いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。本明細書で用いるとき、「フィードバック阻害軽減突然変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害制御機構を軽減する突然変異を指す。フィードバック阻害は、調節された化合物の合成経路における酵素が、その化合物がある特定のレベルまで蓄積したときに阻害され、それにより、細胞内の該化合物の量を調整する、細胞の制御機構である。フィードバック阻害を軽減する突然変異は、対照細胞と比べて遺伝子操作された宿主細胞における調節された酵素の阻害を低下させる。このようにして、遺伝子操作された宿主細胞は、調節された化合物またはその下流生合成産物のレベルを増加させる。いくつかの場合では、調節された酵素の阻害の軽減は、阻害のＩＣ５０が、２倍以上、例えば、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上、またはさらに多く増加することを意味する。増加したレベルとは、対照細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルの１１０％以上である、例えば、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上、例えば、少なくとも３倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上であるまたはさらに多い、宿主細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルを意味する。
目的のＢＩＡのレベルの調節を対象とする様々なフィードバック阻害制御機構及び生合成酵素は、宿主細胞における軽減の標的とされ得る。宿主細胞は、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異を、細胞に対しては天然である１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。１つまたは複数の突然変異は、生合成酵素が調節制御を受ける任意の好都合な生合成酵素遺伝子内に位置してよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、３－デオキシ－ｄ－アラビノース－ヘプツロソン酸－７－リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ及びコリスミ酸ムターゼから選択される１つまたは複数の酵素をコードしてよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、３－デオキシ－ｄ－アラビノース－ヘプツロソン酸－７－リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼをコードする。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、コリスミ酸ムターゼをコードしてよい。ある特定の例では、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異は、ＡＲＯ４及びＡＲＯ７から選択される生合成酵素遺伝子内に存在してよい。ある特定の例では、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異は、ＡＲＯ４である生合成酵素遺伝子内に存在してよい。ある特定の例では、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異は、ＡＲＯ７である生合成酵素遺伝子内に存在してよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異を、表２に記載の遺伝子のうちの１つなどの１つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含んでよい。
任意の好都合な数及び型の突然変異を使用して、フィードバック阻害制御機構を軽減し得る。本明細書で用いるとき、「突然変異」という用語は、基準配列またはモチーフと比べて、アミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換を指す。突然変異は、元来の遺伝子座での天然型遺伝子に対する定向突然変異として取り込まれてよい。いくつかの場合では、突然変異は、別々の遺伝子座での遺伝子組込みとして導入された遺伝子の追加のコピーとして、またはエピソーマルベクター、例えば２μもしくは動原体プラスミド上の追加のコピーとして取り込まれてよい。ある特定の例では、酵素のフィードバック阻害されたコピーは、天然の細胞転写制御下にある。いくつかの例では、酵素のフィードバック阻害されたコピーは、それを合成のプロモーターの制御下に置くことで、タンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的調節と共に導入される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異は、ＡＲＯ４遺伝子内に存在してよい。目的のＡＲＯ４突然変異は、位置２２９でのロイシンとのリジン残基の置換、位置１６６でのリジン残基とのグルタミン残基の置換、またはＨａｒｔｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００（３）：８６２－８６７）またはＦｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（（１９９２）Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ ７４（２）：１１７－１１９）により記載されるような突然変異を含むが、これらに限定されない。いくつかの例では、フィードバック阻害を与えるための突然変異は、酵素突然変異体の突然変異誘発ライブラリーから選択されてよい。このような選択肢の例としては、Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（（１９９０）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ Ｌａｒｇｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｂｅｔａ－Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ Ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ Ｂｅｔａ－Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ． Ａｇｒ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｔｏｋｙｏ ５４（１）：２６９－２７１）により記載されるような、過剰チロシンを有する培地におけるｏ－フルオロ－Ｄ，Ｌ－フェニルアラニンの増殖またはａｒｏ３突然変異酵母菌株の増殖の支援を含んでよい。
ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、またさらには１５個以上のフィードバック阻害軽減突然変異、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のフィードバック阻害軽減突然変異を、遺伝子操作された宿主細胞内の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子に含んでよい。
転写調節改変
宿主細胞は、細胞の１つまたは複数の生合成酵素遺伝子の１つまたは複数の転写調節改変（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多くの改変）を含んでよい。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。細胞の任意の好都合な生合成酵素遺伝子は、転写調節の標的とされ得る。転写調節とは、改変された細胞における目的の遺伝子の発現が、調節される、例えば、対照細胞（例えば、未改変細胞）と比べて増加または低減、増強または抑制されることを意味する。いくつかの場合では、目的の遺伝子の転写調節には、発現を増加させるまたは増強させることが含まれる。発現を増加させるまたは増強させることは、目的の遺伝子の発現レベルが、対照、すなわち改変されていない同一細胞における発現と比較して（例えば、任意の好都合な遺伝子発現アッセイを使用することにより）、２倍以上、例えば、５倍以上、ときには２５、５０、または１００倍以上及びある特定の実施形態では３００倍以上に増加することを意味する。あるいは、細胞中の目的の遺伝子の発現が検出できないほどに低い場合、目的の遺伝子の発現レベルは、発現が容易に検出できるレベルまで増加した場合に、増加していると考えられる。ある特定の例では、目的の遺伝子の転写調節は、発現を低減させるまたは抑制することを含む。発現を低減させるまたは抑制することは、目的の遺伝子の発現レベルが、対照と比較して、１／２以下、例えば、１／５以下、ときには１／２５、１／５０、または１／１００以下及びある特定の実施形態では１／３００以下に低減されることを意味する。いくつかの場合では、発現は、検出できないレベルまで低減する。主題の宿主細胞における使用に適応され得る目的の宿主細胞のプロセスの改変は、Ｓｍｏｌｋｅ ｅｔ ａｌによる米国特許公開第２０１４０２７３１０９号（１４／２１１，６１１）に記載されており、この開示は参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
任意の好都合な生合成酵素遺伝子は、転写的に調節されてよく、図２に記載の生合成酵素を含むがこれらに限定されない。具体的には、図２は、本発明の実施形態に係る、４－ＨＰＡ、ドパミン、及び３，４－ＤＨＰＡへのグルコースの変換のための生合成スキームを示す。図２に記載の酵素の例としては、ＡＲＯ３、ＡＲＯ４、ＡＲＯ１、ＡＲＯ７、ＴＹＲ１、ＴＹＲ、ＴｙｒＨ、ＤＯＤＣ、ＭＡＯ、ＡＲＯ１０、ＡＲＯ９、及びＴＫＬが挙げられる。いくつかの例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ＡＲＯ１０、ＡＲＯ９、及びＴＫＬから選択されてよい。いくつかの場合では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ＡＲＯ１０であってよい。ある特定の例では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ＡＲＯ９であってよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ＴＫＬであってよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表２に記載の遺伝子のうちの１つなどの１つまたは複数の遺伝子に対する１つまたは複数の転写調節改変を含む。
いくつかの実施形態では、転写調節改変は、１つまたは複数の生合成酵素遺伝子の天然型プロモーターに対する強力なプロモーターの置換または強力なプロモーターの制御下にある１つもしくは複数の遺伝子の追加のコピーの発現を含んでよい。目的の遺伝子の発現を推進するプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよいが、プロモーターは宿主細胞中で活性であり得ることが条件である。目的の遺伝子は、それらの天然型プロモーターから発現してよい。加えてまたはあるいは、目的の遺伝子は、天然でないプロモーターから発現されてよい。必須ではないが、かかるプロモーターは、それらが使用される宿主において中から高強度であり得る。プロモーターは、制御されているかまたは構成的であってよい。いくつかの実施形態では、グルコース抑制されていない、または培地中のグルコースの存在により穏やかにのみ抑制されているプロモーターを使用してよい。多くの好適なプロモーターがあり、その例としては、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ｔｓｒ遺伝子のプロモーター（フルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする）または酵母Ｓ．セレビシエ由来のＧＡＰＤＨプロモーター（グリセルアルデヒド－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）（Ｂｉｔｔｅｒ Ｇ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６７３ ６８４（１９８７））が挙げられる。他の目的の強力なプロモーターには、パン酵母のＡＤＨＩプロモーター（Ｒｕｏｈｏｎｅｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：１９３ ２０３（１９９５））、リン酸欠乏誘導性プロモーター、例えば、酵母のＰＨＯ５プロモーター（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８９）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルカリホスファターゼプロモーター（Ｌｅｅ．Ｊ．Ｗ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：１１２７ １１３３（１９９１））、ＧＰＤ１、及びＴＥＦ１が含まれるが、これらに限定されない。目的の酵母プロモーターには、誘導性プロモーター、例えば、Ｇａｌ１－１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳ、抑制性プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯ、及び構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳－伸長因子－１－αプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ－オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーター、等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、強力なプロモーターは、ＧＰＤ１である。ある特定の例では、強力なプロモーターは、ＴＥＦ１である。グルココルチコイド、ステロイド、及び甲状腺ホルモンなどのホルモンにより誘導可能なプロモーターを含有する自律複製酵母発現ベクターも公知であり、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）及び甲状腺ホルモン応答エレメント（ＴＲＥ）を含むが、これらに限定されず、例えば、米国特許第７，０４５，２９０号に記載のプロモーターを参照されたい。αファクター、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを使用してよい。加えて、任意のプロモーター／エンハンサー組み合わせ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢに従う）を使用して目的の遺伝子の発現を推進することもできる。宿主細胞、例えば、大腸菌に特異的な任意の好都合なプロモーターが選択されてよいことが理解される。いくつかの場合では、プロモーター選択を使用して、産生を最大化する一方でエネルギー資源を最小化するように、転写、したがって酵素レベルを最適化してよい。
不活性化突然変異
遺伝子操作された宿主細胞は、細胞の酵素に対して１つまたは複数の不活性化突然変異を含んでよい（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多く）。１つまたは複数の不活性化突然変異を含むことは、目的のＢＩＡまたは同じ事象をもたらす所望の酵素もしくは前駆体のレベルを増加させるように遺伝子操作された宿主細胞の合成経路のフラックスを改変し得る。いくつかの例では、１つまたは複数の不活性化突然変異は、細胞に対しては天然である酵素に対するものである。加えてまたはあるいは、１つまたは複数の不活性化突然変異は、細胞に対しては天然でない酵素に対するものである。本明細書で用いるとき、「不活性化突然変異」とは、この突然変異が、目的の遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的活性を不活性化する、細胞の遺伝子または調節ＤＮＡ配列に対する１つまたは複数の突然変異を意味する。いくつかの場合では、遺伝子は、細胞に対しては天然である。いくつかの例では、この遺伝子は、不活性化され、宿主細胞によって産生される目的のＢＩＡの合成経路の一部であるか、またはそれに連結された酵素をコードする。いくつかの例では、不活性化突然変異は、目的の遺伝子を制御する調節ＤＮＡ配列中に位置する。ある特定の場合では、不活性化突然変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。任意の好都合な突然変異（例えば、本明細書に記載のような）を使用して、目的の遺伝子または調節ＤＮＡ配列を不活性化させ得る。「不活性化」または「不活性化する」とは、突然変異した遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的活性が、突然変異していない対照遺伝子により発現される対照タンパク質と比べて、１０％以上、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上低下することを意味する。いくつかの場合では、タンパク質は酵素であり、不活性化突然変異は、酵素の活性を低下させる。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、細胞に対しては天然である酵素に不活性化突然変異を含む。任意の好都合な酵素は、不活性化の標的とされ得る。目的の酵素には、遺伝子操作された宿主細胞の合成経路におけるその作用が目的のＢＩＡのレベルを低下させる傾向にある、表２に記載の酵素が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの場合では、酵素は、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＺＷＦ１である。いくつかの場合では、酵素はアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、及びＳＦＡ１から選択される。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ２である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ３である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ４である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ５である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ６である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＤＨ７である。いくつかの場合では、酵素は、アルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、及びＡＬＤ６から選択される。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＬＤ２である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＬＤ３である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＬＤ４である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＬＤ５である。ある特定の実施形態では、不活性化突然変異を含む酵素は、ＡＬＤ６である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、表２に記載の１つまたは複数の遺伝子に対して１つまたは複数の不活性化突然変異を含む。
エピマー化改変
本明細書に記載のいくつかの方法、プロセス、及びシステムは（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへの、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換を記載する。これらの方法、プロセス及びシステムのいくつかは、遺伝子操作された宿主細胞を含んでよい。いくつかの例では、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへの（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換は、多様な範囲のアルカロイドへの基質の変換において重要な工程である。いくつかの例では、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへの（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換は、エピマー化反応を含む。いくつかの場合では、基質アルカロイドのエピマー化は、（Ｓ）－基質を対応するシッフ塩基またはイミン中間体へと酸化すること、次いでこの中間体を、図３に提示するように及びスキーム１に概略的に表すように、（Ｒ）－産物へと立体特異的に還元することにより行われてよい。スキーム１に提示するように、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、ＨまたはＣＨ３であってよい。Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ３であってよい。
Figure 0007266966000001
いくつかの例では、（Ｒ）－産物への（Ｓ）－基質の変換は、少なくとも１つの酸化反応及び少なくとも１つの還元反応を必然的に含んでよい。いくつかの場合では、酸化反応の後に、任意選択的に還元反応があってよい。いくつかの場合では、酸化及び還元反応のうちの少なくとも１つは、酵素の存在下で実行される。いくつかの場合では、酸化及び還元反応のうちの少なくとも１つは、酵素により触媒される。いくつかの場合では、酸化及び還元反応は、両方とも、少なくとも１つの酵素の存在下で実行される。いくつかの場合では、少なくとも１つの酵素は、酸化及び還元反応を触媒するために有用である。酸化及び還元反応は、同一の酵素により触媒されてよい。
本明細書に記載のいくつかの方法、プロセス及びシステムでは、酸化反応は、酵素の存在下で行われてよい。いくつかの例では、酵素は、オキシダーゼであってよい。オキシダーゼは、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンを基質として使用してよい。オキシダーゼは、（Ｓ）－基質を対応するイミンまたはシッフ塩基誘導体に変換してよい。オキシダーゼは、１，２－デヒドロレチクリンシンターゼ（ＤＲＳ）と称されてよい。本開示において（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの酸化に好適な酵素の非限定的な例には、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、２－オキソグルタル酸依存性オキシダーゼ、及びフラボタンパク質オキシダーゼが挙げられる。例えば、（Ｓ）－テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（ＳＴＯＸ、Ｅ．Ｃ１．３．３．８）は、（Ｓ）－ノルレチクリン及び他の（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを、１，２－デヒドロノルレチクリン及び他の対応する１，２－デヒドロ産物へと酸化し得る。いくつかの例では、先行する例のいずれか１つのオキシダーゼドメインを含むタンパク質は酸化を行い得る。いくつかの例では、オキシダーゼは、本明細書に記載の遺伝子操作された宿主細胞などの宿主細胞内で酸化反応を触媒し得る。
いくつかの例では、還元反応は、酸化反応の後に生じてよい。還元反応は、酵素により行われてよい。いくつかの例では、レダクターゼは、１－ベンジルイソキノリンに由来するイミンまたはシッフ塩基を基質として使用してよい。レダクターゼは、イミンまたはシッフ塩基誘導体を（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンに変換し得る。レダクターゼは、１，２－デヒドロレチクリンレダクターゼ（ＤＲＲ）と称されてよい。（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するイミンまたはシッフ塩基の還元に好適な酵素の非限定的な例としては、アルド－ケトレダクターゼ（例えば、コデイノンレダクターゼ様酵素（ＥＣ１．１．１．２４７））及び短鎖デヒドロゲナーゼ（例えば、サルタリジンレダクターゼ様酵素（ＥＣ１．１．１．２４８））が挙げられる。いくつかの例では、先行する例のいずれか１つのレダクターゼドメインを含むタンパク質は、還元を行い得る。さらなる実施形態では、還元は、立体特異的である。いくつかの例では、レダクターゼは、本明細書に記載の遺伝子操作された宿主細胞などの宿主細胞内で還元反応を触媒し得る。
（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピマー化反応を行うことができる酵素の例としては、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを有するエピメラーゼが挙げられる。具体的には、エピメラーゼは、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ８２Ｙ２様ドメインを有してよい。加えて、エピメラーゼは、コデイノンレダクターゼ様ドメインを有してよい。さらに、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ８２Ｙ２様ドメインを有し、コデイノンレダクターゼ様ドメインも有するエピメラーゼは、ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素と称されてよい。具体的には、ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素は、融合酵素であってよい。
（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへの（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換を行うために使用されてよいＣＹＰ－ＣＯＲ酵素のアミノ酸配列の例を、図４に提供する。具体的には、図４は、本発明の実施形態に係る、ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素のアミノ酸配列を示す。図４に見られるように、下線テキストは、シトクロムＰ４５０ ＣＹＰ８２Ｙ２様ドメイン（ＡＦＢ７４６１７．１に対して５９％同一性）を示す。点線下線テキストは、アルド－ケトレダクターゼＮＡＤＰＨ依存性コデイノンレダクターゼ様ドメイン（ＡＣＭ４４０６６．１に対して７５％同一性）を示す。ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素の追加のアミノ酸配列を、表１に記載する。（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する際に使用されるエピメラーゼのアミノ酸配列は、表１に列挙する所与のアミノ酸配列に対して７５％以上同一であってよい。例えば、そのようなエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書に提供するアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるアミノ酸配列を含んでよい。加えて、ある特定の実施形態では、「同一の」アミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％～９９％同一性を含有する。いくつかの場合では、「同一の」アミノ酸配列は、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、ある特定の場合ではそれ以上、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％同一性を、アミノ酸レベルで含有する。いくつかの場合では、アミノ酸配列は、同一であり得るが、ＤＮＡ配列は、例えば、宿主生物に関するコドン使用を最適化するように変異される。
（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記遺伝子操作された宿主細胞を提供し得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるエピメラーゼは、生体触媒を形成するように、回収され、精製されてよい。いくつかの場合では、エピメラーゼは、１つまたは複数の酵素へと分割されてよい。加えて、エピメラーゼを分割することにより産生される１つまたは複数の酵素は、遺伝子操作された宿主細胞から回収され得る。エピメラーゼの分割から生じるこれらの１つまたは複数の酵素を使用して、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへの（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換を触媒してもよい。具体的には、エピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞から回収される１つまたは複数の酵素は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスにおいて使用されてよい。該プロセスは、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをエピメラーゼと、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに十分な量で接触させる工程を含んでよい。例では、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、十分な量の１つまたは複数の酵素と、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも５％が（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるように接触してよい。さらなる例では、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、十分な量の１つまたは複数の酵素と、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または１００％が（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるように接触してよい。
（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用されてよい１つまたは複数の酵素は、インビトロで（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに接触してよい。加えて、またあるいは、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用されてよい１つまたは複数の酵素は、インビボで（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに接触してよい。加えて、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用されてよい１つまたは複数の酵素は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを中に有する細胞に提供されてよいか、または遺伝子操作された宿主細胞内で産生されてよい。
いくつかの例では、該方法は、アルカロイド産物を産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、（Ｒ）－産物への（Ｓ）－基質のエピマー化が、アルカロイド産物の産生における重要な工程を含み得る、前記遺伝子操作された宿主細胞を提供する。いくつかの例では、産生されるアルカロイドは、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドである。なおも他の実施形態では、産生されるアルカロイドは、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来し、例えば、４－環プロモルフィナン及び５－環モルフィナンアルカロイドが含まれる。別の実施形態では、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、遺伝子操作された宿主細胞の産物に向かう中間体である。なおも他の実施形態では、アルカロイド産物は、モルフィナン、プロトベルベリン、ノスカピノイド、及びベンゾフェナントリジンアルカロイドからなる群より選択される。
いくつかの例では、（Ｓ）－基質は、（Ｓ）－ノルレチクリン、（Ｓ）－レチクリン、（Ｓ）－テトラヒドロパパベリン、（Ｓ）－ノルコクラウリン、（Ｓ）－コクラウリン、（Ｓ）－Ｎ－メチルコクラウリン、（Ｓ）－３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、（Ｓ）－ノリソオリエンタリン、（Ｓ）－オリエンタリン、（Ｓ）－イソオリエンタリン、（Ｓ）－ノルプロトシノメニン、（Ｓ）－プロトシノメニン、（Ｓ）－ノルラウダノソリン、（Ｓ）－ラウダノソリン、（Ｓ）－４’－Ｏ－メチルラウダノソリン、（Ｓ）－６－Ｏ－メチルノルラウダノソリン、（Ｓ）－４’－Ｏ－メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドである。
いくつかの例では、（Ｓ）－基質は、式Ｉ：
Figure 0007266966000002
の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、水素及びメチルから独立して選択され；
Ｒ５は、水素、ヒドロキシ、及びメトキシから選択される。
いくつかの他の例では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、水素である。
なおも他の例では、（Ｓ）－基質は、式ＩＩ：
Figure 0007266966000003
の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ３は、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから選択され；
Ｒ６及びＲ７は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及びＣ１－Ｃ４アルコキシからそれぞれ独立して選択され；
ｎは、０、１、２、３、または４であり；
ｎ’は、０、１、２、３、４または５である。
結合が環を横切って描かれる場合、これは、非特異的な環原子または位置で置換が生じ得ることを意味する。例えば、上に示す式ＩＩにおいて、６環員中の任意の－ＣＨ－の水素は、Ｒ７と置換されて、－ＣＲ７－を形成し得る。
いくつかの例では、Ｒ６及びＲ７は独立して、メチルまたはメトキシである。いくつかの他の例では、ｎ及びｎ’は独立して、１または２である。なおも他の実施形態では、Ｒ３は、水素またはメチルである。
いくつかの他の例では、（Ｓ）－基質は、式ＩＩＩ：
Figure 0007266966000004
の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ６及びＲ７は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及びＣ１－Ｃ４アルコキシからそれぞれ独立して選択され；
ｎ及びｎ’は独立して、０、１、２、３、または４である。
いくつかの例では、Ｒ６及びＲ７は独立して、ヒドロキシ、メチル、またはメトキシである。いくつかの他の例では、ｎ及びｎ’は独立して、１または２である。なおもさらなる実施形態では、Ｒ６及びＲ７は独立して、フルオロ、ヒドロキシ、メチル、またはメトキシである。
いくつかの例では、該方法は、アルカロイド産物を（Ｓ）－レチクリンから産生する遺伝子操作された宿主細胞を提供する。（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンのエピマー化は、前駆体からの多様なアルカロイド産物の産生における重要な工程を含み得る。いくつかの例では、前駆体は、Ｌ－チロシンまたは糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド産物には、モルフィナン、プロトベルベリン、ノスカピノイド、及びベンゾフェナントリジンアルカロイドが含まれることができるが、これらに限定されない。
任意の好適な炭素源は、エピマー化した１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに向かう前駆体として使用してよい。好適な前駆体は、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖類（例えば、デンプン、セルロース）、またはそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの例では、再生可能供給原料からの未精製混合物を、使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、オオムギ麦芽、バイオマス加水分解物）。なおも他の実施形態では、炭素前駆体は、一炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または二炭素化合物（例えば、エタノール）であることができる。また他の実施形態では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン、及びアミノ酸（例えば、Ｌ－チロシン）を使用することができる。いくつかの例では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、本発明の遺伝子操作された宿主細胞に直接加えられてよく、それは例えば、ノルラウダノソリン、ラウダノソリン、ノルレチクリン、及びレチクリンである。なおもさらなる実施形態では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、遺伝子操作された宿主細胞に単一のエナンチオマー（例えば、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイド）、またはたとえば、ラセミ混合物を含む、エナチオマーの混合物として加えられてよい。
いくつかの例では、該方法は、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心のエピマー化を提供する。さらなる実施形態では、該方法は、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させる工程を含む。少なくとも１つの酵素は、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心の立体化学を反対の立体化学に反転させ得る。いくつかの例では、少なくとも１つの酵素は、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する。少なくとも１つの酵素を使用する（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドへのこの変換のいくつかの例では、（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、（Ｓ）－ノルレチクリン、（Ｓ）－レチクリン、（Ｓ）－テトラヒドロパパベリン、（Ｓ）－ノルコクラウリン、（Ｓ）－コクラウリン、（Ｓ）－Ｎ－メチルコクラウリン、（Ｓ）－３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、（Ｓ）－ノリソオリエンタリン、（Ｓ）－オリエンタリン、（Ｓ）－イソオリエンタリン、（Ｓ）－ノルプロトシノメニン、（Ｓ）－プロトシノメニン、（Ｓ）－ノルラウダノソリン、（Ｓ）－ラウダノソリン、（Ｓ）－４’－Ｏ－メチルラウダノソリン、（Ｓ）－６－Ｏ－メチルノルラウダノソリン、及び（Ｓ）－４’－Ｏ－メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される。
いくつかの他の例では、少なくとも１つの酵素は、５’Ｒ－フタリドイソキノリンアルカロイドを５’Ｓ－フタリドイソキノリンアルカロイドに変換する。少なくとも１つの酵素を使用する５’Ｒ－フタリドイソキノリンアルカロイドの５’Ｓ－フタリドイソキノリンアルカロイドへのこの変換のいくつかの例では、５’Ｒ－フタリドイソキノリンアルカロイドは、５’Ｒ－ナルコトリンヘミアセタール、５’Ｒ－ナルコトリン、５’Ｒ－ナルコチンヘミアセタール、及び５’Ｒ－ノスカピンからなる群より選択される。
いくつかの例では、３Ｓ，５’Ｒ－フタリドイソキノリンアルカロイドは、式ＩＶ：
Figure 0007266966000005
の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ３は、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから選択され；
Ｒ８及びＲ９は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及びＣ１－Ｃ４アルコキシからそれぞれ独立して選択され；
Ｒ１０は存在しない、水素、またはＣ１－Ｃ４アルキルであり；
２つのＲ８及びそれらが付着する炭素原子は、５から８員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し；
２つのＲ９及びそれらが付着する炭素原子は、５から８員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し；
ｎ及びｎ’は独立して、０、１、２、３、または４である。
いくつかの他の例では、少なくとも１つの酵素は、５’Ｒ－セコベルベリンアルカロイドを５’Ｓ－セコベルベリンアルカロイドに変換する。少なくとも１つの酵素を使用する５’Ｒ－セコベルベリンアルカロイドの５’Ｓ－セコベルベリンアルカロイドへのこの変換のいくつかの例では、５’Ｒ－セコベルベリンアルカロイドは、５’Ｒ－４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン、５’Ｒ－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン、及び５’Ｒ－パパベロキシンからなる群より選択される。
いくつかの例では、５’Ｒ－セコベルベリンアルカロイドは、式Ｖ：
Figure 0007266966000006
の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ３は、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから選択され；
Ｒ８及びＲ９は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及びＣ１－Ｃ４アルコキシからそれぞれ独立して選択され；
Ｒ１１は、水素及びアルデヒドから選択され；
Ｒ１２は、水素、ヒドロキシル、及びＯ－メチルから選択され；
Ｒ１３は、ヒドロキシル及びＯ－メチルから選択され；
２つのＲ８及びそれらが付着する炭素原子は、５から８員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し；
２つのＲ９及びそれらが付着する炭素原子は、５から８員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し；
ｎ及びｎ’は独立して、０、１、２、３、または４である。
なおも他の実施形態では、エピマー化される１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、２つ以上の立体中心を含んでよく、２つ以上の立体中心のうちの１つのみが反転されて、基質のジアステレオマーを産生する（例えば、（Ｓ，Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、（Ｒ，Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される）。少なくとも１つの酵素と接触したときに１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの１つのみの立体中心が反転される例では、産物は、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマーと称される。
いくつかの例では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、単一の立体異性体として酵素に提供される。いくつかの他の例では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、立体異性体の混合物として酵素に提供される。なおもさらなる実施形態では、立体異性体の混合物は、ラセミ混合物であってよい。いくつかの他の例では、立体異性体の混合物は、別の立体異性体と比較して１つの立体異性体において富化されていてよい。
いくつかの例では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体が回収される。いくつかの例では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、細胞培養物から回収される。なおもさらなる実施形態では、回収された１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、酵素に提供された１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの元来の混合物と比較して１つの立体異性体においてエナンチオマー富化されている。なおもさらなる実施形態では、回収された１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または１００％のエナンチオマー過剰率を有する。
「異性体」は、同一の分子式を有する異なる化合物である。「立体異性体」は、原子の空間配置のみが異なる異性体である。「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体の対である。エナンチオマーの対の１：１混合物が、「ラセミ」混合物である。「ジアステレオ異性体」または「ジアステレオマー」は、少なくとも２つの不斉原子を有するが、互いに鏡像ではない立体異性体である。「エピマー」という用語は、本明細書で用いるとき、同一の化学式を有するが、特定の位置で異なる光学配置を有する化合物を指す。例えば、化合物の（Ｒ，Ｓ）及び（Ｓ，Ｓ）立体異性体は、互いのエピマーである。いくつかの例では、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドは、そのエピマー（例えば、エピ－１－ベンジルイソキノリンアルカロイド）に変換される。絶対立体化学は、Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－ＰｒｅｌｏｇＲ－Ｓシステムに従って特定される。化合物が純粋なエナンチオマーであるとき、各キラル炭素での立体化学は、ＲまたはＳのいずれかによって特定することができる。その絶対配置が未知である分解された化合物は、ナトリウムＤ線の波長で平面偏光を回転させる方向（右旋性または左旋性）に応じて（＋）または（－）で表すことができる。本明細書に記載のある特定の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含み、ゆえに、（Ｒ）－または（Ｓ）－として、絶対立体化学の観点から定義することができるエナンチオマー、ジアステレオマー及び他の立体異性体を生じることができる。
（表１）ＣＹＰ－ＣＯＲ融合酵素の部分及び完全長アミノ酸配列の例
Figure 0007266966000007
Figure 0007266966000008
Figure 0007266966000009
Figure 0007266966000010
Figure 0007266966000011
Figure 0007266966000012
Figure 0007266966000013
Figure 0007266966000014
Figure 0007266966000015
ビスＢＩＡ生成改変
本明細書に提供するいくつかの方法、プロセス、及びシステムは、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスＢＩＡ）の産生を記載する。ビスＢＩＡは、２つのＢＩＡモノマー間のカップリング反応により形成され得る二量体分子である。例では、ビスＢＩＡは、炭素－酸素カップリング反応により形成されてよい。他の例では、ビスＢＩＡは、炭素－炭素カップリング反応により形成されてよい。いくつかの例では、ビスＢＩＡ二量体分子は、２つの同一のＢＩＡモノマーを含むホモ二量体である。例では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つのＢＩＡモノマーを産生し得る。これらの例では、ＢＩＡモノマーは、１つまたは複数のカップリング酵素と接触したときにホモ二量体を形成し得る。他の例では、ビスＢＩＡ二量体分子は、２つの異なるＢＩＡモノマーを含むヘテロ二量体である。例えば、ビスＢＩＡは、互いのエナンチオマーであるＢＩＡモノマーを含むヘテロ二量体であってよい。いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、２つ以上のＢＩＡモノマーを産生し得る。これらの例では、ＢＩＡモノマーは、１つまたは複数のカップリング酵素と接触したときに、ホモ二量体及びヘテロ二量体を形成し得る。
ビスＢＩＡの産生を記載するこれらの方法、プロセス、及びシステムのいくつかは、遺伝子操作された宿主細胞を含んでよい。いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞を遺伝子操作して、ＢＩＡモノマーを産生してよく、これが今度は、ビスＢＩＡを形成するためのビルディングブロック分子として使用されてよい。ビスＢＩＡを形成するために使用されてよいＢＩＡモノマーの例としては、コクラウリン、Ｎ－メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、６－Ｏ－メチル－ノルラウダノソリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニン、ラウダノシン、及びパパベリンが挙げられる。具体的には、遺伝子操作された宿主細胞は、ＢＩＡモノマーを、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンから、Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、及び３’－ヒドロキシラーゼを含む異種酵素の発現により合成してよい。Ｏ－メチルトランスフェラーゼの例としては、タリクトラム・フラブム（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ネラムボ・ヌシフィラ（Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、ポプルス・ユーフィラティカ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ）、または別の種由来のノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（６ＯＭＴ）が挙げられ得る。Ｏ－メチルトランスフェラーゼのさらなる例としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａまたは別の種由来のカテコールＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）が挙げられ得る。Ｎ－メチルトランスフェラーゼのさらなる例としては、Ｔ．フラブム、Ｎ．ヌシフィラ（Ｎ．ｎｕｃｉｆｅｒａ）、アリストロキア・フィンブリアタ（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ ｆｉｍｂｒｉａｔａ）、または別の種由来のコクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）が挙げられ得る。３’ヒドロキシラーゼの例としては、ハナビシソウ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、Ｔ．フラブム、Ｎ．ヌシフィラ、または別の種由来のＮ－メチルコクラウリン３’－ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８０Ｂ１）が挙げられ得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、任意の所与のＢＩＡモノマーの（Ｓ）または（Ｒ）エナンチオマーのいずれかを産生し得る。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞は、両エナンチオマーの混合物を産生し得る。（Ｓ）及び（Ｒ）エナンチオマーの比率は、ＢＩＡモノマーを合成する１つまたは複数の酵素の基質及び産物特異性により決定されてよい。あるいは、存在する各エナンチオマーの量は、上記のように、別の立体異性体への１つの立体異性体のエピマー化を行う追加の１つまたは複数の酵素の発現によって改変されてよい。
これらのＢＩＡモノマーは、二量体ビスＢＩＡ骨格内に融合されてよい。具体的には、ＢＩＡモノマーは、遺伝子操作された宿主細胞により産生される１つまたは複数の酵素を使用して二量体ビスＢＩＡ骨格内に融合されてよい。加えてまたはあるいは、ＢＩＡモノマーは、遺伝子操作された宿主細胞の外にある供給源からＢＩＡモノマーに提供される１つまたは複数の酵素を使用して二量体ビスＢＩＡ骨格内に融合されてよい。１つまたは複数の酵素を使用して、炭素－酸素及び／または炭素－炭素カップリング反応を形成して、２つのＢＩＡモノマーを１つ、２つ、または３つの位置で融合してよい。いくつかの例では、２つのＢＩＡモノマーは、エーテル架橋により連結されてよい。いくつかの例では、直接炭素－炭素結合を使用して、２つのＢＩＡモノマーを接続してよい。いくつかの例では、２つのＢＩＡモノマーを融合することにより形成されるビスＢＩＡは、１つのジフェニルエーテル結合を含んでよい。いくつかの例では、２つのＢＩＡモノマーを融合して、２つのジフェニルエーテル結合を含むビスＢＩＡを形成してよい。いくつかの例では、２つのＢＩＡモノマーから形成されるビスＢＩＡは、３つのジフェニルエーテル結合を含んでよい。いくつかの例では、ビスＢＩＡは、１つのジフェニルエーテル結合及び１つのベンジルフェニルエーテル結合を含んでよい。いくつかの場合では、ビスＢＩＡは、１つのベンジルフェニルエーテル結合及び２つのジフェニルエーテル結合を含んでよい。
例では、ＢＩＡモノマーは、２つのＢＩＡモノマーを融合するためのカップリング反応を形成するために使用されてよい十分な量の１つまたは複数の酵素と、前記ＢＩＡモノマーの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または１００％がビスＢＩＡに変換されるように接触してよい。ビスＢＩＡへとＢＩＡモノマーを二量体化するために使用されてよい１つまたは複数の酵素は、インビトロでＢＩＡに接触してよい。加えて、またあるいは、ビスＢＩＡへとＢＩＡモノマーを二量体化するために使用されてよい１つまたは複数の酵素は、インビボでＢＩＡに接触してよい。加えて、１つまたは複数のビスＢＩＡ二量体化酵素は、ＢＩＡモノマーを産生する宿主細胞において発現されてよい。あるいは、ＢＩＡモノマーは、ビスＢＩＡ二量体化酵素を発現する遺伝子操作された宿主細胞に提供されてよい。あるいは、１つまたは複数のビスＢＩＡ二量体化酵素は、ＢＩＡモノマーをその中に有する細胞に提供されてよい。
いくつかの例では、ビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、式Ｖａ～Ｖｕ：
Figure 0007266966000016
Figure 0007266966000017
Figure 0007266966000018
のうちのいずれか１つの化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、及びＲ２ｂは、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから独立して選択され；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ８ａ、及びＲ８ｂは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及びＣ１－Ｃ４アルコキシから独立して選択され；
Ｒ４ａ及びＲ５ａは、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、またはＲ４ａ及びＲ５ａは、一緒になってメチレン架橋を形成し；
Ｒ４ｂ及びＲ５ｂは、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、またはＲ４ｂ及びＲ５ｂは、一緒になってメチレン架橋を形成し；
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、及びＲ９ａは、水素及びＣ１－Ｃ４アルキルから独立して選択される。
いくつかの例では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ、水素であり；Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ、メチルであり；Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ、水素であり；Ｒ４ａ及びＲ５ａは、独立して水素またはメチルであり；Ｒ４ｂ及びＲ５ｂは、独立して水素またはメチルであるか、またはＲ４ｂ及びＲ５ｂは、一緒になってメチレン架橋を形成し；Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ８ａ、及びＲ８ｂはそれぞれ、水素であり；Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、及びＲ９ａは、独立して水素またはメチルである。
上に示すように、式Ｖａ、Ｖｂ、及びＶｄのビスＢＩＡ化合物は、炭素－酸素カップリング反応を使用して２つのＢＩＡモノマーを融合することにより形成される。加えて、式Ｖｃ、Ｖｆ、及びＶｈのビスＢＩＡ化合物は、炭素－酸素カップリング反応及び炭素－炭素カップリング反応の両方を使用して２つのＢＩＡモノマーを融合することにより形成される。さらに、式Ｖｅ、Ｖｇ、Ｖｉ、Ｖｊ、Ｖｋ、Ｖｌ、Ｖｍ、Ｖｏ、Ｖｐ、及びＶｑのビスＢＩＡ化合物は、２つの炭素－酸素カップリング反応を使用して２つのＢＩＡモノマーを融合することにより形成される。式ＶｎのビスＢＩＡ化合物は、２つの炭素－酸素カップリング反応及び１つの炭素－炭素カップリング反応を使用して２つのＢＩＡモノマーを融合することにより形成される。加えて、式ＶｒのビスＢＩＡ化合物は、３つの炭素－酸素カップリング反応を使用して２つのＢＩＡモノマーを融合することにより形成される。
カップリング反応を形成するために使用されてよい１つまたは複数の酵素は、公知のシトクロムＰ４５０、例えば、ベルベリス・ストロニフェラ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ） ＣＹＰ８０Ａ１またはこれらの化合物を天然に合成する他の植物由来の同様のシトクロムＰ４５０酵素を含んでよい。あるいは、カップリング反応は、シトクロムＰ４５０ではない酵素により行われてよい。カップリング反応を形成するために使用されてよい１つまたは複数の酵素を遺伝子操作して、天然でない基質を受け入れてよい。したがって、カップリング反応を形成するために使用されてよい１つまたは複数の酵素を使用して、非天然ビスＢＩＡ分子を生成してよい。例では、１つまたは複数の酵素は、天然ＢＩＡモノマーを非天然ＢＩＡモノマーと融合させて、非天然ビスＢＩＡ分子を産生してよい。他の例では、１つまたは複数の酵素は、２つの非天然ＢＩＡモノマーを融合させて、非天然ビスＢＩＡ分子を産生してよい。酵素を遺伝子操作する戦略を使用して、ビスＢＩＡを産生するようにＢＩＡモノマーを融合するカップリング反応を形成するために使用されてよい１つまたは複数の酵素を同定してよい。例では、酵素を遺伝子操作する戦略には、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発及びスクリーニング、ＤＮＡシャッフリング、及びスクリーニングが含まれ得る。
一度ビスＢＩＡが形成されると、ビスＢＩＡは、さらに誘導体化または改変されてよい。ビスＢＩＡは、遺伝子操作された宿主細胞により産生される１つまたは複数の酵素を使用して誘導体化または改変されてよい。具体的には、ビスＢＩＡは、ビスＢＩＡを遺伝子操作された宿主細胞により産生される１つまたは複数の酵素と接触させることにより誘導体化または改変されてよい。加えてまたはあるいは、ビスＢＩＡは、ビスＢＩＡを遺伝子操作された宿主細胞の外にある供給源からビスＢＩＡに提供される１つまたは複数の酵素と接触させることにより誘導体化または改変されてよい。ビスＢＩＡを誘導体化または改変するために使用されてよい１つまたは複数の酵素を使用して、テーラリング反応を行ってよい。テーラリング反応の例としては、酸化、還元、Ｏ－メチル化、Ｎ－メチル化、Ｏ－脱メチル化、アセチル化、メチレンジオキシ架橋形成、及びＯ，Ｏ－脱メチレン化が挙げられる。ビスＢＩＡは、１つまたは複数のテーラリング反応を使用して誘導体化または改変されてよい。
テーラリング反応の例を表３に提供する。いくつかの例では、テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡ、またはその誘導体に行われる炭素－炭素カップリング反応を触媒してよい。炭素－炭素カップリング反応触媒するために使用されてよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、ハナビシソウ、キクバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ベルベリス・ストロニフェラ、タリクトラム・フラブム、または別の種由来のベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）；パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種由来のサルタリジンシンターゼ（ＳａｌＳｙｎ）；及びキクバオウレンまたは別の種由来のコリツベリンシンターゼ（ＣｏｒＳｙｎ）が挙げられる。テーラリング酵素により触媒することができる反応の非限定的な例を、スキーム２に示し、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、及びＲｄは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、Ｃ１－Ｃ４アシル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、及びＣ１－Ｃ４アルコキシから独立して選択される。いくつかの例では、Ｒａ、Ｒｂ、及びそれらが付着する炭素原子は、炭素環または複素環を任意選択で形成する。いくつかの例では、Ｒｃ、Ｒｄ、及びそれらが付着する炭素原子は、炭素環または複素環を任意で形成する。
Figure 0007266966000019
いくつかの例では、テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡまたはその誘導体に行われる酸化反応を触媒してよい。酸化反応を触媒するために使用されてよいテーラリング酵素の例としては、キクバオウレン、アザミゲシ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ ｍｅｘｉｃａｎａ）、ベルベリス・ウィルソナエ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｗｉｌｓｏｎａｅ）、または別の種由来のテトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（ＳＴＯＸ）；パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種由来のジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ（ＤＢＯＸ）；パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種由来のメチルスチロピンヒドロキシラーゼ（ＭＳＨ）；及びパパヴェル・ソムニフェル、ハナビシソウ、または別の種由来のプロトピン６－ヒドロキシラーゼ（Ｐ６Ｈ）が挙げられる。
テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡまたはその誘導体に行われるメチレンジオキシ架橋形成反応を触媒してもよい。メチレンジオキシ架橋形成反応を触媒するために使用してよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェル、ハナビシソウ、アザミゲシ、または別の種由来のスチロピンシンターゼ（ＳｔｙＳｙｎ）；パパヴェル・ソムニフェル、ハナビシソウ、アザミゲシ、または別の種由来のケイランチホリンシンターゼ（ＣｈｅＳｙｎ）；及びタリクトラム・フラブム、トウオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、または別の種由来のカナジンシンターゼ（ＣＡＳ）が挙げられる。
他の例では、テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡまたはその誘導体に行われるＯ－メチル化反応を触媒してよい。Ｏ－メチル化反応を触媒するために使用してよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェル、タリクトラム・フラブム、キクバオウレン、パパヴェル・ブラクテアタム（Ｐａｐａｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、または別の種由来のノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（６ＯＭＴ）；パパヴェル・ソムニフェル、タリクトラム・フラブム、キクバオウレン、トウオウレン、または別の種由来の３’ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）；パパヴェル・ソムニフェル、ハナビシソウ、または別の種由来のレチクリン７－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（７ＯＭＴ）；及びパパヴェル・ソムニフェル、タリクトラム・フラブム、キクバオウレン、トウオウレン、または別の種由来のスコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（９ＯＭＴ）が挙げられる。
加えて、テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡまたはその誘導体に行われるＮ－メチル化反応を触媒してよい。Ｎ－メチル化反応を触媒するために使用してよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェル、タリクトラム・フラブム、キクバオウレン、または別の種由来のコクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）；パパヴェル・ソムニフェル、ハナビシソウ、パパヴェル・ブラクテアタム、または別の種由来のテトラヒドロプロトベルベリンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＴＮＭＴ）が挙げられる。
さらに、テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡまたはその誘導体に行われるＯ－脱メチル化反応を触媒してよい。Ｏ－脱メチル化反応を触媒するために使用してよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種由来のテバイン脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）；及びパパヴェル・ソムニフェル、または別の種由来のコデイン脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）が挙げられる。
テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡまたはその誘導体に行われる還元反応を触媒してもよい。還元反応を触媒するために使用してよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル・ブラクテアタム、または別の種由来のサルタリジンレダクターゼ（ＳａｌＲ）；パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種由来のコデイノンレダクターゼ（ＣＯＲ）；及びハナビシソウまたは別の種由来のサンギナリンレダクターゼ（ＳａｎＲ）が挙げられる。他の例では、テーラリング酵素を使用して、ビスＢＩＡ、またはその誘導体上で行われるアセチル化反応を触媒してよい。アセチル化反応を触媒するために使用してよいテーラリング酵素の例としては、パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種由来のサルタリジンアセチルトランスフェラーゼ（ＳａｌＡＴ）が挙げられる。
異種コード配列
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、遺伝子操作された宿主細胞が、例えば、本明細書に記載のような所望の目的の酵素及び／または目的のＢＩＡを産生することを可能にする活性をコードする１つまたは複数の異種コード配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上）を有する。本明細書で用いるとき、「異種コード配列」という用語は、宿主生物に通常は存在せず、かつ適切な条件下で宿主細胞において発現され得る、ペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするかまたは最終的にコードする、任意のポリヌクレオチドを指す。従って、「異種コード配列」は、宿主細胞に通常存在するコード配列の複数のコピーを含み、よって該細胞は、該細胞に通常存在しないコード配列の追加のコピーを発現する。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはその任意の型、例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはその任意の型、例えばｃＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドであってよい。目的のコード配列は、コード配列、イントロン、プロモーター領域、３’－ＵＴＲ及びエンハンサー領域などの特徴を含む完全長の転写単位を含むが、これらに限定されない。
例では、遺伝子操作された宿主細胞は、表２に列挙する酵素などの酵素をそれぞれコードする複数の異種コード配列を含んでよい。いくつかの例では、複数の異種コード配列によりコードされる複数の酵素は、互いに別個であってよい。いくつかの例では、複数の異種コード配列によりコードされる複数の酵素のいくつかは、互いに別個であってよく、複数の異種コード配列によりコードされる複数の酵素のいくつかは、重複したコピーであってよい。
いくつかの例では、異種コード配列は、作動可能に連結してよい。作動可能に連結する異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド産物及び／またはエピメラーゼ産物を産生する、同一の経路内にあってよい。いくつかの例では、作動可能に連結した異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド産物及び／またはエピメラーゼ産物を産生する経路に沿って、直接配列されてよい。いくつかの例では、作動可能に連結した異種コード配列は、複数の異種コード配列によりコードされる酵素のうちの１つまたは複数の間に１つまたは複数の天然酵素を有してよい。いくつかの例では、異種コード配列は、複数の異種コード配列によりコードされる酵素のうちの１つまたは複数の間に１つまたは複数の異種酵素を有してよい。いくつかの例では、異種コード配列は、複数の異種コード配列によりコードされる酵素のうちの１つまたは複数の間に１つまたは複数の天然でない酵素を有してよい。
遺伝子操作された宿主細胞を１つまたは複数の遺伝子変異を有するように改変して、異種コード配列を収容させてもよい。天然型宿主ゲノムの変異には、ゲノムを改変して、所望の経路に干渉し得る特定のタンパク質の発現を低下させるまたは取り除くことを含むが、これに限定されない。かかる天然型タンパク質の存在は、経路の中間体または最終産物のうちの１つを所望の経路において使用可能でない代謝産物または他の化合物へと急速に変換し得る。ゆえに、天然型酵素の活性が低下したまたは完全に存在しない場合、産生された中間体は、所望の産物への取り込みのためにより容易に利用可能であるだろう。
異種コード配列は、植物における目的のＢＩＡの産生を通常担う、野生型または同等の配列のいずれかの酵素をコードする配列を含むがこれらに限定されない。いくつかの場合では、異種配列がコードする酵素は、１－ＢＩＡ経路における酵素のいずれであってもよく、任意の好都合な供給源から得られ得る。特定の合成経路に関して異種コード配列によりコードされる酵素の選択及び数は、所望の産物に基づいて選択されてよい。ある特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、またさらには１５個以上の異種コード配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の異種コード配列を含んでよい。
本明細書で用いるとき、「異種コード配列」という用語はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列、ならびに、完全長転写単位のコード部分、すなわち、イントロン及びエキソンを含む遺伝子、ならびに、酵素をコードするもしくはその等価なアミノ酸配列をコードする「コドンの最適化された」配列、切断短縮された配列、または他の形態の変異した配列を含み、ただし、この等価なアミノ酸配列は、機能的タンパク質を産生する。このような等価なアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失を有してよく、この欠失はＮ末端、Ｃ末端または中間である。切断短縮された形態は、それらが本明細書に示された触媒能を有する限り想定される。２種以上の酵素の融合体もまた、触媒活性が維持されている限り、経路における代謝物の転位を促進するために想定される。
作動可能な断片、突然変異体、または切断短縮形態は、モデリング及び／またはスクリーニングにより同定され得る。いくつかの場合では、これは、例えば、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部領域を段階的に欠失させ、続いて、元来の配列と比較して所望の反応に関するその活性について、得られた誘導体を分析することによって達成される。当該誘導体がこの能力を発揮する場合、等価な酵素の誘導体の構成は適切であると考えられる。
例では、いくつかの異種タンパク質は、組換え宿主において発現されるときに誤って処理される場合を示すことがある。例えば、微生物産生宿主において発現されるシトクロムＰ４５０酵素などの植物タンパク質は、誤ったプロセシングを生じ得る。具体的には、サルタリジンシンターゼは、酵母において異種発現されるときにＮ結合型グリコシル化を受ける場合がある。このＮ結合型グリコシル化は、植物において観察されない場合があるが、これは、異種微生物宿主における酵素の活性を低下させるための新生ＳａｌＳｙｎ転写物の誤ったＮ末端ソーティングの指標であってよい。かかる例では、Ｎ結合型グリコシル化パターンを除くために新生転写物の正しいＮ末端ソーティングを対象とするタンパク質操作は、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の向上をもたらし得る。これは、以下の実施例１０においてさらに説明される。
本発明の態様は、様々な酵素の天然型アミノ酸配列に対して等価であるアミノ酸配列をコードする異種コード配列にも関する。「等価」であるアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列と同一ではないが、所望の目的のために使用されるときに、特定のアミノ酸配列の類似の活性と比較して、タンパク質の生物学的活性に本質的に影響を及ぼさない少なくともいくつかのアミノ酸変化（欠失、置換、逆位、挿入、等）をむしろ含有する、アミノ酸配列と定義される。生物学的活性は、エピメラーゼの例においては、その触媒活性を指す。等価な配列はまた、元来のアミノ酸配列とは異なる特性を有するように遺伝子操作された及び／または進化された配列を含むことを意図する。目的の突然変異可能な特性には、触媒活性、基質特異性、選択性、安定性、可溶性、局在性、等が含まれる。
いくつかの例では、酵素の各タイプの発現は、追加の遺伝子コピー（すなわち、複数のコピー）を通して増加し、これは、中間体蓄積及び／または目的のＢＩＡ産生を増加する。本発明の実施形態は、単一または複数の酵素の複数の種バリアントの同時発現を通した宿主細胞における目的のＢＩＡ産生の増加を含む。いくつかの場合では、単一または複数の酵素の追加の遺伝子コピーは、宿主細胞内に含まれる。宿主細胞における酵素の異種コード配列の複数のコピーを含む任意の好都合な方法を使用してもよい。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素の異種コード配列の複数のコピー、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またさらには１０以上のコピーを含む。これの例を図２８に記載する。具体的には、図２８は、遺伝子操作された酵母菌株における２つのコピーから３つのコピーへのＮＣＳ遺伝子のコピー数の増加によるベンジルイソキノリンアルカロイドレチクリンの産生の増加を示す。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、１つまたは複数の酵素の異種コード配列の複数のコピー、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上等の複数のコピーを含む。いくつかの場合では、酵素の異種コード配列の複数のコピーは、宿主細胞と比べて２つ以上の異なる生物源から得られる。例えば、遺伝子操作された宿主細胞は、１つの異種コード配列の複数のコピーを含んでよく、各コピーは異なる生物源から得られる。従って、各コピーは、異種コード配列によりコードされる目的の酵素の種間の差異に基づいて、顕在配列において幾分のばらつきを含んでよい。
遺伝子操作された宿主細胞培地をサンプリングし、目的のＢＩＡの産生について観察してよい。目的のＢＩＡは、任意の好都合な方法を使用して観察及び測定されてよい。目的の方法としては、ＬＣ－ＭＳ法（例えば、本明細書に記載のような）が挙げられるがこれに限定されず、この方法では、目的の試料は、既知量の標準化合物との比較によって分析される。加えて、目的のＢＩＡを観察及び／または測定し得る他の方法が存在する。ＢＩＡを観察及び／または測定する代替の方法の例としては、中でもＧＣ－ＭＳ、ＵＶ－ｖｉｓ分光法、ＮＭＲ、ＬＣ－ＮＭＲ、ＬＣ－ＵＶ、ＴＬＣ、キャピラリー電気泳動が挙げられる。同一性は、例えば、ｍ／ｚ及びＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンによって確認され得、該化合物の定量または測定は、既知の保持時間のＬＣトレースピーク及び／または既知量の標準化合物の対応するＬＣ－ＭＳ分析への参照によるＥＩＣ ＭＳピーク分析を介して達成され得る。
加えて、遺伝子操作された宿主細胞の培養物を、ＣＹＰ－ＣＯＲ酵素などの目的の酵素の産生のためにサンプリング及び観察してよい。目的の酵素は、任意の好都合な方法を使用して観察及び測定されてよい。目的の方法には、酵素活性アッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一酸化炭素分光法、及びウェスタンブロット分析が含まれる。
方法
プロセス工程
上記に要約されているように、本発明の態様は、目的のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を調製する方法を含む。加えて、本発明の態様は、目的の酵素を調製する方法を含む。従って、本発明の態様は、１つまたは複数の宿主細胞改変（例えば、本明細書に記載のような）が、細胞が目的の出発化合物を目的の生成物酵素及び／またはＢＩＡへと変換するように機能的に発現される条件下で遺伝子操作された宿主細胞を培養することを含む。１つまたは複数の異種コード配列が機能的に発現され、目的の出発化合物を目的の生成物酵素またはＢＩＡへと変換するように、タンパク質産生に好適な条件下で遺伝子操作された宿主細胞を培養する工程を含む方法も提供する。例では、本方法は、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のような）を培養する工程；出発化合物を細胞培養物に加えること；及びＢＩＡを細胞培養物から回収する工程を含む、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を調製する方法である。いくつかの例では、本方法は、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のような）を培養する工程；出発化合物を細胞培養物に加える工程；及び酵素を細胞培養物から回収する工程を含む、酵素を調製する方法である。
発酵培地は、好適な炭素基質を含有してよい。本開示の方法を行うのに好適な炭素源は、広範な炭素含有基質を包含してよい。好適な基質は、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖類（例えば、デンプン、セルロース）、またはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合では、再生可能供給原料からの未精製混合物を使用してよい（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、オオムギ麦芽）。いくつかの場合では、炭素基質は、一炭素基質（例えば、メタノール、二酸化炭素）または二炭素基質（例えば、エタノール）であってよい。他の場合では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン、及びアミノ酸を使用してよい。
遺伝子操作された宿主細胞を培養する任意の好都合な方法を、目的の酵素及び／またはＢＩＡを産生するために使用してよい。使用される具体的なプロトコルは、例えば、遺伝子操作された宿主細胞、異種コード配列、目的の酵素、目的のＢＩＡ等に応じて変動してよい。細胞は、任意の好都合な環境、例えば、細胞が１つまたは複数の機能的な異種酵素を発現することができる環境に存在し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、酵素の発現を行える条件下で、インビボで目的の酵素及び／またはＢＩＡの産生を可能とするために利用可能な適切な基質と共に培養される。いくつかの実施形態では、機能的な酵素は、インビトロ条件下での目的の酵素及び／またはＢＩＡの産生のために遺伝子操作された宿主から抽出される。いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、多細胞宿主生物中に戻される。遺伝子操作された宿主細胞は、静止期及びｌｏｇ増殖期等を含むがこれらに限定されない任意の増殖期にある。さらに、培養それ自体は、連続培養であっても、バッチ培養であってもよい。
細胞は、適切な発酵培地にて、１４～４０℃の間の温度で増殖し得る。細胞は、任意の好都合な速度（例えば、２００ｒｐｍ）で振とうさせた状態で増殖し得る。細胞は、好適なｐＨで増殖し得る。発酵に好適なｐＨの範囲は、ｐＨ５～９の間であり得る。発酵は、好気性、嫌気性または微好気性の条件下で行われ得る。任意の好適な増殖培地を使用してよい。適切な増殖培地は、合成規定（ＳＤ）最小培地または酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＥＰＤ）リッチ培地などの一般的に市販されている培地を含み得るが、これらに限定されない。微生物に適切な任意の他のリッチ、規定、または合成増殖培地を使用してよい。
細胞は、本質的に任意のサイズ及び形状の容器内で培養してよい。本開示の方法を実施するのに好適な容器の例としては、マルチウェル振とうプレート、試験管、フラスコ（バッフル付き及びバッフル無し）、及びバイオリアクターが挙げられるが、これらに限定されない。培養物の容量は、１０マイクロリットルから１０，０００リットルを超える範囲であり得る。
アルカロイドの産生に望ましい方法で代謝を調節することが知られている増殖培地への薬剤の添加を含んでよい。非限定的な例では、環状アデノシン２’３’－一リン酸を増殖培地に添加して、異化産物抑制を調節してよい。
特定の細胞型のための任意の好都合な細胞培養条件が使用されてよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の改変を含む宿主細胞は、標準的な細胞培養用培地及び補助物を伴って、標準的または容易に最適化される条件下で培養される。一例として、プラスミド維持のための選択圧が必要とされない場合の標準的な増殖培地は、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのペプトン、及び２０ｇ／Ｌのデキストロース（ＹＰＤ）を含有し得る。プラスミドを含有する宿主細胞は、増殖及び選択のために必要とされる適切なアミノ酸が補充された、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基、５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、及び２０ｇ／Ｌのデキストロースを含有する合成完全（ＳＣ）培地中で増殖する。誘導性酵素発現のために有用であり得る代替的な炭素源としては、スクロース、ラフィノース及びガラクトースが含まれるが、これらに限定されない。細胞は、任意の好都合な温度（例えば３０℃）で、任意の好都合な速度（例えば２００ｒｐｍ）で振とうさせた状態で、容器中、例えば、試験管またはフラスコ中、１～１０００ｍＬまたはそれ以上の範囲の容量で、研究室において増殖する。
培養容量は、例えば、工業的プロセスの一部として、より大きな発酵容器中での増殖のために規模を大きくしてよい。工業的発酵プロセスは、閉鎖バッチ、流加バッチ、または連続ケモスタット条件下、または任意の好適な発酵様式で行ってよい。いくつかの場合では、細胞を全細胞触媒として基材上に固定化し、アルカロイド産生のための発酵条件に供してよい。
バッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵プロセス中に変更されない閉鎖系である。所望の生物は、発酵の開始時に培地に接種される。いくつかの例では、バッチ発酵は、ｐＨ及び酸素濃度（但し、炭素ではない）などの因子を制御するためにシステムに対して行われる変更を伴って実行される。このタイプの発酵システムでは、システムのバイオマス及び代謝産物組成は、発酵の過程にわたって連続的に変化する。細胞は、典型的には誘導期を経て対数増殖期（高増殖率）、次に定常期（増殖率が低下または停止）、最終的には死滅期（未処理のままである場合）に進む。
連続発酵は、所定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、同量の発酵培地が処理のために容器から連続的に除去される開放系である。連続発酵システムは、一般に、培地が取り除かれたことによる細胞損失が発酵における増殖速度と釣り合うように、定常状態の増殖条件を維持するように操作される。連続発酵は、一般に、細胞が一定の高い細胞密度にある条件で操作される。連続発酵は、標的生成物濃度及び／または細胞増殖に影響を及ぼす１つまたは複数の因子の調節を可能にする。
液体培地は、上記添加成分を有するリッチまたは合成の規定培地を含み得るがこれらに限定されない。培地成分は、水に溶解され、熱、圧力、ろ過、放射線、化学物質、またはそれらの任意の組み合わせによって滅菌され得る。いくつかの培地成分は、別々に調製され、滅菌され、次いで発酵容器中で混合され得る。培地は、発酵全体を通して一定のｐＨを維持するのを助けるために緩衝化されてよい。
温度、溶存酸素、ｐＨ、攪拌、通気速度、及び細胞密度を含むプロセスパラメータは、発酵の経過にわたって観察または制御され得る。例えば、発酵プロセスの温度は、培地中に浸漬された温度プローブによって観察され得る。培養温度は、ジャケット温度を調節することによって設定値で制御され得る。水は、外部冷却器で冷却され、次いでバイオリアクター制御塔に流入し、容器内の設定温度を維持するのに必要な温度でジャケットに循環され得る。
加えて、気体流パラメータは、発酵プロセスにおいて観察され得る。例えば、気体は、スパージャを通して培地中に流入し得る。本開示の方法に好適な気体は、圧縮空気、酸素、及び窒素を含み得る。気体流は、固定された速度であってよいか、または溶存酸素設定値を維持するように調節されてよい。
培地のｐＨも観察され得る。例では、ｐＨは、容器内の培地に浸漬されたｐＨプローブによって観察され得る。ｐＨ制御が有効な場合、各溶液を必要な速度で培地に添加する酸性及び塩基性ポンプによってｐＨを調整し得る。ｐＨを制御するために使用される酸溶液は、硫酸または塩酸であってよい。ｐＨを制御するために使用される塩基溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化アンモニウムであってよい。
さらに、溶存酸素は、培地中に浸漬された溶存酸素プローブによって培地中で観察され得る。溶存酸素調節が有効な場合、酸素レベルは、攪拌速度を増減することによって調整され得る。溶存酸素レベルは、気体流量を増減することによっても調整され得る。気体は、圧縮空気、酸素または窒素であってよい。
攪拌速度も、発酵プロセスにおいて観察され得る。例では、攪拌モータは攪拌器を駆動し得る。撹拌速度は、発酵全体を通して一貫したｒｐｍに設定され得るか、または設定された溶存酸素レベルを維持するように動的に調節され得る。
加えて、混濁度は、発酵プロセスにおいて観察され得る。例では、細胞密度は、混濁度プローブを使用して測定され得る。あるいは、細胞密度は、バイオリアクターから試料を採取し、分光光度計でそれらを分析することによって測定され得る。さらに、試料は、滅菌サンプリング装置を通して、時間間隔でバイオリアクターから除去され得る。試料は、宿主細胞により産生されるアルカロイドについて分析され得る。試料は、他の代謝産物及び糖、培地成分の欠失、または細胞の密度についても分析され得る。
別の例では、発酵プロセス中に供給原料パラメータが観察され得る。具体的には、外部ポンプを使用して発酵に添加され得る糖及び他の炭素源を含む供給原料、栄養素、ならびに補因子。他の成分も発酵中に添加されてよく、それには、消泡剤、塩、キレート剤、界面活性剤、及び有機液体が含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞における異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するための任意の好都合なコドン最適化技術を、主題の宿主細胞及び方法における使用のために適応させてよく、例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，３４６－３５３を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
主題の方法はまた、出発化合物を細胞培養物に加える工程も含んでよい。任意の好都合な添加法を、主題の方法における使用に適応させてよい。細胞培養物に、十分な量の目的の出発物質（例えば本明細書に記載のもの）、例えばｍＭからμＭの量、例えば、約１～５ｍＭの出発化合物を補充してよい。添加される出発物質の量、添加の時期及び速度、添加される材料の形態等は、様々な因子に応じて変化し得ることが理解されたい。出発物質は、無溶媒で加えられてよく、または好適な溶媒（例えば、細胞培養用培地、水、または有機溶媒）に予め溶解されてよい。出発物質は、添加時の細胞培養用培地の希釈率を最小限とし得るために、濃縮形態（例えば、所望の濃度の１０倍以上）で添加されてよい。出発物質は、１つまたは複数のバッチに添加されてよく、または連続添加により長期にわたって（例えば数時間または数日間）添加されてよい。
発酵培地から産物を単離するための方法
主題の方法は、細胞培養物から目的の酵素及び／またはＢＩＡを回収する工程も含んでよい。任意の好都合な分離法及び単離法（例えば、クロマトグラフィー法または沈降法）を、主題の方法における使用に適応させて、細胞培養物から目的の酵素及び／またはＢＩＡを回収し得る。ろ過法を使用して、細胞培養物の不溶性画分から可溶性画分を分離し得る。いくつかの場合では、液体クロマトグラフィー法（例えば、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー）を使用して、細胞培養物の他の可溶性成分から目的のＢＩＡを分離し得る。いくつかの場合では、抽出法（例えば、液体抽出、ｐＨ系精製、固相抽出、親和性クロマトグラフィー、イオン交換、等）を使用して、細胞培養物の他の成分から目的の酵素及び／またはＢＩＡを分離し得る。
産生されたアルカロイドは、当該分野で公知の方法を使用して発酵培地から単離されてよい。所望の産物の最初の回収のために発酵の直後に（またはいくつかの例では、最中に）いくつかの回収工程が行われてよい。これらの工程を通して、アルカロイド（例えば、ＢＩＡ）は、細胞、細胞デブリ及び廃棄物から分離され得、そして他の栄養素、糖、及び有機分子は、使用済み培地中に残り得る。このプロセスを使用してＢＩＡ富化産物が得られ得る。
一例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）産物を有する生成物流は、遺伝子操作された酵母細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供することにより、形成される。具体的には、遺伝子操作された酵母細胞は、少なくとも約５分間にわたってインキュベートすることにより発酵に供して、ＢＩＡ産物及び細胞物質を含む溶液を生成し得る。一度、遺伝子操作された酵母細胞が発酵に供されると、少なくとも１つの分離装置を使用して、ＢＩＡ産物を細胞物質から分離して、ＢＩＡ産物を含む生成物流を提供し得る。具体的には、生成物流は、ＢＩＡ産物、ならびに追加の成分、例えば、清澄化された酵母培養用培地を含んでよい。加えて、ＢＩＡ産物は、１つまたは複数の目的のＢＩＡ、例えば、１つまたは複数のＢＩＡ化合物を含んでよい。
異なる方法を使用して、目的の酵素及び／またはＢＩＡを含むバイオリアクター培地から細胞を除去してよい。例では、細胞は、経時的な沈降により除去されてよい。沈降のこのプロセスは、冷却することまたはシリカなどの清澄剤の添加によって促進され得る。次いで、使用済み培地を反応器の頂部から吸い上げるか、または細胞を反応器の基部からデカントしてよい。あるいは、細胞は、フィルター、膜、または他の多孔質材料を通す濾過によって除去されてよい。細胞は、遠心分離、例えば連続流遠心分離によって、または連続抽出器を用いて除去してもよい。
いくつかの有益な目的の酵素及び／またはＢＩＡが細胞の内側に存在する場合、細胞を透過化または溶解し、細胞デブリを上記の方法のいずれかによって除去してよい。細胞を透過させるために使用される薬剤には、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）または塩（例えば、酢酸リチウム）が含まれるが、これらに限定されない。細胞を溶解する方法は、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の添加、またはビーズ粉砕または超音波処理による機械的破壊を含み得る。
目的の酵素及び／またはＢＩＡは、清澄化された使用済み培地から、水性培地と混和しない有機液体の添加による液液抽出を通して抽出してよい。例では、他の処理工程に加えて液液抽出の使用を使用してよい。好適な有機液体の例には、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、クロロホルム、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、オレイン酸メチル、トルエン、オレイルアルコール、酪酸エチルが含まれるが、これらに限定されない。有機液体は、水性培地の容量のわずか１０％または多くて１００％にて添加してよい。
いくつかの場合では、有機液体は、発酵の開始時または発酵中の任意の時に加えてよい。抽出発酵のこのプロセスは、酵素及び／またはＢＩＡを有機相に継続的に除去することにより宿主細胞からの目的の酵素及び／またはＢＩＡの収率を増加させ得る。
撹拌によって、有機相は、水性培地とのエマルジョンを形成し得る。２つの相の異なる層への分離を促進する方法には、解乳化剤または核形成剤の添加、またはｐＨの調整が含まれるが、これらに限定されない。エマルジョンを遠心分離して、例えば、連続円錐プレート遠心分離によって、２つの相を分離してもよい。
あるいは、抽出後に物理的に除去され得るように、有機相を水性培地から単離してよい。例えば、溶媒は膜に封入されてよい。
例では、目的の酵素及び／またはＢＩＡは、吸着法を使用して発酵培地から抽出されてよい。例では、目的のＢＩＡは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ４などの樹脂または吸着によってＢＩＡを除去する別の薬剤の添加によって、清澄化した使用済み培地から抽出され得る。次いで、目的のＢＩＡを、有機溶媒を用いて樹脂から放出し得る。好適な有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、酢酸エチル、またはアセトンが挙げられるが、これらに限定されない。
目的のＢＩＡは、ろ過を使用して発酵培地から抽出されてもよい。高ｐＨでは、目的のＢＩＡは、バイオリアクター中で結晶質様沈殿物を形成し得る。この沈殿物は、フィルター、膜または他の多孔性材料を通したろ過により直接除去され得る。沈殿物は、遠心分離及び／またはデカンテーションによって収集されてもよい。
上述の抽出法は、生体内（バイオリアクター内）または生体外（例えば、それを通して培地がバイオリアクターから流出し、抽出剤と接触し、容器の中に再循環される外部ループ内）のいずれかで実行されてよい。あるいは、抽出法は、バイオリアクター容器から除去された清澄化培地を使用して発酵が終了した後に行われてよい。
アルカロイド富化液から産物を精製するための方法
後続の精製工程は、目的の個別の産物種を高純度に回収するために当該分野で公知の方法を使用して目的のＢＩＡ産物を富化した発酵後溶液を処理することを必然的に含む。
一例では、有機相にて抽出された目的のＢＩＡを水溶液に移してよい。いくつかの場合では、熱及び／または真空によって有機溶媒を蒸発させ、得られた粉末を好適なｐＨの水溶液に溶解させてよい。さらなる例では、目的のＢＩＡの水相への抽出を促進する好適なｐＨでの水溶液の添加によって、目的のＢＩＡを有機相から抽出してよい。次いで、水相を、デカンテーション、遠心分離、または別の方法によって除去してよい。
ＢＩＡ含有溶液は、例えば、好適なキレート剤で処理することによって金属を除去するためにさらに処理してよい。目的のＢＩＡ含有溶液は、タンパク質及びＤＮＡなどの他の不純物を沈殿によって除去するためにさらに処理されてよい。一例では、目的のＢＩＡ含有溶液を、エタノール、メタノール、アセトンまたはイソプロパノールなどの適切な沈殿剤で処理する。代替的な例では、ＤＮＡ及びタンパク質は、混入生物学的高分子からより小さなアルカロイドを分離する透析またはサイズ排除の他の方法によって除去し得る。
さらなる例では、目的のＢＩＡを含有する溶液は、当該分野で公知の方法を使用して連続クロスフローろ過により高純度に抽出され得る。
溶液が、目的のＢＩＡの混合物を含有する場合、その溶液を当該分野で公知の方法を使用して、酸性塩基処理に供して、個別の目的の種のＢＩＡを得てよい。このプロセスでは、水溶液のｐＨは、個別のＢＩＡを沈殿させるように調整される。
高純度小規模調製について、ＢＩＡは、液体クロマトグラフィーによる単一の工程において精製され得る。
酵母由来アルカロイドＡＰＩ対植物由来ＡＰＩ
清澄化した酵母培養用培地（ＣＹＣＭ）は、複数の不純物を含有し得る。清澄化した酵母培養用培地は、真空及び／または加熱によって脱水されて、アルカロイド富化粉末が得られ得る。この産物は、ポピーストロー（ＣＰＳ）またはアヘンの濃縮物に類似しており、これは、ケシを育てている国から輸出され、ＡＰＩ製造業者が購入した。本発明の目的のために、ＣＰＳは、そこから所望のアルカロイド産物が最終的にさらに精製され得る任意のタイプの精製植物抽出物の代表例である。表４及び表５は、ＣＹＣＭまたはＣＰＳのいずれかに特異的であり得るかまたは両方に存在し得る、これら２つの産物中の不純物を強調する。一部のＢＩＡには不純物として色素が含まれている場合があるが、他のＢＩＡは色素自体に分類され得る。したがって、これらのＢＩＡは、非色素不純物に基づいて不純物について評価され得る。これらの不純物のサブセットについて未知の起源の産物を分析することにより、当業者は、産物が酵母産生宿主由来であるかまたは植物産生宿主由来であるかを決定し得る。
ＡＰＩグレードの医薬成分は高度に精製された分子である。したがって、ＡＰＩの植物起源または酵母起源を示すことができる不純物（表４及び表５に記載されているものなど）は、産物のＡＰＩ段階では存在しない可能性がある。実際に、本発明の酵母菌株に由来するＡＰＩ産物の多くは、従来の植物由来のＡＰＩとほとんど区別できない場合がある。しかしながら、いくつかの場合では、従来のアルカロイド化合物は、化学合成アプローチを用いて化学修飾されてよく、このような化学的修飾を必要とする植物由来産物中の化学的不純物として現れる可能性がある。例えば、化学誘導体化は、化学合成プロセスに関連する不純物のセットをもたらすことがしばしばあり得る。ある特定の状況では、これらの改変は、酵母産生プラットフォームにおいて生物学的に実施され得、それにより、化学的誘導に関連する不純物の一部が酵母由来産物中に存在するのを回避する。具体的には、化学誘導産物からのこれらの不純物は、化学合成プロセスを使用して産生されるＡＰＩ産物中には存在し得るが、酵母由来産物を使用して産生されるＡＰＩ産物には存在しない場合がある。あるいは、酵母由来の産物を化学的に誘導された産物と混合する場合、得られる不純物は存在してもよいが、化学的に誘導された産物のみまたはこれを主に含むＡＰＩにおいて予想されるものよりも少ない量で存在し得る。この例では、これらの不純物のサブセットについてＡＰＩ産物を分析することにより、当業者は、産物が酵母生産宿主に由来するものであるか、または従来の化学誘導体化経路からのものであるかを決定することができる。
化学的に誘導体化されたモルフィナンＡＰＩ中に存在し得るが、生合成されたＡＰＩ中に存在しないだろう不純物の非限定的な例としては、ＡＰＩコデイン中のコデイン－Ｏ（６）－メチルエーテル不純物；ＡＰＩオキシコドン中の８，１４－ジヒドロキシ－７，８－ジヒドロコデイノン；及びＡＰＩヒドロコドン中のテトラヒドロテバインが挙げられる。コデイン－Ｏ（６）－メチルエーテルは、モルヒネの化学的な過剰メチル化により形成され得る。ＡＰＩオキシコドン中の８，１４－ジヒドロキシ－７，８－ジヒドロコデイノンは、テバインの化学的な過剰酸化により形成され得る。加えて、ＡＰＩヒドロコドン中のテトラヒドロテバインは、テバインの化学的な過剰還元により形成され得る。
しかしながら、酵母由来の化合物及び植物由来の化合物が両方とも化学合成手法を通して化学的改変を受ける場合、化学合成プロセスに関連する同一の不純物が、産物中に予想され得る。このような状況では、出発物質（例えば、ＣＹＣＭまたはＣＰＳ）は、上述のように分析され得る。
宿主細胞を遺伝子操作する方法
目的の酵素及び／またはＢＩＡを産生する目的のために宿主細胞を遺伝子操作する方法も含まれる。ＤＮＡを宿主細胞に挿入することは、任意の好都合な方法を使用して達成され得る。該方法を使用して、宿主細胞が酵素を機能的に発現し、目的の出発化合物を目的の酵素及び／またはＢＩＡ産物へと変換するように、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞に挿入する。
任意の好都合なプロモーターを、主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法において使用してよい。異種コード配列の発現を推進するプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよいが、遺伝子操作された宿主細胞においてプロモーターが活性であることが条件である。異種コード配列は、それらの天然型プロモーターから発現され得るか、または天然でないプロモーターが使用され得る。このようなプロモーターは、それらが使用される宿主において低強度から高強度であり得る。プロモーターは、調節され得るかまたは構成的であり得る。ある特定の実施形態では、グルコース抑制されていないか、または培地中のグルコースの存在によってほんの軽度に抑制されているプロモーターが使用される。目的のプロモーターは、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、Ｂ．サブティリス ｔｓｒ遺伝子のプロモーター（フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター領域をコードする）またはグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする酵母Ｓ．セレビシエ遺伝子からのプロモーター（ＧＰＤ、ＧＡＰＤＨ、またはＴＤＨ３）、パン酵母のＡＤＨ１プロモーター、リン酸欠乏誘導性プロモーター、例えば、酵母のＰＨＯ５プロモーター、Ｂ．リケニフォルミスからのアルカリホスファターゼプロモーター、酵母誘導性プロモーター、例えば、Ｇａｌ１－１０、Ｇａｌ１、ＧａｌＬ、ＧａｌＳ、抑制性プロモーターＭｅｔ２５、ｔｅｔＯ、及び構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳－伸長因子－１－αプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ－オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、ＭＲＰ７プロモーター、等が含まれるが、これらに限定されない。グルココルチコイド、ステロイド及び甲状腺ホルモンなどのホルモンによって誘導可能なプロモーターを含有する自律複製酵母発現ベクターもまた使用され得、これには、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）及び甲状腺ホルモン応答エレメント（ＴＲＥ）が含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の例は、米国特許第７，０４５，２９０号に記載されており、これは、そこに引用された参考文献を含めて参照により組み入れられる。α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含有する追加のベクターも使用され得る。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢに従う）もまた遺伝子の発現を推進するために使用され得る。任意の好都合な適切なプロモーターが、宿主細胞、例えば大腸菌のために選択され得る。また、転写物、及び従って酵素レベルを最適化して、エネルギー源を最小限としつつ産生を最大限とするためにプロモーターの選択を使用してよい。
任意の好都合なベクターを、主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法に使用してよい。目的のベクターは、酵母及び他の細胞において使用するためのベクターを含む。酵母ベクターの型は、次の４つの一般的な分類に分割され得る：組込み型ベクター（ＹＩｐ）、自律複製型高コピー数ベクター（ＹＥｐまたは２μプラスミド）、自律複製型低コピー数ベクター（ＹＣｐまたは動原体プラスミド）、及び大きな断片をクローニングするためのベクター（ＹＡＣ）。ベクターＤＮＡを、任意の好都合な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入する。別の供給源のＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成二本鎖ＤＮＡ産物、または合成二本鎖もしくは一本鎖オリゴヌクレオチド）を使用して、ゲノムへの組込みによって酵母を遺伝子操作してよい。任意の単一の形質転換事象には、宿主細胞を遺伝子改変するために１つまたはいくつかの核酸（ベクター、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ断片）が含まれ得る。
有用性
例えば、上記の本発明の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、様々な用途に使用される。目的の用途としては、研究用途及び治療用途が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、酵素及び／またはＢＩＡの産生が目的である任意の好都合な用途を含む、様々な異なる用途に使用される。
主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、様々な治療用途において使用される。目的の治療用途には、ＢＩＡを含む医薬品の調製を目的とする用途が含まれる。本明細書に記載の遺伝子操作された宿主細胞は、目的のＢＩＡ及び目的の酵素を産生する。レチクリンは、オピオイド産物などの最終産物を産生するための遺伝子操作取り組みを含むＢＩＡの合成における重要な分岐点中間体である。主題の宿主細胞を使用して、目的のＢＩＡを、目的のＢＩＡ、例えば、レチクリン、及びＢＩＡ最終産物の産生において使用され得る簡易で安価な出発物質から産生し得る。従って、主題の宿主細胞は、治療的に活性な目的のＢＩＡの供給に使用される。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、これらの化合物の化学合成が低収率であり、大規模生産のための有効な手段ではない場合の、商業的規模の量のＢＩＡの生産において使用される。ある特定の場合では、宿主細胞及び方法は、治療用製品のための目的のＢＩＡの迅速な生産を可能とする、例えば、５，０００～２００，０００リットル容量のバイオリアクター（発酵槽）を含み得る発酵施設において使用される。このような用途は、セルロース、デンプン、及び遊離糖などの発酵可能な炭素源からの目的のＢＩＡの工業規模の生産を含み得る。
主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、様々な研究用途に使用される。主題の宿主細胞及び方法は、様々な目的の酵素及び／またはＢＩＡの生合成経路上の様々な酵素の作用を分析するために使用され得る。加えて、遺伝子操作された宿主細胞は、まだ明らかとなっていない治療機能における目的の生物活性についての試験に使用される目的の酵素及び／またはＢＩＡを産生するように遺伝子操作され得る。いくつかの場合では、様々な酵素をコードする様々な異種コード配列を含むように宿主細胞を遺伝子操作することは、目的の酵素及び／またはＢＩＡに向けての高収率の生合成経路を解明する。ある特定の場合では、研究用途は、その後所望の産物へとさらに化学的に改変もしくは誘導体化され得る目的の治療用分子のため、または目的の治療活性の増加についてスクリーニングするための目的の酵素及び／またはＢＩＡの産生を含む。いくつかの例では、宿主細胞株は、このような経路において関心対象である酵素活性についてスクリーニングするために使用され、これにより、これらの菌株において産生されたＢＩＡ代謝物の変換を介して酵素発見がもたらされ得る。
主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、植物に特殊化された代謝産物の産生プラットフォームとして使用され得る。主題の宿主細胞及び方法は、薬物ライブラリーの開発ならびに植物酵素の発見のためのプラットフォームとして使用され得る。例えば、主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、天然物をベースとする薬物ライブラリーの開発に使用され得、それは、プロトピンなどの関心対象の骨格分子を産生する酵母菌株を採取し、コンビナトリアル生合成を通して化合物の構造をさらに官能基化することによるかまたは化学的手段による。このようにして薬物ライブラリーを産生することによって、あらゆる可能性のある薬物ヒットはすでに、大規模培養及び産生に適用できる産生宿主と関連付けられている。別の例として、これらの主題の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、植物酵素の発見に使用され得る。主題の宿主細胞は、定義された代謝物の明瞭なバックグラウンドを提供して、新規の酵素活性を同定するための植物ＥＳＴライブラリーを発現する。主題の宿主細胞及び方法は、酵母における植物酵素の機能的発現及び活性増加のための発現方法及び培養条件を提供する。
キット及びシステム
本発明の態様は、キット及びシステムをさらに含み、該キット及びシステムは、本発明の方法に使用された１つまたは複数の構成要素、例えば、本明細書に記載のような、遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培地等を含み得る。いくつかの実施形態では、主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のような）、ならびに出発化合物、異種コード配列、及び／またはそれを含むベクター、ベクター、増殖供給原料、発現系における使用に好適な構成要素（例えば、細胞、クローニングベクター、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）、双方向プロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、等）、及び培地から選択される１つまたは複数の構成要素を含む。
本明細書に記載の構成要素のいずれもがキット中に提供されてよく、それは、例えば、１つまたは複数の改変を含む宿主細胞、出発化合物、培地、等である。異種コード配列、クローニングベクター及び発現系の作製及び使用に使用されるのに好適な様々な構成要素が、主題のキットにおいて使用され得る。キットはまた、チューブ、バッファー等、及び使用説明書も含んでよい。キットの様々な試薬成分は、所望の場合には、別々の容器に存在しても、またはそれらの一部もしくは全てを単一の容器中で試薬混合物中に予め配合してもよい。
目的の酵素及び／またはＢＩＡを産生するためのシステムであって、１つまたは複数の改変を含む遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のような）、出発化合物、培地、発酵槽及び発酵設備、例えば、宿主細胞のための増殖条件を維持するのに好適な装置、サンプリング及びモニタリング設備ならびに構成要素等を含み得る、前記システムも提供する。酵母細胞の大規模発酵に使用するのに好適な様々な構成要素は、主題のシステムに使用され得る。
いくつかの場合では、該システムは、遺伝子操作された宿主細胞の大規模発酵、ならびに発酵された宿主細胞により産生される酵素及び／またはＢＩＡ化合物のモニタリング及び精製のための構成要素を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の出発化合物（例えば、本明細書に記載のような）は、発酵槽内の遺伝子操作された宿主細胞が１つまたは複数の所望の目的のＢＩＡ産物を産生する条件下で、該システムに加えられる。いくつかの例では、宿主細胞は、目的のＢＩＡを産生する（例えば、本明細書に記載のような）。ある特定の場合では、目的のＢＩＡ産物は、オピオイド産物、例えば、テバイン、コデイン、ネオピン、モルヒネ、ネオモルフィン、ヒドロコドン、オキシコドン、ヒドロモルフォン、ジヒドロコデイン、１４－ヒドロキシコデイン、ジヒドロモルヒネ、またはオキシモルフォンである。
いくつかの場合では、該システムは、主題の宿主細胞によって産生される１つまたは複数の目的の酵素及び／またはＢＩＡ化合物をモニタリング及びまたは分析するためのプロセスを含む。例えば本明細書に記載のように、試料を分析し、標準物質に対して比較し得る、例えば、本明細書に記載のＬＣ－ＭＳ分析システム、クロマトグラフィーシステム、または任意の好都合なシステム。発酵培地は、発酵前及び発酵中の任意の好都合な時に、サンプリング及び分析によって観察され得る。目的の酵素及び／またはＢＩＡ産物への出発化合物の変換が完了すると、発酵は停止され得、ＢＩＡ産物の精製が行われ得る。従って、いくつかの場合では、主題のシステムは、その中に目的の酵素及び／またはＢＩＡ産物が産生される宿主細胞培地から目的の酵素及び／またはＢＩＡ産物を精製するのに好適な精製用構成要素を含む。精製用構成要素には、発酵により産生される目的の酵素及び／またはＢＩＡ産物を精製するために使用され得る任意の好都合な手段を含み得、それには、シリカクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体抽出、及びｐＨ抽出法が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの場合では、主題のシステムは、システムへの１つまたは複数の出発化合物の投入後に、酵素及び／またはＢＩＡ発酵産物の産生及び単離を提供する。
以下の例は、当業者に、本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するために示され、本発明者らが彼らの発明として考えるものの範囲を制限する意図はなく、また、以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図しない。使用された数字（例えば量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、幾分の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
酵素リストの考察
宿主細胞を、目的のＢＩＡ及び／または目的の酵素の産生を提供する１つまたは複数の改変（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、またはさらに多くの改変）を含むように遺伝子操作してよい。表２は、遺伝子操作された宿主細胞において目的のＢＩＡ及び／または目的の酵素の産生を提供するように１つまたは複数の改変により作用し得る例示的な遺伝子の表を提供する。
表２に提供する遺伝子の改変を使用して、目的のＢＩＡを、増殖に必要な最小限の栄養素を含有する培地を補充された遺伝子操作された宿主細胞から産生し得る。この最小培地は、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン、及び塩を含有し得る。例えば、表２に提供する遺伝子の改変を使用して、糖を供給された遺伝子操作された宿主細胞から目的のＢＩＡを産生し得る。加えて、表２に提供する１つまたは複数の遺伝子の改変を使用して、薬物産生のために遺伝子操作され得る宿主細胞の生合成プロセスを増強し得る。
加えて、遺伝子操作された宿主細胞における目的のＢＩＡ及び／または目的の酵素の産生を提供するためのこれらの改変の使用は、遺伝子により産生され得る酵素の単なる同定からは容易に明らかにならない。具体的には、本明細書に記載のような酵母細胞などの宿主細胞において再構築されている合成経路は、単一の生物内で自然には一緒に作用しない様々な酵素を含む。加えて、本明細書に考察する酵素のいくつかは、それらの天然の状況ではＢＩＡ生合成のために作用しない。さらに、本明細書に記載の酵素のいくつかは、酵母細胞などの特定の宿主細胞において機能するようには発達しておらず、一緒に機能するように発達していない。これらの場合では、下流ＢＩＡ最終産物を産生するための経路を通る十分なフラックスを有するために十分な活性を、酵母などの宿主細胞における合成ＢＩＡ経路の文脈において呈するということは明らかでないだろう。
例えば、植物酵素は、酵母などの異種微生物宿主において機能的に発現することが難しい場合が多い。多くの場合では、酵素は、ミスフォールドされる、宿主細胞内で正しく局在化しない、及び／または誤ってプロセシングされる可能性がある。酵母及び植物間のタンパク質翻訳及びプロセシングにおける差異により、これらの酵素は、酵母宿主において検出可能な活性が実質的に低下するまたは検出されなくなり得る。これらの課題は、ＢＩＡ経路において強く表されるシトクロムＰ４５０などの膜内局在化酵素に共通して生じる。低下した酵素活性でさえも、所望のＢＩＡ産物の高レベルの蓄積を確実にするために各工程で十分な活性を必要とする、酵母を遺伝子操作して複合ＢＩＡを産生することにおいて実質的な課題をもたらし得る。
加えて、ＢＩＡ経路における初期前駆体（すなわち、チロシンからノルコクラウリンへの中間体）の多くで作用し得る、酵母などのいくつかの宿主細胞中に、内因性酵素／経路が存在し、したがって、これらの競合する内因性経路を考慮すると、実質的なＢＩＡ産生を達成するために異種経路を通る十分なフラックスが存在し得ることは容易に明らかでない可能性がある。例えば、酵母内のＥｒｌｉｃｈ経路（Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．２００８．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：２２５９－６６；Ｌａｒｒｏｙ，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１４３－１４４：２２９－３８；Ｌａｒｒｏｙ，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：５７３８－４５）は、初期ＢＩＡ経路における中間体の多くを望ましくない産物に変換するように作用し、合成経路からフラックスを反らし得る、主な内因性経路である。
さらに、本明細書に考察するような、及び表２に提供するような酵素の多くは、異種酵母宿主に移る際に失われ得る、天然型植物宿主における空間的制御を含む、非常に特異的な制御戦略下で機能し得る。加えて、植物は、ｐＨ、酸化還元条件、基質、補助基質、補酵素、補因子の利用可能性を含む、酵素が機能するように進化した酵母細胞とは非常に異なる生化学環境を提示する。天然型宿主及び異種酵母宿主間の生化学環境及び制御戦略における差異を考慮すると、酵母環境上で酵素が実質的な活性を呈し得ることは明らかではなく、それらが一緒に機能して、糖などの単純な前駆体を複雑なＢＩＡ化合物へと指向させるかはさらに明らかでない。酵母宿主において酵素の活性を維持することは、経路の多くが、多くの（１０工程より多い）反応工程を有するために、特に重要である。これらの工程が有効でない場合、所望の下流産物の蓄積は、期待できないだろう。
加えて、天然型植物宿主において、これらの経路中の関連する代謝産物は、異なる細胞及び組織タイプにわたって局在化され得る。いくつかの例では、生合成に特化し得る細胞型及び代謝産物蓄積のために合成され得る細胞型が存在する。このタイプの細胞の特殊化は、異種酵母宿主内で経路を発現するときに失われる可能性があり、細胞に及ぼすこれらの代謝産物の毒性を制御するのに重要な役割を果たす可能性がある。したがって、これらの化合物の毒性に害されることなく、これらの代謝産物を生合成及び蓄積するように酵母がうまく遺伝子操作され得ることは明らかではない。
１つの例として、天然型植物宿主では、酵素ＢＢＥは、動的な細胞内局在化を有すると報告されている。具体的には、酵素ＢＢＥは、ＥＲにて最初始まり、その後、液胞へとソートされる（Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２００１．Ｐｌａｎｔａ．２１３：８８８－９７）。植物におけるＢＢＥのＥＲ関連（Ａｌｃａｎｔａｒａ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３８：１７３－８３）が、ＢＢＥ活性のために最適な塩基ｐＨ（ｐＨ約８．８）を提供することが示されている（Ｚｉｅｇｌｅｒ ａｎｄ Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２００８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．５９：７３５－６９）。別の例として、植物細胞内の特殊化した小胞においてサンギナリン生合成が生じることが証明されている（Ａｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｐｌａｎｔａ．１６７：３１０－２０）が、中間体のうちのいくつかのみが小胞中に蓄積する。これは、それらを他の酵素活性及び／または毒性効果から隔絶するために生じ得る。
別の例として、モルフィナン経路枝における生合成酵素は全て、植物の維管束組織の一部である篩部に局在化している。篩部では、経路酵素は、２つの細胞型：全ての植物に共通である篩要素、及び特殊化した二次代謝産物を作製するある特定の植物においてのみ存在する特殊化した細胞型である乳管の間でさらに分割され得る。上流酵素（すなわち、ＮＣＳからＳａｌＡＴまで）は、主として篩要素内にあり、下流酵素（すなわち、Ｔ６ＯＤＭ、ＣＯＲ、ＣＯＤＭ）は、ほとんどが乳管内にある（Ｏｎｏｙｏｖｗｅ，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．２５：４１１０－２２）。加えて、ノスカピン生合成経路における最終工程が乳管において発生することが発見された（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２０１４．Ｐｌａｎｔ Ｊ．７７：１７３－８４）。この区画化は、中間体を単離するまたは追跡すること、最適なｐＨを提供すること、補因子の供給を増強することにより生合成を制御することにおいて非常に重要であると考えられるが、ケシの乳管微小環境の性質は、まだ調査中である（Ｚｉｅｇｌｅｒ ａｎｄ Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２００８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．５９：７３５－６９）。さらに、酵素のいくつかが、植物二次代謝に共通する多酵素複合体または代謝チャネルとして機能し得ると予期される（Ｋｅｍｐｅ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７０：５７９－８９；Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１５５９－６６）。生合成酵素が、異なる宿主から組み合わされる及び／または異種酵母細胞において組換えて発現されるとき、これらの複合体またはチャネルが、天然型宿主と同様に形成し得るかは明らかでない。追加の例では、キクバオウレンにおいて、ベルベリンは、根組織において生合成され、次いで、特殊化したＡＴＰ結合カセット輸送タンパク質の作用を介して根茎内に蓄積される（Ｓｈｉｔａｎ，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９１：１０９－１６）。ケシでは、モルフィナンアルカロイドは、ラテックス（乳管細胞の細胞質）内に蓄積する（Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．１９６７．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６：２３５５－６３）。
さらに、これらを考慮せずとも、本明細書に記載の経路の工程のいくつかに関する植物酵素がまだ特徴決定されていない場合もある。例えば、初期ベンジルイソキノリンアルカロイド骨格ノルコクラウリンへのチロシンの変換は、まだ特徴決定されていない。加えて、（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンの変換は、本明細書に記載のようにほんの最近になって特徴決定された。ゆえに、本明細書中に記載される経路の工程のいくつかでは、代替の生合成スキームを、ＢＩＡの生合成のために天然には通常一緒に生じない酵素活性を合わせるかまたは再構築された経路において使用するためにゲノム配列情報から新しい酵素活性を同定することにより産生した。
例えば、チロシンのドパミンへの２工程変換は、少なくとも５種の哺乳類酵素及び１種の細菌酵素を組み合わせることにより達成され得、これらは、天然には一緒に存在せず、かつこの経路上でまたは植物酵素で機能するようには発達していない。これらの例では、それに対して天然には進化しなかった化合物の生合成のためにこれらの酵素を使用すること及びこれらの酵素が異種微生物宿主及びこの経路上で効果的に機能し得ることは明白でない可能性がある。別の例として、（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンの変換を担う酵素は不明であった。本明細書に考察する新規の酵素は、酵母及び合成ＢＩＡ経路上でこのエピマー化反応を行い得る。これは、新しい酵素の発見を表すため、これらのＢＩＡ化合物の合成のための経路上でこの酵素を使用することは明らかではなかっただろう。
目的のＢＩＡ及び／または目的の酵素を産生するための改変の対象である遺伝子の例を以下に記載する。加えて、遺伝子は、目的のＢＩＡ及び／または目的の酵素の生成において使用される経路を示す一連の図に関して記載される。
［ＴＬＫ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素トランスケトラーゼの発現を改変し得る。トランスケトラーゼは、ＴＫＬ１遺伝子によりコードされる。例では、トランスケトラーゼは、図２に参照されるように、フルクトース－６－リン酸＋グリセルアルデヒド－３－リン酸⇔キシルロース－５－リン酸＋エリトロース－４－リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＫＬ１遺伝子の構成的過剰発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＫＬ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＫＬ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＴＫＬ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＴＫＬ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＴＫＬ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＺＷＦ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは、ＺＷＦ１遺伝子によりコードされる。例では、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは、図２に参照されるように、グルコース－６－リン酸→６－ホスホグルコノラクトンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＺＷＦ１遺伝子のコード領域を欠失させ得る。あるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、不活性化突然変異を導入することなどにより、ＺＷＦ１遺伝子の機能性を無効にし得る。
［ＡＲＯ４］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソン酸－７－リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼの発現を改変し得る。ＤＡＨＰシンターゼは、ＡＲＯ４遺伝子によりコードされる。例では、ＤＡＨＰシンターゼは、図２に参照されるように、エリトロース－４－リン酸＋ホスホエノールピルビン酸→ＤＡＨＰの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、ＡＲＯ４遺伝子を改変して、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異を取り込み得る。具体的には、フィードバック阻害軽減突然変異（例えば、ＡＲＯ４ＦＢＲ）は、元来の遺伝子座での天然型ＡＲＯ４遺伝子に対する定向突然変異として；別の遺伝子座での遺伝子組込みとして導入される追加のコピーとして；またはエピソーマルベクター、例えば２－μｍもしくは動原体プラスミド上の追加のコピーとして、取り込まれ得る。突然変異ＡＲＯ４ＦＢＲにおける識別子「ＦＢＲ」は、フィードバック耐性突然変異体及び突然変異を指す。ＤＡＨＰシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、天然の酵母転写制御下にあり得、例えば、遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞であるときである。あるいは、ＤＡＨＰシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、それを合成のプロモーターの制御下に置くことで、タンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的制御と共に遺伝子操作された宿主細胞に導入され得る。いくつかの場合では、ＡＲＯ４遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエに由来し得る。いくつかの場合では、ＡＲＯ４遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。ＡＲＯ４遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性突然変異、Ｋ２２９Ｌ、またはＱ１６６Ｋが挙げられる。
［ＡＲＯ７］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コリスミ酸ムターゼの発現を改変し得る。コリスミ酸ムターゼは、ＡＲＯ７遺伝子によりコードされる。例では、コリスミ酸ムターゼは、図２に参照されるように、コリスミ酸→プレフェナートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、ＡＲＯ７遺伝子を改変して、１つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異を取り込み得る。具体的には、フィードバック阻害軽減突然変異（例えば、ＡＲＯ７ＦＢＲ）は、元来の遺伝子座での天然型ＡＲＯ７遺伝子に対する定向突然変異として；別の遺伝子座での遺伝子組込みとして導入される追加のコピーとして；またはエピソーマルベクター、例えば２－μｍもしくは動原体プラスミド上の追加のコピーとして取り込まれ得る。突然変異ＡＲＯ７ＦＢＲにおける識別子「ＦＢＲ」は、フィードバック耐性突然変異体及び突然変異を指す。コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、天然の酵母転写制御下にあり得、例えば、遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞であるときである。あるいは、コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、それを合成のプロモーターの制御下に置くことで、タンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的制御と共に遺伝子操作された宿主細胞に導入され得る。いくつかの場合では、ＡＲＯ７遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエに由来し得る。いくつかの場合では、ＡＲＯ７遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。ＡＲＯ７遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性突然変異であるＴ２２６Ｉが挙げられる。
［ＡＲＯ１０］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの発現を改変し得る。フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＡＲＯ１０遺伝子によりコードされる。例では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、図２に参照されるように、ヒドロキシフェニルピルビン酸→４－ヒドロキシフェニルアセテート（４ＨＰＡ）の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ１０遺伝子の構成的過剰発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ１０遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＲＯ１０遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＡＲＯ１０遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＡＲＯ１０遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＡＲＯ１０遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＡＤＨ２～７、ＳＦＡ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の発現を改変し得る。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、及びＳＦＡ１遺伝子のうちの１つまたは複数によりコードされ得る。例では、アルコールデヒドロゲナーゼは、４ＨＰＡ→チロソールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、及びＳＦＡ１遺伝子のうちの１つまたは複数のコード領域を欠失させ得る。あるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、不活性化突然変異を導入することなどにより、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＤＨ７、及びＳＦＡ１遺伝子のうちの１つまたは複数の機能を無効とし得る。
［ＡＬＤ２～６］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルデヒドオキシダーゼ酵素の発現を改変し得る。アルデヒドオキシダーゼ酵素は、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、及びＡＬＤ６遺伝子のうちの１つまたは複数によりコードされ得る。例では、アルデヒドオキシダーゼは、４ＨＰＡ→ヒドロキシフェニル酢酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、及びＡＬＤ６遺伝子のうちの１つまたは複数のコード領域を欠失させ得る。あるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、不活性化突然変異を導入することなどにより、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、及びＡＬＤ６遺伝子のうちの１つまたは複数の機能を無効とし得る。
［ＡＲＯ９］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を改変し得る。芳香族アミノトランスフェラーゼは、ＡＲＯ９遺伝子によりコードされる。例では、芳香族アミノトランスフェラーゼは、図２に参照されるように、ヒドロキシフェニルピルビン酸＋グルタミメート→チロシン＋α－ケトグルタル酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ９遺伝子の構成的過剰発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＲＯ９遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＲＯ９遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＡＲＯ９遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＡＲＯ９遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＡＲＯ９遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＴＹＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシンキナーゼの発現を改変し得る。チロシナーゼは、ＴＹＲ遺伝子によりコードされる。例では、チロシナーゼは、図２に参照されるように、チロシン→Ｌ－ドパの反応を触媒する。他の例では、チロシナーゼは、Ｌ－ドパ→ドパキノンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＹＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＹＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＹＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＴＹＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＴＹＲ遺伝子は、ラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、アガリクス・ビスプラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＴＹＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＴｙｒＨ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシンヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。チロシンヒドロキシラーゼは、ＴｙｒＨ遺伝子によりコードされる。例では、チロシンヒドロキシラーゼは、図２及び図５に参照されるように、チロシン→Ｌ－ドパの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴｙｒＨ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴｙｒＨ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴｙｒＨ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＴｙｒＨ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＴｙｒＨ遺伝子は、ホモ・サピエンス、ドブネズミ、ハツカネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＴｙｒＨ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＤＯＤＣ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素Ｌ－ドパデカルボキシラーゼの発現を改変し得る。Ｌ－ドパデカルボキシラーゼは、ＤＯＤＣ遺伝子によりコードされる。例では、Ｌ－ドパデカルボキシラーゼは、図２及び図５に参照されるように、Ｌ－ドパ→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＯＤＣ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＯＤＣ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＯＤＣ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＤＯＤＣ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＤＯＤＣ遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ドブネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＤＯＤＣ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＴＹＤＣ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシン／ドパデカルボキシラーゼの発現を改変し得る。チロシン／ドパデカルボキシラーゼは、ＴＹＤＣ遺伝子によりコードされる。例では、チロシン／ドパデカルボキシラーゼは、図２に参照されるように、Ｌ－ドパ→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＹＤＣ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＹＤＣ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＹＤＣ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＴＹＤＣ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＴＹＤＣ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェルまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＴＹＤＣ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＭＡＯ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モノアミンオキシダーゼの発現を改変し得る。モノアミンオキシダーゼは、ＭＡＯ遺伝子によりコードされる。例では、モノアミンオキシダーゼは、図２に参照されるように、ドパミン→３，４－ＤＨＰＡの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＡＯ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＡＯ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＭＡＯ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＭＡＯ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＭＡＯ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＭＡＯ遺伝子は、大腸菌、ホモ・サピエンス、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＭＡＯ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７７％同様である。
［ＮＣＳ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリンシンターゼの発現を改変し得る。ノルコクラウリンシンターゼは、ＮＣＳ遺伝子によりコードされる。例では、ノルコクラウリンシンターゼは、図５に参照されるように、４ＨＰＡ＋ドパミン→（Ｓ）－ノルコクラウリンの反応を触媒する。具体的には、図５は、本発明の実施形態に係る、ノルコクラウリンを介するレチクリンへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。図５は、酵素ＴｙｒＨ、チロシンヒドロキシラーゼ；ＤＯＤＣ、ドパデカルボキシラーゼ；本明細書に記載のような、ＮＣＳ、ノルコクラウリンシンターゼ；６ＯＭＴ、６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＮＭＴ、コクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＹＰ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０ ＮＡＤＰＨレダクターゼ；４’ＯＭＴ、３’ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ．Ｌ－ドパ、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン；及び４－ＨＰＡ、４－ヒドロキシフェニルアセチルアルデヒドの使用を提供する。図５に示される酵素の中で、４－ＨＰＡ及びＬ－チロシンは、酵母において天然に合成される。示される全ての他の代謝産物は、酵母において天然に産生されない。加えて、ＴｙｒＨは、Ｌ－ドパへのＬ－チロシンの変換を触媒すると示されるが、本明細書に記載のように、他の酵素を使用してこの工程を行ってもよい。例えば、チロシナーゼを使用して、Ｌ－ドパへのＬ－チロシンの変換を行ってもよい。加えて、シトクロムＰ４５０オキシダーゼなどの他の酵素を使用して、Ｌ－ドパへのＬ－チロシンの変換を行ってもよい。このような酵素は、Ｌ－ドパ及びＬ－チロシンを含む関連するＢＩＡ前駆体化合物上でオキシダーゼ活性を呈し得る。
加えて、ノルコクラウリンシンターゼは、図６に参照されるように、３，４－ＤＨＰＡ＋ドパミン→（Ｓ）－ノルラウダノソリンの反応を触媒する。具体的には、図６は、本発明の実施形態に係る、ノルラウダノソリンを介するレチクリンへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。図６は、酵素ＴｙｒＨ、チロシンヒドロキシラーゼ；ＤＯＤＣ、ドパデカルボキシラーゼ；ｍａｏＡ、モノアミンオキシダーゼ；ＮＣＳ、ノルコクラウリンシンターゼ；６ＯＭＴ、６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＮＭＴ、コクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ；４’ＯＭＴ、３’ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ．Ｌ－ドパ、Ｌ－３、４－ジヒドロキシフェニルアラニン；及び３，４－ＤＨＰＡ、３，４－ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドの使用を提供する。図６に示す酵素の中で、Ｌ－チロシンは、酵母において天然に合成される。図６に示される他の代謝産物は、酵母において天然に産生されない。
遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＮＣＳ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＮＣＳ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＮＣＳ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＮＣＳ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。加えて、ノルコクラウリンシンターゼは、Ｎ末端が切断短縮されていてよい。いくつかの場合では、ＮＣＳ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＮＣＳ遺伝子は、キクバオウレン、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル・ブラクテアタム（Ｐａｐｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、タリクトラム・フラブム、コリダリス・サキシコラ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｓａｘｉｃｏｌａ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＮＣＳ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して８０％同様である。
［６ＯＭＴ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、６ＯＭＴ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、図５に参照されるように、ノルコクラウリン→コクラウリンの反応を触媒する。他の例では、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、ノルラウダノソリン→３’ヒドロキシコクラウリンの反応、ならびに図６に提示されるものなどの、本明細書に詳述される他の反応を触媒する。加えて、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞における６ＯＭＴ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞における６ＯＭＴ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、６ＯＭＴ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内での６ＯＭＴ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。６ＯＭＴ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、Ｔ．フラブム、キクバオウレン、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、６ＯＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＣＮＭＴ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、ＣＮＭＴ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、図５に参照されるように、コクラウリン→Ｎ－メチルコクラウリンの反応を触媒する。他の例では、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、３’ヒドロキシコクラウリン→３’ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリンの反応を触媒し得る。他の例では、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、図６に提示されるものなどの、本明細書に詳述される他の反応を触媒し得る。加えて、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＮＭＴ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＮＭＴ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＮＭＴ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＮＭＴ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＣＮＭＴ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、Ｔ．フラブム、キクバオウレン、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＮＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［４’ＯＭＴ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、４’ＯＭＴ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、図５に参照されるように、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン→レチクリンの反応を触媒する。他の例では、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、図６に提示されるものなどの、本明細書に詳述される他の反応を触媒する。加えて、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞における４’ＯＭＴ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞における４’ＯＭＴ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、４’ＯＭＴ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内での４’ＯＭＴ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。４’ＯＭＴ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、Ｔ．フラブム、キクバオウレン、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、４’ＯＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＣＹＰ８０Ｂ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１の発現を改変し得る。シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１は、ＣＹＰ８０Ｂ１遺伝子によりコードされる。例では、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１は、図５に参照されるように、Ｎ－メチルコクラウリン→３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるシトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるシトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのシトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＹＰ８０Ｂ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、ハナビシソウ（Ｅ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、Ｔ．フラブム、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、Ｐ４５０ ８０Ｂ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７７％同様である。
［ＦＯＬ２］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ＧＴＰシクロヒドロラーゼの発現を改変し得る。ＧＴＰシクロヒドロラーゼは、ＦＯＬ２遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、ＧＴＰシクロヒドロラーゼは、図１に参照されるように、ＧＴＰ→ジヒドロネオプテリン三リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＦＯＬ２遺伝子の構成的過剰発現を含んでよい。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、天然制御を含んでもよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＦＯＬ２遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＦＯＬ２遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＦＯＬ２遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＦＯＬ２遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ、ホモ・サピエンス、ハツカネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＦＯＬ２遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＰＴＰＳ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素６－ピルボイルテトラヒドロビオプテリン（ＰＴＰ）シンターゼの発現を改変し得る。ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、ＰＴＰＳ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、６－ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、図１に参照されるように、ジヒドロネオプテリン三リン酸→ＰＴＰの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＴＰＳ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＴＰＳ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＴＰＳ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＰＴＰＳ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＰＴＰＳ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＰＴＰＳ遺伝子は、ドブネズミ、ホモ・サピエンス、ハツカネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＰＴＰＳ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して８０％同様である。
［ＳｅｐＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素セピアプテリンレダクターゼの発現を改変し得る。セピアプテリンレダクターゼは、ＳｅｐＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、セピアプテリンレダクターゼは、図１に参照されるように、ＰＴＰ→ＢＨ４の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳｅｐＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳｅｐＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳｅｐＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳｅｐＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＳｅｐＲ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＳｅｐＲ遺伝子は、ドブネズミ、ホモ・サピエンス、ハツカネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳｅｐＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７２％同様であり得る。
［ＰＣＤ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素４ａ－ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン（プテリン－４α－カルビノールアミン）デヒドラターゼの発現を改変し得る。４ａ－ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、ＰＣＤ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、４ａ－ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、図１に参照されるように、４ａ－ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン→Ｈ２Ｏ＋キノノイドジヒドロプテリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＣＤ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＣＤ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＣＤ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＰＣＤ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＰＣＤ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＰＣＤ遺伝子は、ドブネズミ、ホモ・サピエンス、ハツカネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＰＣＤ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７９％同様であり得る。
［ＱＤＨＰＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼの発現を改変し得る。キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、ＱＤＨＰＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、図１に参照されるように、キノノイドジヒドロプテリジン→ＢＨ４の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＱＤＨＰＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＱＤＨＰＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＱＤＨＰＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＱＤＨＰＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＱＤＨＰＲ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＱＤＨＰＲ遺伝子は、ドブネズミ、ホモ・サピエンス、ハツカネズミ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＱＤＨＰＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７５％同様であり得る。
［ＤＨＦＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現を改変し得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼは、ＤＨＦＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、ジヒドロ葉酸レダクターゼは、図１に参照されるように、７，８－ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）→５，６，７，８－テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の反応を触媒する。この反応は、図５に示すように、Ｌ－ドパへのチロシンの変換のための補助基質としてＢＨ４を回収することにおいて有用であり得る。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＨＦＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＤＨＦＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＤＨＦＲ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＤＨＦＲ遺伝子は、ドブネズミ、ホモ・サピエンス、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＤＨＦＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７７％同様である。
［ＣＹＰ－ＣＯＲ］１－ＢＩＡのエピマー化に関して上述するように、遺伝子操作された宿主細胞は、ＢＩＡエピメラーゼの発現を改変し得る。ＢＩＡエピメラーゼは、ＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子（例えば、ＣＹＰ８２Ｙ２－ＣＯＲ遺伝子）によりコードされる。いくつかの例では、ＣＹＰ－ＣＯＲは、ＤＲＳ－ＤＲＲとも称されてよい。いくつかの例では、ＢＩＡエピメラーゼは、図７に参照されるように、（Ｓ）－１－ＢＩＡ→（Ｒ）－１－ＢＩＡの変換を触媒する。具体的には、図７は、本発明の実施形態に係る、モルフィナンアルカロイドへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。図７は、酵素ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ；ＣＹＰ－ＣＯＲ、シトクロムＰ４５０ ＣＹＰ８２Ｙ１様コデイノンレダクターゼ様融合体；ＳａｌＳｙｎ、サルタリジンシンターゼ；ＳａｌＲ、サルタリジンレダクターゼ；ＳａｌＡＴ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ；Ｔ６ＯＤＭ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素；ＣＯＲ、コデイノンレダクターゼ；及びＣＯＤＭ、コデイン－Ｏ－脱メチル化酵素の使用を提供する。
遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子は、パパヴェル・ブラクテアタム、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル・セチゲラム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｅｔｉｇｅｒｕｍ）、ケリドニウム・マジャス（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ ｍａｊｕｓ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＹＰ－ＣＯＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７７％同様である。
［ＣＰＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムＰ４５０レダクターゼの発現を改変し得る。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＣＰＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、図７に参照されるように、（Ｒ）－レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。加えて、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、本明細書を通して図に記載のものなどの他の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＰＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＰＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＰＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＰＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＣＰＲ遺伝子は、ハナビシソウ、Ｐ．ソムニフェルム、Ｈ．サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｓ．セレビシエ、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＰＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＳａｌＳｙｎ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンシンターゼの発現を改変し得る。サルタリジンシンターゼは、ＳａｌＳｙｎ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、サルタリジンシンターゼは、図７に参照されるように、（Ｒ）－レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳａｌＳｙｎ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳａｌＳｙｎ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳａｌＳｙｎ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳａｌＳｙｎ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＳａｌＳｙｎ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの例では、ＳａｌＳｙｎは、Ｎ末端で改変されてよい。ＳａｌＳｙｎ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル属（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｐｐ）、ケリドニウム・マジャス、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳａｌＳｙｎ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７８％同様であり得る。
［ＳａｌＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンレダクターゼの発現を改変し得る。サルタリジンレダクターゼは、ＳａｌＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、サルタリジンレダクターゼは、図７に参照されるように、サルタリジノール→サルタリジンの反応を可逆的に触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳａｌＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳａｌＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳａｌＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳａｌＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＳａｌＲ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＳａｌＲ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル・ブラクテアタム、パパヴェル属、ケリドニウム・マジャス、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳａｌＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して８０～１００％同様であり得る。
［ＳａｌＡＴ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素アセチル－ＣｏＡ：サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。アセチル－ＣｏＡ：サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼは、ＳａｌＡＴ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、アセチル－ＣｏＡ：サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼは、図７に参照されるように、アセチル－ＣｏＡ＋サルタリジノール→ＣｏＡ＋７－Ｏ－アセチルサルタリジノールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳａｌＡＴ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳａｌＡＴ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳａｌＡＴ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳａｌＡＴ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＳａｌＡＴ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＳａｌＡＴ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル・ブラクテアタム、パパヴェル・オリエンタレ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、パパヴェル属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳａｌＡＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７７～８０％同様であり得る。
［Ｔ６ＯＤＭ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素の発現を改変し得る。テバイン６－Ｏ脱メチル化酵素は、Ｔ６ＯＤＭ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素は、図７に参照されるように、テバイン→ネオピノンの反応を触媒する。一度ネオピノンが産生されると、ネオピノンは、コデイノンへと変換され得る。ネオピノン→コデイノンの変換は自然発生的に生じ得る。あるいは、ネオピノン→コデイノンの変換は、触媒された反応の結果として生じ得る。他の例では、Ｔ６ＯＤＭ酵素は、テバイン以外の基質のＯ－脱メチル化を触媒し得る。例えば、Ｔ６ＯＤＭは、オリパビンをＯ－脱メチル化して、モルフィノンを産生し得る。あるいは、Ｔ６ＯＤＭは、１－ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、またはプロトピンクラス、例えば、それぞれ、パパベリン、カナジン、及びアロクリプトピン内のＢＩＡのＯ－脱メチル化を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴ６ＯＤＭ遺伝子の構成的発現を含んでよい。ｏ加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴ６ＯＤＭ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、Ｔ６ＯＤＭ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＴ６ＯＤＭ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、Ｔ６ＯＤＭ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。Ｔ６ＯＤＭ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、Ｔ６ＯＤＭ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７６．２％同様であり得る。
［ＣＯＲ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデイノンレダクターゼの発現を改変し得る。コデイノンレダクターゼは、ＣＯＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、コデイノンレダクターゼは、図７に参照されるように、コデイノンのコデインへの反応を触媒する。いくつかの場合では、コデイノンレダクターゼは、ネオピノンのネオピンへの反応を触媒することができる。他の例では、ＣＯＲは、ヒドロコドン→ジヒドロコデイン、１４－ヒドロキシコデイノン→１４－ヒドロキシコデイン、及びヒドロモルフォン→ジヒドロモルヒネを含む他のモルフィナンの還元を触媒することができる。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＯＲ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＯＲ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＯＲ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＯＲ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＯＲ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。加えてまたはあるいは、ＣＯＲ遺伝子は、ミトコンドリア、液胞、小胞体、またはそれらの組み合わせに対する標的化配列の付加を用いて改変され得る。ＣＯＲ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＯＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７６～７８％同様であり得る。例では、ＣＯＲ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７６．８％、７７．０％、７７．３％、または７７．７％同様であり得る。
［ＣＯＤＭ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデインＯ－脱メチル化酵素の発現を改変し得る。コデインＯ－脱メチル化酵素は、ＣＯＤＭ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、コデインＯ－脱メチル化酵素は、図７に参照されるように、コデインのモルヒネへの反応を触媒する。コデインＯ－脱メチル化酵素は、ネオピンのネオモルフィンへの反応も触媒することができる。コデインＯ－脱メチル化酵素は、テバインのオリパビンへの反応も触媒することができる。他の例では、ＣＯＤＭは、１－ベンジルイソキノリン、アポルフィン、及びプロトベルベリンクラス、例えば、それぞれレチクリン、イソコリジン、及びスコウレリン内でＢＩＡのＯ－脱メチル化を触媒し得る。他の例では、ＣＯＤＭ酵素は、Ｏ，Ｏ－脱メチレン化反応を触媒して、プロトピンにおけるメチレンジオキシ架橋構造を切断し得る。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＯＤＭ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＯＤＭ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＯＤＭ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＯＤＭ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＯＤＭ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。加えてまたはあるいは、ＣＯＤＭ遺伝子は、ミトコンドリアに対する標的化配列の付加を用いて改変され得る。ＣＯＤＭ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＯＤＭ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７５％同様であり得る。例では、ＣＯＤＭ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７５．２％同様であり得る。
［ＢＢＥ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ベルベリン架橋酵素の発現を改変し得る。ベルベリン架橋酵素は、ＢＢＥ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、ベルベリン架橋酵素は、図８に参照されるように、（Ｓ）－レチクリン→（Ｓ）－スコウレリンの反応を触媒する。図８は、本発明の実施形態に係るプロトベルベリンアルカロイドへの、Ｌ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。具体的には、図８は、酵素ＢＢＥ、ベルベリン架橋酵素；Ｓ９ＯＭＴ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＡＳ、カナジンシンターゼ；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ；及びＳＴＯＸ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼの使用を提供する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＢＢＥ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＢＢＥ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＢＢＥ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＢＢＥ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＢＢＥ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、アザミゲシ、ハナビシソウ、ベルベリス・ストロニフェラ、タリクトラム・フラブム亜種グラウカム（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｆｌａｖｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、キクバオウレン、パパヴェル属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＢＢＥ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して９９％同様であり得る。
［Ｓ９ＯＭＴ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン：（Ｓ）－スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン：（Ｓ）－スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン：（Ｓ）－スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、図８に参照されるように、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン＋（Ｓ）－スコウレリン→Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン＋（Ｓ）－テトラヒドロコルンバミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳ９ＯＭＴ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳ９ＯＭＴ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳ９ＯＭＴ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。Ｓ９ＯＭＴ遺伝子は、タリクトラム・フラブム亜種グラウカム、キクバオウレン、トウオウレン、パパヴェル・ソムニフェル、タリクトラム属、オウレン属（Ｃｏｐｔｉｓ ｓｐｐ．）、パパヴェル属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。例では、Ｓ９ＯＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して８０％同様である。
［ＣＡＳ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素（Ｓ）－カナジンシンターゼの発現を改変し得る。（Ｓ）－カナジンシンターゼは、ＣＡＳ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、（Ｓ）－カナジンシンターゼは、図８に参照されるように、（Ｓ）－テトラヒドロコルンバミン→（Ｓ）－カナジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞においてＣＡＳ遺伝子を発現してよい。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＡＳ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＡＳ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＡＳ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＡＳ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよいＣＡＳ遺伝子は、タリクトラム・フラブム亜種グラウカム、キクバオウレン、タリクトラム属、オウレン属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＡＳ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。
［ＳＴＯＸ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素（Ｓ）－テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼの発現を改変し得る。（Ｓ）－テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼは、ＳＴＯＸ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、（Ｓ）－テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼは、図８に参照されるように、（Ｓ）－テトラヒドロベルベリン＋２Ｏ２→ベルベリン＋２Ｈ２Ｏ２の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＴＯＸ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＴＯＸ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳＴＯＸ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳＴＯＸ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの例では、ＳＴＯＸは、Ｎ末端で改変されてよい。いくつかの場合では、ＳＴＯＸ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＳＴＯＸ遺伝子は、ベルベリス・ウィルソナエ、キクバオウレン、ベルベリス属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｓｐｐ．）、オウレン属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳＴＯＸ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７８％同様であり得る。
［ＴＮＭＴ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、ＴＮＭＴ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、図９に参照されるように、カナジン→Ｎ－メチルカナジンの反応を触媒する。図９は、本発明の実施形態に係る、ノスカピン、ノスカピノイド、及びフタリドイソキノリンへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。具体的には、図９は、酵素ＢＢＥ、ベルベリン架橋酵素；Ｓ９ＯＭＴ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＡＳ、カナジンシンターゼ；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ；ＴＮＭＴ、テトラヒドロプロトベルベリンシス－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＹＰ８２Ｙ１、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ；ＣＹＰ８２Ｘ２、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ；ＡＴ１、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカンジン１３－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ；ＣＹＰ８２Ｘ１、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ；ＣＸＥ１、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ；ＮＯＳ（またはＳＤＲ１）、ノスカピンシンターゼ；ＭＴ２、ナルコトリン－４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ｔｒａｓｎｆｅｒａｓｅ）１；ＭＴ３、ナルコトリン－４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ２；及び６ＯＭＴ、６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの使用を提供する。
他の例では、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、図１０に参照されるように、スチロピン→シス－Ｎ－メチルスチロピンの反応を触媒する。図１０は、本発明の実施形態に係る、サンギナリン及びベンゾフェナントリジンアルカロイドへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキームを示す。具体的には、図１０は、酵素ＢＢＥ、ベルベリン架橋酵素；ＣＦＳ、ケイランチホリンシンターゼ；ＳＴＳ、スチロピンシンターゼ；ＴＮＭＴ、テトラヒドロベルベリンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＭＳＨ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ；Ｐ６Ｈ、プロトピン６－ヒドロキシラーゼ；及びＤＢＯＸ、ジヒドロベンゾフェナントリド（ｂｅｎｚｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｅ）オキシダーゼの使用を提供する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＮＭＴ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＴＮＭＴ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＴＮＭＴ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＴＮＭＴ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＴＮＭＴ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＴＮＭＴ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、ハナビシソウ、パパヴェル・ブラクテアタム、アザミゲシ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＴＮＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。例では、ＴＮＭＴ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して８１％同様であり得る。
［ＣＹＰ８２Ｙ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼは、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼは、図９に参照されるように、Ｎ－メチルカナジン→１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｙ１は、Ｎ末端で改変されてよい。ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル属、エダウチオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｒｅｎａｒｉａ）、ラウオルフィア・ヘテロフィラ（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、アドルミア・フンゴサ（Ａｄｌｕｍｉａ ｆｕｎｇｏｓａ）、ヒドラスチス・カナデンシス（Ｈｙｄｒａｓｔｉｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、スティロメコン・ヘテロフィラ（Ｓｔｙｌｏｍｅｃｏｎ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、ヒペコウム属（Ｈｙｐｅｃｏｕｍ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｙ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７０～７８％同様であり得る。
［ＣＹＰ８２Ｘ２］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼは、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼは、図９に参照されるように、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン→１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルオフィオカルピン（すなわち１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン）の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ２は、Ｎ末端で改変されてよい。ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、パパヴェル属、エダウチオオバコ、ラウオルフィア・ヘテロフィラ、アドルミア・フンゴサ、ヒドラスチス・カナデンシス、スティロメコン・ヘテロフィラ、ダクティリカプノス・トルロサ（Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｔｏｒｕｌｏｓａ）、グラウシウム・フラブム（Ｇｌａｕｃｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ベルベリス・ラウリナ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ｌａｕｒｉｎａ）、Ｂ．バルガリス（Ｂ．Ｖｕｌｇａｒｉｓ）、コリダリス属（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｓｐｐ）、フマリア属（Ｆｕｍａｒｉａ ｓｐｐ）、ダクティリカプノス属（Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｐｐ．）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７０～７７％同様であり得る。他の例では、ＣＹＰ８２Ｘ２遺伝子は、Ｎ末端遺伝子操作を受け得る。例では、Ｎ末端遺伝子操作は、Ｎ末端切断短縮を含み得る。
［ＣＹＰ８２Ｘ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼの発現を改変し得る。４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼは、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼは、図９に参照されるように、１－ヒドロキシ－１３－Ｏ－アセチル－Ｎ－メチルカナジン→４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンの反応を触媒する。加えて、ＣＹＰ８２Ｘ１は、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン→４’－Ｏ－デスメチルマクラントアルデヒドの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ１は、Ｎ末端で改変されてよい。ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェル、パパヴェル属、エダウチオオバコ、ラウオルフィア・ヘテロフィラ、アドルミア・フンゴサ、ヒドラスチス・カナデンシス、スティロメコン・ヘテロフィラ、ヒペコウム属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７１～７７％同様であり得る。他の例では、ＣＹＰ８２Ｘ１遺伝子は、Ｎ末端遺伝子操作を受け得る。例では、Ｎ末端遺伝子操作は、Ｎ末端切断短縮を含み得る。
［ＣＦＳ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ケイランチホリンシンターゼの発現を改変し得る。ケイランチホリンシンターゼは、ＣＦＳ遺伝子によりコードされる。例では、ケイランチホリンシンターゼは、図１０に参照されるように、スコウレリン→ケイランチホリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＦＳ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＦＳ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＦＳ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＦＳ遺伝の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＣＦＳ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、ハナビシソウ、アザミゲシ（Ａ．ｍｅｘｉｃａｎａ）、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＦＳ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７７％、７８％、または７９％同様であり得る。加えて、ＣＦＳ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。
［ＳＴＳ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素スチロピンシンターゼの発現を改変し得る。スチロピンシンターゼは、ＳＴＳ遺伝子によりコードされる。例では、スチロピンシンターゼは、図１０に参照されるように、ケイランチホリン→スチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＴＳ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＴＳ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳＴＳ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳＴＳ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＳＴＳ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、ハナビシソウ、アザミゲシ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳＴＳ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７６％、７８％、または７９％同様であり得る。加えて、ＳＴＳ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。
［ＭＳＨ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼは、ＭＳＨ遺伝子によりコードされる。例では、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼは、図１０に参照されるように、シス－Ｎ－メチルスチロピン→プロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＳＨ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＳＨ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＭＳＨ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＭＳＨ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＭＳＨ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルムまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＭＳＨ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７９％同様であり得る。加えて、ＭＳＨ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。
［Ｐ６Ｈ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素プロトピン－６－ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。プロトピン－６－ヒドロキシラーゼは、Ｐ６Ｈ遺伝子によりコードされる。例では、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼは、図１０に参照されるように、プロトピン→６－ヒドロキシプロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰ６Ｈ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰ６Ｈ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、Ｐ６Ｈ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＦＳ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。Ｐ６Ｈ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、ハナビシソウ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、Ｐ６Ｈ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７９％同様であり得る。加えて、Ｐ６Ｈ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。
［ＤＢＯＸ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼの発現を改変し得る。ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼは、ＤＢＯＸ遺伝子によりコードされる。例では、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼは、図１０に参照されるように、ジヒドロサンギナリン→サンギナリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＢＯＸ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＤＢＯＸ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＤＢＯＸ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＤＢＯＸ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。ＤＢＯＸ遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルムまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＤＢＯＸ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して１００％同様であってよい。加えて、ＤＢＯＸ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。
［ＡＴ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼは、ＡＴ１遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼは、図１１Ａに参照されるように、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン→１－ヒドロキシ－１３－Ｏ－アセチル－Ｎ－メチルカナジンの反応を触媒する。図１１Ａは、本発明の実施形態に係る、ノスカピンへのカナジンの変換のための生合成スキームを示す。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＴ１遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＡＴ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＡＴ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＡＴ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＡＴ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＡＴ１遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、パパヴェル属、エダウチオオバコ、ラウオルフィア・ヘテロフィラ、アドルミア・フンゴサ、ヒドラスチス・カナデンシス、スティロメコン・ヘテロフィラ、ヒペコウム・レプトカルプム（Ｈｙｐｅｃｏｕｍ ｌｅｐｔｏｃａｒｐｕｍ）、ダクティリカプノス・トルロサ、グラウシウム・フラブム、ベルベリス・ラウリナ、Ｂ．バルガリス、コリダリス属、フマリア属、ダクティリカプノス属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＡＴ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して８１％同様である。
［ＣＸＥ１またはＣＸＥ２］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ナルコチンヘミアセタールシンターゼの発現を改変し得る。ナルコチンヘミアセタールシンターゼは、ＣＸＥ１遺伝子によりコードされる。ＣＸＥ２遺伝子によりコードされる酵素も、ナルコチンヘミアセタールシンターゼとして機能することができる。いくつかの例では、ナルコチンヘミアセタールシンターゼは、図１１Ａに参照されるように、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン→ナルコトリンヘミアセタール及び３－Ｏ－アセチルパパベロキシン→ナルコチンヘミアセタールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＣＸＥ１またはＣＸＥ２遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、パパヴェル属、エダウチオオバコ、ラウオルフィア・ヘテロフィラ、アドルミア・フンゴサ、ヒドラスチス・カナデンシス、スティロメコン・ヘテロフィラ、ヒペコウム・レプトカルプム、ダクティリカプノス・トルロサ、グラウシウム・フラブム、ベルベリス・ラウリナ、Ｂ．バルガリス、コリダリス属、フマリア属、ダクティリカプノス属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＸＥ１遺伝子またはＣＸＥ２遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７８％同様であり得る。
［ＳＤＲ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノスカピンシンターゼの発現を改変し得る。ノスカピンシンターゼは、ＳＤＲ１遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、ノスカピンシンターゼは、図１１Ａに参照されるように、ナルコトリンヘミアセタール→ナルコトリンの反応を触媒する。加えて、ノスカピンシンターゼは、ナルコチンヘミアセタール→ノスカピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＤＲ１遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＳＤＲ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＳＤＲ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＳＤＲ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＳＤＲ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＳＤＲ１遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、パパヴェル属、エダウチオオバコ、ラウオルフィア・ヘテロフィラ、アドルミア・フンゴサ、ヒドラスチス・カナデンシス、スティロメコン・ヘテロフィラ、ヒペコウム・レプトカルプム、ダクティリカプノス・トルロサ、グラウシウム・フラブム、ベルベリス・ラウリナ、Ｂ．バルガリス、コリダリス属、フマリア属、ダクティリカプノス属、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＳＤＲ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７９％同様であり得る。
［ＭＴ２及びＭＴ３］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼの発現を改変し得る。ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼは、ＭＴ２及びＭＴ３遺伝子によりコードされるＯ－メチルトランスフェラーゼモノマーにより形成されるヘテロ二量体である。いくつかの例では、ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼは、図１１Ａに参照されるように、ナルコトリン→ノスカピンの反応を触媒する。加えて、ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼは、ナルコトリンネヘミアセタール（ｎａｒｃｏｔｏｌｉｎｅｎｅｈｅｍｉａｃｅｔａｌ）→ナルコチンヘミアセタール及び４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン→３－Ｏ－アセチルパパベロキシンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＴ２及びＭＴ３遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＭＴ２及びＭＴ３遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＭＴ２及びＭＴ３遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＭＴ２及びＭＴ３遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＭＴ２及びＭＴ３遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＭＴ２及びＭＴ３遺伝子は、Ｐ．ソムニフェルム、パパヴェル属、フマリア・パルビフローラ（Ｆｕｍａｒｉａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）、エダウチオオバコ、ラウオルフィア・ヘテロフィラ、または別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＭＴ２及びＭＴ３遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して、それぞれ８０％及び７９％同様であり得る。
［ｍｏｒＡ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒネデヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。モルヒネデヒドロゲナーゼは、ｍｏｒＡ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、図１１Ｂに参照されるように、モルヒネ→モルフィノンの反応を触媒する。他の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、図１１Ｂに参照されるように、コデイノン→コデインの反応を触媒する。図１１Ｂは、本発明の実施形態に係る、半合成オピオイドの産生のための生合成スキームを示す。具体的には、図１１Ｂは、ｍｏｒＡ、モルヒネデヒドロゲナーゼ；及びｍｏｒＢ、モルヒネレダクターゼを取り込むことによる酵母におけるテバインの拡張した形質転換を示す。
遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるｍｏｒＡ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるｍｏｒＡ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ｍｏｒＡ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのｍｏｒＡ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ｍｏｒＡ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ｍｏｒＡ遺伝子は、シュードモナス・プチダまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ｍｏｒＡ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７３．７％同様であり得る。
［ｍｏｒＢ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルフィノンレダクターゼの発現を改変し得る。モルフィノンレダクターゼは、ｍｏｒＢ遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、モルフィノンレダクターゼは、図１１Ｂに参照されるように、コデイノン→ヒドロコドンの反応を触媒する。他の例では、モルフィノンレダクターゼは、同じく図１１Ｂに参照されるように、モルフィノン→ヒドロモルフォンの反応を触媒する。他の例では、モルフィノンレダクターゼは、反応１４－ヒドロキシコデイノン→オキシコドンを触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるｍｏｒＢ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるｍｏｒＢ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ｍｏｒＢ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのｍｏｒＢ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ｍｏｒＢ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ｍｏｒＢ遺伝子は、シュードモナス・プチダまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ｍｏｒＢ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して６７．２％同様であり得る。
［ＣＹＰ８０Ａ１］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ベルバムニンシンターゼを発現し得る。ベルバムニンシンターゼは、シトクロムＰ４５０酵素８０Ａ１（ＣＹＰ８０Ａ１）のための遺伝子によりコードされる。いくつかの例では、ＣＹＰ８０Ａ１は、反応（Ｓ）－Ｎ－メチルコクラウリン＋（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリン→ベルバムニンを触媒する。他の例では、ＣＹＰ８０Ａ１は、反応（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリン＋（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリン→グアッテガウメリンを触媒する。他の例では、ＣＹＰ８０Ａ１は、反応（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリン＋（Ｓ）－コクラウリン→２’ノルベルバムニンを触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８０Ａ１遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＣＹＰ８０Ａ１遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＣＹＰ８０Ａ１遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＣＹＰ８０Ａ１遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＣＹＰ８０Ａ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＣＹＰ８０Ａ１遺伝子は、ベルベリス・ストロニフェラまたは別の種に由来し得る。いくつかの例では、ＣＹＰ８０Ａ１遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７６％同様であり得る。
［ＰＯＤＡ］いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素プロトピンＯ－デアルキラーゼを発現し得る。プロトピンＯ－デアルキラーゼは、遺伝子ＰＯＤＡによりコードされる。いくつかの例では、ＰＯＤＡは、カナジン、スチロピン、ベルベリン、クリプトピン、アロクリプトピン、及びプロトピンなどのプロトベルベリン及びプロトピンのＯ，Ｏ－脱メチレン化を触媒する。いくつかの例では、ＰＯＤＡは、テトラヒドロパパベリン、テトラヒドロパルマチン、及びクリプトピンを含むＢＩＡのＯ－脱メチル化を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＯＤＡ遺伝子の構成的発現を含んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞におけるＰＯＤＡ遺伝子の発現を合成的に制御してよい。例では、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、ＰＯＤＡ遺伝子の１つもしくは複数のコピー、または追加のコピーを取り込んでよい。加えてまたはあるいは、遺伝子操作された宿主細胞を改変して、遺伝子操作された宿主細胞内でのＰＯＤＡ遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入を取り込んでよい。いくつかの場合では、ＰＯＤＡ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され得る。ＰＯＤＡ遺伝子は、パパヴェル・ソムニフェルまたは他の種に由来し得る。いくつかの例では、ＰＯＤＡ遺伝子は、天然に存在する遺伝子に対して７０～１００％同様であり得る。
前述の遺伝子の例は、プラスミド（２μ、ＡＲＳ／ＣＥＮ）、ＹＡＣ、またはゲノムを含む、宿主細胞におけるいくつかの異なるプラットフォームから発現されることができる。加えて、前述の遺伝子配列の例は、天然型であるかまたは所望の異種宿主（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）における発現のためにコドン最適化されているかのいずれであることもできる。
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を示す目的のために与えられ、いかなる形でも本発明を限定することを意味しない。示される場合、発現構築物は、好適なプロモーター、遺伝子、及びターミネーター取り込み、それは、使用される正確なターミネーター配列が特定されていない場合も含むと理解される。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、目下好ましい実施形態を表しており、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるその中の変化及び他の用途は、当業者に想定されるであろう。
実施例１：チロシンヒドロキシラーゼ突然変異体は遺伝子操作された酵母菌株におけるノルコクラウリン産生を向上させる
ドブネズミ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のチロシンヒドロキシラーゼを、酵母コドン最適化し、合成し、低コピープラスミド中にクローニングした。単一の突然変異体（Ｗ１６６Ｙ、Ｅ３３２Ｄ、Ｓ４０Ｄ及びＲ３７ＥＲ３８Ｅ）、二重突然変異体（Ｗ１６６Ｙ及びＥ３３２Ｄ、Ｗ１６６Ｙ及びＳ４０Ｄ、Ｗ１６６Ｙ及びＲ３７ＥＲ３８Ｅ）、及び１つの三重突然変異体（Ｗ１６６Ｙ、Ｒ３７ＥＲ３８Ｅ、及びＥ３３２Ｄ）を、部位特異的突然変異誘発を通して生成した。各ＴｙｒＨ突然変異体を、中央代謝に以下の突然変異（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載）：ＡＲＯ４ＦＢＲ、ΔＺＷＦ１、及びＧＰＤ－ＴＫＬ１プロモーター置換を含有する酵母菌株中にてＧＰＤプロモーターを有する低コピープラスミドから発現させた。加えて、菌株は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来のドパデカルボキシラーゼ（ＤＯＤＣ）の染色体に組込まれたコピー、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の４つの染色体に組込まれた遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＰＴＰＳ；セピアプテリンレダクターゼ、ＳｅｐＲ；プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素、ＰＣＤ；ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ＱＤＨＰＲ）、及びＧＰＤプロモーターを有する低コピープラスミドから発現されるキクバオウレン（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）を発現した。ＴｙｒＨ突然変異体を有する菌株を、２％デキストロースを有してチロシンを欠く選択規定培地（ＹＮＢ）中で９６時間にわたって増殖させ、ノルコクラウリンの産生を、トランジション２７２ｍ／ｚ～１０７ｍ／ｚでＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して培地中で測定した。図１２は、このアッセイの結果を示し、ＴｙｒＨ突然変異体が、野生型ＴｙｒＨと比較したときにノルコクラウリン産生を、９倍も多く向上させることができることを実証する。このように、図１２は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株における糖からのノルコクラウリン産生を向上させるチロシンヒドロキシラーゼ突然変異体を示す。
実施例２：チロシンヒドロキシラーゼ突然変異体は遺伝子操作された酵母菌株におけるレチクリン産生を向上させる
ドブネズミ由来のチロシンヒドロキシラーゼを、酵母コドン最適化し、合成し、低コピープラスミド中にクローニングした。単一の突然変異体（Ｗ１６６Ｙ、Ｅ３３２Ｄ、Ｓ４０Ｄ及びＲ３７ＥＲ３８Ｅ）、二重突然変異体（Ｗ１６６Ｙ及びＥ３３２Ｄ、Ｗ１６６Ｙ及びＳ４０Ｄ、Ｗ１６６Ｙ及びＲ３７ＥＲ３８Ｅ）、及び１つの三重突然変異体（Ｗ１６６Ｙ、Ｒ３７ＥＲ３８Ｅ、及びＥ３３２Ｄ）を、部位特異的突然変異誘発を通して生成した。各ＴｙｒＨ突然変異体は、中央代謝に以下の突然変異（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載）：ＡＲＯ４ＦＢＲ、ΔＺＷＦ１、及びＧＰＤ－ＴＫＬ１プロモーター置換を含有する酵母菌株中にてＧＰＤプロモーターを有する低コピープラスミドから発現させた。加えて、菌株は、Ｐ．プチダ由来のドパデカルボキシラーゼ（ＤＯＤＣ）の染色体に組込まれたコピー、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の４つの染色体に組込まれた遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＰＴＰＳ；セピアプテリンレダクターゼ、ＳｅｐＲ；プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素、ＰＣＤ；ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ＱＤＨＰＲ）、ＧＰＤプロモーターを有する低コピープラスミドから発現されるキクバオウレン由来のノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）、及びノルコクラウリンからのレチクリンの生合成のための５つの遺伝子（Ｐ．ソムニフェルム ６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、Ｐｓ６ＯＭＴ；Ｐ．ソムニフェルムコクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ、ＰｓＣＮＭＴ；ハナビシソウ シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、ＥｃＣＹＰ８０Ｂ１；Ｐ．ソムニフェルムシトクロムＰ４５０ ＮＡＤＰＨレダクターゼ、ＰｓＣＰＲ；及びＰ．ソムニフェルム ３’ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、Ｐｓ４’ＯＭＴ）を発現した。ＴｙｒＨ突然変異体を有する菌株を、２％デキストロースを有してチロシンを欠く選択規定培地（ＹＮＢ）中で９６時間にわたって増殖させ、レチクリンの産生を、トランジション３３０ｍ／ｚ～１３７ｍ／ｚでＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して培地中で測定した。図１３は、このアッセイの結果を示し、ＴｙｒＨ突然変異体が、野生型ＴｙｒＨと比較したときにレチクリン産生を、５倍も多く向上させることができることを実証する。このように、図１３は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株における糖からのレチクリン産生を向上させるチロシンヒドロキシラーゼ突然変異体を示す。
実施例３：ＤＨＦＲの発現は遺伝子操作された酵母菌株におけるチロシンヒドロキシラーゼ活性を向上させる
ドブネズミ由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を、酵母コドン最適化し、合成し、ＧＰＤプロモーターの制御下で低コピープラスミド中にクローニングした。ＤＨＦＲを、野生型ＲｎＴｙｒＨ（ＧＰＤプロモーターを有する低コピープラスミド）と、中央代謝に以下の突然変異（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載）：ＡＲＯ４ＦＢＲ、ΔＺＷＦ１、及びＧＰＤ－ＴＫＬ１プロモーター置換を含有する酵母菌株中にて共発現させた。加えて、菌株は、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の４つの染色体に組込まれた遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＰＴＰＳ；セピアプテリンレダクターゼ、ＳｅｐＲ；プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素、ＰＣＤ；ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ＱＤＨＰＲ）を発現した。ＤＨＦＲ及び野生型ＲｎＴｙｒＨを発現する菌株を、２％デキストロースを有してチロシンを欠く選択規定培地（ＹＮＢ）中で９６時間にわたって増殖させ、Ｌ－ドパの産生を、トランジション１９８ｍ／ｚ～１５２ｍ／ｚでＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して培地中で測定した。野生型ＲｎＴｙｒＨを伴うＤＨＦＲの発現は、図１４に示すように、Ｌ－ドパ産生を１．８倍増加させる。このように、図１４は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるチロシンヒドロキシラーゼによるＬ－ドパ産生を向上させるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の共発現を示す。
実施例４：増殖培地への抗酸化剤の添加は遺伝子操作された酵母菌株におけるチロシンヒドロキシラーゼ活性を向上させる
中央代謝に以下の突然変異（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載）：ＡＲＯ４ＦＢＲ、ΔＺＷＦ１、及びＧＰＤ－ＴＫＬ１プロモーター置換を含有し、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の４つの染色体に組込まれた遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＰＴＰＳ；セピアプテリンレダクターゼ、ＳｅｐＲ；プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素、ＰＣＤ；ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ＱＤＨＰＲ）ならびにＧＰＤプロモーターの制御下で低コピープラスミドから野生型ＲｎＴｙｒＨを発現する酵母菌株を、２％ガラクトース及び２ｍＭアスコルビン酸を有してチロシンを欠く選択規定培地（ＹＮＢ）中で９６時間にわたって増殖させた。
Ｌ－ドパの産生は、トランジション１９８ｍ／ｚ～１５２ｍ／ｚでＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して培地中で測定した。２ｍＭアスコルビン酸の添加は、野生型ＲｎＴｙｒＨを用いたＬ－ドパ産生を１．８倍向上させる。加えて、濃縮ＢＨ４中間体を、以下のトランジション：Ｂ、２３８ｍ／ｚ～１７８ｍ／ｚ；ＢＨ２、２４０ｍ／ｚ～１６５ｍ／ｚ及びＢＨ４、２４２ｍ／ｚ～１６６ｍ／ｚで、ＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。アスコルビン酸の添加は、培地中のＢＨ４も増加させ、これは、ＢＨ４のＢＨ２への酸化が防がれたことを示す。
したがって、図１５は、本発明の実施形態に係る、（Ａ）遺伝子操作された酵母菌株においてチロシンヒドロキシラーゼによりＬ－ドパ産生を向上させる培地への抗酸化剤の添加及び（Ｂ）ＢＨ４レベルを増加させる培地への抗酸化剤の添加を示す。具体的には、図１５Ａは、野生型ＲｎＴｙｒＨ（ＧＰＤプロモーターの制御下で低コピープラスミドから発現された）が、中央代謝に以下の突然変異（米国仮特許出願番号第６１／８９９，４９６号に記載）：ＡＲＯ４ＦＢＲ、ΔＺＷＦ１、及びＧＰＤ－ＴＫＬ１プロモーター置換を含有する酵母菌株中にて発現されたことを示す。加えて、菌株は、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の４つの染色体に組込まれた遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＰＴＰＳ；セピアプテリンレダクターゼ、ＳｅｐＲ；プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素、ＰＣＤ；ジヒドロプテリジンレダクターゼ、ＱＤＨＰＲ）を発現した。野生型ＲｎＴｙｒＨを発現する菌株を、２％デキストロースを有してチロシンを欠き、２ｍＭアスコルビン酸（ａａ）を有するまたは有さない選択規定培地（ＹＮＢ）中で９６時間にわたって増殖させた。Ｌ－ドパの産生を、トランジション１９８ｍ／ｚ～１５２ｍ／ｚでＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを介して培地中で測定した。加えて、図１５Ｂは、図１５Ａに記載のものと同一の菌株において、以下のトランジション：ＢＨ４、２４２ｍ／ｚ～１６６ｍ／ｚでＭＲＭモードにおいてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて、２ｍＭアスコルビン酸（ａａ）を有してまたは有さずに増殖させた菌株の培地中でＢＨ４中間体の濃度が測定されたことを示す。
実施例５：ビスＢＩＡベルバムニンを産生するように遺伝子操作された酵母菌株
図１６は、本発明の実施形態に係る、（Ａ）ビスＢＩＡへのＬ－チロシンの変換のための生合成スキーム及び（Ｂ）ビスＢＩＡを生合成するように遺伝子操作された酵母菌株を示す。具体的には、図１６（Ａ）は、ビスＢＩＡベルバムニン及びグアッテガウメリンを産生するために使用される経路を示す。図１６は、酵素ＡＲＯ９、芳香族アミノトランスフェラーゼ；ＡＲＯ１０、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｄｅｃａｒｂｏｘｌａｓｅ）；ＴｙｒＨ、チロシンヒドロキシラーゼ；ＤＯＤＣ、ドパデカルボキシラーゼ；ＮＣＳ、ノルコクラウリンシンターゼ；６ＯＭＴ、６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＮＭＴ、コクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＣＹＰ８０Ａ１、シトクロムＰ４５０ ８０Ａ１；ＣＰＲ、シトクロムＰ４５０ ＮＡＤＰＨレダクターゼの使用を提供する。図１６に提供する代謝産物の中で、４－ＨＰＡ、４－ＨＰＰ、及びＬ－チロシンは、酵母において天然に合成される。図１６に示される他の代謝産物は、酵母において天然には合成されない。
本発明の実施例では、（Ａ）に示す経路を使用して生成されるものなどのビスＢＩＡを産生するビスＢＩＡ産生酵母菌株は、単一の構築物を遺伝子座ＹＤＲ５１４Ｃ中に組込むことにより遺伝子操作される。加えて、図１６（Ｂ）は、ビスＢＩＡを合成するように遺伝子操作された酵母菌株の例を提供する。Ｐｓ６ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＰｓＣＰＲ、及びＢｓＣＹＰ８０Ａ１は、酵母ゲノム中に単一の遺伝子座（ＹＤＲ５１４Ｃ）で組込まれた。各酵素は、構成的プロモーターから発現された。遺伝子発現カセットの配置及び転写方向は、模式図の矢印により示される。これらの菌株は、（Ｒ）－及び（Ｓ）－ノルコクラウリンをコクラウリンへと、次いで、Ｎ－メチルコクラウリンへと変換する。一例では、菌株は、（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリンの１分子及び（Ｓ）－Ｎ－メチルコクラウリンの１分子をコンジュゲートして、ベルバムニンを形成し得る。別の例では、菌株は、（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリンの２つの分子をコンジュゲートして、グアッテガウメリンを形成し得る。別の例では、菌株は、（Ｒ）－Ｎ－メチルコクラウリンの１分子及び（Ｓ）－コクラウリンの１分子をコンジュゲートして、２’－ノルベルバムニンを形成し得る。別の実施形態では、菌株は、図５に提示するように、前駆体（Ｒ）－及び（Ｓ）－ノルコクラウリンをＬ－チロシンから提供するように、遺伝子操作され得る。
構築物は、それらの天然型植物ヌクレオチド配列として発現されたＰ．ソムニフェルム酵素６ＯＭＴ及びＣＮＭＴのための発現カセットを含む。Ｐ．ソムニフェルム由来の第三の酵素であるＣＰＲは、酵母における発現のためにコドン最適化されている。ＰｓＣＰＲは、第４の酵素であるベルベリス・ストロニフェラ ＣＹＰ８０Ａ１の活性を支持し、また酵母における発現のためにコドン最適化されている。発現カセットはそれぞれ、特有の酵母構成的プロモーター及びターミネーターを含む。最後に、組込み構築物は、Ｃｒｅリコンビナーゼによる切除のためにｌｏｘＰ部位に隣接するＬＥＵ２選択マーカーを含む。
Ｐｓ６ＯＭＴ、ＰｓＣＮＭＴ、ＢｓＣＹＰ８０Ａ１、及びＰｓＣＰＲを発現する酵母菌株は、選的培地中で１６時間にわたり、３０℃にて振とうさせた状態で培養する。細胞は、遠心分離により回収され、４００μＬ破砕バッファー（１００ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール、１４ｍＭ ２－メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中に再懸濁される。ガラスビーズ及びボルテックスの添加によって細胞を物理的に破壊する。液体を除去し、以下の基質及び補因子：１ｍＭ（Ｒ，Ｓ）－ノルコクラウリン、１０ｍＭ Ｓ－アデノシルメチオニン、２５ｍＭ ＮＡＤＰＨを添加して反応を開始する。粗細胞溶解物を３０℃にて４時間インキュベートし、次いで０．１％酢酸で酸性化したエタノールを１：１で加えることによりクエンチする。反応物を遠心分離し、上清を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分析して、ビスＢＩＡ産物ベルバムニン、グアッテガウメリン、及び２’－ノルベルバムニンを、それらの保持及び質量電荷比により検出する。
実施例６．エピメラーゼ酵素の同定
本明細書に開示の方法のエピマー化反応を行うために好適なエピメラーゼ酵素を同定するために、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ８２Ｙ１様ドメイン及びコデイノンレダクターゼ様ドメインを、市販の植物トランスクリプトーム中の単一のオープンリーディングフレーム（ＣＹＰ－ＣＯＲ）において同定した。ＣＹＰ－ＣＯＲ融合体を、１０００ Ｐｌａｎｔｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｍａｔａｓｃｉ，ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ．３：１７）及びＰｈｙｔｏＭｅｔａＳｙｎ（Ｆａｃｃｈｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：１２７－３１；Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６６：１２２－３４）トランスクリプトームのＢＬＡＳＴ検索から、レチクリン蓄積をもたらした以前に公開されたＣＯＲ－サイレンシングＶＩＧＳ構築物（Ｗｉｊｅｋｏｏｎ ａｎｄ Ｆａｃｃｈｉｎｉ．２０１２．Ｐｌａｎｔ Ｊ．６９： １０５２－６３）の配列であるクエリーを用いるｂｌａｓｔｎを使用して、同定した。一度、１つのＣＹＰ－ＣＯＲ融合配列がヒットとして観察されると、その配列を翻訳し、そのアミノ酸配列を、ｔｂｌａｓｔｎを用いた両データベースの二回目の検索のためのクエリーとして使用した。データベースから同定された、ＣＹＰ－ＣＯＲ融合酵素の系統樹を図１７に提示する。配列は、１０００ Ｐｌａｎｔｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ及びＰｈｙｔｏＭｅｔａＳｙｎトランスクリプトームデータベースからバイオインフォマティック検索に基づいて同定された。加えて、例示的なアミノ酸配列を、上記のように、図４に提示する。加えて、表１は、このＣＹＰ－ＣＯＲ酵素に対して同定されたアミノ酸配列の様々な例を列挙し、これらは、パパヴェル・ソムニフェル（ケシ）、パパヴェル・セチゲラム（トロイポピー（ｐｏｐｐｙ ｏｆ Ｔｒｏｙ））、パパヴェル・ブラクテアタム（ハカマオニゲシ）、及びケリドニウム・マジャス（クサノオウ）を含む様々な植物に由来する。
実施例７．遺伝子操作された非植物宿主細胞における（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンのエピマー化
非植物宿主細胞を遺伝子操作して、本明細書に記載の酵素を異種発現させた。例えば、酵母菌株（サッカロミセス・セレビシエ）を遺伝子操作して、実施例６に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させ、この微生物宿主でのそれらの機能を確かめた。部分アミノ酸配列ｐｂｒ．ＰＢＲＳＴ１ＰＦ＿４３２８及びｐｂｒ．ＰＢＲＳＴ１ＰＦ＿８９４０５に対する酵母－コドン最適化ＤＮＡコード配列を、ＳＳＤＵ－２０１５６３４のアミノ酸１～４０（表１）の酵母－コドン最適化コード配列とインフレームで合成して、それぞれ、ＣＹＰ－ＣＯＲ＿４３２８及びＣＹＰ－ＣＯＲ＿８９４０５を生成した。これらのＣＹＰ－ＣＯＲコード配列を、ＵＲＡ３選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、ＴＤＨ３プロモーターから発現させた。プラスミドを、染色体内に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２）を有する酵母菌株中に形質転換した。２つのプラスミドを有するこれらの酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｕｒａ－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地中で増殖させた。酵母菌株に、（Ｓ）－レチクリンを供給し、ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により増殖の７２時間後に分析した。
実施例８．遺伝子操作された酵母細胞における（Ｓ）－レチクリンからのサルタリジンの産生
酵母菌株（サッカロミセス・セレビシエ）を遺伝子操作して、実施例６に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させ、この微生物宿主でのそれらの機能を確認した。部分アミノ酸配列ｐｂｒ．ＰＢＲＳＴ１ＰＦ＿４３２８及びｐｂｒ．ＰＢＲＳＴ１ＰＦ＿８９４０５に対する酵母－コドン最適化ＤＮＡコード配列を、ＳＳＤＵ－２０１５６３４のアミノ酸１～４０（表１）の酵母－コドン最適化コード配列とインフレームで合成させて、それぞれ、ＣＹＰ－ＣＯＲ＿４３２８及びＣＹＰ－ＣＯＲ＿８９４０５を生成した。これらのＣＹＰ－ＣＯＲコード配列を、ＵＲＡ３選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、ＴＤＨ３プロモーターから発現させた。サルタリジンシンターゼ（ＳａｌＳｙｎ）コード配列を、ＴＲＰ１選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、ＴＤＨ３プロモーターから発現させた。プラスミドを、染色体に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２）を有する酵母菌株中に形質転換した。２つのプラスミドを有するこれらの酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｕｒａ－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地中で増殖させた。酵母菌株に、（Ｓ）－レチクリンを供給し、ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により増殖の７２時間後に分析した。分析により、遺伝子操作された酵母細胞は、（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンへと変換することができ、次いでこれにサルタリジンシンターゼが作用して、サルタリジン、４－環プロモルフィナンアルカロイドを形成することが示された（図７、図１８）。サルタリジンシンターゼは、（Ｒ）－レチクリンに作用し、（Ｓ）－レチクリンでの観察可能な活性はないと以前に示されている（Ｇｅｓｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：２４４３２－４２）。
図７に示すように、ＣＹＰ－ＣＯＲは、（Ｒ）－レチクリンへの（Ｓ）－レチクリンの変換を触媒し、次いでこれに、サルタリジンシンターゼが作用して、プロモルフィナンアルカロイドサルタリジンを作製する。図１８（Ａ）は、２つのエピメラーゼバリアント（ＣＹＰ－ＣＯＲ＿８９４０５、ＣＹＰ－ＣＯＲ＿４３２８）及び標準物に関するレチクリン及びサルタリジンを示すクロマトグラムのトレースを示す。図１８（Ｂ）はまた、標準物質との共溶出を実証するために再プロットされたものとして、（Ａ）におけるサルタリジンに関する同一のクロマトグラムトレースを示す。この実験では、酵母は、ＵＲＡ３及びＴＲＰ１選択マーカーを有する２つの低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミド、ＴＤＨ３プロモーター、ならびにＣＹＰ－ＣＯＲ及びＳａｌＳｙｎコード配列を含有する。酵母を、新しく形質転換したコロニーから３ｍＬ選択培地中で一晩増殖させ、３．５ｍＬ培地中にＯＤ０．８まで希釈し戻し、７時間増殖させ、ペレット化し、次いで、１００μＭ（Ｓ）－レチクリン（Ｓｐｅｃｓ）を有するｐＨ７．４ ＨＥＰＥＳバッファー中に再懸濁した。３０℃にてスピナーで１６時間後、酵母をペレット化し、バッファー上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。各トレースは、２つの代表的な単一の試料からのものである。ピークは、全てのクロマトグラムにおける最大ピークが１００％であるように正規化する。
実施例９．遺伝子操作された非植物宿主細胞におけるラセミノルラウダノソリンからの（Ｒ）－レチクリンの産生
酵母菌株（サッカロミセス・セレビシエ）を遺伝子操作して、実施例６に記載の同定されたエピメラーゼを異種的に発現させ、この微生物宿主におけるそれらの機能を確認した。実施例７に記載の酵母－コドン最適化ＤＮＡコード配列ＣＹＰ－ＣＯＲ＿８９４０５を、ＵＲＡ３選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、ＴＤＨ３プロモーターから発現させた。このプラスミドを、染色体に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２）及び３つのメチルトランスフェラーゼ（パパヴェル・ソムニフェル ノルコクラウリン－６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリンＮ－メチルトランスフェラーゼ、及び３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、全てＰＴＥＦ１から発現される）の発現カセットを有する酵母菌株中に形質転換した。プラスミドを有するこの酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｕｒａ）を有する合成完全培地中で増殖させた。酵母菌株に、ラセミノルラウダノソリンを供給し、ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により増殖の７２時間後に分析した。キラルの特徴決定のために、レチクリンを、酵母培地から、５ｍＬ酵母培養物をペレット化し、１２０ｍｇ ＸＡＤ－４樹脂を４ｍＬ上清に加え、室温にて回転器上で一晩インキュベーションし、０．５ｍＬメタノールで溶出することにより濃縮した。濃縮物を、０．１％ギ酸を伴う均一溶媒の１５％メタノールを用いて５ｍＬ／分の流速で６．５分間、４０～５０μＬの注入量で、逆相ＨＰＬＣ（Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ－Ｃ１８、５μｍ、５０ｍｍ×１０ｍｍ）により分画した。ピークベースのフラクションを、おおよそ４．５分で回収した。フラクションを統合し、凍結乾燥させ、０．５ｍＬイソプロパノール中に再懸濁した。濃度に応じて、０．５～５μＬをキラルカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｘセルロース－１、３μｍ、１５０ｍｍ×２ｍｍ）に注入し、均一溶媒の７２％Ｎ－ヘキサン、２８％イソプロパノール、０．１％ジエチルアミンを用いて０．３ｍＬ／分の流速、及びＭＳによる検出と２５０ｎｍ ＵＶにより分離した。ＭＳ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６３２０イオントラップ質量分析計を用いて、３５０℃のＥＳＩ源気体温度、１０Ｌ／分の気体流、ネブライザー圧４０ＰＳＩ及び幅１．０でｍ／ｚ３３０．１の単離で行った。レチクリンピークの保持時間を、真正の（Ｓ）－レチクリン及び（Ｒ）－レチクリン標準物のそれと比較した。分析により、ＣＹＰ－ＣＯＲプラスミドを含有する遺伝子操作された酵母細胞が、ラセミノルラウダノソリンを（Ｒ）－レチクリンに変換することができ、一方で空プラスミドを有する遺伝子操作された酵母細胞は、排他的に（Ｓ）－レチクリンを産生することが示された（図１９）。
実施例１０：微生物宿主において発現されるときにサルタリジンシンターゼのプロセシング及び活性を向上させるためのサルタリジンシンターゼのタンパク質遺伝子操作
異種タンパク質は、組換え宿主において発現されるときに誤ってプロセシングされる場合があり、それは、例えば、微生物産生宿主において発現されるシトクロムＰ４５０酵素などの植物タンパク質である。例えば、サルタリジンシンターゼは、（Ｒ）－レチクリンをサルタリジンに変換するが、酵母において異種発現するとき、Ｎ結合型グリコシル化を受ける（図２０）。サルタリジンシンターゼ上で観察されたＮ結合型グリコシル化パターンは、酵素が植物において発現される時には観察されず、新生ＳａｌＳｙｎ転写の誤ったＮ末端ソーティングを示し、これは、異種微生物宿主における酵素の活性を低下させる。ゆえに、新生転写物のＮ末端ソーティングを矯正し、それによりＮ結合型グリコシル化パターンを除去することを目的とするタンパク質遺伝子操作は、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の向上をもたらすだろう。
例えば、ケイランチホリンシンターゼ（ＣＦＳ）からのＮ末端αヘリックスを使用して、サルタリジンシンターゼからのＮ末端αヘリックスを置き換えた（ＳａｌＳｙｎ、図２１）。これらの融合体の接合点は、ＣＦＳ及びＳａｌＳｙｎの二次構造モチーフに基づいて、またはＣＦＳ及びＳａｌＳｙｎのアミノ酸アラインメントに基づいて、選択された。融合体を、ＣＦＳからのＮ末端断片及びＳａｌＳｙｎからのＣ末端断片を、他の断片と重なる１５～４０ヌクレオチドで増幅することによりクローニングし、次いで、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙにより、互い及びベクター骨格で組み立て、完全な融合オープンリーディングフレームを形成した（Ｇｉｂｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６：３４３－５）。
別の例として、サルタリジンシンターゼからのシトクロムＰ４５０ドメインのコード配列を、ＢＭ３酵素などの他の安定的に発現されるシトクロムＰ４５０のＰ４５０コード領域中に直接配置した。例えば、サルタリジンシンターゼの保存されたシトクロムＰ４５０ドメイン及びバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） Ｐ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ１０２Ａ１（ＢＭ３、（Ｍｉｃｈｅｎｅｒ ａｎｄ Ｓｍｏｌｋｅ．２０１２．Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１４：３０６－１６））の遺伝子操作されたバリアントからのシトクロムＰ４５０ドメインを、ＮＣＢＩ保存ドメイン検索により同定した。ＢＭ３の最初のいくつかのアミノ酸のコード配列をサルタリジンシンターゼのＰ４５０ドメインのコード配列に融合し、その後に、Ｐ４５０ドメインのＣ末端のＢＭ３ドメインのコード配列が続くように、プライマーを設計した。前と同じように、この構築物は、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを介して組み立てた。
遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体を、ウェスタンブロット分析により分析して、酵母における完全長発現及びＮ結合型グリコシル化パターンに対する改変またはそれの消失を確認した（図２０）。サルタリジンシンターゼ酵素及びタンパク質融合体を、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープを用いてＣ末端にタグ付けし、酵母及び植物発現に適切な発現プラスミド中にクローニングした。酵母については、酵素コード配列を、ＵＲＡ３選択マーカーを有する低コピー酵母／大腸菌シャトルベクター中にクローニングし、ＴＤＨ３プロモーターから発現させた。植物については、配列は、カナマイシン耐性を有する大腸菌／アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）シャトルベクター及びササゲモザイクウイルスＲＮＡ－２からの５’及び３’未翻訳領域が隣接するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター中に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス浸潤を介する一時的な植物発現のためにクローニングした。サルタリジンシンターゼを発現するように遺伝子操作された酵母は、Ｎ結合型グリコシル化を示す横じま模様を呈した。本発明者らは、部位特異的突然変異誘発をグリコシル化部位に行うことによりこのパターンがＮ結合型グリコシル化に起因すると確認した。対照的に、図２０（Ａ）に見られるように、この酵素の植物発現は、Ｎ結合型グリコシル化を示す横じま模様をもたらさなかった。図２０（Ｂ）に見られるにように、Ｎ結合型グリコシル化部位が未改変であったが、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体は、酵母において発現されたときＮ－グリコシル化されなかった。ウェスタンブロット法により、本発明者らは、酵母－発現融合酵素は、植物発現親酵素について観察される発現と同様に、単一のバンドとして存在することを実証し、これは、Ｎ結合型グリコシル化をもたらす酵母における新生タンパク質のミスプロセシングは、遺伝子操作された融合体により修復されたことを示した。
遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体を、酵母において異種発現されたときの酵素活性の向上について分析した。サルタリジンシンターゼ及び遺伝子操作された融合体のコード配列を、ＵＲＡ３選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、ＴＤＨ３プロモーターから発現させた。酵母は、ＴＲＰ１遺伝子座に組込まれたＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２を有し、ＵＲＡ３選択マーカーを有する単一の低コピープラスミド及びＴＤＨ３プロモーターを有するサルタリジンシンターゼコード配列を含有する。酵母を、新しく形質転換したコロニーから１ｍＬ選択培地（－Ｕｒａ）中で一晩増殖させ、１０μＭ（Ｒ）－レチクリン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で９６ウェルプレートにおいて０．５ｍＬ選択培地中に１：２０に希釈し戻した。振とう培養器に７２～９６時間入れた後、酵母をペレット化し、培地上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。分析により、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ酵素が、酵母において異種発現されるときに野生型配列のそれと比べて向上した活性を呈することが示された（図２２）。
図２２は、本発明の実施形態に係る、酵母における活性を向上させるサルタリジンシンターゼコドン最適化及び遺伝子操作された融合体を示す。図２２に見られるように、黒色のバーは、サルタリジンシンターゼに対する天然型野生型配列、ＰｓＣＹＰ７１９Ｂ１を示す。黒色の枠を伴う灰色のバーは、パパヴェル・ソムニフェル及びパパヴェル・ブラクテアタムから新しく同定された配列からの酵母コドン最適化バリアントである。斜めにパターン形成されているバーは、最も向上した遺伝子操作された融合体を示し、これは、Ｐ．ブラクテアタム配列をベースとする。エラーバーは、少なくとも２つの生物学的反復の範囲を示す。Ｐ．ブラクテアタム、Ｐ．ソムニフェルム、またはＰ．セチゲラム（または関連する植物）由来のサルタリジンシンターゼの、天然、合成コドン最適化された、及び／またはタンパク質遺伝子操作されたバリアントは、これらの遺伝子操作された菌株において使用されてよい。
遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体を、下流ベンジルイソキノリンアルカロイド産物の産生を増加させるために生合成経路で使用することができる。一例では、酵母を遺伝子操作して、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ融合体、Ｐ．ブラクテアタムサルタリジンレダクターゼ、及びＰ．ソムニフェルムサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする酵母コドン最適化遺伝子を異種発現させた。３つの発現カセット（ＰＴＤＨ３－Ｄ９４ｙＰｓＳＳ、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、ＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴ）を、ＴＲＰ１切片マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。ＹＡＣを、染色体に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ｙＰｓＣＰＲｖ２）を有する酵母中に入れた。酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地において増殖させ、（Ｒ）－レチクリンを供給した。ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を通して増殖の９６時間後に分析した。分析により、サルタリジンシンターゼ酵素及び他の経路酵素で遺伝子操作された酵母菌株が、モルフィナンアルカロイドテバインを産生することが示され、これは図２３の（Ａ）に示される。
したがって、図２３（Ａ）は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母がテバインへの（Ｒ）－レチクリンの変換を触媒する小規模バッチ発酵のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。図２３の（Ａ）に提示するように、酵母菌株は、ＴＲＰ１遺伝子座中に組込まれたＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１発現カセットを有し、ＴＲＰ１選択マーカー及び３つの発現カセット：ＰＴＤＨ３－ｙＥｃＣＦＳ１－８３－ｙＰｓＳＳ９５－５０５、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、及びＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴを有する単一の酵母人工染色体を含有するように遺伝子操作される。酵母を、新しく形質転換したコロニーから３ｍＬ選択培地中で一晩増殖させ、１００μＭ（Ｒ）－レチクリン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で培養管において０．５ｍＬ選択培地（－Ｔｒｐ）中に１：２０に希釈し戻した。振とう培養器に７２時間入れた後、酵母をペレット化し、培地上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。クロマトグラムトレースは、この菌株により産生されたテバインならびに蓄積したサルタリジノール及びサルタリジンを標準物とともに、示す。これらのトレースは、２つの試料の代表である。
実施例１１：異種微生物宿主からのモルフィナン産物の産生を向上させるための下流モルフィナン分岐における酵素のタンパク質遺伝子操作
本発明の一実施形態では、経路酵素は、遺伝子操作されて、目的のＢＩＡの産生を増加させるための活性の増加を呈す。この例では、突然変異を、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩで増幅させることにより特定の経路酵素のオープンリーディングフレームに導入する（表６を参照されたい）。十分な鋳型ＤＮＡを増幅反応に含んで、遺伝子１個あたり、１～４個のヌクレオチド置換の突然変異率をもたらした。突然変異導入ライブラリーを、ギャップリペアにより直接的に酵母においてｐＹＥＳ１Ｌベクター中にクローニングした。いくつかの例では、ライブラリー発現のために選択された酵母菌株は、突然変異誘発された酵素の基質を生成する遺伝子の組込まれたコピーを含有した。例えば、ＣＯＤＭバリアントのライブラリーを、Ｔ６ＯＤＭ及びＣＯＲ１．３の組込まれたコピーを有する菌株中に形質転換し、培地中でテバインを供給した。これらの菌株におけるＴ６ＯＤＭ及びＣＯＲ１．３の発現は、コデイン及びネオピンが、各導入されたＣＯＤＭバリアントの基質として利用可能であり得ることを確かにした。個別のコロニーを、９６ウェルプレートに接種し、９６時間培養し、次いで、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によりそれらの産物の産生についてアッセイした。ＣＯＤＭライブラリーの例では、産物を、モルヒネ及びネオモルフィンについてスクリーニングした。各スクリーンでは、ＢＩＡ産生が増加したバリアントを配列決定し、検証のために再クローニングした。表６は、酵母におけるＢＩＡ産生の増加をもたらしたスクリーンを通して同定された突然変異型酵素バリアントの概要を含む。
図２４は、これらの突然変異体のうちの１つの検証された活性の増強のデータを示す。具体的には、図２４は、本発明の実施形態に係る、ランダム突然変異誘発及びスクリーニングを通して酵母において活性の増強を呈するＣＯＤＭ酵素バリアントの生成を示す。ＣＯＤＭバリアントのライブラリーを、エラープローンＰＣＲによりコード領域を突然変異誘発することにより生成した。このライブラリーのスクリーニングにより同定したバリアントであるＣＯＤＭＮ３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖを再クローニングし、Ｔ６ＯＤＭ及びＣＯＲ１．３の組込まれたコピーを有する酵母菌株において発現させた。この菌株及び野生型ＣＯＤＭを発現する別の対照菌株を、１ｍＭテバインを有する液体培地において培養した。９６時間後、培地をＣＯＤＭ活性についてＬＣ－ＭＳにより分析した。バリアントＣＯＤＭＮ３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖは、野生型ＣＯＤＭを発現する菌株よりも、１．４倍多いモルヒネ及び２．６倍多いネオモルフィンを産生した。
実施例１２：異種微生物宿主からのベンジルイソキノリンアルカロイド産生を向上させるための発現及び増殖の条件の最適化
遺伝子操作された微生物宿主からのベジルイソキノリンアルカロイド産生は、経路酵素の発現及び増殖条件を最適化することによりさらに向上させることができる。一例では、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼの発現は、酵母において、一連の異なるプロモーターから酵素を発現することにより変えられる。酵母を、異なるプロモーターからのＰ．ソムニフェルムサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする酵母コドン最適化遺伝子を異種発現するように遺伝子操作した（図２５の（Ａ）に提示する）。２つの発現カセット（ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、ＰＸ－ｙＰｓＳａｌＡＴ）を、ＴＲＰ１切片マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。ＹＡＣを、酵母に入れ、細胞を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地中で増殖させ、サルタリジンを供給した。ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により増殖の７２時間後に分析した。経路酵素発現レベルの最適化は、モルフィナンアルカロイドテバインの産生を増加させることができる（図２５の（Ａ）に提示する）。
糖源、増殖温度、及びｐＨを含むが、これらに限定されない菌株培養条件の最適化を使用して、遺伝子操作された酵母菌株からのベンジルイソキノリンアルカロイドの産生を増加させることができる（図２５の（Ｂ）及び（Ｃ）に提示する）。一例では、ｐＨを変動させて、遺伝子操作された酵母菌株からのテバイン産生を増加させた。２つの発現カセット（ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、ＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴ）を、ＴＲＰ１切片マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。ＹＡＣを酵母に入れ、細胞を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ）を有する合成培地において増殖させ、ｐＨ５．７～９のバッファーに再懸濁し、サルタリジンを供給した。ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によりインキュベーションの１６時間後に分析した。４－環プロモルフィナンアルカロイドサルタリジノール及び５－環モルフィナンアルカロイドテバインのレベルは、増加するｐＨの関数として増加した（図２５の（Ｂ）に提示する）。
別の例では、温度、糖、及び培地バッファー含有率を変動させて、遺伝子操作された酵母菌株からのテバイン産生を増加させた。３つの発現カセット（ＰＴＤＨ３－Ｄ９４ｙＰｓＳＳ、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、ＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴ）を、ＴＲＰ１切片マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。ＹＡＣを、染色体中に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ｙＰｓＣＰＲｖ２）を有する酵母に入れた。酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地において増殖させ、（Ｒ）－レチクリンを供給した。ＢＩＡ代謝産物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により増殖の７２時間後に分析した。分析により、モルフィナンアルカロイドテバインの微生物産生が、ある特定の培養条件で増加することが示された（３０℃でデキストロースを有する干渉培地、図２５の（Ｃ）に提示する）。
したがって、図２５は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母によるテバインへの（Ｒ）－レチクリンの変換のための発酵最適化を示す。（Ａ）ＳａｌＡＴプロモーターバリアント、（Ｂ）異なるｐＨ条件下で増殖したＳａｌＲ及びＳａｌＡＴ菌株、ならびに（Ｃ）糖源、増殖温度、及び培地バッファー含有率の最適化の全細胞緩衝アッセイのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。（Ａ）様々なＳａｌＡＴプロモーターを用いた、ＴＲＰ１選択マーカー及び２つの発現カセット：ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ及びＰＸ－ｙＰｓＳａｌＡＴを有する単一の酵母人工染色体を含有するように遺伝子操作された酵母菌株。酵母を、新しく形質転換したコロニーから３ｍＬ選択培地中で一晩増殖させ、１００μＭサルタリジン（Ｓｐｅｃｓ）で培養管において０．５ｍＬ培地中に１：２０に希釈し戻した。振とう培養器に７２時間入れた後、酵母をペレット化し、培地上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。（Ｂ）酵母菌株を、ＴＲＰ１選択マーカー及び２つの発現カセット：ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ及びＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴを有する単一の酵母人工染色体を含有するように遺伝子操作した。酵母を、新しく形質転換したコロニーから３ｍＬ選択培地中で一晩増殖させ、ＯＤ０．８まで３．５ｍＬ培地中に希釈し戻し、７時間増殖させ、ペレット化し、次いで、ｐＨ５．７ ＭＯＰＳ、または１０μＭサルタリジン（Ｓｐｅｃｓ）を有するｐＨ７、８、または９のトリスバッファー中に再懸濁した。３０℃にてスピナーで１６時間後、酵母をペレット化し、バッファー上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。エラーバーは、２つの試料の範囲を表す。（Ｃ）糖源、増殖温度、及び培地バッファー含有率の最適化。この実験では、酵母菌株を、ＴＲＰ１遺伝子座中に組込まれたＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１を有し、ＴＲＰ１選択マーカー及び３つの発現カセット：ＰＴＤＨ３－ｙＥｃＣＦＳ１－８３－ｙＰｓＳＳ９５－５０５、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、及びＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴを有する単一の酵母人工染色体を含有するように遺伝子操作した。酵母を、新しく形質転換したコロニーから３ｍＬ選択培地中で一晩増殖させ、１００μＭ（Ｒ）－レチクリン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で培養管において０．５ｍＬ培地中に１：２０に希釈し戻した。振とう培養器に７２時間入れた後、酵母をペレット化し、培地上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。
実施例１３：初期１－ベンジルイソキノリンアルカロイド骨格からのテバインの産生のために遺伝子操作された酵母
酵母菌株は、初期１－ベンジルイソキノリンアルカロイドからの、モルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドの産生のために遺伝子操作することができる。一例として、遺伝子操作された酵母菌株は、ラセミもしくは（Ｓ）－ノルコクラウリンまたはラセミもしくは（Ｓ）－ノルラウダノソリンからモルフィナンアルカロイド産物を産生することができる（図５、６、７、及び２３の（Ｂ））。酵母菌株を遺伝子操作して、（Ｓ）－ノルコクラウリンまたはラセミもしくは（Ｓ）－ノルラウダノソリンから（Ｓ）－レチクリンを、３つまたは５つの発現カセットを酵母ゲノム中に組込むことにより、産生する。（Ｓ）－レチクリンをラセミまたは（Ｓ）－ノルラウダノソリンから産生するために、組込まれた発現カセットは、パパヴェル・ソムニフェル ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（Ｐｓ６ＯＭＴ、ＥＣ２．１．１．１２８）、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＥＣ２．１．１．１１６）、及びコクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ、ＥＣ２．１．１．１４０）をコードし、それぞれＴＥＦ１プロモーターを有する（Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｍｏｌｋｅ．２００８．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５６４－７３）。（Ｓ）－レチクリンをラセミまたは（Ｓ）－ノルコクラウリンから産生するために、菌株は、酵母コドン最適化されたハナビシソウ Ｎ－メチルコクラウリン３’－ヒドロキシラーゼ（ｙＥｃＣＹＰ８０Ｂ１、ＥＣ１．１４．１３．７１）及びＴＤＨ３またはＴＥＦ１プロモーターから発現されるＡＴＲ１またはｙＰｓＣＰＲｖ２シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ、ＥＣ１．６．２．４）の組込まれた発現カセットをさらに有する。これらの菌株をさらに遺伝子操作して、エピマー化－触媒酵素（例えば、ＣＹＰ－ＣＯＲ）、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノールアセチルトランスフェラーゼを取り込んで、ラセミもしくは（Ｓ）－ノルコクラウリンまたはラセミもしくは（Ｓ）－ノルラウダノソリンをモルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバイン由来のモルフィナンアルカロイドへと変換する（図７）。エピマー化－触媒酵素の発現の代替として、６ＯＭＴ、４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、及び／またはＣＹＰ８０Ｂ１が、ｒａｃ－レチクリンがｒａｃ－ノルコクラウリンまたはｒａｃ－ノルラウダノソリンから産生されるように遺伝子操作され得る。
一例では、酵母菌株を遺伝子操作して、ｒａｃ－ノルラウダノソリンをテバインに変換する。酵母菌株は、それぞれＴＥＦ１プロモーターを有する、Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、及びｙＰｓＣＰＲｖ２をコードする組込まれた発現カセットを有する。４つの発現カセット（ＰＴＤＨ３－ｙＥｃＣＦＳ１－８３－ｙＰｓＳＳ９５－５０５、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、ＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴ、ＰＨＸＴ７－ＣＹＰ－ＣＯＲ＿８９４０５）を、この菌株においてＴＲＰ１選択マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。ＹＡＣ及び組込まれたカセットを有する酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ）及び１ｍＭ ｒａｃ－ノルラウダノソリン基質を有する合成完全培地中で増殖させた。９６時間増殖させた後、培地を、ＢＩＡ代謝産物についてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析した。ほぼ２００ｎＭのテバインが検出された（図２３の（Ｂ））。他の遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼバリアントもこの菌株において使用してよい（図２２、実施例１０）。
実施例１４：Ｌ－チロシンからのレチクリンの産生のために遺伝子操作されたプラットフォーム酵母菌株
重要な分岐点ＢＩＡ中間体（Ｓ）－レチクリンをＬ－チロシンから産生するプラットフォーム酵母菌株を構築した（図５）。具体的には、４つの多重遺伝子発現構築物を酵母菌株のゲノム中に組込んだ。４つの構築物の組成を図２６に示す。各構築物は、強力な構成的プロモーターから発現される４つまたは５つの遺伝子の遺伝子からなる。遺伝子は、模式図の上にあるアノテーションに指定するように、プロモーター、遺伝子オープンリーディングフレーム、及びターミネーターを含む完全な発現カセットとして、各遺伝子座に位置する。模式図は、所与の遺伝子を表す矢印の方向により各発現カセットの転写方向を示す。選択可能なマーカーは、アノテーション中でイタリック体としており、模式図では灰色の矢印により表される。各選択マーカーは、遺伝子座からのマーカーの除去を可能にするようにｌｏｘＰ部位に隣接する。加えて、各構築物は、選択可能なマーカーを、Ｃｒｅリコンビナーゼによりそれを除去することができるようにｌｏｘＰ部位に隣接させている。
第一の組込み構築物では、ドブネズミ由来の４つの異種遺伝子が、ＹＢＲ１９７Ｃ遺伝子座に、Ｇ４１８選択マーカー（ＫａｎＭＸ）と一緒に組込まれる。ＲｎＰＴＰＳ、ＲｎＳｅｐＲ、ＲｎＰＣＤ、及びＲｎＱＤＨＰＲは、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を酵母内因性葉酸合成経路から合成し、再生する必要がある。各遺伝子は、酵母における発現のためにコドン最適化されている。
第二の組込み構築物では、４つの異種遺伝子が、ＨＩＳ３遺伝子座に、ＨＩＳ５選択マーカーと一緒に組込まれる。ドブネズミチロシンヒドロキシラーゼ（ＲｎＴｙｒＨ）は、チロシンをＬ－ドパへと、先行する組込み構築物により生成された補助基質ＢＨ４を使用して変換する。ＲｎＴｙｒＨ遺伝子は、野生型、または活性の増強を与える改善された突然変異体のいずれでもあることができる（例えば、Ｗ１６６Ｙ、Ｒ３７Ｅ、及びＲ３８Ｅ、実施例２）。第二のドブネズミ遺伝子であるＲｎＤＨＦＲは、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ４の酸化産物）をＢＨ４に還元する酵素をコードし、この方法でこの補助基質の利用可能性を高める。また、第三に構築物に含まれているものは、シュードモナス・プチダ由来のＰｐＤＯＤＣであり、Ｌ－ドパをドパミンに変換する酵素である。第四の酵素は、キクバオウレン由来のＣｊＮＣＳであり、これは、４－ＨＰＡ及びドパミンを縮合させてノルコクラウリンを作製する。各遺伝子は、酵母における発現のためにコドン最適化されている。
第三の組込み構築物では、植物由来の５つの異種遺伝子及びＬＥＵ２選択マーカーが、遺伝子座ＹＤＲ５１４Ｃ中に組込まれる。Ｐｓ６ＯＭＴ、Ｐｓ４’ＯＭＴ、及びＰｓＣＮＭＴは、パパヴェル・ソムニフェル由来のメチルトランスフェラーゼであり、天然型植物ヌクレオチド配列として発現される。第四のＰ．ソムニフェルム遺伝子、ｙＰｓＣＰＲｖ２は、酵母に対してコドン最適化されており、ハナビシソウ由来のシトクロムＰ４５０であるＥｃＣＹＰ８０Ａ１の活性を支持するレダクターゼをコードする。ＥｃＣＹＰ８０Ａ１は、その天然型植物ヌクレオチド配列として発現される。この構築物においてコードされる酵素は、２つのＯ－メチル化、Ｎ－メチル化、及び水酸化を行って、先行する組込み構築物により産生されたノルコクラウリンからレチクリンを産生する。
最後の組込み構築物では、サッカロミセス・セレビシエ内因性遺伝子の追加のコピーＡＲＯ４Ｑ１６６Ｋ、ＡＲＯ７Ｔ２２６Ｉ、ＴＫＬ１、及びＡＲＯ１０が、ＡＲＯ４遺伝子座に、ヒグロマイシン耐性選択マーカーと一緒に組込まれる。ＡＲＯ４Ｑ１６６Ｋ及びＡＲＯ７Ｔ２２６Ｉは、それぞれが、野生型配列と比べて単一の塩基対置換をコードする、ＡＲＯ４及びＡＲＯ１０のフィードバック耐性突然変異体である。ＴＫＬ１及びＡＲＯ１０は、天然型酵母遺伝子に対して同一であるが、強力なプロモーターの後ろで発現する。Ａｒｏ４ｐ及びＡｒｏ７ｐは、チロシンを含む芳香族アミノ酸の生合成における酵素である。フィードバック阻害をこれらの酵素から除去することにより、内因性チロシン生合成の上方制御がもたらされる。Ｔｋｌ１ｐの過剰発現は、チロシンの前駆体である、エリトロース４－リン酸（Ｅ４Ｐ）の供給の増強をもたらすペントースリン酸経路を上方制御する。Ａｒｏ１０ｐの過剰発現は、４－ＨＰＡの産生を増加させる。
プラットフォーム酵母菌株は、４つの発現カセットの任意の数で構築することができる。具体的には、プラットフォーム酵母菌株は、組込み構築物１～４及び組込み構築物１～３で構築された。チロシン過剰産生構築物（構築物４）が除外された後者の菌株では、追加のチロシンが、レチクリンの生合成を支持するために培地に供給されてよい。追加の遺伝子改変を、下流ＢＩＡの産生を支持し、ＢＩＡ生合成へのフラックスを増加させるために、プラットフォーム菌株に取り込んでよい。
適切にしたアミノ酸ドロップアウト溶液を有する合成完全培地中で２５及び３０℃にて、酵母菌株を増殖させた。培地上清中のＢＩＡ代謝産物を、増殖の４８及び９６時間後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析した。
実施例１５：Ｌ－チロシンからのテバイン及び他のモルフィナンアルカロイドの産生のために遺伝子操作された酵母
酵母菌株を、チロシンなどの初期前駆体から、モルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバイン由来のモルフィナンアルカロイドの産生のために遺伝子操作することができる。一例として、実施例１４に記載のプラットフォーム酵母菌株をさらに遺伝子操作して、モルフィナンアルカロイド産物をＬ－チロシンから産生することができる（図７）。
（Ｓ）－レチクリンをＬ－チロシンから産生するプラットフォーム酵母菌株（実施例１４の記載を参照されたい）をさらに遺伝子操作して、エピマー化－触媒酵素、例えば、新しく同定されたＣＹＰ－ＣＯＲ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノールアセチルトランスフェラーゼを取り込んで、生合成された（Ｓ）－レチクリンを、モルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドへと変換した（図７）。３つの発現カセット（ＰＴＤＨ３－ｙＥｃＣＦＳ１－２６－ｙＰｂＳＳ３３－５０４、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ、ＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳａｌＡＴ）を、プラットフォーム酵母菌株中に直接ＴＲＰ１選択マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。他の遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼバリアントも、ＹＡＣに取り込まれ得る（図２２、実施例１０）。その結果得られた酵母菌株をまた、ＵＲＡ３選択マーカー、ＴＤＨ３プロモーター、及びＣＹＰ－ＣＯＲコード配列を有する低コピーＣＥＮ／ＡＲＳプラスミドで形質転換した。
ＹＡＣ、低コピープラスミド、及び組込まれたカセットを有する酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液（－Ｕｒａ－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地中で２５及び３０℃にて増殖させた。９６時間の増殖後、培地をＢＩＡ代謝産物についてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析した。温度、炭素源、ｐＨ条件、及び培地組成に関するさらなる培養最適化を行って、ＢＩＡ産生を向上させた。
追加の遺伝子改変を、酵母菌株に導入して、テバインに由来するモルフィナンアルカロイドを産生することができる（図７）。一例では、発現カセットＰＡＤＨ１－Ｔ６ＯＤＭ－ＴＡＤＨ１、ＰＨＸＴ７－ＣＯＲ－ＴＰＧＫ１、及びＰＴＥＦ１－ＣＯＤＭ－ＴＣＹＣ１を、直接組み立て、テバイン－産生酵母菌株のｔｒｐ１遺伝子座中に組込んだ（Ｔｈｏｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。別の例では、これらの酵母菌株をさらに遺伝子操作して、発現カセットＰＧＰＤ－ｍｏｒＡ－ＴＣＹＣ１、ＰＰＧＫ１－ｍｏｒＢ－ＴＰＨＯ５を直接組み立て、この構築物を染色体上のｕｒａ３遺伝子座中に組込むことにより追加のモルヒネアルカロイドを産生することができる（Ｔｈｏｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
実施例１６：Ｌ－チロシンからのベルベリン及び他のプロトベルベリンアルカロイドの産生のために遺伝子操作された酵母
酵母菌株を、Ｌ－チロシンからの、アルカロイドベルベリンの、ならびにプロトベルベリン、フタリドイソキノリン、及びベルベリンに由来するベルベリンアルカロイドまたはベルベリンの形成に関与する中間体の産生のために遺伝子操作することができる（図５、８）。例えば、３つまたは４つの発現カセット（ＰＰＧＫ１－ＰｓＢＢＥ－ＴＰＨＯ５、ＰＴＥＦ１－ｙＰｓＳ９ＯＭＴ－ＴＣＹＣ１、ＰＴＤＨ３－ｙＣｊＣＡＳ－ＴＡＤＨ１、ＰＴＰＩ１－ｙＢｗＳＴＯＸ－ＴＳＴＥ２を伴うまたは伴わない）を、ＴＲＰ１切片マーカーを有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）へと組み立てた。ＹＡＣを、（Ｓ）－レチクリンをＬ－チロシンから産生し（実施例１４を参照されたい）、染色体に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２）を加えて有するプラットフォーム酵母菌株に入れた。ＰＴＥＦ１－Ｓ９ＯＭＴ－ＴＣＹＣ１発現カセットを含有する追加の高コピープラスミドを、この菌株中に形質転換して、下流産物へのフラックスを改善した。
酵母菌株を、適切にしたアミノ酸ドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ）を有する合成完全培地中で２５及び３０℃にて増殖させた。培地上清中のＢＩＡ代謝産物を、４８及び９６時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析した。
実施例１７：Ｌ－チロシンからのノスカピン及び他のノスカピノイドアルカロイドの産生のために遺伝子操作された酵母
酵母菌株を、Ｌ－チロシンからの、ナルコトリン及びノスカピンなどのフタリドイソキノリンアルカロイド、ノスカピンの形成に関与する中間体、またはその誘導体の産生のために遺伝子操作することができる（図５、９）。
例えば、発現カセットＰＡＤＨ１－ＣＡＳ－ＴＡＤＨ１、ＰＨＸＴ７－ＣＹＰ８２Ｙ１－ＴＰＧＫ１、ＰＴＥＦ１－Ｓ９ＯＭＴ－ＴＣＹＣ１、及びＰＰＧＫ１－ＢＢＥ－ＴＰＨＯ５を、直接組み立て、（Ｓ）－レチクリンをＬ－チロシンから産生し（実施例１４を参照されたい）、染色体に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２）を加えて有する、プラットフォーム酵母菌株のｔｒｐ１遺伝子座中に組込んだ。次いで、発現カセットＰＧＰＤ－ＴＮＭＴ－ＴＣＹＣ１、ＰＰＧＫ１－ＰｓＭＴ２－ＴＰＨＯ５、ＰＡＤＨ１－ＣＹＰ８２Ｘ１－ＴＧＡＰ１、及びＰＰＹＫ１－ＰｓＣＸＥ１－ＴＭｆ１を直接組み立て、酵母菌株のｕｒａ３遺伝子座中に組込んだ。次いで、発現カセットＰＨＸＴ７－ＣＹＰ８２Ｘ２－ＴＣＹＣ１、ＰＧＰＤ－ＰｓＡＴ１－ＴＡＤＨ１、ＰＴＰＩ１－ＰｓＳＤＲ１－ＴＳｔｅ２、及びＰＰＧＫ１－ＰｓＭＴ３－ＴＰＨＯ５を直接組み立て、酵母菌株のｌｅｕ２遺伝子座中に組込んだ。ＰＴＥＦ１－Ｓ９ＯＭＴ－ＴＣＹＣ１発現カセットを含有する追加の高コピープラスミド及びＰＨＸＴ７－ＣＹＰ８２Ｘ２－ＴＣＹＣ１発現カセットを含有する追加の低コピープラスミドをこの酵母菌株中に形質転換して、下流産物のフラックスを改善した。
酵母菌株を、適切にしたアミノ酸ドロップアウト溶液（－Ｔｒｐ、Ｕｒａ）を有する合成完全培地中で２５及び３０℃にて増殖させた。培地上清中のＢＩＡ代謝産物を、４８及び９６時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析した。
実施例１８：Ｌ－チロシンからのサンギナリン及び他のベンゾフェナントリジンアルカロイドの産生のために遺伝子操作された酵母
酵母菌株を、Ｌ－チロシンからの、プロトベルベリン、プロトピン、及び最終産物サンギナリンなどのベンゾフェナントリジンアルカロイド、サンギナリンの形成に関与する中間体、またはその誘導体の産生のために遺伝子操作することができる（図５、１０）。
例えば、発現カセットＰＡＤＨ１－ＴＮＭＴ－ＴＡＤＨ１、ＰＨＸＴ７－ＥｃＳＴＳ－ＴＰＧＫ１、ＰＧＰＤ－ＥｃＣＦＳ－ＴＣＹＣ１、及びＰＰＧＫ１－ＢＢＥ－ＴＰＨＯ５を直接組み立て、（Ｓ）－レチクリンをＬ－チロシンから産生し（実施例１４を参照されたい）、染色体に組込まれたシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現カセット（ＰＴＥＦ１－ＡＴＲ１またはＰＴＥＦ１－ＰｓＣＰＲｖ２）を加えて有する、プラットフォーム酵母菌株のｔｒｐ１遺伝子座中に組込んだ。次いで、発現カセットＰＧＰＤ－ＰｓＭＳＨ－ＴＣＹＣ１、ＰＰＧＫ１－ＰｓＰ６Ｈ－ＴＰＨＯ５を直接組み立て、酵母菌株のｕｒａ３遺伝子座中に組込んだ。
酵母菌株を、適切にしたアミノ酸ドロップアウト溶液を有する合成完全培地中で２５及び３０℃にて増殖させた。培地上清中のＢＩＡ代謝産物を、４８及び９６時間の増殖後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析した。
実施例１９：Ｌ－チロシンからのヒドロコドン及び他のモルフィナンアルカロイドの産生のために遺伝子操作された酵母
酵母菌株を、ヒドロコドンの産生のために遺伝子操作することができる。一例として、実施例１５に記載のテバイン産生酵母菌株を、さらに遺伝子操作して、医薬品有効成分ヒドロコドンを産生することができる。図２７は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるテバイン及びヒドロコドン産生を示す。図２７Ａでは、多重遺伝子構築物は、構築物１～４（図２６）を含有する遺伝子操作された酵母菌株中に取り込まれた。図２７Ｂでは、構築物５の組込みは、構築物１～４を含有する菌株と比べてレチクリン力価を増加させた。図２７Ｃでは、構築物６の組込みは、糖からのテバイン産生をもたらす。遺伝子操作された菌株により産生されたテバインを、培地中でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により同定し、市販の基準標準物と比較した。図２７Ｄでは、ＹＡＣへの構築物７の導入は、糖からのヒドロコドン産生をもたらす。遺伝子操作された菌株により産生されたヒドロコドンを、培地中でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により同定し、市販の基準標準物と比較した。
一例では、レチクリンをＬ－チロシンから産生する酵母菌株（実施例１４の記載を参照されたい）を、さらに遺伝子操作して、レチクリン産生を増加させ、次いでさら改変して、実施例１５に記載のテバイン産生酵素を取り込み、次いでさらに改変して、テバイン脱メチル化酵素及びモルフィノンレダクターゼを取り込んで、生合成されたテバインをヒドロコドンへと変換した。３つの多重遺伝子発現構築物は、実施例１４に記載のレチクリン産生酵母菌株中に取り込まれた；２つを染色体組込みとして、及び３つ目をエピソーマルＹＡＣ構築物として。
第一の構築物では、遺伝子を取り込んで、実施例１４に記載の菌株からの（Ｓ）－レチクリンの生合成を増加させた。（Ｓ）－レチクリン産生を増加させるために、ＣｊＮＣＳ（ドパミンのノルコクラウリンへの取り込みを増加させるため）及びＰｓ４’ＯＭＴ（３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリンの（Ｓ）－レチクリンへの取り込みを増加させるため）の追加のコピーは菌株中に取り込まれた。ＲｎＴｙｒＨの追加のコピーも含んで、レチクリン生合成のための異種経路へのチロシンの流入を増加させた。３つの発現カセット（ＰＰＧＫ１－ｙＣｊＮＣＳ－ＴＰＨＯ５、ＰＴＥＦ１－Ｐｓ４’ＯＭＴ－ＴＣＹＣ１、及びＰＧＰＤ－ＲｎＴｙｒＨＷＲ－ＴＡＤＨ１）を、遺伝子座ＹＰＬ２５０Ｃ中に、フレオマイシン耐性のためのｂｌｅ選択マーカーと一緒に組込んだ（図２７Ａ）。その結果得られた酵母菌株は、レチクリン蓄積において４倍の増加を呈した（図２７Ｂ）。
第二の構築物では、遺伝子を取り込んで、テバインを生合成された（Ｓ）－レチクリンから産生した。実施例１５に記載のテバイン産生のための４つの酵素を、４つの発現カセット（ＰＨＸＴ７－ｙＰｂＣＹＰ－ＣＯＲ－ＴＣＹＣ１、ＰＧＰＤ－ｙＥｃＣＦＳ１－８３－ｙＰｂＳａｌＳｙｎ９２－５０４－ＴＡＤＨ１、ＰＴＰＩ１－ｙＰｂＳａｌＲ－ＴＳＴＥ２、及びＰＰＧＫ１－ｙＰｓＳａｌＡＴ－ＴＰＨＯ５）として組み立て、選択マーカーＫｌＵＲＡ３と遺伝子座ＴＲＰ１中に組込んだ（図２７Ａ）。その結果得られた酵母菌株は、標準酵母培養用培地中で培養されたときにテバインを産生した（図２７Ｃ）。
第三の構築物では、遺伝子を取り込んで、生合成されたテバインからヒドロコドンを産生した。この例では、テバイン脱メチル化酵素活性を、Ｐ．ソムニフェルム由来のＴ６ＯＤＭ酵素として取り込んで、テバインをネオピノンへと変換し、モルフィノンレダクターゼ活性をＰ．プチダ由来のｍｏｒＢ酵素として取り込んで、コデイノンをヒドロコドンへと変換した。この例では、コデイノンへのネオピノンの間にある変換は、自発的に生じた。別の例では、イソメラーゼ酵素を含んで、ネオピノンをコデイノンへと酵素的に変換する。Ｔ６ＯＤＭ及びｍｏｒＢ遺伝子は、酵母にコドン最適化され、２つの発現カセット（ＰＧＰＤ－ｙＴ６ＯＤＭ－ＴＡＤＨ１及びＰＰＧＫ１－ｙＰｂｍｏｒＢ－ＴＰＨＯ５）として含まれ、ＴＲＰ１選択マーカーとＹＡＣへと組み立てられた（図２７Ａ）。この例では、酵母菌株は、Ｔ６ＯＤＭ、２－オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの活性を支持するために、５０ｍＭ ２－オキソグルタル酸を補充された培地中で培養される。別の例では、酵母宿主細胞を遺伝子操作して、２－オキソグルタル酸を、Ｔ６ＯＤＭ活性を支持するのに十分なレベルで蓄積させる。記載の多重遺伝子構築物を有し、記載の培地中で培養された酵母菌株は、ヒドロコドンをグルコースから生合成した（図２７Ｄ）。
実施例２０：経路フラックスにおけるボトルネックを克服するための遺伝子コピー数の増加
いくつかの例では、酵母菌株は、その活性が制限されている酵素に対する遺伝子コピー数を増加させることにより、ベンジルイソキノリンアルカロイドの産生を増強させるように最適化されることができる。
一例では、実施例１９に記載のレチクリン産生菌株におけるレチクリン産生は、ＮＣＳの３つ目の遺伝子コピーを加えることにより最適化された（図２８）。この例では、親菌株は、ＹＭＲ２０６Ｗ遺伝子座で組込まれたＮＣＳの１つのコピー、及びＹＰＬ２５０Ｃ遺伝子座に別のコピーを有し、それぞれＰＧＫ１プロモーターから発現された。ＮＣＳの３つ目のコピー（ＴＤＨ３プロモーターから発現される）を、ＢＵＤ９遺伝子座で組込み、この改変は、レチクリン力価において２倍の増加をもたらした。別の例では、経路における他の酵素の追加のコピーを菌株に取り込んで、レチクリン力価をさらに増加させる。
（表２）酵素リスト
Figure 0007266966000020
Figure 0007266966000021
Figure 0007266966000022
Figure 0007266966000023
Figure 0007266966000024
Figure 0007266966000025
Figure 0007266966000026
Figure 0007266966000027
（表３）テーラリング酵素
Figure 0007266966000028
（表４）ポピーストロー（またはアヘン）濃縮物中と清澄化された酵母培養用培地中に存在し得る不純物の比較
Figure 0007266966000029
（表５）清澄化された酵母培養培地（ＣＹＣＭ）に存在する別個の分子群
ポピーストロー（ＣＰＳ）またはアヘンの濃縮物と異なり、アルカノイドの他のクラスが存在しないように、酵母宿主菌株を遺伝子操作してアルカノイドの所定のクラスの分子を産生し得る（すなわち、菌株１つあたり１経路のみの生合成経路）。それゆえ、このＣＹＣＭは、１つまたは２つのカラムにわたる分子のサブセットを含む、単一の生合成経路内での分子を含有し得る一方で、多くのカラムにわたる分子のサブセットを含有し得る。
Figure 0007266966000030
（表６）突然変異誘発スクリーニングにより同定された様々な酵素の有益な突然変異
Figure 0007266966000031
添付の項目にかかわらず、本開示はまた、以下の項目によって定義される。
１．遺伝子操作していない細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞であって、基質阻害軽減突然変異；生産物阻害軽減突然変異；及び補因子回収促進機構からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
２．前記少なくとも１つの改変が、基質阻害軽減突然変異を含む、項目１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
３．前記基質阻害軽減突然変異が、点突然変異Ｗ１６６Ｙを含む、項目２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
４．前記少なくとも１つの改変が、補助基質結合部位での競合的結合を緩和する少なくとも１つの生産物阻害軽減突然変異を含む、項目１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
５．前記少なくとも１つの生産物阻害軽減突然変異が、点突然変異Ｓ４０Ｄを含む、項目４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
６．前記少なくとも１つの生産物阻害軽減突然変異が、接合突然変異Ｒ３７Ｅ及びＲ３８Ｅを含む、項目４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
７．前記接合突然変異Ｒ３７Ｅ及びＲ３８Ｅが、ドパミンの存在下でチロシンヒドロキシラーゼ活性を向上させる、項目６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
８．前記少なくとも１つの改変が、不可逆的な生産物阻害を緩和する生産物阻害軽減突然変異を含む、項目１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９．前記生産物阻害軽減突然変異が、点突然変異Ｅ３３２Ｄを含む、項目８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０．前記生産物阻害軽減突然変異が、点突然変異Ｙ３７１Ｆを含む、項目８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１１．前記生産物阻害軽減突然変異が、活性部位でのカテコールアミンの鉄への不可逆的な結合を緩和する、項目８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２．前記少なくとも１つの改変が補因子回収促進機構を含む、項目１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３．前記補因子回収促進機構が、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする異種コード配列を含む、項目１２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１４．前記遺伝子操作された非植物細胞により産生されたジヒドロ葉酸レダクターゼが、前記遺伝子操作された非植物細胞内でのテトラヒドロビオプテリンへのジヒドロビオプテリンの変換を触媒する、項目１３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１５．（ａ）基質阻害軽減突然変異；生産物阻害軽減突然変異；及び補因子回収促進機構からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する遺伝子操作された非植物細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供する工程、
（ｂ）前記バッチ反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約５分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、ベンジルイソキノリンアルカロイド産物と細胞物質とを含む溶液を生成する工程；ならびに
（ｃ）少なくとも１つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
１６．前記バッチ反応器の少なくとも１つのプロセスパラメータが、結果として得られるベンジルイソキノリンアルカロイド産物組成物を変異させるように改変可能である、項目１５に記載の方法。
１７．改変可能である前記少なくとも１つのプロセスパラメータが、溶存酸素、ｐＨ、撹拌速度、通気速度、及び細胞密度のうちの少なくとも１つを含む、項目１６に記載の方法。
１８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリンアルカロイド前駆体を含む、項目１５に記載の方法。
１９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド前駆体が、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、チロシン、チラミン、４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、３，４－ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及びドパミンの群より選択される、項目１８に記載の方法。
２０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリンアルカロイドを含む、項目１５に記載の方法。
２１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、プロトピン、ベンゾフェナントリジン、プロモルフィナン、モルフィナン、セコベルベリン、フタリドイソキノリン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される構造的クラスを有する、項目２０に記載の方法。
２２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、コクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、４’－Ｏ－メチルノルラウダノソリン、４’－Ｏ－メチル－ラウダノソリン、Ｎ－メチルノルコクラウリン、ラウダノソリン、Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、パパベリン、ラウダニン、ラウダノシン、テトラヒドロパパベリン、１，２－ジヒドロパパベリン、及びオリエンタリンの群より選択されるベンジルイソキノリンである、項目２１に記載の方法。
２３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、スコウレリン、ケイランチホリン、スチロピン、ナンジニン、ジャトロリジン、ステホリジン、ジスクレタミン、シス－Ｎ－メチルスチロピン、テトラヒドロコルンバミン、パルマチン、テトラヒドロパルマチン、コルンバミン、カナジン、Ｎ－メチルカナジン、１－ヒドロキシカナジン、ベルベリン、Ｎ－メチル－オフィオカルピン、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン、及び１－ヒドロキシ－１０－Ｏ－アセチル－Ｎ－メチルカナジンの群より選択されるプロトベルベリンである、項目２１に記載の方法。
２４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、プロトピン、６－ヒドロキシプロトピン、アロクリプトピン、クリプトピン、ムラミン、及びタリクトリシンの群より選択される、プロトピンである、項目２１に記載の方法。
２５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ジヒドロサンギナリン、サンギナリン、ジヒドロケイリルビン、ケイリルビン、ジヒドロマルカピン、マルカピン、及びケレリトリンの群より選択されるベンゾフェナントリジンである、項目２１に記載の方法。
２６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、サルタリジン、サルタリジノール、及びサルタリジノール－７－Ｏ－アセテートの群より選択されるプロモルフィナンである、項目２１に記載の方法。
２７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルフィノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルフィン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、１４－ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、１４－ヒドロキシコデイン、モルフィノン、ヒドロモルフォン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、及びオキシモルフォンの群より選択されるモルフィナンである、項目２１に記載の方法。
２８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、４’－Ｏ－デスメチルマクラントアルデヒド、４’－Ｏ－デスメチルパパベロキシン、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン、及び３－Ｏ－アセテイルパパベロキシンの群より選択されるセコベルベリンである、項目２１に記載の方法。
２９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンの群より選択されるフタリドイソキノリンである、項目２１に記載の方法。
３０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、マグノフロリン、コリツベリン、アポモルヒネ、ボルジン、イソボルジン、イソテバイン、イソコリツベリン、及びグラウフィンの群より選択されるアポルフィンである、項目２１に記載の方法。
３１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベルバムニン、グアットガウメリン、ダウリシン、及びリエンシニンの群より選択されるビスベンジルイソキノリンである、項目２１に記載の方法。
３２．（ａ）チロシンヒドロキシラーゼ活性を増加させる突然変異を有さない野生型チロシンヒドロキシラーゼを発現する細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞、栄養素を含む供給原料、及び水を、反応器に提供する工程；
（ｂ）前記反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約５分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、細胞物質とベンジルイソキノリンアルカロイド産物とを含む溶液を生成する工程であって、前記溶液が、プロトベルベリン、モルフィナン、イソパビン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される分子の１つ以下のクラスを含む、前記工程；ならびに
（ｃ）少なくとも１つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
３３．前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレオイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルヒネ、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される分子を、５ｐｐｍを超えて含有しない、項目３２に記載の方法。
３４．前記生成物流が、メコン酸を、５ｐｐｍを超えて含有しない、項目３３に記載の方法。
３５．前記生成物流が、殺虫剤、殺菌剤、または除草剤からなる群より選択される物質の検出可能な量を含有しない、項目３２に記載の方法。
３６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、少なくとも液液抽出を使用して前記生成物流から回収される、項目３２に記載の方法。
３７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、発酵プロセスが完了した直後に回収される、項目３６に記載の方法。
３８．（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させる工程であって、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する、前記工程
を含む、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドにエピマー化する方法。
３９．前記少なくとも１つの酵素が、前記少なくとも１つの酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することにより産生される、項目３８に記載の方法。
４０．（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に加える工程をさらに含む、項目３９に記載の方法。
４１．前記（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を、前記細胞培養物から回収する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
４２．前記少なくとも１つの酵素がオキシダーゼを含む、項目３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
４３．前記少なくとも１つの酵素がレダクターゼを含む、項目３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．前記少なくとも１つの酵素がエピメラーゼを含む、項目３８～４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目４４に記載の方法。
４６．前記エピメラーゼが、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含む、項目４４または４５に記載の方法。
４７．前記オキシダーゼドメインがシトクロムＰ４５０オキシダーゼ様ドメインである、項目４６に記載の方法。
４８．前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、項目４６に記載の方法。
４９．前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが（Ｓ）－レチクリンである、項目３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
５０．前記（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが（Ｒ）－レチクリンである、項目３８～４９のいずれか一項に記載の方法。
５１．前記（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを４－環プロモルフィナンアルカロイドに変換する工程をさらに含む、項目３８～５０のいずれか一項に記載の方法。
５２．前記４－環プロモルフィナンアルカロイドがサルタリジンである、項目５１に記載の方法。
５３．前記（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを５－環モルフィナンアルカロイドに変換する工程をさらに含む、項目３８～５０のいずれか一項に記載の方法。
５４．前記遺伝子操作された非植物細胞内に存在する前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された微生物細胞内で産生される、項目３８～５３のいずれか一項に記載の方法。
５５．前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記遺伝子操作された非植物細胞内で、Ｌ－チロシンから始まる代謝経路により産生される、項目３８～５４のいずれか一項に記載の方法。
５６．前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記遺伝子操作された非植物細胞内で、炭水化物及び窒素源から始まる代謝経路により産生される、項目３８～５４のいずれか一項に記載の方法。
５７．前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、（Ｓ）－ノルレチクリン；（Ｓ）－レチクリン；（Ｓ）－テトラヒドロパパベリン；（Ｓ）－ノルコクラウリン；（Ｓ）－コクラウリン；（Ｓ）－Ｎ－メチルコクラウリン；（Ｓ）－３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン；（Ｓ）－ノリソオリエンタリン；（Ｓ）－オリエンタリン；（Ｓ）－イソオリエンタリン；（Ｓ）－ノルプロトシノメニン；（Ｓ）－プロトシノメニン；（Ｓ）－ノルラウダノソリン；（Ｓ）－ラウダノソリン；（Ｓ）－４’－Ｏ－メチルラウダノソリン；（Ｓ）－６－Ｏ－メチルノルラウダノソリン；及び（Ｓ）－４’－Ｏ－メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される、項目３８～５６のいずれか一項に記載の方法。
５８．前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、式Ｉ：
Figure 0007266966000032
式Ｉ
の化合物である、項目３８～５７のいずれか一項に記載の方法：
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は独立して、水素またはメチルであり；
Ｒ５は、水素、ヒドロキシ、またはメトキシである。
５９．（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを遺伝子操作された非植物細胞内に存在する（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドから産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、エピメラーゼをコードする異種コード配列を含み、前記エピメラーゼが、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
６０．サルタリジンシンターゼをコードする異種コード配列をさらに含む、項目５９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
６１．前記サルタリジンシンターゼが、前記（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをサルタリジンに変換する、項目６０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
６２．（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピメラーゼを産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記遺伝子操作された非植物細胞。
６３．（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスであって、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドをエピメラーゼと、前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに十分な量で接触させる工程を含む、前記プロセス。
６４．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目６３に記載のプロセス。
６５．少なくとも５％の前記（Ｓ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、（Ｒ）－１－ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、項目６３に記載のプロセス。
６６．１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも１つの酵素と接触させる工程であって、前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の立体化学を、前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の反対の立体化学へと反転させる、前記工程
を含む、前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心をエピマー化する方法。
６７．前記少なくとも１つの酵素が、前記少なくとも１つの酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することにより産生される、項目６６に記載の方法。
６８．前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に加える工程をさらに含む、項目６７に記載の方法。
６９．前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの単一立体異性体として存在する、項目６６に記載の方法。
７０．前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体異性体の混合物として存在する、項目６６に記載の方法。
７１．前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体異性体の前記混合物が、前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドのエナンチオマーのラセミ混合物である、項目７０に記載の方法。
７２．前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体異性体またはその誘導体を、細胞培養物から回収する工程をさらに含む、項目６７に記載の方法。
７３．回収した前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも約８０％のエナンチオマー過剰率を有する、項目７２に記載の方法。
７４．回収した前記１－ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも約９８％のエナンチオマー過剰率を有する、項目７２に記載の方法。
７５．前記少なくとも１つの酵素がオキシダーゼを含む、項目６６～７４のいずれか一項に記載の方法。
７６．前記少なくとも１つの酵素がレダクターゼを含む、項目６６～７５のいずれか一項に記載の方法。
７７．前記少なくとも１つの酵素がエピメラーゼを含む、項目６６～７４のいずれか一項に記載の方法。
７８．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
７９．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
８０．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
８１．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
８２．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
８３．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
８４．前記エピメラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５のいずれかに少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７７に記載の方法。
８５．前記エピメラーゼが、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含む、項目７７～８４のいずれかに記載の方法。
８６．前記オキシダーゼドメインがシトクロムＰ４５０オキシダーゼ様ドメインである、項目８５に記載の方法。
８７．前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、項目８５に記載の方法。
８８．ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを、遺伝子操作された非植物細胞内に存在する２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーから産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、
少なくとも１つのカップリング酵素をコードする異種コード配列
を含み、
前記少なくとも１つのカップリング酵素が、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それにより、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを形成する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
８９．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、１つまたは複数の共有結合を形成することにより、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９０．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、１つまたは複数の炭素－炭素結合を形成することにより、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９１．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、１つまたは複数の炭素－酸素結合を形成することにより、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９２．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、同一であるベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりホモ二量体を形成する、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９３．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、別個のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりヘテロ二量体を形成する、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９４．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが互いの立体異性体である、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９５．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第一のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、Ｎ－メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、６－Ｏ－メチル－ノルラウダノソリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９６．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第二のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、Ｎ－メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、６－Ｏ－メチル－ノルラウダノソリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９７．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーのうちの少なくとも１つが、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９８．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーのうちの少なくとも１つが、前記遺伝子操作された非植物細胞の外側で産生される、項目８８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
９９．遺伝子操作された非植物細胞内に存在するカップリング酵素を使用してビスベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する、遺伝子操作された非植物細胞であって、
前記遺伝子操作された非植物細胞内での少なくとも１つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの前記産生において使用される少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列
を含み、
少なくとも１つの前記カップリング酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それにより前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを形成する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
１００．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、１つまたは複数の共有結合を形成することにより、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０１．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、１つまたは複数の炭素－炭素結合を形成することにより、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０２．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、１つまたは複数の炭素－酸素結合を形成することにより、前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０３．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、同一であるベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりホモ二量体を形成する、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０４．前記少なくとも１つのカップリング酵素が、別個のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりヘテロ二量体を形成する、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０５．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが互いの立体異性体である、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０６．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第一のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、Ｎ－メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、６－Ｏ－メチル－ノルラウダノソリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０７．前記２つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第二のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、Ｎ－メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、６－Ｏ－メチル－ノルラウダノソリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目１０６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０８．前記カップリング酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１０９．前記カップリング酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞の外側で産生される、項目９９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１１０．（ａ）少なくとも１つのカップリング酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列を含み、少なくとも１つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの産生において使用された少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種コード配列をさらに含む遺伝子操作された非植物細胞、栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供する工程；
（ｂ）前記バッチ反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約５分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物と細胞物質とを含む溶液を生成する工程；ならびに
（ｃ）少なくとも１つの分離装置を使用して、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
１１１．前記バッチ反応器の少なくとも１つのプロセスパラメータが、結果として得られるビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物組成物を変異させるように改変可能である、項目１０８に記載の方法。
１１２．改変可能である前記少なくとも１つのプロセスパラメータが、溶存酸素、ｐＨ、撹拌速度、通気速度、及び細胞密度のうちの少なくとも１つを含む、項目１０９に記載の方法。
１１３．少なくとも１つの前記ベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、Ｎ－メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、６－Ｏ－メチル－ノルラウダノソリン、３’－ヒドロキシ－Ｎ－メチルコクラウリン、３’－ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンのうちの少なくとも１つを含む、項目１０８に記載の方法。
１１４．炭水化物源を、（Ｓ）－レチクリンに由来するベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する、遺伝子操作された非植物細胞。
１１５．グアノシン三リン酸をテトラヒドロビオプテリンに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１１６．前記複数の異種コード配列が、ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、セピアプテリンレダクターゼ、プテリン４ａ－カルビノールアミン脱水酵素、及びジヒドロプテリジンレダクターゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１１５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１１７．チロシンをＬ－ドパに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種コード配列をさらに含む、項目１１５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１１８．１つまたは複数の異種コード配列が、チロシンヒドロキシラーゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１１７に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１１９．Ｌ－ドパを（Ｓ）－レチクリンに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２０．前記複数の異種コード配列が、Ｌ－ドパデカルボキシラーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン－６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及び４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１１９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２１．前記複数の異種コード配列が、Ｌ－ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン－６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、及び４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１１９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２２．（Ｓ）－レチクリンをモルフィナンアルカロイドに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２３．前記複数の異種コード配列が、１－ベンジルイソキノリンアルカロイドエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１２２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２４．前記複数の異種コード配列が、テバイン－６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、及びコデイン脱メチル化酵素のうちの少なくとも１つを追加でコードする、項目１２３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２５．前記１つまたは複数の酵素を使用して（Ｓ）－レチクリンをプロモルフィナンアルカロイドに変換する、項目１２２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２６．前記１つまたは複数の酵素を使用して（Ｓ）－レチクリンを半合成モルフィナンアルカロイドに変換する、項目１２２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２７．（Ｓ）－レチクリンをカナジンに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２８．前記複数の異種コード配列が、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン－９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１２７に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１２９．前記複数の異種コード配列が、カナジンをプロトベルベリン産物に変換するよう１つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目１２８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３０．前記複数の異種コード配列が、カナジンをフタリドイソキンノリン（ｉｓｏｑｕｉｎｎｏｌｉｎｅ）産物に変換するよう１つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目１２８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３１．前記複数の異種コード配列が、カナジンをノスカピノイド産物に変換するよう１つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目１２８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３２．（Ｓ）－レチクリンをベルベリンに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３３．前記複数の異種コード配列が、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン－９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びテトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１３２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３４．前記複数の異種コード配列が、ベルベリンをベルベリン産物に変換するよう１つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目１３３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３５．（Ｓ）－レチクリンをプロトベルベリン産物に変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３６．前記複数の異種コード配列がベルベリン架橋酵素をコードする、項目１３８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３７．（Ｓ）－レチクリンをプロトピンに変換するために使用される１つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目１１４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３８．前記複数の異種コード配列が、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、及びシス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼのうちの少なくとも１つをコードする、項目１３７に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１３９．前記複数の異種コード配列が、プロトピンをプロトピン産物に変換するよう１つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目１３８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１４０．前記複数の異種コード配列が、プロトピンをベンゾフェナントリジン産物に変換するよう１つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目１３８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１４１．前記複数の異種コード配列が、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼを追加でコードする、項目１４０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１４２．（ａ）遺伝子操作された非植物細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供する工程；
（ｂ）前記バッチ反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を炭水化物源及び窒素源と接触させ、かつ、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約５分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、レチクリンに由来するベンジルイソキノリンアルカロイド産物と細胞物質とを含む溶液を生成する工程；ならびに
（ｃ）少なくとも１つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
１４３．前記バッチ反応器の少なくとも１つのプロセスパラメータが、結果として得られるベンジルイソキノリンアルカロイド産物組成物を変異させるように改変可能である、項目１３９に記載の方法。
１４４．改変可能である前記少なくとも１つのプロセスパラメータが、溶存酸素、ｐＨ、撹拌速度、通気速度、及び細胞密度のうちの少なくとも１つを含む、項目１４０に記載の方法。
１４５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリンアルカロイドを含む、項目１３９に記載の方法。
１４６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、プロトピン、ベンゾフェナントリジン、プロモルフィナン、モルフィナン、セコベルベリン、フタリドイソキノリン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される構造的クラスを有する、項目１４２に記載の方法。
１４７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、パパベリン、テトラヒドロパパベリン、１，２－ジヒドロパパベリン、及びオリエンタリンの群より選択されるベンジルイソキノリンである、項目１４３に記載の方法。
１４８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、スコウレリン、ケイランチホリン、スチロピン、ナンジニン、ジャトロリジン、ステホリジン、ジスクレタミン、シス－Ｎ－メチルスチロピン、テトラヒドロコルンバミン、パルマチン、テトラヒドロパルマチン、コルンバミン、カナジン、Ｎ－メチルカナジン、１－ヒドロキシカナジン、ベルベリン、Ｎ－メチル－オフィオカルピン、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン、及び１－ヒドロキシ－１０－Ｏ－アセチル－Ｎ－メチルカナジンの群より選択されるプロトベルベリンである、項目１４３に記載の方法。
１４９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、プロトピン、６－ヒドロキシプロトピン、アロクリプトピン、クリプトピン、ムラミン、及びタリクトリシンの群より選択されるプロトピンである、項目１４３に記載の方法。
１５０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ジヒドロサンギナリン、サンギナリン、ジヒドロケイリルビン、ケイリルビン、ジヒドロマルカピン、マルカピン、及びケレリトリンの群より選択されるベンゾフェナントリジンである、項目１４３に記載の方法。
１５１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、サルタリジン、サルタリジノール、及びサルタリジノール－７－Ｏ－アセテートの群より選択されるプロモルフィナンである、項目１４３に記載の方法。
１５２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルフィノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルフィン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、１４－ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、１４－ヒドロキシコデイン、モルフィノン、ヒドロモルフォン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、及びオキシモルフォンの群より選択されるモルフィナンである、項目１４３に記載の方法。
１５３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、４’－Ｏ－デスメチルマクラントアルデヒド、４’－Ｏ－デスメチルパパベロキシン、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシン、及び３－Ｏ－アセテイルパパベロキシンの群より選択されるセコベルベリンである、項目１４３に記載の方法。
１５４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンの群より選択されるフタリドイソキノリンである、項目１４３に記載の方法。
１５５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、マグノフロリン、コリツベリン、アポモルヒネ、ボルジン、イソボルジン、イソテバイン、イソコリツベリン、及びグラウフィンの群より選択されるアポルフィンである、項目１４３に記載の方法。
１５６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベルバムニン、グアットガウメリン、ダウリシン、及びリエンシニンの群より選択されるビスベンジルイソキノリンである、項目１４３に記載の方法。
１５７．（ａ）遺伝子操作された非植物細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、反応器に提供する工程；
（ｂ）前記反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を炭水化物源及び窒素源と接触させ、それにより、細胞物質とレチクリンに由来するベンジルイソキノリンアルカロイド産物とを含む溶液を生成する工程であって、前記溶液が、プロトベルベリン、モルフィナン、イソパビン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される１つ以下のクラスの分子を含む、前記工程；ならびに
（ｃ）少なくとも１つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
１５８．前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレオイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルヒネ、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される分子を、５ｐｐｍを超えて含有しない、項目１５４に記載の方法。
１５９．前記生成物流が、メコン酸を、５ｐｐｍを超えて含有しない、項目１５５に記載の方法。
１６０．前記生成物流が、殺虫剤、殺菌剤、または除草剤からなる群より選択される物質の検出可能な量を含有しない、項目１５４に記載の方法。
１６１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、少なくとも液液抽出を使用して前記生成物流から回収される、項目１５４に記載の方法。
１６２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、発酵プロセスが完了した直後に回収される、項目１５８に記載の方法。
１６３．前記遺伝子操作された非植物細胞が、２つ以上の異種コード配列を含み、前記２つ以上の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素及び第二の酵素をコードし、前記第一の酵素及び前記第二の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の方法。
１６４．前記遺伝子操作された非植物細胞が、３つの異種コード配列を含み、前記３つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素、第二の酵素及び第三の酵素をコードし、前記第一の酵素、前記第二の酵素、及び前記第三の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の方法。
１６５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１６６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１６７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目１６５または１６６に記載の方法。
１６８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１６９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１７０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目１６８または１６９に記載の方法。
１７１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１７２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１７３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目１７１または１７２に記載の方法。
１７４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１７５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１７６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目１７４または１７５に記載の方法。
１７７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１７８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１７９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目１７７または１７８に記載の方法。
１８０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１８１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１８２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目１８０または１８１に記載の方法。
１８３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１８４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１８５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目１８３または１８４に記載の方法。
１８６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１８７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１８８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目１８６または１８７に記載の方法。
１８９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
１９０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
１９１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目１８９または１９０に記載の方法。
１９２．前記遺伝子操作された非植物細胞が、２つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記２つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が、前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１６５～１９１のいずれかに記載の方法。
１９３．前記遺伝子操作された非植物細胞が、３つの追加の異種コード配列を含み、前記３つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１６５～１９１のいずれかに記載の方法。
１９４．２つ以上の異種コード配列を含み、前記２つ以上の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素及び第二の酵素をコードし、前記第一の酵素及び前記第二の酵素が、前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１９５．３つの異種コード配列を含み、前記３つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素、第二の酵素、及び第三の酵素をコードし、前記第一の酵素、前記第二の酵素、及び前記第三の酵素が、前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１９６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１９７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１９８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目１９６または１９７に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
１９９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２００．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、プロトピンＯ－デアルキラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目１９９または２００に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目２０２または２０３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目２０５または２０６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２０９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目２０８または２０９に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目２１１または２１２に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼ、及びシトクロムＰ４５０レダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目２１４または２１５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２１９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目２１７または２１８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２２０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２２１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２２２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目２２０または２２１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２２３．２つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記２つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９６～２２２のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２２４．３つの追加の異種コード配列を含み、前記３つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９６～２２２のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２２５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２２６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２２７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目２２５または２２６に記載の方法。
２２８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２２９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２３０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目２２８または２２９に記載の方法。
２３１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２３２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２３３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目２３１または２３２に記載の方法。
２３４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２３５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２３６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目２３４または２３５に記載の方法。
２３７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２３８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２３９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目２３７または２３８に記載の方法。
２４０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２４１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２４２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目２４０または２４１に記載の方法。
２４３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２４４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２４５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目２４３または２４４に記載の方法。
２４６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２４７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２４８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目２４６または２４７に記載の方法。
２４９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１６３に記載の方法。
２５０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１６４に記載の方法。
２５１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目２４９または２５０に記載の方法。
２５２．前記遺伝子操作された非植物細胞が、２つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記２つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目２２５～２５１のいずれかに記載の方法。
２５３．前記遺伝子操作された非植物細胞が、３つの追加の異種コード配列を含み、前記３つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の、第二の追加の、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目２２５～２５１のいずれかに記載の方法。
２５４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２５５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２５６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目２５４または２５５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２５７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２５８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンＯ－デアルキラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２５９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目２５７または２５８に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、シス－Ｎ－メチルスチロピン１４－ヒドロキシラーゼ、プロトピン－６－ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目２６０または２６１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目２６３または２６４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール７－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、テバイン６－Ｏ－脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインＯ－脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目２６６または２６７に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２６９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７１．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目２６９または２７０に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７２．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７３．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン９－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、Ｎ－メチルカナジン１－ヒドロキシラーゼ、１－ヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－ヒドロキシラーゼ、４’－Ｏ－デスメチル－３－Ｏ－アセチルパパベロキシンシンターゼ、１，１３－ジヒドロキシ－Ｎ－メチルカナジン１３－Ｏアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン４’－Ｏ－メチラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７４．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目２７２または２７３に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７５．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７６．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＢＩＡエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７７．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目２７５または２７６に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７８．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９４に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２７９．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン／ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９５に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２８０．前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目２２０または２２１に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２８１．２つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記２つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９６～２２２のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２８２．３つの追加の異種コード配列を含み、前記３つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の、第二の追加の、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン６－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、４’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、シトクロムＰ４５０ ８０Ｂ１、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、及びＢＩＡエピメラーゼからなる群より選択される、項目１９６～２２２のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２８３．遺伝子操作された酵母細胞である、前記項目のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２８４．遺伝子操作された酵母細胞である、前記項目のいずれかに記載の方法。
２８５．遺伝子操作された細菌細胞である、項目１～２８２のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
２８６．遺伝子操作された細菌細胞である、項目１～２８２のいずれかに記載の方法。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、かかる実施形態は単なる例示として提示されていることが、当業者に明らかであるだろう。本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更及び置換が当業者に可能であるだろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物がそれによって包括されることが意図される。

Claims (6)

  1. 遺伝子操作された酵母細胞内で、該細胞内で産生された（Ｓ）－レチクリンを少なくとも１つの酵素と接触させる工程であって、前記遺伝子操作された酵母細胞内で前記（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンに変換する、前記工程
    を含む、前記遺伝子操作された酵母細胞内で前記（Ｓ）－レチクリンを（Ｒ）－レチクリンにエピマー化する方法であって、
    前記酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含むエピメラーゼを含み、
    前記オキシダーゼドメインがシトクロムＰ４５０オキシダーゼ様ドメインであり、かつ、
    前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、
    前記方法。
  2. 前記少なくとも１つの酵素が、前記遺伝子操作された酵母細胞を培養することにより産生される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記（Ｒ）－レチクリンまたはその誘導体を前記細胞培養物から回収する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記（Ｓ）－レチクリンが、Ｌ－チロシンから始まる代謝経路により、前記遺伝子操作された酵母細胞内で産生される、請求項１～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記エピメラーゼが融合エピメラーゼである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記エピメラーゼが分割エピメラーゼである、請求項１に記載の方法。
JP2017558387A 2015-05-08 2016-05-09 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法 Active JP7266966B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021088222A JP2021129587A (ja) 2015-05-08 2021-05-26 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法
JP2024010647A JP2024038497A (ja) 2015-05-08 2024-01-29 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562159122P 2015-05-08 2015-05-08
US62/159,122 2015-05-08
US201562174475P 2015-06-11 2015-06-11
US62/174,475 2015-06-11
PCT/US2016/031506 WO2016183023A1 (en) 2015-05-08 2016-05-09 Methods of producing epimerases and benzylisoquinoline alkaloids

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021088222A Division JP2021129587A (ja) 2015-05-08 2021-05-26 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018515093A JP2018515093A (ja) 2018-06-14
JP2018515093A5 JP2018515093A5 (ja) 2019-05-23
JP7266966B2 true JP7266966B2 (ja) 2023-05-01

Family

ID=57248432

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017558387A Active JP7266966B2 (ja) 2015-05-08 2016-05-09 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法
JP2021088222A Pending JP2021129587A (ja) 2015-05-08 2021-05-26 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法
JP2024010647A Pending JP2024038497A (ja) 2015-05-08 2024-01-29 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021088222A Pending JP2021129587A (ja) 2015-05-08 2021-05-26 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法
JP2024010647A Pending JP2024038497A (ja) 2015-05-08 2024-01-29 エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US11859225B2 (ja)
EP (2) EP3294865B1 (ja)
JP (3) JP7266966B2 (ja)
KR (1) KR20180016396A (ja)
CN (1) CN107960102A (ja)
AU (3) AU2016261490B2 (ja)
BR (1) BR112017023816A2 (ja)
CA (1) CA2983445A1 (ja)
DK (1) DK3294865T3 (ja)
ES (1) ES2945359T3 (ja)
GB (1) GB2555044B (ja)
HK (1) HK1246354A1 (ja)
IL (1) IL255136B2 (ja)
WO (1) WO2016183023A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066642A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
US10190141B2 (en) 2013-12-04 2019-01-29 Epimeron Inc. Compositions and methods for making (R)-Reticuline and precursors thereof
CN107002103B (zh) * 2014-11-17 2022-01-28 小利兰.斯坦福大学托管委员会 产生类诺斯卡品的微生物以及其制备和使用方法
AU2017309313B2 (en) 2016-08-09 2023-11-02 River Stone Biotech, Inc. Biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and benzylisoquinoline alkaloid precursors
CA3052635A1 (en) * 2017-02-06 2018-11-08 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of tyramine by fermentation
GB2579940B (en) * 2017-08-03 2022-11-30 Antheia Inc Engineered benzylisoquinoline alkaloid epimerases and methods of producing benzylisoquinoline alkaloids
WO2019203870A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Abbvie Inc. Methods of treating heavy menstrual bleeding
US20200325509A1 (en) * 2017-09-08 2020-10-15 Intrexon Corporation Microorganisms and Methods in the Fermentation of Benzylisoquinoline Alkaloids
AU2018379410A1 (en) 2017-12-05 2020-07-23 Willow Biosciences Inc. Neopinone isomerase and methods of using
CN111971390A (zh) * 2018-02-08 2020-11-20 安思雅公司 产生吗啡喃生物碱及衍生物的方法
WO2019243624A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Valorbec, Limited Partnership Production of benzylisoquinoline alkaloids in recombinant hosts
CN109468351B (zh) * 2018-11-27 2020-07-14 湖南美可达生物资源股份有限公司 高效酶催化合成血根碱与白屈菜红碱的方法
CN114302951A (zh) * 2019-03-26 2022-04-08 安思雅公司 提高吗啡喃生物碱和衍生物的产量的方法
CN112516143B (zh) * 2020-11-30 2023-03-21 重庆医科大学 双苄四氢异喹啉衍生物在制备抗冠状病毒药物中的应用
WO2024100063A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 River Stone Biotech Aps Genetically modified benzylisoquinoline alkaloid-producing host cells with modified efflux transporter gene expression
CN116536285A (zh) * 2023-05-26 2023-08-04 浙江中医药大学 一种粉防己乌药碱氮甲基转移酶cnmt及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066642A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
WO2015081437A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Epimeron Inc. Compositions and methods for making (r)-reticuline and precursors thereof

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3785927A (en) 1973-02-12 1974-01-15 Merck & Co Inc Process for converting(-)reticuline to(+)salutaridine
GB8910958D0 (en) 1989-05-12 1989-06-28 Bruce Neil C Assay
US6204337B1 (en) 1996-11-19 2001-03-20 The Board Of Regents Of The University And Community College System Of Neveda Solid-phase synthesis of codeine from morphine
AUPO887297A0 (en) 1997-08-29 1997-09-25 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Cytochrome p450 reductase from poppy plants
AUPP946399A0 (en) 1999-03-26 1999-04-22 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Codeinone reductase from alkaloid poppy
ATE532874T1 (de) 2001-02-15 2011-11-15 Univ Chicago Verfahren zum nachweis in hefe für mittels die proteinfaltung beeinflussen
EP1270727A1 (en) 2001-06-11 2003-01-02 Institut für Pflanzenbiochemie Salutaridinol 7-O-acetyltransferase and derivatives thereof
DE10232930A1 (de) 2002-07-19 2004-02-05 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie
US6579985B1 (en) 2002-10-21 2003-06-17 Mallinckrodt Inc. Preparation of codeine from morphine
EP1512748A1 (en) 2003-09-03 2005-03-09 Johnson & Johnson Research Pty Limited O-methyltransferases of tetrahydrobenzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in papaver somniferum
CA2538918A1 (en) 2003-09-17 2005-04-14 Kyoto University Process for producing intermediate of useful alkaloid biosynthesis according to rnai method
TWI223707B (en) 2003-12-30 2004-11-11 Univ Nat Yunlin Sci & Tech Drug sensor for the alkaloid measurement, the preparation thereof, and measuring systems comprising the same
US6949645B1 (en) 2004-05-20 2005-09-27 Acura Pharmaceuticals, Inc. Process for the production of opiates
US7482140B2 (en) 2004-06-15 2009-01-27 Ajinomoto Co., Inc. L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine
EP1632565A1 (en) 2004-08-12 2006-03-08 Johnson & Johnson Research Pty Limited Modulation of alkaloid biosynthesis in plants and plants having altered alkaloid biosynthesis
WO2006124895A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Massachusetts Institute Of Technology Mutations for enhanced tyrosine production
US8318474B1 (en) 2005-05-23 2012-11-27 California Institute Of Technology Engineered yeast cells and uses thereof
US20070199090A1 (en) 2006-02-22 2007-08-23 Nestor Apuya Modulating alkaloid biosynthesis
EP1837396A1 (en) 2006-03-23 2007-09-26 Institut für Pflanzenbiochemie-IPB Salutaridine reductase and morphine biosynthesis
WO2008067070A2 (en) * 2006-10-19 2008-06-05 California Institute Of Technology Compositions and methods for producing benzylisoquinolines alkaloids
US20080102499A1 (en) 2006-10-27 2008-05-01 Lori Jean Templeton Method of enhancing L-tyrosine production in recombinant bacteria
US9102948B2 (en) 2006-11-17 2015-08-11 22Nd Century Limited, Llc Regulating alkaloids
US8993280B2 (en) 2007-06-12 2015-03-31 Kyoto University Method for producing alkaloids
JP2009225669A (ja) 2008-03-19 2009-10-08 Ishikawa Pref Gov 植物ベンジルイソキノリンアルカロイドの生産方法
US8546572B2 (en) 2008-03-31 2013-10-01 Sun Pharmaceutical Industries Limited Process for the preparation of morphinane analogues
US8541647B2 (en) 2008-05-29 2013-09-24 Tasmania Alkaloids Pty, Ltd. Papaver somniferum with high concentration of codeine
US20110288114A1 (en) 2008-06-20 2011-11-24 Kinemed, Inc. Compositions for the treatment of fibrotic diseases or conditions
WO2011058446A2 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Uti Limited Partnership Thebaine 6-o-demethylase and codeine o-demethylase from papaver somniferum
CA3086817C (en) 2010-06-22 2023-01-03 Sun Pharmaceutical Industries (Australia) Pty Ltd Methyltransferase nucleic acids and polypeptides
WO2012010872A2 (en) 2010-07-22 2012-01-26 Glaxosmithkline Australia Pty Limited Plant cytochrome p450
JP5761723B2 (ja) 2010-09-22 2015-08-12 石川県公立大学法人 植物ベンジルイソキノリンアルカロイドの生産方法
US20140013465A1 (en) 2010-11-01 2014-01-09 Tpi Enterprises Ltd. Papaver bracteatum with modified alkaloid content
US20130340119A1 (en) 2010-11-05 2013-12-19 Basf Plant Science Company Gmbh Method for Increasing Yield and Fine Chemical Production in Plants
CN102657652A (zh) 2011-03-10 2012-09-12 李宏 通式ⅰ所述的双苄基异喹啉生物碱衍生物或类似物的新用途
WO2012135389A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 The Regents Of The University Of California Host cells and methods for oxidizing aromatic amino acids
EP2565262A1 (en) 2011-08-31 2013-03-06 VTU Holding GmbH Protein expression
US8809028B2 (en) 2011-11-07 2014-08-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Biosynthesis of caffeic acid and caffeic acid derivatives by recombinant microorganisms
BR112014015921A2 (pt) 2011-12-27 2021-05-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation processos para produzir lipídeos
GB201204407D0 (en) 2012-03-13 2012-04-25 Glaxosmithkline Australia Pty Ltd Nucleic acid molecule
DK3553177T3 (da) 2013-03-15 2021-02-15 Univ Leland Stanford Junior Benzylisoquinolinalkaloider (bia) som producerer mikrober, og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
AU2014306345B2 (en) 2013-08-16 2018-12-13 Willow Biosciences Inc. Compositions and methods for making noscapine and synthesis intermediates thereof
WO2015103711A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Valorbec Société en Commandite Method of making a benzylisoquinoline alkaloid (bia) metabolite, enzymes therefore
EP3137618A4 (en) 2014-04-29 2017-12-13 Epimeron Inc. Improved methods for making and using polynucleotide sequences in the synthesis of alkaloid compounds
US10006010B2 (en) * 2014-05-16 2018-06-26 The University Of York Cytochrome P450 fusion protein
CA2952638C (en) 2014-06-19 2024-04-09 Epimeron Inc. Compositions and methods for making (s)-norcoclaurine and (s)-norlaudanosoline, and synthesis intermediates thereof
EP3183348A4 (en) 2014-08-22 2018-01-17 Epimeron Inc. Compositions and methods for making alkaloid morphinans
WO2016049364A2 (en) 2014-09-26 2016-03-31 The Regents Of The University Of California Tyrosine hydroxylase variants and methods of use thereof
CN107002103B (zh) 2014-11-17 2022-01-28 小利兰.斯坦福大学托管委员会 产生类诺斯卡品的微生物以及其制备和使用方法
US11085060B2 (en) 2015-01-02 2021-08-10 Georgia Tech Research Corporation Pterin-dependent biocatalysts and uses thereof
CN107660207B (zh) 2015-03-10 2020-09-29 罗德科技公司 丁丙诺啡乙酸盐及用于制备丁丙诺啡的方法
WO2016149821A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 Valorbec Société en Commandite Methods of making morphinan alkaloids and enzymes therefore
CA2983419A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
GB201511156D0 (en) 2015-06-24 2015-08-05 Glaxosmithkline Australia Pty Ltd And University Of York Production of alkaloids
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
WO2017083632A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 President And Fellows Of Harvard College Host cells and systems for membrane protein expression
GB2546285A (en) 2016-01-13 2017-07-19 Sun Pharmaceutical Ind Australia Pty Ltd Modified plant
JP6368328B2 (ja) 2016-02-10 2018-08-01 株式会社豊田自動織機 レジスタおよび車両
CA3028817A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 Serturner Corp. Polynucleotides and polypeptides useful for making alkaloid compounds
EP3475417B1 (en) 2016-06-27 2023-05-24 Antheia, Inc. Compositions and methods for making benzylisoquinoline alkaloids, morphinan alkaloids, thebaine, and derivatives thereof
AU2017309313B2 (en) 2016-08-09 2023-11-02 River Stone Biotech, Inc. Biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and benzylisoquinoline alkaloid precursors
CA2941315C (en) 2016-08-12 2018-03-06 Api Labs Inc. High thebaine poppy and methods of producing the same
CA3034848A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Gregory Michael SYMONS P. somniferum plants for the production of codeine
WO2018136654A1 (en) 2017-01-19 2018-07-26 Donald Danforth Plant Science Center Morphinan n-demethylase isolated from the methylobacterium thebainfresser and methods of use thereof
BR112021017659A2 (pt) 2019-03-08 2021-11-16 Univ Leland Stanford Junior Células hospedeiras não vegetais produtoras de alcaloide de tropano (ta), e métodos de preparação e uso das mesmas

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066642A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
WO2015081437A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Epimeron Inc. Compositions and methods for making (r)-reticuline and precursors thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１１年，Ｖｏｌ．２：３２６，ｐ．１－８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３２７
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４年，Ｖｏｌ．６５，ｐ．１０３９－１０４６
ＰｌｏＳ ｏｎｅ，２０１３年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１ ｅ５２７８４，ｐ．１－１５

Also Published As

Publication number Publication date
US11859225B2 (en) 2024-01-02
JP2024038497A (ja) 2024-03-19
IL255136B1 (en) 2023-05-01
KR20180016396A (ko) 2018-02-14
GB201719939D0 (en) 2018-01-17
IL255136B2 (en) 2023-09-01
IL255136A0 (en) 2017-12-31
AU2016261490B2 (en) 2019-10-31
BR112017023816A2 (pt) 2018-07-31
GB2555044A (en) 2018-04-18
WO2016183023A1 (en) 2016-11-17
JP2018515093A (ja) 2018-06-14
CA2983445A1 (en) 2016-11-17
HK1246354A1 (zh) 2018-09-07
JP2021129587A (ja) 2021-09-09
DK3294865T3 (da) 2023-05-08
EP3294865A1 (en) 2018-03-21
AU2022215268A1 (en) 2022-09-01
EP4253525A2 (en) 2023-10-04
CN107960102A (zh) 2018-04-24
GB2555044B (en) 2021-03-17
EP3294865A4 (en) 2019-06-26
AU2019246920A1 (en) 2019-11-14
ES2945359T3 (es) 2023-06-30
EP3294865B1 (en) 2023-04-12
EP4253525A3 (en) 2023-10-18
US20180163241A1 (en) 2018-06-14
AU2019246920B2 (en) 2022-05-12
AU2016261490A1 (en) 2017-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7266966B2 (ja) エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法
JP7199417B2 (ja) 遺伝子操作されたベンジルイソキノリンアルカロイドエピメラーゼおよびベンジルイソキノリンアルカロイドの生成方法
JP7247153B2 (ja) ノスカピノイド産生微生物ならびにその作製及び使用方法
US11396668B2 (en) Methods of producing nor-opioid and nal-opioid benzylisoquinoline alkaloids
JP2021513346A (ja) モルフィナンアルカロイドおよび誘導体を生成する方法
CN114302951A (zh) 提高吗啡喃生物碱和衍生物的产量的方法
US20240218408A1 (en) Methods of Producing Epimerases and Benzylisoquinoline Alkaloids
CN116964190A (zh) 提高吗啡喃类生物碱和衍生物的产量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20171108

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190409

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190409

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20200121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200205

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200501

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200804

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20210127

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210526

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20210526

C11 Written invitation by the commissioner to file amendments

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11

Effective date: 20210607

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210630

C092 Termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C092

Effective date: 20210705

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210706

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20210707

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20210708

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20210910

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20210915

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20220207

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20220406

C13 Notice of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13

Effective date: 20220616

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20220803

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220825

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20221005

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221207

C23 Notice of termination of proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23

Effective date: 20230224

C03 Trial/appeal decision taken

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03

Effective date: 20230329

C30A Notification sent

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012

Effective date: 20230329

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230419

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7266966

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150