JP7266966B2 - エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法 - Google Patents
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Description
合衆国法典第35巻119条(e)の下で、本出願は、2015年5月8日に出願された米国仮特許出願番号第62/159,122号及び2015年6月11日に出願された米国仮特許出願番号第62/174,475号の出願日に対する優先権を主張し、これらの出願の開示は、参照により本明細書に組込まれる。
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約番号AT007886の下で、政府の支援を伴ってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1つの酵素と接触させる工程であって、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する、前記工程
を含む、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにエピマー化する方法。
[本発明1002]
前記少なくとも1つの酵素が、前記少なくとも1つの酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することにより産生される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に加える工程
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を前記細胞培養物から回収する工程
をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記少なくとも1つの酵素がオキシダーゼを含む、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つの酵素がレダクターゼを含む、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記少なくとも1つの酵素がエピメラーゼを含む、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記エピメラーゼが、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含む、本発明1007または1008の方法。
[本発明1010]
前記オキシダーゼドメインがシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記遺伝子操作された非植物細胞が、遺伝子操作された酵母細胞である、本発明1007~1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(S)-レチクリンである、本発明1001~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R)-レチクリンである、本発明1001~1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、L-チロシンから始まる代謝経路により、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、本発明1001~1014のいずれかの方法。
参照による組込み
本明細書中で言及する全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的に及び個別に参照により組込まれると示されている場合と同じ程度に参照により本明細書に組込まれる。
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において多様なベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)を産生するための方法を提供する。本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において産生される多様なアルカロイドの組成物をさらに提供する。加えて、本開示は、遺伝子操作された宿主細胞においてエピメラーゼを産生するための方法を提供する。特定の場合では、本開示は、遺伝子操作された宿主細胞において(R)-1-ベンジルイソキノリン(benyzlisoquinoline)アルカロイドへの(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマー化を通して多様なアルカロイド産物を産生するための方法を提供する。さらに特定の場合では、本開示は、(R)-レチクリンへの(S)-レチクリンのエピマー化を通して多様なアルカロイド産物を産生するための方法を提供する。
目的のBIAを産生する宿主細胞を提供する。いくつかの例では、宿主細胞の遺伝子操作された菌株、例えば、本発明の遺伝子操作された菌株は、目的のベンジルイソキノリンアルカロイドならびに前駆体BIA、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、プロトピン、ベンゾフェナントリジン、プロモルフィナン、モルフィナン、セコベルベリン、フタリドイソキノリン、アポルフィン、ビスベンジルイソキノリン、及びその他を含むがこれらに限定されない、いくつかの構造的クラスにわたるそれらの改変物を産生するためのプラットフォームを提供する。これらのクラスはそれぞれ、そのクラスのメンバーへと導き得る遺伝子操作された宿主細胞生合成経路の任意の好都合なメンバーの、それらのクラスの生合成前駆体、中間体及び代謝産物を含むと意図される。化合物の非限定的な例を、これらの構造的クラスのそれぞれについて以下に示す。いくつか場合では、所与の例の構造はそれ自身がベンジルイソキノリンアルカロイドとして特徴づけられても、特徴づけられなくてもよい。本化学実体は、単一エナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマーの混合物、及び中間体混合物を含む、全ての可能な異性体を含むと意図される。
任意の好都合な細胞を、主題の宿主細胞及び方法に使用してよい。いくつかの場合では、宿主細胞は非植物細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は、微生物細胞であることを特徴としてよい。ある特定の場合では、宿主細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、または酵母細胞である。任意の好都合なタイプの宿主細胞は、主題のBIA産生細胞の産生において使用してよい。例えば、US2008/0176754、及びUS2014/0273109を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が組込まれる。目的の宿主細胞には、細菌細胞、例えば、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、及びネズミチフス菌(Salmonella typhimuium)細胞、昆虫細胞、例えば、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster) S2及びスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) Sf9細胞、ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、宿主細胞は、酵母細胞または大腸菌(E.coli)細胞である。いくつかの場合では、宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドなどの目的のBIAを産生するように遺伝子操作された酵母の菌株に由来する。いくつかの例では、宿主細胞は、目的の酵素を産生するように遺伝子操作された酵母の菌株に由来する。いくつかの例では、宿主細胞は、エピメラーゼを産生するように遺伝子操作された酵母の菌株に由来する。エピメラーゼは、オキシダーゼ及びレダクターゼを有してよい。加えて、エピメラーゼは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換することができ得る。さらに、エピメラーゼは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへと変換するために使用されるようにオキシダーゼまたはレダクターゼ活性を保持するより小さい酵素へと分離され得る。
宿主細胞は、目的のBIAの産生を提供する1つまたは複数の改変(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多くの改変)を含むように遺伝子操作されてよい。加えてまたはあるいは、宿主細胞は、目的の酵素の産生を提供する1つまたは複数の改変(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多くの改変)を含むように遺伝子操作されてよい。いくつかの場合では、改変は、遺伝子改変、例えば、遺伝子もしくはその断片の突然変異、付加、もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写制御である。本明細書で用いるとき、「突然変異」という用語は、基準配列またはモチーフと比べて、アミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換を指す。突然変異は、元来の遺伝子座での天然型遺伝子に対する定向突然変異として取り込まれてよい。いくつかの場合では、突然変異は、別々の遺伝子座での遺伝子組込みとして導入された遺伝子の追加のコピーとして、またはエピソーマルベクター、例えば2μもしくは動原体プラスミド上の追加のコピーとして取り込まれてよい。ある特定の例では、酵素の基質阻害されたコピーは、天然の細胞転写制御下にある。いくつかの例では、酵素の基質阻害されたコピーは、それを合成のプロモーターの制御下に置くことで、タンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的制御と共に導入される。いくつかの例では、1つまたは複数の改変の対象は、天然型遺伝子であってよい。いくつかの例では、1つまたは複数の改変の対象は、天然でない遺伝子であってよい。いくつかの例では、天然でない遺伝子は、宿主細胞に挿入されてよい。さらなる例では、天然でない遺伝子は、宿主細胞に挿入される前に、1つまたは複数の改変により変異されてよい。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害軽減突然変異(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多く)を細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対して天然である(例えば、未改変細胞中に存在する)。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対して天然でない。本明細書で用いるとき、「基質阻害軽減突然変異」という用語は、細胞の基質阻害制御機構を軽減させる突然変異を指す。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回収促進機構(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多く)を細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である(例えば、未改変細胞中に存在する)。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。本明細書で用いるとき、「補因子回収促進機構」という用語は、細胞の補因子回収制御機構を促進する機構を指す。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の生産物阻害軽減突然変異(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多く)を細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である(例えば、未改変細胞中に存在する)。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。本明細書で用いるとき、「生産物阻害軽減突然変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞の短期及び/または長期生産物阻害制御機構を軽減する突然変異を指す。短期生産物阻害は、補助基質結合部位で競合的結合が生じる細胞の制御機構である。長期生産物阻害は、所望の経路から離れた化合物の不可逆的な結合が生じる細胞の制御機構である。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害軽減突然変異(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多く)を細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む、細胞である。いくつかの場合では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である(例えば、未改変細胞中に存在する)。加えてまたはあるいは、いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。本明細書で用いるとき、「フィードバック阻害軽減突然変異」という用語は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害制御機構を軽減する突然変異を指す。フィードバック阻害は、調節された化合物の合成経路における酵素が、その化合物がある特定のレベルまで蓄積したときに阻害され、それにより、細胞内の該化合物の量を調整する、細胞の制御機構である。フィードバック阻害を軽減する突然変異は、対照細胞と比べて遺伝子操作された宿主細胞における調節された酵素の阻害を低下させる。このようにして、遺伝子操作された宿主細胞は、調節された化合物またはその下流生合成産物のレベルを増加させる。いくつかの場合では、調節された酵素の阻害の軽減は、阻害のIC50が、2倍以上、例えば、3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上、またはさらに多く増加することを意味する。増加したレベルとは、対照細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルの110%以上である、例えば、120%以上、130%以上、140%以上、150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、または200%以上、例えば、少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上であるまたはさらに多い、宿主細胞における調節された化合物またはその下流産物のレベルを意味する。
宿主細胞は、細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の1つまたは複数の転写調節改変(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多くの改変)を含んでよい。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然である。いくつかの例では、1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、細胞に対しては天然でない。細胞の任意の好都合な生合成酵素遺伝子は、転写調節の標的とされ得る。転写調節とは、改変された細胞における目的の遺伝子の発現が、調節される、例えば、対照細胞(例えば、未改変細胞)と比べて増加または低減、増強または抑制されることを意味する。いくつかの場合では、目的の遺伝子の転写調節には、発現を増加させるまたは増強させることが含まれる。発現を増加させるまたは増強させることは、目的の遺伝子の発現レベルが、対照、すなわち改変されていない同一細胞における発現と比較して(例えば、任意の好都合な遺伝子発現アッセイを使用することにより)、2倍以上、例えば、5倍以上、ときには25、50、または100倍以上及びある特定の実施形態では300倍以上に増加することを意味する。あるいは、細胞中の目的の遺伝子の発現が検出できないほどに低い場合、目的の遺伝子の発現レベルは、発現が容易に検出できるレベルまで増加した場合に、増加していると考えられる。ある特定の例では、目的の遺伝子の転写調節は、発現を低減させるまたは抑制することを含む。発現を低減させるまたは抑制することは、目的の遺伝子の発現レベルが、対照と比較して、1/2以下、例えば、1/5以下、ときには1/25、1/50、または1/100以下及びある特定の実施形態では1/300以下に低減されることを意味する。いくつかの場合では、発現は、検出できないレベルまで低減する。主題の宿主細胞における使用に適応され得る目的の宿主細胞のプロセスの改変は、Smolke et alによる米国特許公開第20140273109号(14/211,611)に記載されており、この開示は参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
遺伝子操作された宿主細胞は、細胞の酵素に対して1つまたは複数の不活性化突然変異を含んでよい(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多く)。1つまたは複数の不活性化突然変異を含むことは、目的のBIAまたは同じ事象をもたらす所望の酵素もしくは前駆体のレベルを増加させるように遺伝子操作された宿主細胞の合成経路のフラックスを改変し得る。いくつかの例では、1つまたは複数の不活性化突然変異は、細胞に対しては天然である酵素に対するものである。加えてまたはあるいは、1つまたは複数の不活性化突然変異は、細胞に対しては天然でない酵素に対するものである。本明細書で用いるとき、「不活性化突然変異」とは、この突然変異が、目的の遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的活性を不活性化する、細胞の遺伝子または調節DNA配列に対する1つまたは複数の突然変異を意味する。いくつかの場合では、遺伝子は、細胞に対しては天然である。いくつかの例では、この遺伝子は、不活性化され、宿主細胞によって産生される目的のBIAの合成経路の一部であるか、またはそれに連結された酵素をコードする。いくつかの例では、不活性化突然変異は、目的の遺伝子を制御する調節DNA配列中に位置する。ある特定の場合では、不活性化突然変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。任意の好都合な突然変異(例えば、本明細書に記載のような)を使用して、目的の遺伝子または調節DNA配列を不活性化させ得る。「不活性化」または「不活性化する」とは、突然変異した遺伝子により発現されるタンパク質の生物学的活性が、突然変異していない対照遺伝子により発現される対照タンパク質と比べて、10%以上、例えば、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、または99%以上低下することを意味する。いくつかの場合では、タンパク質は酵素であり、不活性化突然変異は、酵素の活性を低下させる。
本明細書に記載のいくつかの方法、プロセス、及びシステムは(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換を記載する。これらの方法、プロセス及びシステムのいくつかは、遺伝子操作された宿主細胞を含んでよい。いくつかの例では、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換は、多様な範囲のアルカロイドへの基質の変換において重要な工程である。いくつかの例では、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの変換は、エピマー化反応を含む。いくつかの場合では、基質アルカロイドのエピマー化は、(S)-基質を対応するシッフ塩基またはイミン中間体へと酸化すること、次いでこの中間体を、図3に提示するように及びスキーム1に概略的に表すように、(R)-産物へと立体特異的に還元することにより行われてよい。スキーム1に提示するように、R1、R2、R3、及びR4は、HまたはCH3であってよい。R5は、H、OH、またはOCH3であってよい。
の化合物またはその塩であり、
式中、R1、R2、R3、及びR4は、水素及びメチルから独立して選択され;
R5は、水素、ヒドロキシ、及びメトキシから選択される。
の化合物またはその塩であり、
式中、R3は、水素及びC1-C4アルキルから選択され;
R6及びR7は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1-C4アシル、C1-C4アルキル、及びC1-C4アルコキシからそれぞれ独立して選択され;
nは、0、1、2、3、または4であり;
n’は、0、1、2、3、4または5である。
の化合物またはその塩であり、
式中、R6及びR7は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1-C4アシル、C1-C4アルキル、及びC1-C4アルコキシからそれぞれ独立して選択され;
n及びn’は独立して、0、1、2、3、または4である。
の化合物またはその塩であり、
式中、R3は、水素及びC1-C4アルキルから選択され;
R8及びR9は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1-C4アシル、C1-C4アルキル、及びC1-C4アルコキシからそれぞれ独立して選択され;
R10は存在しない、水素、またはC1-C4アルキルであり;
2つのR8及びそれらが付着する炭素原子は、5から8員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し;
2つのR9及びそれらが付着する炭素原子は、5から8員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し;
n及びn’は独立して、0、1、2、3、または4である。
の化合物またはその塩であり、
式中、R3は、水素及びC1-C4アルキルから選択され;
R8及びR9は、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1-C4アシル、C1-C4アルキル、及びC1-C4アルコキシからそれぞれ独立して選択され;
R11は、水素及びアルデヒドから選択され;
R12は、水素、ヒドロキシル、及びO-メチルから選択され;
R13は、ヒドロキシル及びO-メチルから選択され;
2つのR8及びそれらが付着する炭素原子は、5から8員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し;
2つのR9及びそれらが付着する炭素原子は、5から8員シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を任意選択で形成し;
n及びn’は独立して、0、1、2、3、または4である。
本明細書に提供するいくつかの方法、プロセス、及びシステムは、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド(ビスBIA)の産生を記載する。ビスBIAは、2つのBIAモノマー間のカップリング反応により形成され得る二量体分子である。例では、ビスBIAは、炭素-酸素カップリング反応により形成されてよい。他の例では、ビスBIAは、炭素-炭素カップリング反応により形成されてよい。いくつかの例では、ビスBIA二量体分子は、2つの同一のBIAモノマーを含むホモ二量体である。例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つのBIAモノマーを産生し得る。これらの例では、BIAモノマーは、1つまたは複数のカップリング酵素と接触したときにホモ二量体を形成し得る。他の例では、ビスBIA二量体分子は、2つの異なるBIAモノマーを含むヘテロ二量体である。例えば、ビスBIAは、互いのエナンチオマーであるBIAモノマーを含むヘテロ二量体であってよい。いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、2つ以上のBIAモノマーを産生し得る。これらの例では、BIAモノマーは、1つまたは複数のカップリング酵素と接触したときに、ホモ二量体及びヘテロ二量体を形成し得る。
のうちのいずれか1つの化合物またはその塩であり、
式中、R1a、R1b、R2a、及びR2bは、水素及びC1-C4アルキルから独立して選択され;
R3a、R3b、R6a、R6b、R8a、及びR8bは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1-C4アシル、C1-C4アルキル、及びC1-C4アルコキシから独立して選択され;
R4a及びR5aは、水素及びC1-C4アルキルから独立して選択されるか、またはR4a及びR5aは、一緒になってメチレン架橋を形成し;
R4b及びR5bは、水素及びC1-C4アルキルから独立して選択されるか、またはR4b及びR5bは、一緒になってメチレン架橋を形成し;
R7a、R7b、及びR9aは、水素及びC1-C4アルキルから独立して選択される。
いくつかの例では、遺伝子操作された宿主細胞は、遺伝子操作された宿主細胞が、例えば、本明細書に記載のような所望の目的の酵素及び/または目的のBIAを産生することを可能にする活性をコードする1つまたは複数の異種コード配列(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上)を有する。本明細書で用いるとき、「異種コード配列」という用語は、宿主生物に通常は存在せず、かつ適切な条件下で宿主細胞において発現され得る、ペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするかまたは最終的にコードする、任意のポリヌクレオチドを指す。従って、「異種コード配列」は、宿主細胞に通常存在するコード配列の複数のコピーを含み、よって該細胞は、該細胞に通常存在しないコード配列の追加のコピーを発現する。異種コード配列は、RNAもしくはその任意の型、例えばmRNA、DNAもしくはその任意の型、例えばcDNA、またはRNA/DNAのハイブリッドであってよい。目的のコード配列は、コード配列、イントロン、プロモーター領域、3’-UTR及びエンハンサー領域などの特徴を含む完全長の転写単位を含むが、これらに限定されない。
プロセス工程
上記に要約されているように、本発明の態様は、目的のベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)を調製する方法を含む。加えて、本発明の態様は、目的の酵素を調製する方法を含む。従って、本発明の態様は、1つまたは複数の宿主細胞改変(例えば、本明細書に記載のような)が、細胞が目的の出発化合物を目的の生成物酵素及び/またはBIAへと変換するように機能的に発現される条件下で遺伝子操作された宿主細胞を培養することを含む。1つまたは複数の異種コード配列が機能的に発現され、目的の出発化合物を目的の生成物酵素またはBIAへと変換するように、タンパク質産生に好適な条件下で遺伝子操作された宿主細胞を培養する工程を含む方法も提供する。例では、本方法は、遺伝子操作された宿主細胞(例えば、本明細書に記載のような)を培養する工程;出発化合物を細胞培養物に加えること;及びBIAを細胞培養物から回収する工程を含む、ベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)を調製する方法である。いくつかの例では、本方法は、遺伝子操作された宿主細胞(例えば、本明細書に記載のような)を培養する工程;出発化合物を細胞培養物に加える工程;及び酵素を細胞培養物から回収する工程を含む、酵素を調製する方法である。
主題の方法は、細胞培養物から目的の酵素及び/またはBIAを回収する工程も含んでよい。任意の好都合な分離法及び単離法(例えば、クロマトグラフィー法または沈降法)を、主題の方法における使用に適応させて、細胞培養物から目的の酵素及び/またはBIAを回収し得る。ろ過法を使用して、細胞培養物の不溶性画分から可溶性画分を分離し得る。いくつかの場合では、液体クロマトグラフィー法(例えば、逆相HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー)を使用して、細胞培養物の他の可溶性成分から目的のBIAを分離し得る。いくつかの場合では、抽出法(例えば、液体抽出、pH系精製、固相抽出、親和性クロマトグラフィー、イオン交換、等)を使用して、細胞培養物の他の成分から目的の酵素及び/またはBIAを分離し得る。
後続の精製工程は、目的の個別の産物種を高純度に回収するために当該分野で公知の方法を使用して目的のBIA産物を富化した発酵後溶液を処理することを必然的に含む。
清澄化した酵母培養用培地(CYCM)は、複数の不純物を含有し得る。清澄化した酵母培養用培地は、真空及び/または加熱によって脱水されて、アルカロイド富化粉末が得られ得る。この産物は、ポピーストロー(CPS)またはアヘンの濃縮物に類似しており、これは、ケシを育てている国から輸出され、API製造業者が購入した。本発明の目的のために、CPSは、そこから所望のアルカロイド産物が最終的にさらに精製され得る任意のタイプの精製植物抽出物の代表例である。表4及び表5は、CYCMまたはCPSのいずれかに特異的であり得るかまたは両方に存在し得る、これら2つの産物中の不純物を強調する。一部のBIAには不純物として色素が含まれている場合があるが、他のBIAは色素自体に分類され得る。したがって、これらのBIAは、非色素不純物に基づいて不純物について評価され得る。これらの不純物のサブセットについて未知の起源の産物を分析することにより、当業者は、産物が酵母産生宿主由来であるかまたは植物産生宿主由来であるかを決定し得る。
目的の酵素及び/またはBIAを産生する目的のために宿主細胞を遺伝子操作する方法も含まれる。DNAを宿主細胞に挿入することは、任意の好都合な方法を使用して達成され得る。該方法を使用して、宿主細胞が酵素を機能的に発現し、目的の出発化合物を目的の酵素及び/またはBIA産物へと変換するように、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞に挿入する。
例えば、上記の本発明の遺伝子操作された宿主細胞及び方法は、様々な用途に使用される。目的の用途としては、研究用途及び治療用途が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、酵素及び/またはBIAの産生が目的である任意の好都合な用途を含む、様々な異なる用途に使用される。
本発明の態様は、キット及びシステムをさらに含み、該キット及びシステムは、本発明の方法に使用された1つまたは複数の構成要素、例えば、本明細書に記載のような、遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培地等を含み得る。いくつかの実施形態では、主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞(例えば、本明細書に記載のような)、ならびに出発化合物、異種コード配列、及び/またはそれを含むベクター、ベクター、増殖供給原料、発現系における使用に好適な構成要素(例えば、細胞、クローニングベクター、マルチプルクローニングサイト(MCS)、双方向プロモーター、配列内リボソーム進入部位(IRES)、等)、及び培地から選択される1つまたは複数の構成要素を含む。
宿主細胞を、目的のBIA及び/または目的の酵素の産生を提供する1つまたは複数の改変(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、またはさらに多くの改変)を含むように遺伝子操作してよい。表2は、遺伝子操作された宿主細胞において目的のBIA及び/または目的の酵素の産生を提供するように1つまたは複数の改変により作用し得る例示的な遺伝子の表を提供する。
ドブネズミ(R.norvegicus)由来のチロシンヒドロキシラーゼを、酵母コドン最適化し、合成し、低コピープラスミド中にクローニングした。単一の突然変異体(W166Y、E332D、S40D及びR37ER38E)、二重突然変異体(W166Y及びE332D、W166Y及びS40D、W166Y及びR37ER38E)、及び1つの三重突然変異体(W166Y、R37ER38E、及びE332D)を、部位特異的突然変異誘発を通して生成した。各TyrH突然変異体を、中央代謝に以下の突然変異(米国仮特許出願番号第61/899,496号に記載):ARO4FBR、ΔZWF1、及びGPD-TKL1プロモーター置換を含有する酵母菌株中にてGPDプロモーターを有する低コピープラスミドから発現させた。加えて、菌株は、P.プチダ(P.putida)由来のドパデカルボキシラーゼ(DODC)の染色体に組込まれたコピー、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体に組込まれた遺伝子(ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、PTPS;セピアプテリンレダクターゼ、SepR;プテリン4a-カルビノールアミン脱水酵素、PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ、QDHPR)、及びGPDプロモーターを有する低コピープラスミドから発現されるキクバオウレン(C.japonica)由来のノルコクラウリンシンターゼ(NCS)を発現した。TyrH突然変異体を有する菌株を、2%デキストロースを有してチロシンを欠く選択規定培地(YNB)中で96時間にわたって増殖させ、ノルコクラウリンの産生を、トランジション272m/z~107m/zでMRMモードにおいてLC-MS/MSを介して培地中で測定した。図12は、このアッセイの結果を示し、TyrH突然変異体が、野生型TyrHと比較したときにノルコクラウリン産生を、9倍も多く向上させることができることを実証する。このように、図12は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株における糖からのノルコクラウリン産生を向上させるチロシンヒドロキシラーゼ突然変異体を示す。
ドブネズミ由来のチロシンヒドロキシラーゼを、酵母コドン最適化し、合成し、低コピープラスミド中にクローニングした。単一の突然変異体(W166Y、E332D、S40D及びR37ER38E)、二重突然変異体(W166Y及びE332D、W166Y及びS40D、W166Y及びR37ER38E)、及び1つの三重突然変異体(W166Y、R37ER38E、及びE332D)を、部位特異的突然変異誘発を通して生成した。各TyrH突然変異体は、中央代謝に以下の突然変異(米国仮特許出願番号第61/899,496号に記載):ARO4FBR、ΔZWF1、及びGPD-TKL1プロモーター置換を含有する酵母菌株中にてGPDプロモーターを有する低コピープラスミドから発現させた。加えて、菌株は、P.プチダ由来のドパデカルボキシラーゼ(DODC)の染色体に組込まれたコピー、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体に組込まれた遺伝子(ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、PTPS;セピアプテリンレダクターゼ、SepR;プテリン4a-カルビノールアミン脱水酵素、PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ、QDHPR)、GPDプロモーターを有する低コピープラスミドから発現されるキクバオウレン由来のノルコクラウリンシンターゼ(NCS)、及びノルコクラウリンからのレチクリンの生合成のための5つの遺伝子(P.ソムニフェルム 6-O-メチルトランスフェラーゼ、Ps6OMT;P.ソムニフェルムコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ、PsCNMT;ハナビシソウ シトクロムP450 80B1、EcCYP80B1;P.ソムニフェルムシトクロムP450 NADPHレダクターゼ、PsCPR;及びP.ソムニフェルム 3’ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4’-O-メチルトランスフェラーゼ、Ps4’OMT)を発現した。TyrH突然変異体を有する菌株を、2%デキストロースを有してチロシンを欠く選択規定培地(YNB)中で96時間にわたって増殖させ、レチクリンの産生を、トランジション330m/z~137m/zでMRMモードにおいてLC-MS/MSを介して培地中で測定した。図13は、このアッセイの結果を示し、TyrH突然変異体が、野生型TyrHと比較したときにレチクリン産生を、5倍も多く向上させることができることを実証する。このように、図13は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株における糖からのレチクリン産生を向上させるチロシンヒドロキシラーゼ突然変異体を示す。
ドブネズミ由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を、酵母コドン最適化し、合成し、GPDプロモーターの制御下で低コピープラスミド中にクローニングした。DHFRを、野生型RnTyrH(GPDプロモーターを有する低コピープラスミド)と、中央代謝に以下の突然変異(米国仮特許出願番号第61/899,496号に記載):ARO4FBR、ΔZWF1、及びGPD-TKL1プロモーター置換を含有する酵母菌株中にて共発現させた。加えて、菌株は、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体に組込まれた遺伝子(ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、PTPS;セピアプテリンレダクターゼ、SepR;プテリン4a-カルビノールアミン脱水酵素、PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ、QDHPR)を発現した。DHFR及び野生型RnTyrHを発現する菌株を、2%デキストロースを有してチロシンを欠く選択規定培地(YNB)中で96時間にわたって増殖させ、L-ドパの産生を、トランジション198m/z~152m/zでMRMモードにおいてLC-MS/MSを介して培地中で測定した。野生型RnTyrHを伴うDHFRの発現は、図14に示すように、L-ドパ産生を1.8倍増加させる。このように、図14は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるチロシンヒドロキシラーゼによるL-ドパ産生を向上させるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の共発現を示す。
中央代謝に以下の突然変異(米国仮特許出願番号第61/899,496号に記載):ARO4FBR、ΔZWF1、及びGPD-TKL1プロモーター置換を含有し、補助基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体に組込まれた遺伝子(ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、PTPS;セピアプテリンレダクターゼ、SepR;プテリン4a-カルビノールアミン脱水酵素、PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ、QDHPR)ならびにGPDプロモーターの制御下で低コピープラスミドから野生型RnTyrHを発現する酵母菌株を、2%ガラクトース及び2mMアスコルビン酸を有してチロシンを欠く選択規定培地(YNB)中で96時間にわたって増殖させた。
図16は、本発明の実施形態に係る、(A)ビスBIAへのL-チロシンの変換のための生合成スキーム及び(B)ビスBIAを生合成するように遺伝子操作された酵母菌株を示す。具体的には、図16(A)は、ビスBIAベルバムニン及びグアッテガウメリンを産生するために使用される経路を示す。図16は、酵素ARO9、芳香族アミノトランスフェラーゼ;ARO10、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ(decarboxlase);TyrH、チロシンヒドロキシラーゼ;DODC、ドパデカルボキシラーゼ;NCS、ノルコクラウリンシンターゼ;6OMT、6-O-メチルトランスフェラーゼ;CNMT、コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ;CYP80A1、シトクロムP450 80A1;CPR、シトクロムP450 NADPHレダクターゼの使用を提供する。図16に提供する代謝産物の中で、4-HPA、4-HPP、及びL-チロシンは、酵母において天然に合成される。図16に示される他の代謝産物は、酵母において天然には合成されない。
本明細書に開示の方法のエピマー化反応を行うために好適なエピメラーゼ酵素を同定するために、シトクロムP450オキシダーゼ82Y1様ドメイン及びコデイノンレダクターゼ様ドメインを、市販の植物トランスクリプトーム中の単一のオープンリーディングフレーム(CYP-COR)において同定した。CYP-COR融合体を、1000 Plants Project(Matasci,et al.2014.Gigascience.3:17)及びPhytoMetaSyn(Facchini,et al.2012.Trends Biotechnol.30:127-31;Xiao,et al.2013.J.Biotechnol.166:122-34)トランスクリプトームのBLAST検索から、レチクリン蓄積をもたらした以前に公開されたCOR-サイレンシングVIGS構築物(Wijekoon and Facchini.2012.Plant J.69: 1052-63)の配列であるクエリーを用いるblastnを使用して、同定した。一度、1つのCYP-COR融合配列がヒットとして観察されると、その配列を翻訳し、そのアミノ酸配列を、tblastnを用いた両データベースの二回目の検索のためのクエリーとして使用した。データベースから同定された、CYP-COR融合酵素の系統樹を図17に提示する。配列は、1000 Plants Project及びPhytoMetaSynトランスクリプトームデータベースからバイオインフォマティック検索に基づいて同定された。加えて、例示的なアミノ酸配列を、上記のように、図4に提示する。加えて、表1は、このCYP-COR酵素に対して同定されたアミノ酸配列の様々な例を列挙し、これらは、パパヴェル・ソムニフェル(ケシ)、パパヴェル・セチゲラム(トロイポピー(poppy of Troy))、パパヴェル・ブラクテアタム(ハカマオニゲシ)、及びケリドニウム・マジャス(クサノオウ)を含む様々な植物に由来する。
非植物宿主細胞を遺伝子操作して、本明細書に記載の酵素を異種発現させた。例えば、酵母菌株(サッカロミセス・セレビシエ)を遺伝子操作して、実施例6に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させ、この微生物宿主でのそれらの機能を確かめた。部分アミノ酸配列pbr.PBRST1PF_4328及びpbr.PBRST1PF_89405に対する酵母-コドン最適化DNAコード配列を、SSDU-2015634のアミノ酸1~40(表1)の酵母-コドン最適化コード配列とインフレームで合成して、それぞれ、CYP-COR_4328及びCYP-COR_89405を生成した。これらのCYP-CORコード配列を、URA3選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、TDH3プロモーターから発現させた。プラスミドを、染色体内に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット(PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2)を有する酵母菌株中に形質転換した。2つのプラスミドを有するこれらの酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液(-Ura-Trp)を有する合成完全培地中で増殖させた。酵母菌株に、(S)-レチクリンを供給し、BIA代謝産物を、LC-MS/MS分析により増殖の72時間後に分析した。
酵母菌株(サッカロミセス・セレビシエ)を遺伝子操作して、実施例6に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させ、この微生物宿主でのそれらの機能を確認した。部分アミノ酸配列pbr.PBRST1PF_4328及びpbr.PBRST1PF_89405に対する酵母-コドン最適化DNAコード配列を、SSDU-2015634のアミノ酸1~40(表1)の酵母-コドン最適化コード配列とインフレームで合成させて、それぞれ、CYP-COR_4328及びCYP-COR_89405を生成した。これらのCYP-CORコード配列を、URA3選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、TDH3プロモーターから発現させた。サルタリジンシンターゼ(SalSyn)コード配列を、TRP1選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、TDH3プロモーターから発現させた。プラスミドを、染色体に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット(PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2)を有する酵母菌株中に形質転換した。2つのプラスミドを有するこれらの酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液(-Ura-Trp)を有する合成完全培地中で増殖させた。酵母菌株に、(S)-レチクリンを供給し、BIA代謝産物を、LC-MS/MS分析により増殖の72時間後に分析した。分析により、遺伝子操作された酵母細胞は、(S)-レチクリンを(R)-レチクリンへと変換することができ、次いでこれにサルタリジンシンターゼが作用して、サルタリジン、4-環プロモルフィナンアルカロイドを形成することが示された(図7、図18)。サルタリジンシンターゼは、(R)-レチクリンに作用し、(S)-レチクリンでの観察可能な活性はないと以前に示されている(Gesell,et al.2009.J.Biol.Chem.284:24432-42)。
酵母菌株(サッカロミセス・セレビシエ)を遺伝子操作して、実施例6に記載の同定されたエピメラーゼを異種的に発現させ、この微生物宿主におけるそれらの機能を確認した。実施例7に記載の酵母-コドン最適化DNAコード配列CYP-COR_89405を、URA3選択マーカーを有する低コピープラスミド中にクローニングし、TDH3プロモーターから発現させた。このプラスミドを、染色体に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット(PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2)及び3つのメチルトランスフェラーゼ(パパヴェル・ソムニフェル ノルコクラウリン-6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ、及び3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4’-O-メチルトランスフェラーゼ、全てPTEF1から発現される)の発現カセットを有する酵母菌株中に形質転換した。プラスミドを有するこの酵母菌株を、適切にしたドロップアウト溶液(-Ura)を有する合成完全培地中で増殖させた。酵母菌株に、ラセミノルラウダノソリンを供給し、BIA代謝産物を、LC-MS/MS分析により増殖の72時間後に分析した。キラルの特徴決定のために、レチクリンを、酵母培地から、5mL酵母培養物をペレット化し、120mg XAD-4樹脂を4mL上清に加え、室温にて回転器上で一晩インキュベーションし、0.5mLメタノールで溶出することにより濃縮した。濃縮物を、0.1%ギ酸を伴う均一溶媒の15%メタノールを用いて5mL/分の流速で6.5分間、40~50μLの注入量で、逆相HPLC(Pursuit XRs-C18、5μm、50mm×10mm)により分画した。ピークベースのフラクションを、おおよそ4.5分で回収した。フラクションを統合し、凍結乾燥させ、0.5mLイソプロパノール中に再懸濁した。濃度に応じて、0.5~5μLをキラルカラム(Phenomenex Luxセルロース-1、3μm、150mm×2mm)に注入し、均一溶媒の72%N-ヘキサン、28%イソプロパノール、0.1%ジエチルアミンを用いて0.3mL/分の流速、及びMSによる検出と250nm UVにより分離した。MS検出は、Agilent 6320イオントラップ質量分析計を用いて、350℃のESI源気体温度、10L/分の気体流、ネブライザー圧40PSI及び幅1.0でm/z330.1の単離で行った。レチクリンピークの保持時間を、真正の(S)-レチクリン及び(R)-レチクリン標準物のそれと比較した。分析により、CYP-CORプラスミドを含有する遺伝子操作された酵母細胞が、ラセミノルラウダノソリンを(R)-レチクリンに変換することができ、一方で空プラスミドを有する遺伝子操作された酵母細胞は、排他的に(S)-レチクリンを産生することが示された(図19)。
異種タンパク質は、組換え宿主において発現されるときに誤ってプロセシングされる場合があり、それは、例えば、微生物産生宿主において発現されるシトクロムP450酵素などの植物タンパク質である。例えば、サルタリジンシンターゼは、(R)-レチクリンをサルタリジンに変換するが、酵母において異種発現するとき、N結合型グリコシル化を受ける(図20)。サルタリジンシンターゼ上で観察されたN結合型グリコシル化パターンは、酵素が植物において発現される時には観察されず、新生SalSyn転写の誤ったN末端ソーティングを示し、これは、異種微生物宿主における酵素の活性を低下させる。ゆえに、新生転写物のN末端ソーティングを矯正し、それによりN結合型グリコシル化パターンを除去することを目的とするタンパク質遺伝子操作は、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の向上をもたらすだろう。
本発明の一実施形態では、経路酵素は、遺伝子操作されて、目的のBIAの産生を増加させるための活性の増加を呈す。この例では、突然変異を、Mutazyme IIで増幅させることにより特定の経路酵素のオープンリーディングフレームに導入する(表6を参照されたい)。十分な鋳型DNAを増幅反応に含んで、遺伝子1個あたり、1~4個のヌクレオチド置換の突然変異率をもたらした。突然変異導入ライブラリーを、ギャップリペアにより直接的に酵母においてpYES1Lベクター中にクローニングした。いくつかの例では、ライブラリー発現のために選択された酵母菌株は、突然変異誘発された酵素の基質を生成する遺伝子の組込まれたコピーを含有した。例えば、CODMバリアントのライブラリーを、T6ODM及びCOR1.3の組込まれたコピーを有する菌株中に形質転換し、培地中でテバインを供給した。これらの菌株におけるT6ODM及びCOR1.3の発現は、コデイン及びネオピンが、各導入されたCODMバリアントの基質として利用可能であり得ることを確かにした。個別のコロニーを、96ウェルプレートに接種し、96時間培養し、次いで、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によりそれらの産物の産生についてアッセイした。CODMライブラリーの例では、産物を、モルヒネ及びネオモルフィンについてスクリーニングした。各スクリーンでは、BIA産生が増加したバリアントを配列決定し、検証のために再クローニングした。表6は、酵母におけるBIA産生の増加をもたらしたスクリーンを通して同定された突然変異型酵素バリアントの概要を含む。
遺伝子操作された微生物宿主からのベジルイソキノリンアルカロイド産生は、経路酵素の発現及び増殖条件を最適化することによりさらに向上させることができる。一例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼの発現は、酵母において、一連の異なるプロモーターから酵素を発現することにより変えられる。酵母を、異なるプロモーターからのP.ソムニフェルムサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼをコードする酵母コドン最適化遺伝子を異種発現するように遺伝子操作した(図25の(A)に提示する)。2つの発現カセット(PTPI1-yPbSalR、PX-yPsSalAT)を、TRP1切片マーカーを有する酵母人工染色体(YAC)へと組み立てた。YACを、酵母に入れ、細胞を、適切にしたドロップアウト溶液(-Trp)を有する合成完全培地中で増殖させ、サルタリジンを供給した。BIA代謝産物を、LC-MS/MS分析により増殖の72時間後に分析した。経路酵素発現レベルの最適化は、モルフィナンアルカロイドテバインの産生を増加させることができる(図25の(A)に提示する)。
酵母菌株は、初期1-ベンジルイソキノリンアルカロイドからの、モルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドの産生のために遺伝子操作することができる。一例として、遺伝子操作された酵母菌株は、ラセミもしくは(S)-ノルコクラウリンまたはラセミもしくは(S)-ノルラウダノソリンからモルフィナンアルカロイド産物を産生することができる(図5、6、7、及び23の(B))。酵母菌株を遺伝子操作して、(S)-ノルコクラウリンまたはラセミもしくは(S)-ノルラウダノソリンから(S)-レチクリンを、3つまたは5つの発現カセットを酵母ゲノム中に組込むことにより、産生する。(S)-レチクリンをラセミまたは(S)-ノルラウダノソリンから産生するために、組込まれた発現カセットは、パパヴェル・ソムニフェル ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ(Ps6OMT、EC2.1.1.128)、4’-O-メチルトランスフェラーゼ(Ps4’OMT、EC2.1.1.116)、及びコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ(CNMT、EC2.1.1.140)をコードし、それぞれTEF1プロモーターを有する(Hawkins and Smolke.2008.Nat.Chem.Biol.4:564-73)。(S)-レチクリンをラセミまたは(S)-ノルコクラウリンから産生するために、菌株は、酵母コドン最適化されたハナビシソウ N-メチルコクラウリン3’-ヒドロキシラーゼ(yEcCYP80B1、EC1.14.13.71)及びTDH3またはTEF1プロモーターから発現されるATR1またはyPsCPRv2シトクロムP450レダクターゼ(CPR、EC1.6.2.4)の組込まれた発現カセットをさらに有する。これらの菌株をさらに遺伝子操作して、エピマー化-触媒酵素(例えば、CYP-COR)、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノールアセチルトランスフェラーゼを取り込んで、ラセミもしくは(S)-ノルコクラウリンまたはラセミもしくは(S)-ノルラウダノソリンをモルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバイン由来のモルフィナンアルカロイドへと変換する(図7)。エピマー化-触媒酵素の発現の代替として、6OMT、4’OMT、CNMT、及び/またはCYP80B1が、rac-レチクリンがrac-ノルコクラウリンまたはrac-ノルラウダノソリンから産生されるように遺伝子操作され得る。
重要な分岐点BIA中間体(S)-レチクリンをL-チロシンから産生するプラットフォーム酵母菌株を構築した(図5)。具体的には、4つの多重遺伝子発現構築物を酵母菌株のゲノム中に組込んだ。4つの構築物の組成を図26に示す。各構築物は、強力な構成的プロモーターから発現される4つまたは5つの遺伝子の遺伝子からなる。遺伝子は、模式図の上にあるアノテーションに指定するように、プロモーター、遺伝子オープンリーディングフレーム、及びターミネーターを含む完全な発現カセットとして、各遺伝子座に位置する。模式図は、所与の遺伝子を表す矢印の方向により各発現カセットの転写方向を示す。選択可能なマーカーは、アノテーション中でイタリック体としており、模式図では灰色の矢印により表される。各選択マーカーは、遺伝子座からのマーカーの除去を可能にするようにloxP部位に隣接する。加えて、各構築物は、選択可能なマーカーを、Creリコンビナーゼによりそれを除去することができるようにloxP部位に隣接させている。
酵母菌株を、チロシンなどの初期前駆体から、モルフィナンアルカロイドテバイン、またはテバイン由来のモルフィナンアルカロイドの産生のために遺伝子操作することができる。一例として、実施例14に記載のプラットフォーム酵母菌株をさらに遺伝子操作して、モルフィナンアルカロイド産物をL-チロシンから産生することができる(図7)。
酵母菌株を、L-チロシンからの、アルカロイドベルベリンの、ならびにプロトベルベリン、フタリドイソキノリン、及びベルベリンに由来するベルベリンアルカロイドまたはベルベリンの形成に関与する中間体の産生のために遺伝子操作することができる(図5、8)。例えば、3つまたは4つの発現カセット(PPGK1-PsBBE-TPHO5、PTEF1-yPsS9OMT-TCYC1、PTDH3-yCjCAS-TADH1、PTPI1-yBwSTOX-TSTE2を伴うまたは伴わない)を、TRP1切片マーカーを有する酵母人工染色体(YAC)へと組み立てた。YACを、(S)-レチクリンをL-チロシンから産生し(実施例14を参照されたい)、染色体に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット(PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2)を加えて有するプラットフォーム酵母菌株に入れた。PTEF1-S9OMT-TCYC1発現カセットを含有する追加の高コピープラスミドを、この菌株中に形質転換して、下流産物へのフラックスを改善した。
酵母菌株を、L-チロシンからの、ナルコトリン及びノスカピンなどのフタリドイソキノリンアルカロイド、ノスカピンの形成に関与する中間体、またはその誘導体の産生のために遺伝子操作することができる(図5、9)。
酵母菌株を、L-チロシンからの、プロトベルベリン、プロトピン、及び最終産物サンギナリンなどのベンゾフェナントリジンアルカロイド、サンギナリンの形成に関与する中間体、またはその誘導体の産生のために遺伝子操作することができる(図5、10)。
酵母菌株を、ヒドロコドンの産生のために遺伝子操作することができる。一例として、実施例15に記載のテバイン産生酵母菌株を、さらに遺伝子操作して、医薬品有効成分ヒドロコドンを産生することができる。図27は、本発明の実施形態に係る、遺伝子操作された酵母菌株におけるテバイン及びヒドロコドン産生を示す。図27Aでは、多重遺伝子構築物は、構築物1~4(図26)を含有する遺伝子操作された酵母菌株中に取り込まれた。図27Bでは、構築物5の組込みは、構築物1~4を含有する菌株と比べてレチクリン力価を増加させた。図27Cでは、構築物6の組込みは、糖からのテバイン産生をもたらす。遺伝子操作された菌株により産生されたテバインを、培地中でLC-MS/MS分析により同定し、市販の基準標準物と比較した。図27Dでは、YACへの構築物7の導入は、糖からのヒドロコドン産生をもたらす。遺伝子操作された菌株により産生されたヒドロコドンを、培地中でLC-MS/MS分析により同定し、市販の基準標準物と比較した。
いくつかの例では、酵母菌株は、その活性が制限されている酵素に対する遺伝子コピー数を増加させることにより、ベンジルイソキノリンアルカロイドの産生を増強させるように最適化されることができる。
ポピーストロー(CPS)またはアヘンの濃縮物と異なり、アルカノイドの他のクラスが存在しないように、酵母宿主菌株を遺伝子操作してアルカノイドの所定のクラスの分子を産生し得る(すなわち、菌株1つあたり1経路のみの生合成経路)。それゆえ、このCYCMは、1つまたは2つのカラムにわたる分子のサブセットを含む、単一の生合成経路内での分子を含有し得る一方で、多くのカラムにわたる分子のサブセットを含有し得る。
1.遺伝子操作していない細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞であって、基質阻害軽減突然変異;生産物阻害軽減突然変異;及び補因子回収促進機構からなる群より選択される少なくとも1つの改変を有する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
2.前記少なくとも1つの改変が、基質阻害軽減突然変異を含む、項目1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
3.前記基質阻害軽減突然変異が、点突然変異W166Yを含む、項目2に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
4.前記少なくとも1つの改変が、補助基質結合部位での競合的結合を緩和する少なくとも1つの生産物阻害軽減突然変異を含む、項目1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
5.前記少なくとも1つの生産物阻害軽減突然変異が、点突然変異S40Dを含む、項目4に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
6.前記少なくとも1つの生産物阻害軽減突然変異が、接合突然変異R37E及びR38Eを含む、項目4に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
7.前記接合突然変異R37E及びR38Eが、ドパミンの存在下でチロシンヒドロキシラーゼ活性を向上させる、項目6に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
8.前記少なくとも1つの改変が、不可逆的な生産物阻害を緩和する生産物阻害軽減突然変異を含む、項目1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
9.前記生産物阻害軽減突然変異が、点突然変異E332Dを含む、項目8に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
10.前記生産物阻害軽減突然変異が、点突然変異Y371Fを含む、項目8に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
11.前記生産物阻害軽減突然変異が、活性部位でのカテコールアミンの鉄への不可逆的な結合を緩和する、項目8に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
12.前記少なくとも1つの改変が補因子回収促進機構を含む、項目1に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
13.前記補因子回収促進機構が、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする異種コード配列を含む、項目12に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
14.前記遺伝子操作された非植物細胞により産生されたジヒドロ葉酸レダクターゼが、前記遺伝子操作された非植物細胞内でのテトラヒドロビオプテリンへのジヒドロビオプテリンの変換を触媒する、項目13に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
15.(a)基質阻害軽減突然変異;生産物阻害軽減突然変異;及び補因子回収促進機構からなる群より選択される少なくとも1つの改変を有する遺伝子操作された非植物細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供する工程、
(b)前記バッチ反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約5分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、ベンジルイソキノリンアルカロイド産物と細胞物質とを含む溶液を生成する工程;ならびに
(c)少なくとも1つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
16.前記バッチ反応器の少なくとも1つのプロセスパラメータが、結果として得られるベンジルイソキノリンアルカロイド産物組成物を変異させるように改変可能である、項目15に記載の方法。
17.改変可能である前記少なくとも1つのプロセスパラメータが、溶存酸素、pH、撹拌速度、通気速度、及び細胞密度のうちの少なくとも1つを含む、項目16に記載の方法。
18.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリンアルカロイド前駆体を含む、項目15に記載の方法。
19.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド前駆体が、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、チロシン、チラミン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及びドパミンの群より選択される、項目18に記載の方法。
20.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリンアルカロイドを含む、項目15に記載の方法。
21.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、プロトピン、ベンゾフェナントリジン、プロモルフィナン、モルフィナン、セコベルベリン、フタリドイソキノリン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される構造的クラスを有する、項目20に記載の方法。
22.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、コクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、4’-O-メチルノルラウダノソリン、4’-O-メチル-ラウダノソリン、N-メチルノルコクラウリン、ラウダノソリン、N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、パパベリン、ラウダニン、ラウダノシン、テトラヒドロパパベリン、1,2-ジヒドロパパベリン、及びオリエンタリンの群より選択されるベンジルイソキノリンである、項目21に記載の方法。
23.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、スコウレリン、ケイランチホリン、スチロピン、ナンジニン、ジャトロリジン、ステホリジン、ジスクレタミン、シス-N-メチルスチロピン、テトラヒドロコルンバミン、パルマチン、テトラヒドロパルマチン、コルンバミン、カナジン、N-メチルカナジン、1-ヒドロキシカナジン、ベルベリン、N-メチル-オフィオカルピン、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン、及び1-ヒドロキシ-10-O-アセチル-N-メチルカナジンの群より選択されるプロトベルベリンである、項目21に記載の方法。
24.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、プロトピン、6-ヒドロキシプロトピン、アロクリプトピン、クリプトピン、ムラミン、及びタリクトリシンの群より選択される、プロトピンである、項目21に記載の方法。
25.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ジヒドロサンギナリン、サンギナリン、ジヒドロケイリルビン、ケイリルビン、ジヒドロマルカピン、マルカピン、及びケレリトリンの群より選択されるベンゾフェナントリジンである、項目21に記載の方法。
26.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、サルタリジン、サルタリジノール、及びサルタリジノール-7-O-アセテートの群より選択されるプロモルフィナンである、項目21に記載の方法。
27.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルフィノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルフィン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルフィノン、ヒドロモルフォン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、及びオキシモルフォンの群より選択されるモルフィナンである、項目21に記載の方法。
28.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、4’-O-デスメチルマクラントアルデヒド、4’-O-デスメチルパパベロキシン、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシン、及び3-O-アセテイルパパベロキシンの群より選択されるセコベルベリンである、項目21に記載の方法。
29.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンの群より選択されるフタリドイソキノリンである、項目21に記載の方法。
30.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、マグノフロリン、コリツベリン、アポモルヒネ、ボルジン、イソボルジン、イソテバイン、イソコリツベリン、及びグラウフィンの群より選択されるアポルフィンである、項目21に記載の方法。
31.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベルバムニン、グアットガウメリン、ダウリシン、及びリエンシニンの群より選択されるビスベンジルイソキノリンである、項目21に記載の方法。
32.(a)チロシンヒドロキシラーゼ活性を増加させる突然変異を有さない野生型チロシンヒドロキシラーゼを発現する細胞と比べてチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加している遺伝子操作された非植物細胞、栄養素を含む供給原料、及び水を、反応器に提供する工程;
(b)前記反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約5分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、細胞物質とベンジルイソキノリンアルカロイド産物とを含む溶液を生成する工程であって、前記溶液が、プロトベルベリン、モルフィナン、イソパビン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される分子の1つ以下のクラスを含む、前記工程;ならびに
(c)少なくとも1つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
33.前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレオイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルヒネ、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される分子を、5ppmを超えて含有しない、項目32に記載の方法。
34.前記生成物流が、メコン酸を、5ppmを超えて含有しない、項目33に記載の方法。
35.前記生成物流が、殺虫剤、殺菌剤、または除草剤からなる群より選択される物質の検出可能な量を含有しない、項目32に記載の方法。
36.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、少なくとも液液抽出を使用して前記生成物流から回収される、項目32に記載の方法。
37.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、発酵プロセスが完了した直後に回収される、項目36に記載の方法。
38.(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1つの酵素と接触させる工程であって、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する、前記工程
を含む、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにエピマー化する方法。
39.前記少なくとも1つの酵素が、前記少なくとも1つの酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することにより産生される、項目38に記載の方法。
40.(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に加える工程をさらに含む、項目39に記載の方法。
41.前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を、前記細胞培養物から回収する工程をさらに含む、項目40に記載の方法。
42.前記少なくとも1つの酵素がオキシダーゼを含む、項目38~41のいずれか一項に記載の方法。
43.前記少なくとも1つの酵素がレダクターゼを含む、項目38~42のいずれか一項に記載の方法。
44.前記少なくとも1つの酵素がエピメラーゼを含む、項目38~43のいずれか一項に記載の方法。
45.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目44に記載の方法。
46.前記エピメラーゼが、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含む、項目44または45に記載の方法。
47.前記オキシダーゼドメインがシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインである、項目46に記載の方法。
48.前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、項目46に記載の方法。
49.前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(S)-レチクリンである、項目38~48のいずれか一項に記載の方法。
50.前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R)-レチクリンである、項目38~49のいずれか一項に記載の方法。
51.前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを4-環プロモルフィナンアルカロイドに変換する工程をさらに含む、項目38~50のいずれか一項に記載の方法。
52.前記4-環プロモルフィナンアルカロイドがサルタリジンである、項目51に記載の方法。
53.前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを5-環モルフィナンアルカロイドに変換する工程をさらに含む、項目38~50のいずれか一項に記載の方法。
54.前記遺伝子操作された非植物細胞内に存在する前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された微生物細胞内で産生される、項目38~53のいずれか一項に記載の方法。
55.前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記遺伝子操作された非植物細胞内で、L-チロシンから始まる代謝経路により産生される、項目38~54のいずれか一項に記載の方法。
56.前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記遺伝子操作された非植物細胞内で、炭水化物及び窒素源から始まる代謝経路により産生される、項目38~54のいずれか一項に記載の方法。
57.前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、(S)-ノルレチクリン;(S)-レチクリン;(S)-テトラヒドロパパベリン;(S)-ノルコクラウリン;(S)-コクラウリン;(S)-N-メチルコクラウリン;(S)-3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン;(S)-ノリソオリエンタリン;(S)-オリエンタリン;(S)-イソオリエンタリン;(S)-ノルプロトシノメニン;(S)-プロトシノメニン;(S)-ノルラウダノソリン;(S)-ラウダノソリン;(S)-4’-O-メチルラウダノソリン;(S)-6-O-メチルノルラウダノソリン;及び(S)-4’-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される、項目38~56のいずれか一項に記載の方法。
58.前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、式I:
式I
の化合物である、項目38~57のいずれか一項に記載の方法:
式中、R1、R2、R3、及びR4は独立して、水素またはメチルであり;
R5は、水素、ヒドロキシ、またはメトキシである。
59.(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを遺伝子操作された非植物細胞内に存在する(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドから産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、エピメラーゼをコードする異種コード配列を含み、前記エピメラーゼが、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
60.サルタリジンシンターゼをコードする異種コード配列をさらに含む、項目59に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
61.前記サルタリジンシンターゼが、前記(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをサルタリジンに変換する、項目60に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
62.(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピメラーゼを産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記遺伝子操作された非植物細胞。
63.(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスであって、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをエピメラーゼと、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに十分な量で接触させる工程を含む、前記プロセス。
64.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目63に記載のプロセス。
65.少なくとも5%の前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、項目63に記載のプロセス。
66.1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1つの酵素と接触させる工程であって、前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の立体化学を、前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の反対の立体化学へと反転させる、前記工程
を含む、前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心をエピマー化する方法。
67.前記少なくとも1つの酵素が、前記少なくとも1つの酵素をコードするためのコード配列を有する遺伝子操作された非植物細胞を培養することにより産生される、項目66に記載の方法。
68.前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に加える工程をさらに含む、項目67に記載の方法。
69.前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの単一立体異性体として存在する、項目66に記載の方法。
70.前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体異性体の混合物として存在する、項目66に記載の方法。
71.前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体異性体の前記混合物が、前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのエナンチオマーのラセミ混合物である、項目70に記載の方法。
72.前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体異性体またはその誘導体を、細胞培養物から回収する工程をさらに含む、項目67に記載の方法。
73.回収した前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも約80%のエナンチオマー過剰率を有する、項目72に記載の方法。
74.回収した前記1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも約98%のエナンチオマー過剰率を有する、項目72に記載の方法。
75.前記少なくとも1つの酵素がオキシダーゼを含む、項目66~74のいずれか一項に記載の方法。
76.前記少なくとも1つの酵素がレダクターゼを含む、項目66~75のいずれか一項に記載の方法。
77.前記少なくとも1つの酵素がエピメラーゼを含む、項目66~74のいずれか一項に記載の方法。
78.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
79.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15のいずれかに少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
80.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15のいずれかに少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
81.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15のいずれかに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
82.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15のいずれかに少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
83.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15のいずれかに少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
84.前記エピメラーゼが、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15のいずれかに少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含む、項目77に記載の方法。
85.前記エピメラーゼが、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含む、項目77~84のいずれかに記載の方法。
86.前記オキシダーゼドメインがシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインである、項目85に記載の方法。
87.前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、項目85に記載の方法。
88.ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを、遺伝子操作された非植物細胞内に存在する2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーから産生する遺伝子操作された非植物細胞であって、
少なくとも1つのカップリング酵素をコードする異種コード配列
を含み、
前記少なくとも1つのカップリング酵素が、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それにより、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを形成する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
89.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、1つまたは複数の共有結合を形成することにより、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
90.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、1つまたは複数の炭素-炭素結合を形成することにより、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
91.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、1つまたは複数の炭素-酸素結合を形成することにより、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
92.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、同一であるベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりホモ二量体を形成する、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
93.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、別個のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりヘテロ二量体を形成する、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
94.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが互いの立体異性体である、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
95.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第一のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
96.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第二のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目95に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
97.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーのうちの少なくとも1つが、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
98.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーのうちの少なくとも1つが、前記遺伝子操作された非植物細胞の外側で産生される、項目88に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
99.遺伝子操作された非植物細胞内に存在するカップリング酵素を使用してビスベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する、遺伝子操作された非植物細胞であって、
前記遺伝子操作された非植物細胞内での少なくとも1つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの前記産生において使用される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列
を含み、
少なくとも1つの前記カップリング酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それにより前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイドを形成する、前記遺伝子操作された非植物細胞。
100.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、1つまたは複数の共有結合を形成することにより、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
101.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、1つまたは複数の炭素-炭素結合を形成することにより、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
102.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、1つまたは複数の炭素-酸素結合を形成することにより、前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化する、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
103.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、同一であるベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりホモ二量体を形成する、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
104.前記少なくとも1つのカップリング酵素が、別個のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーを二量体化し、それによりヘテロ二量体を形成する、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
105.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが互いの立体異性体である、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
106.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第一のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
107.前記2つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの第二のベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンの群より選択される、項目106に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
108.前記カップリング酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞内で産生される、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
109.前記カップリング酵素が、前記遺伝子操作された非植物細胞の外側で産生される、項目99に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
110.(a)少なくとも1つのカップリング酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列を含み、少なくとも1つのベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーの産生において使用された少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの異種コード配列をさらに含む遺伝子操作された非植物細胞、栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供する工程;
(b)前記バッチ反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約5分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物と細胞物質とを含む溶液を生成する工程;ならびに
(c)少なくとも1つの分離装置を使用して、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
111.前記バッチ反応器の少なくとも1つのプロセスパラメータが、結果として得られるビスベンジルイソキノリンアルカロイド産物組成物を変異させるように改変可能である、項目108に記載の方法。
112.改変可能である前記少なくとも1つのプロセスパラメータが、溶存酸素、pH、撹拌速度、通気速度、及び細胞密度のうちの少なくとも1つを含む、項目109に記載の方法。
113.少なくとも1つの前記ベンジルイソキノリンアルカロイドモノマーが、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニンのうちの少なくとも1つを含む、項目108に記載の方法。
114.炭水化物源を、(S)-レチクリンに由来するベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する、遺伝子操作された非植物細胞。
115.グアノシン三リン酸をテトラヒドロビオプテリンに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
116.前記複数の異種コード配列が、ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ、セピアプテリンレダクターゼ、プテリン4a-カルビノールアミン脱水酵素、及びジヒドロプテリジンレダクターゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目115に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
117.チロシンをL-ドパに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数の異種コード配列をさらに含む、項目115に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
118.1つまたは複数の異種コード配列が、チロシンヒドロキシラーゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目117に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
119.L-ドパを(S)-レチクリンに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
120.前記複数の異種コード配列が、L-ドパデカルボキシラーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン-6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及び4’-O-メチルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目119に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
121.前記複数の異種コード配列が、L-ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン-6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、及び4’-O-メチルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目119に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
122.(S)-レチクリンをモルフィナンアルカロイドに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
123.前記複数の異種コード配列が、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、シトクロムP450レダクターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目122に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
124.前記複数の異種コード配列が、テバイン-6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、及びコデイン脱メチル化酵素のうちの少なくとも1つを追加でコードする、項目123に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
125.前記1つまたは複数の酵素を使用して(S)-レチクリンをプロモルフィナンアルカロイドに変換する、項目122に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
126.前記1つまたは複数の酵素を使用して(S)-レチクリンを半合成モルフィナンアルカロイドに変換する、項目122に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
127.(S)-レチクリンをカナジンに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
128.前記複数の異種コード配列が、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン-9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、及びシトクロムP450レダクターゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目127に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
129.前記複数の異種コード配列が、カナジンをプロトベルベリン産物に変換するよう1つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目128に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
130.前記複数の異種コード配列が、カナジンをフタリドイソキンノリン(isoquinnoline)産物に変換するよう1つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目128に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
131.前記複数の異種コード配列が、カナジンをノスカピノイド産物に変換するよう1つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目128に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
132.(S)-レチクリンをベルベリンに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
133.前記複数の異種コード配列が、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン-9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、シトクロムP450レダクターゼ、及びテトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目132に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
134.前記複数の異種コード配列が、ベルベリンをベルベリン産物に変換するよう1つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目133に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
135.(S)-レチクリンをプロトベルベリン産物に変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
136.前記複数の異種コード配列がベルベリン架橋酵素をコードする、項目138に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
137.(S)-レチクリンをプロトピンに変換するために使用される1つまたは複数の酵素をコードする複数の異種コード配列を有する複数の多重遺伝子発現構築物を含む、項目114に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
138.前記複数の異種コード配列が、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、シトクロムP450レダクターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、及びシス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼのうちの少なくとも1つをコードする、項目137に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
139.前記複数の異種コード配列が、プロトピンをプロトピン産物に変換するよう1つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目138に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
140.前記複数の異種コード配列が、プロトピンをベンゾフェナントリジン産物に変換するよう1つまたは複数の酵素を追加でコードする、項目138に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
141.前記複数の異種コード配列が、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼを追加でコードする、項目140に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
142.(a)遺伝子操作された非植物細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、バッチ反応器に提供する工程;
(b)前記バッチ反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を炭水化物源及び窒素源と接触させ、かつ、前記遺伝子操作された非植物細胞を少なくとも約5分間にわたってインキュベートすることにより前記遺伝子操作された非植物細胞を発酵に供して、レチクリンに由来するベンジルイソキノリンアルカロイド産物と細胞物質とを含む溶液を生成する工程;ならびに
(c)少なくとも1つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
143.前記バッチ反応器の少なくとも1つのプロセスパラメータが、結果として得られるベンジルイソキノリンアルカロイド産物組成物を変異させるように改変可能である、項目139に記載の方法。
144.改変可能である前記少なくとも1つのプロセスパラメータが、溶存酸素、pH、撹拌速度、通気速度、及び細胞密度のうちの少なくとも1つを含む、項目140に記載の方法。
145.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリンアルカロイドを含む、項目139に記載の方法。
146.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベンジルイソキノリン、プロトベルベリン、プロトピン、ベンゾフェナントリジン、プロモルフィナン、モルフィナン、セコベルベリン、フタリドイソキノリン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される構造的クラスを有する、項目142に記載の方法。
147.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、パパベリン、テトラヒドロパパベリン、1,2-ジヒドロパパベリン、及びオリエンタリンの群より選択されるベンジルイソキノリンである、項目143に記載の方法。
148.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、スコウレリン、ケイランチホリン、スチロピン、ナンジニン、ジャトロリジン、ステホリジン、ジスクレタミン、シス-N-メチルスチロピン、テトラヒドロコルンバミン、パルマチン、テトラヒドロパルマチン、コルンバミン、カナジン、N-メチルカナジン、1-ヒドロキシカナジン、ベルベリン、N-メチル-オフィオカルピン、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン、及び1-ヒドロキシ-10-O-アセチル-N-メチルカナジンの群より選択されるプロトベルベリンである、項目143に記載の方法。
149.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、プロトピン、6-ヒドロキシプロトピン、アロクリプトピン、クリプトピン、ムラミン、及びタリクトリシンの群より選択されるプロトピンである、項目143に記載の方法。
150.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ジヒドロサンギナリン、サンギナリン、ジヒドロケイリルビン、ケイリルビン、ジヒドロマルカピン、マルカピン、及びケレリトリンの群より選択されるベンゾフェナントリジンである、項目143に記載の方法。
151.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、サルタリジン、サルタリジノール、及びサルタリジノール-7-O-アセテートの群より選択されるプロモルフィナンである、項目143に記載の方法。
152.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルフィノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルフィン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルフィノン、ヒドロモルフォン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、ヘテロコデイン、及びオキシモルフォンの群より選択されるモルフィナンである、項目143に記載の方法。
153.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、4’-O-デスメチルマクラントアルデヒド、4’-O-デスメチルパパベロキシン、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシン、及び3-O-アセテイルパパベロキシンの群より選択されるセコベルベリンである、項目143に記載の方法。
154.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ナルコトリンヘミアセタール、ナルコチンヘミアセタール、ナルコトリン、及びノスカピンの群より選択されるフタリドイソキノリンである、項目143に記載の方法。
155.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、マグノフロリン、コリツベリン、アポモルヒネ、ボルジン、イソボルジン、イソテバイン、イソコリツベリン、及びグラウフィンの群より選択されるアポルフィンである、項目143に記載の方法。
156.前記ベンジルイソキノリンアルカロイドが、ベルバムニン、グアットガウメリン、ダウリシン、及びリエンシニンの群より選択されるビスベンジルイソキノリンである、項目143に記載の方法。
157.(a)遺伝子操作された非植物細胞、及び栄養素を含む供給原料、及び水を、反応器に提供する工程;
(b)前記反応器中で、前記遺伝子操作された非植物細胞を炭水化物源及び窒素源と接触させ、それにより、細胞物質とレチクリンに由来するベンジルイソキノリンアルカロイド産物とを含む溶液を生成する工程であって、前記溶液が、プロトベルベリン、モルフィナン、イソパビン、アポルフィン、及びビスベンジルイソキノリンの群より選択される1つ以下のクラスの分子を含む、前記工程;ならびに
(c)少なくとも1つの分離装置を使用して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を前記細胞物質から分離し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を含む生成物流を提供する工程
を含む、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を有する前記生成物流を形成するための方法。
158.前記生成物流が、リグニン、フラボノイド、フェナントレオイド、ラテックス、ルビスコ、メコン酸、プソイドモルヒネ、ナルセイン、テバオール、及び花粉の群より選択される分子を、5ppmを超えて含有しない、項目154に記載の方法。
159.前記生成物流が、メコン酸を、5ppmを超えて含有しない、項目155に記載の方法。
160.前記生成物流が、殺虫剤、殺菌剤、または除草剤からなる群より選択される物質の検出可能な量を含有しない、項目154に記載の方法。
161.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、少なくとも液液抽出を使用して前記生成物流から回収される、項目154に記載の方法。
162.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物が、発酵プロセスが完了した直後に回収される、項目158に記載の方法。
163.前記遺伝子操作された非植物細胞が、2つ以上の異種コード配列を含み、前記2つ以上の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素及び第二の酵素をコードし、前記第一の酵素及び前記第二の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の方法。
164.前記遺伝子操作された非植物細胞が、3つの異種コード配列を含み、前記3つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素、第二の酵素及び第三の酵素をコードし、前記第一の酵素、前記第二の酵素、及び前記第三の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の方法。
165.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
166.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
167.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目165または166に記載の方法。
168.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
169.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
170.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目168または169に記載の方法。
171.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
172.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
173.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目171または172に記載の方法。
174.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
175.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
176.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目174または175に記載の方法。
177.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
178.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
179.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目177または178に記載の方法。
180.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
181.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
182.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目180または181に記載の方法。
183.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン4’-O-メチラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
184.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン4’-O-メチラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
185.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目183または184に記載の方法。
186.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
187.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
188.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目186または187に記載の方法。
189.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
190.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
191.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目189または190に記載の方法。
192.前記遺伝子操作された非植物細胞が、2つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記2つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が、前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目165~191のいずれかに記載の方法。
193.前記遺伝子操作された非植物細胞が、3つの追加の異種コード配列を含み、前記3つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目165~191のいずれかに記載の方法。
194.2つ以上の異種コード配列を含み、前記2つ以上の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素及び第二の酵素をコードし、前記第一の酵素及び前記第二の酵素が、前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
195.3つの異種コード配列を含み、前記3つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の酵素、第二の酵素、及び第三の酵素をコードし、前記第一の酵素、前記第二の酵素、及び前記第三の酵素が、前記代謝経路に沿って作動可能に連結している、前記項目のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
196.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
197.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
198.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目196または197に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
199.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
200.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、プロトピンO-デアルキラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
201.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目199または200に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
202.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
203.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
204.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目202または203に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
205.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
206.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
207.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目205または206に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
208.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
209.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、モルフィノンレダクターゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
210.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目208または209に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
211.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
212.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
213.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目211または212に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
214.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン4’-O-メチラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
215.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、ナルコトリン4’-O-メチラーゼ、及びシトクロムP450レダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
216.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目214または215に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
217.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
218.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
219.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目217または218に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
220.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
221.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
222.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目220または221に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
223.2つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記2つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目196~222のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
224.3つの追加の異種コード配列を含み、前記3つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目196~222のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
225.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
226.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
227.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目225または226に記載の方法。
228.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
229.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
230.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目228または229に記載の方法。
231.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
232.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
233.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目231または232に記載の方法。
234.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
235.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
236.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目234または235に記載の方法。
237.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
238.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
239.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目237または238に記載の方法。
240.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
241.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
242.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目240または241に記載の方法。
243.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン4’-O-メチラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
244.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン4’-O-メチラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
245.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目243または244に記載の方法。
246.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
247.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
248.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目246または247に記載の方法。
249.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目163に記載の方法。
250.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目164に記載の方法。
251.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目249または250に記載の方法。
252.前記遺伝子操作された非植物細胞が、2つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記2つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目225~251のいずれかに記載の方法。
253.前記遺伝子操作された非植物細胞が、3つの追加の異種コード配列を含み、前記3つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の、第二の追加の、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目225~251のいずれかに記載の方法。
254.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
255.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
256.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトベルベリン産物である、項目254または255に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
257.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
258.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びプロトピンO-デアルキラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
259.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロトピン産物である、項目257または258に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
260.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
261.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、ケイランチホリンシンターゼ、スチロピンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シス-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼ、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼ、及びジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
262.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンゾフェナントリジン産物である、項目260または261に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
263.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
264.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、及びサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
265.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がプロモルフィナン産物である、項目263または264に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
266.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
267.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-脱メチル化酵素、コデイノンレダクターゼ、コデインO-脱メチル化酵素、モルヒネデヒドロゲナーゼ、及びモルフィノンレダクターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
268.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がモルフィナン産物である、項目266または267に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
269.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
270.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、及び1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
271.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がセコベルベリン産物である、項目269または270に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
272.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン4’-O-メチラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
273.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、ベルベリン架橋酵素、スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ、カナジンシンターゼ、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルカナジン1-ヒドロキシラーゼ、1-ヒドロキシ-N-メチルカナジン13-ヒドロキシラーゼ、4’-O-デスメチル-3-O-アセチルパパベロキシンシンターゼ、1,13-ジヒドロキシ-N-メチルカナジン13-Oアセチルトランスフェラーゼ、ナルコチンヘミアセタールシンターゼ、ノスカピンシンターゼ、及びナルコトリン4’-O-メチラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
274.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がフタリドイソキノリン産物である、項目272または273に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
275.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
276.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、BIAエピメラーゼ、及びベルバムニンシンターゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
277.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がビスベンジルイソキノリン産物である、項目275または276に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
278.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一及び第二の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目194に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
279.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一、第二、及び第三の酵素がそれぞれ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、チロシン/ドパデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、チロシナーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目195に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
280.前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物がベンジルイソキノリン産物である、項目220または221に記載の遺伝子操作された非植物細胞。
281.2つ以上の追加の異種コード配列を含み、前記2つ以上の追加の異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素及び第二の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素及び前記第二の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の及び第二の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目196~222のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
282.3つの追加の異種コード配列を含み、前記3つの異種コード配列が、基質を前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物に変換する代謝経路に関与する少なくとも第一の追加の酵素、第二の追加の酵素、及び第三の追加の酵素をコードし、前記第一の追加の酵素、前記第二の追加の酵素、及び前記第三の追加の酵素が前記代謝経路に沿って作動可能に連結し、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド産物を産生する前記代謝経路に関与する前記第一の追加の、第二の追加の、及び第三の追加の酵素がそれぞれ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、4’-O-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、及びBIAエピメラーゼからなる群より選択される、項目196~222のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
283.遺伝子操作された酵母細胞である、前記項目のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
284.遺伝子操作された酵母細胞である、前記項目のいずれかに記載の方法。
285.遺伝子操作された細菌細胞である、項目1~282のいずれかに記載の遺伝子操作された非植物細胞。
286.遺伝子操作された細菌細胞である、項目1~282のいずれかに記載の方法。
Claims (6)
- 遺伝子操作された酵母細胞内で、該細胞内で産生された(S)-レチクリンを少なくとも1つの酵素と接触させる工程であって、前記遺伝子操作された酵母細胞内で前記(S)-レチクリンを(R)-レチクリンに変換する、前記工程
を含む、前記遺伝子操作された酵母細胞内で前記(S)-レチクリンを(R)-レチクリンにエピマー化する方法であって、
前記酵素が、SEQ ID NO:9及び10からなる群より選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、オキシダーゼドメイン及びレダクターゼドメインを含むエピメラーゼを含み、
前記オキシダーゼドメインがシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインであり、かつ、
前記レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、
前記方法。 - 前記少なくとも1つの酵素が、前記遺伝子操作された酵母細胞を培養することにより産生される、請求項1に記載の方法。
- 前記(R)-レチクリンまたはその誘導体を前記細胞培養物から回収する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記(S)-レチクリンが、L-チロシンから始まる代謝経路により、前記遺伝子操作された酵母細胞内で産生される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エピメラーゼが融合エピメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記エピメラーゼが分割エピメラーゼである、請求項1に記載の方法。
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