JP2009225669A - 植物ベンジルイソキノリンアルカロイドの生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ドーパミンを基質とし、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを作用させることを含む、レチクリンを生産する工程、および、得られたレチクリンを出発物質とし、イソキノリンアルカロイド生合成酵素を作用させる工程を含む、イソキノリンアルカロイドの製造方法を提供する。
【選択図】なし
Description
Hung TM, et al. (2007) Magnoflorine from Coptidis rhizoma protects high density lipoprotein during oxidant stress. Biol Pharm Bull 30: 1157-1160 Hung TM, et al. (2007) Protective effect of magnoflorine isolated from Coptidis rhizoma on Cu2+-induced oxidation of human low density lipoprotein. Planta Med 73: 1281-1284 Rashid MA, et al. (1995) Anti-HIV alkaloids from Toddalia asiatica. Nat Prod Res 6: 153-156 Kong W, et al. (2004) Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins. Nature Med 10: 1344-1351 Gates M, Tschudi G (1952) The synthesis of morphine. J Am Chem Soc 74: 1109-1110 Sato F, Inui T, Takemura T (2007) Metabolic engineering in isoquinoline alkaloid biosynthesis. Curr Pharm Biotech 8: 211-218 Allen RS, et al. (2004) RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy. Nat Biotechnol 22: 1559-1566 Fujii N, Inui T, Iwasa K, Morishige T, Sato F (2007) Knockdown of berberine bridge enzyme by RNAi accumulates (S)-reticuline and activates a silent pathway in cultured California poppy cells. Transgenic Res 16: 363-375 Sato F, Yamada Y (in press) In Bioengineering and Molecular Biology of Plant Pathways, Volume 1 (Bohnert HJ and Nguyen HT, Eds.), Elsevier, Amsterdam. Rathbone DA, Bruce NC (2002) Microbial transformation of alkaloids. Curr Opin Microbiol 5: 274-281 Ro DK, et al. (2006) Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature 440: 940-943 Minami, H., Dubouzet, E., Iwasa, K., & Sato, F. Functional analysis of norcoclaurine synthase in Coptis japonica. J. Biol. Chem. 282, 6274-6282 (2007) Morishige, T., Tsujita, T., Yamada, Y., & Sato, F. Molecular characterization of the S-adenosyl-L-methionine:3'-hydroxy-N-methylcoclaurine 4'-O-methyltransferase involved in isoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica. J. Biol. Chem. 275, 23398-23405 (2000)
得られたレチクリンを出発物質とし、イソキノリンアルカロイド生合成酵素を作用させる工程を含む、イソキノリンアルカロイドの製造方法を提供する。
ドーパミンに、MAOを作用させることによって、3,4-DHPAAを得る工程、
ドーパミンと3,4-DHPAAとを反応させることによって、3’-ヒドロキシノルコクラウリン(以下、ノルラウダノソリンとも称する)を得る工程、
3’-ヒドロキシノルコクラウリンに6OMTを作用させることによって、3’-ヒドロキシコクラウリン(以下、6-O-メチルノルラウダノソリンとも称する)を得る工程、
3’-ヒドロキシコクラウリンにCNMTを作用させることによって、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンを得る工程、および、
3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンに4’OMTを作用させるによって、レチクリンを得る工程。
レチクリンにCYP80G2を作用させてコリツベリンを得る工程、および、
コリツベリンにCNMTを作用させてマグノフロリンを得る工程、
を含む、マグノフロリンの製造方法を提供する。
レチクリンにBBEを作用させてスコウレリンを得る工程、
を含む、スコウレリンの製造方法を提供する。
第一のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、MAO、6OMT、CNMTおよび4’OMTをコードする遺伝子が導入されてなる、MAO、6OMT、CNMTおよび4’OMTを発現する第一の組換え宿主細胞を提供する工程、および
第二のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子を導入して、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を発現する第二の組換え宿主細胞を提供する工程、
ドーパミンの存在下に、該第一の組換え宿主細胞および第二の組換え宿主細胞を培養する工程。
該方法においては、目的のイソキノリンアルカロイドが組換え宿主細胞内で生産されるため、本明細書においてかかる方法を、「インビボでのイソキノリンアルカロイドの第一生産方法」と称する。
一種のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、MAO、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子が導入されてなる、MAO、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を発現する組換え宿主細胞を提供する工程、
ドーパミンの存在下に、該組換え宿主細胞を培養する工程、
を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法。
各々が、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素からなる群から選択される1以上の酵素を発現する1種以上の細胞からなり、全細胞を合わせると、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素のすべてを発現する1種以上の細胞を提供する工程、
ただし、該1種以上の細胞を構成する細胞のうち少なくとも1種は、イソキノリンアルカロイド非生産性細胞である、
該1種以上の細胞から、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を含む酵素抽出液を得る工程、
該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を用いてイソキノリンアルカロイドを産生させる工程。
得られたレチクリンを出発物質とし、イソキノリンアルカロイド生合成酵素を作用させる工程を含む、イソキノリンアルカロイドの製造方法を提供する。
ドーパミンに、MAOを作用させることによって、3,4-DHPAAを得る工程、
ドーパミンと3’4-DHPAAとを反応させることによって、3’-ヒドロキシノルコクラウリン(以下、ノルラウダノソリンとも称する)を得る工程、
3’-ヒドロキシノルコクラウリンに6OMTを作用させることによって、3’-ヒドロキシコクラウリン(以下、6-O-メチルノルラウダノソリンとも称する)を得る工程、
3’-ヒドロキシコクラウリンにCNMTを作用させることによって、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンを得る工程、および、
3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンに4’OMTを作用させるによって、レチクリンを得る工程。
レチクリンにCYP80G2を作用させてコリツベリンを得る工程、および、
コリツベリンにCNMTを作用させてマグノフロリンを得る工程、
を含む、マグノフロリンの製造方法を提供する。
レチクリンにBBEを作用させてスコウレリンを得る工程、
を含む、スコウレリンの製造方法を提供する。
(a)配列番号1、2、3、4、5、6、7または8のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1、2、3、4、5、6、7または8のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質。
(b') 配列番号1、2、3、4、5、6、7または8のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に対して、70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質。
(a) 配列番号1、2、3、4、5、6、7または8のヌクレオチド配列からなるDNA;
(b)(a)のヌクレオチド配列からなるDNAと相補的なヌクレオチド配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c) 配列番号1、2、3、4、5、6、7または8のヌクレオチド配列に対して、70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
ここで「相同性」については上記したとおりである。
本発明は、以下の工程を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法を提供する:
第一のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、MAO、6OMT、CNMTおよび4’OMTをコードする遺伝子が導入されてなる、MAO、6OMT、CNMTおよび4’OMTを発現する第一の組換え宿主細胞を提供する工程、および
第二のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子を導入して、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を発現する第二の組換え宿主細胞を提供する工程、
ドーパミンの存在下に、該第一の組換え宿主細胞および第二の組換え宿主細胞を培養する工程。かかる方法を、「インビボでのイソキノリンアルカロイドの第一生産方法」と称する。
ドーパミンの存在下に、該組換え宿主細胞を培養する工程、
を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法も提供する。かかる方法を、「インビボでのイソキノリンアルカロイドの第二生産方法」と称する。
また、インビトロでのイソキノリンアルカロイドの生産方法において、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMT、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素およびそれらをコードする遺伝子についての説明は、「インビボでのイソキノリンアルカロイド生産」について記載したとおりである。
各々が、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素からなる群から選択される1以上の酵素を発現する1種以上の細胞からなり、全細胞を合わせると、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素のすべてを発現する1種以上の細胞を提供する工程、
ただし、該1種以上の細胞を構成する細胞のうち少なくとも1種は、イソキノリンアルカロイド非生産性細胞である、
該1種以上の細胞から、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4’OMTおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を含む酵素抽出液を得る工程、
該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を用いてイソキノリンアルカロイドを産生させる工程。
酵素抽出液には、トリス、HEPES、MOPSバッファー等の一般的バッファー(グッドバッファー)を含めるのが好ましく、pHは6〜8に調整するのが好ましい。
微生物におけるベンジルイソキノリンアルカロイド生産のための実験計画
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。実施例に示す系は、大腸菌および出芽酵母細胞によるイソキノリンアルカロイドの2段階合成系からなるが、本発明はかかる系に限定されない。
まず、本発明者は、ベンジルイソキノリンアルカロイドの重要な中間体としてのレチクリンの高い生産を大腸菌において確認した。インビボ生産のために、ドーパミンからのレチクリンの生産に関与する生合成遺伝子 (即ち、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4’OMT)を発現する形質転換大腸菌を2 mM ドーパミンを含む培地で培養した。この培養物は主に(R,S)-レチクリンを28時間で培地 1リットル当たり 2.0 mg の収率で生産した (図3)。ドーパミンおよび生産されたレチクリンは大腸菌細胞の成育を阻害することはなかった。この系の利点は (R,S)-レチクリンがメチル基供与体であるS-アデノシル-L-メチオニン (SAM)を添加せずに生産されることである。というのは、微生物細胞におけるSAMの再生は生物変換の際にインビボメチル化活性を維持することが知られているためである。レチクリン生合成遺伝子を発現する形質転換大腸菌の培地が空のベクターを含む大腸菌の培地と比べて淡褐色化することは、酸化および重合する前に、ドーパミンが効率的にレチクリンに変換されたことを示唆する。
本発明の系の生物製造特性を特徴決定するために、(S)-ノルラウダノソリンから (S)-ノルレチクリンへのベンジルイソキノリンアルカロイド経路における中間体の生合成も、メチルトランスフェラーゼ酵素の様々な組合せ; 6OMT、CNMT、および4’OMTを発現する形質転換大腸菌細胞を用いて調べた。LC-MS 分析は明らかに、(S)-レチクリンに至るまでの4種類のベンジルイソキノリン中間体が本発明の改変された生物製造系において主要な生成物として合成されたことを示した(図5)。図5の結果は、CNMT または4’OMT 反応が6OMT 反応がなければほとんど進行せず、6OMTがベンジルイソキノリンアルカロイド生合成において必須の役割を果たしていることを示した。これはハナビシソウ(California poppy ) 細胞で示されているように律速段階としての6OMTの性質と一致する。これらの結果は、生合成酵素の基質特異性が代謝産物生産を制御し、様々な中間体の生産を制御することができるという知見を支持する。
微生物におけるベンジルイソキノリンアルカロイド生産のために、本発明者は、医薬の目的のため、マグノフロリンをターゲットとした。マグノフロリン生産のために、レチクリン生合成遺伝子を発現する形質転換大腸菌細胞を 5 mM ドーパミンを含む培地で培養した。一定期間の培養の後、CYP80G2 およびCNMTを発現する出芽酵母細胞を大腸菌がドーパミンからレチクリンを生産している培地に添加した。液体クロマトグラフィー-質量分析 (LC-MS)により、マグノフロリンとコリツベリンが、大腸菌と出芽酵母との共培地中に生産されたことが示された(図7および図8)。マグノフロリンは72時間で培地1リットル当たり7.2 mgの収率で合成された。この系において、マグノフロリンはメチル基供与体であるSAMやレチクリンを添加せずに生産された。
(S)-レチクリンはDr. P.J. Facchini (the University of Calgary)から譲り受けた。マグノフロリンはDr. R. Nishida (Kyoto University)から譲り受けた。(R,S)-レチクリン、(R,S)-ノルレチクリン、(R,S)-3’-ヒドロキシコクラウリン、および(R,S)-スコウレリンはMitsui Chemicals、Inc.、Japanから譲り受けた。(R,S)-3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンは以前に記載されているようにして調製した(Cui W, et al. (2006) Potential cancer chemopreventive activity of simple isoquinolines, 1-benzylisoquinolines, and protoberberines. Phytochemistry 67: 70-79)。(R,S)-ノルラウダノソリン は Acros Organics から購入した。ドーパミン は Sigma-Aldrich から購入した。
大腸菌でのレチクリン合成
イソキノリンアルカロイドの中間産物であるレチクリンは、ドーパミンと4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとの重合反応後、3段階のメチル化と1段階のヒドロキシル化を経て生合成されることが知られている(図1a)。本発明者は、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドのかわりに3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを用いることで、ヒドロキシル化のステップを省略できることを見いだしている。さらに微生物 (Micrococcus luteus) 由来のモノアミンオキシダーゼ (MAO) を用いることで、ドーパミンから3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを合成できる。すなわち、ドーパミンのみからの効率的なレチクリン合成が可能である(図1b)。
レチクリン合成に関与する酵素、MAO、ノルコクラウリンシンターゼ (NCS)、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ (6OMT)、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ (CNMT)、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4’-O-メチルトランスフェラーゼ (4’OMT) に対して、各上流に tac プロモーター もしくは T7 プロモーターを付加し、2種類の発現ベクターに組み込んだ (図2)。このプラスミドで 大腸菌 BL21 (DE3) を形質転換し、発現株を構築した。詳細を以下に示す。
Micrococcus luteus MAO 遺伝子を含む発現ベクター pKK223-3 の構築
全長 M. luteus MAO cDNA の PCR 増幅を行い、MAO 用大腸菌発現ベクターを pKK223-3 中に構築した。PCR には以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
フォワードプライマー、5’TTGAATTCATGAGCAACCCGCATGTCGTG3’(配列番号9) (これには ATG 開始コドンの前に EcoRI 制限部位を含めた (下線));
リバースプライマー、5’CTAAGCTTCAGGCGCGGATGTCCCGGAG3’ (配列番号10)(これは cDNA の 3’ 末端と相補的であり、TGA 停止コドンの後ろに、HindIII 制限部位を含めた (下線))。
PCR を以下の条件で行った: 最初の変性工程、2 分、94℃; 15 秒、94℃の変性、30 秒、50℃のアニーリング、90 秒、68℃の DNA 伸長からなるサイクルを 30 サイクル、そして最後の 68℃、5 分の伸長、これには KOD-plus DNA ポリメラーゼ (東洋紡) を用いた。PCR 断片を EcoRI および HindIII 制限酵素で切断した pKK223-3 ベクター (Pharmacia) にサブクローニングした。M. luteus MAO cDNA 断片を pKK223-3 中 tac ポリメラーゼプロモーターの制御下においた。DNA インサートの両鎖を配列決定し、PCR 増幅中に突然変異が導入されていないことを確認した。
オウレン NCS 遺伝子を含む発現ベクター pET41a (Minami, H. et al. Journal of Biological Chemistry, 282, 6274-6282 (2007))をDNAの鋳型としてPCRを行った。PCRには以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
NCS用オリゴヌクレオチド
フォワードプライマー、5’-ACTCGCGATCCCGCGAAATTAATACG-3’(配列番号11) (これにはT7ポリメラーゼプロモーターの前に NruI 制限部位を含めた (下線));
リバースプライマー、5’-CAGGATCCAGCAAAAAACCCCTCAAGAC-3’ (配列番号12)(これは cDNA の 3’ 末端と相補的であり、T7ターミネーターの後ろに、BamHI 制限部位を含めた (下線))。
PCR断片を、NruI および BamHI 制限酵素で切断した M. luteus MAO 遺伝子を含む発現ベクター pKK223-3 にサブクローニングした。
全長オウレン6OMT、CNMT、4’OMT cDNA の大腸菌発現ベクターの構築は、上記 M. luteus MAO 遺伝子を含む発現ベクター pKK223-3 の構築と同様にして行った。オウレン 6OMT、CNMT、4’OMT 遺伝子を含む発現ベクター pET21d (Morishige, T. et al. Journal of Biological Chemistry, 275, 23398-23405 (2000), Choi, K.B. et al. Journal of Biological Chemistry, 277, 830-835 (2002)) を DNA の鋳型として PCR を行った。PCR には以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
6OMT 用オリゴヌクレオチド
フォワードプライマー、5’AGGTACCGATCCCGCGAAATTAATACG3’ (配列番号13)(これには T7 ポリメラーゼプロモーターの前に KpnI 制限部位を含めた (下線));
リバースプライマー、5’CAGATCTAATATGGATAAGCCTCAATCAC3’ (配列番号14)(これは cDNA の 3’末端と相補的であり、TAG 停止コドンを含む、BglII 制限部位を含めた (下線))。
4’OMT 用オリゴヌクレオチド
フォワードプライマー、5’CAGATCTGATCCCGCGAAATTAATACG3’ (配列番号15)(これには T7 ポリメラーゼプロモーターの前に BglII 制限部位を含めた (下線));
リバースプライマー、5’TGGATCCTATGGAAAAACCTCAATGACTG3’ (配列番号16)(これは cDNA の 3’ 末端と相補的であり、TAG 停止コドンを含む、BamHI 制限部位を含めた (下線))。
CNMT 用オリゴヌクレオチド
フォワードプライマー、5’ TGGATCCGATCCCGCGAAATTAATACG3’ (配列番号17)(これには T7 ポリメラーゼプロモーターの前に BamHI 制限部位を含めた (下線));
リバースプライマー、5’ ACCTGCAGGCAGCAAAAAACCCCTCAAGAC 3’ (配列番号18)(これは cDNA の 3’ 末端と相補的であり、T7 ターミネーターの後ろに、PstI 制限部位を含めた (下線))。
3つの遺伝子の PCR 断片を KpnI および PstI 制限酵素で切断した pUC18 ベクターにサブクローニングした。この 3つの遺伝子を含む発現ベクター pUC18 より、PvuII-PvuII 断片を、EcoRV および NruI 制限酵素で切断した pACYC184 ベクターにサブクローニングした。
レチクリン生合成遺伝子発現プラスミド (pKK223-3 および pACYC184) を大腸菌 BL21 (DE3) に導入した。これら組換え大腸菌細胞を 100 μg/ml のアンピシリンと 50 μg/ml のクロラムフェニコールを含む LB 培地 100 ml 中で 37℃で 80 rpm にて培養した。IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトシド) を大腸菌の OD600 が 0.5 となった時点で終濃度 1 mM となるように添加した。細胞をさらに 24 時間 20℃で培養した。
細胞を 8,000 rpm、5 分、4℃の遠心分離によって回収した。ペレットを 3 ml の抽出バッファー (50 mM Tris-HCl (pH7.5)、10%グリセロール、5 mM 2-メルカプトエタノール) に再懸濁し、Sonic (Vibra-cell VC-130, Sonics&Materials Inc.) で超音波処理した (出力設定 15 で60 秒×3 回)。粗抽出物を 10,000 xg で5 分遠心分離し、細胞フリーの上清を得た。上清を酵素抽出液としてインビトロレチクリン合成に用いた。
インビボレチクリン生合成
大腸菌体内(インビボ)でのレチクリン生合成は、以下の点を除いては、上記大腸菌における組換えレチクリン生合成遺伝子の発現実験と同様にして行った。
IPTG 添加時に、終濃度 2 mM となるようにドーパミンを添加した。細胞をさらに 20 時間 25℃で培養した。培養液を 10,000 xg で5 分遠心分離し、菌体を除いた。遠心上清に等量のメタノールを加え、培地中のタンパク質を除去した。培地中のレチクリンを LC-MS (API 3200TM with AgilentTm HPLC system, Applied Biosystems Japan Ltd) にて測定した。
インビボレチクリン生合成
培地中のレチクリンを測定した結果、レチクリン生合成遺伝子発現株により、(R,S)-レチクリンが生合成された (図3)。収量は、2.0 mg/L であった。添加するドーパミン濃度を 5 mM まで上げることで、(R,S)-レチクリンの収量は 11 mg/L まで増加した。
インビトロレチクリン合成
インビトロでのレチクリン合成を行い、LC-MS で測定した。100 μl の標準酵素反応混合物は以下からなるものであった: 100 mM トリスバッファー、pH 7.5、1 mM のSAM (S-アデノシルメチオニン)、70 μl の酵素抽出液および 2 mM の ドーパミン。
反応混合物を 60 分、37℃でインキュベートした。反応を等量のメタノールの添加により停止させた。タンパク質が沈降した後、反応生成物を LC-MS を用いて定性、定量した。
サンプルを ODS-80Ts (Tosoh) に注入し、カラム温度 40℃、流速 0.7 ml/分で溶出した。移動相は 40% アセトニトリル+0.1% 酢酸であった。MS は ESI、ポジティブモードで、ドーパミンからレチクリンまでの全ての生成物(m/z=153, 154, 288, 302, 316, 330) を測定した。レチクリンの定量は、m/z=330のピーク面積の測定により行った。検量線を用いてピーク面積をレチクリン量に変換した。
インビトロレチクリン合成
酵素抽出液(インビトロ)により、2 mM ドーパミンから (S)-レチクリンが 22 mg/L 合成された。反応は完全に進行し、中間産物は見られなかった (図4)。ドーパミン濃度を 5 mM まで上げることで、合成された (S)-レチクリン量は、55 mg/L まで増加した。
3'-ヒドロキシノルコクラウリン(ノルラウダノソリン)からレチクリンまでのベンジルイソキノリンアルカロイド経路におけるその他の中間体の生合成を、様々な組合せのメチルトランスフェラーゼ酵素の生合成遺伝子(6OMT、CNMTおよび4’OMT)を発現するトランスジェニック大腸菌細胞を用いて調べた。結果を図5に示す。LC-MS分析により明らかに、(S)-レチクリンまでの4種のベンジルイソキノリン中間体が本発明者らのインビトロ方法を用いて主要生成物として合成されることが示された。インビボでの有効な生物変換も6OMTを導入していない組換え大腸菌と比較してMAO、NCSおよび6OMTを導入した組換え大腸菌では培地が明色になることにより示された(6OMTを導入していない組換え大腸菌では培地は黒くなった)。これらの結果は、CNMTまたは4’OMT反応が、ベンジルイソキノリンアルカロイド生合成において重要な役割を果たしている6OMT反応なしでは進行しないことを明らかに示す。これらの結果はオウレン細胞において6OMTが律速段階の酵素であることが示されたことおよび4’OMTの活性がN-メチル化により制御されていることと一致している。
マグノフロリン/スコウレリン生産のための発現ベクターの構築およびその出芽酵母における発現
P450 および酵母 NADPH-P450 レダクターゼのための共発現ベクター pGYRはDr. Y. Yabusaki、Sumitomo Cemicals Co.、Ltd.から譲り受けた。このベクターはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ プロモーターおよびターミネーターを含むものであった (Sakaki T, Akiyoshi-Shibata M, Yabusaki Y, Ohkawa H (1992) Organella-targeted expression of rat liver cytochrome P450c27 in yeast. J Biol Chem 267: 16497-16502)。pGYRのクローニング部位をさらに改変してSpeI 部位を含むようにしてpGYR-SpeIを構築した。全長 CYP80G2 cDNAを、オウレン培養細胞の1.3 μgのトータルRNAからオリゴ (dT) プライマーおよび SuperScript III RNase H-逆転写酵素 (Invitrogen)を用いて合成した一本鎖 cDNAを用いたPCRにより増幅し、pGYR-SpeI のSpeI 部位 にライゲーションして酵母発現ベクター、pGS-CYP80G2 を作成した(Ikezawa et al.Molecular cloning and characterization of CYP80G2, a cytochrome P450 which catalyzes an intramolecular C-C phenol coupling of (S)-reticuline in magnoflorine biosynthesis, from cultured Coptis japonica cells. J Biol Chem,in press, 2008)。CNMTの発現ベクターは以下に記載するように構築した。全長 CNMT cDNAをKpnI-CNMT-Fプライマー(5’-TATGGTACCATGGCTGTGGAAGCAAAGCAA-3’(配列番号19)) および CNMT-SalI-R プライマー(5’-CCAGTCGACTCATTTTTTCTTGAACAGAAC-3’(配列番号20))を用いてPCRにより増幅した。CNMT 遺伝子のPCR産物をpAUR123 ベクター (Takara Shuzo Co.)の KpnIおよび SalI 部位にライゲーションし、酵母発現ベクター、pAUR123-CNMTを作成した。BBEの発現ベクターを構築するために、全長 BBE cDNAを CYP80G2について行ったのと同様にしてPCRにより増幅し、pYES2 ベクター (Invitrogen)のHindIII および EcoRI 部位にライゲーションし、酵母発現ベクター、pYES2-BBEを作成した(Ikezawa et al.、データ未公表)。pYES2-BBEの作成用プライマーとしては、HindIII-BBE-Fプライマー(5’-ATAAAGCTTATTATGCGAGCAACGCATACAATTATCTC-3’(配列番号21))および、BBE-EcoRI-Rプライマー(5’-TGAATTCTTTAGATAACAATATTTCCTCTACATCCAACACC-3’(配列番号22))を用いた。
マグノフロリンのインビボ生産のために、大腸菌細胞を25℃で12時間、5 mM ドーパミンを含むLB 培地でIPTG 誘導をかけてインキュベートし、CYP80G2およびCNMTを発現する出芽酵母細胞を28℃で20 時間SD 培地でインキュベートした。出芽酵母細胞および2 % グルコースを大腸菌培地に添加し、28℃でのインキュベーションをさらに72時間行った。スコウレリン生産のために、BBEを発現する出芽酵母細胞および2 % ガラクトースを大腸菌培地に添加し、28℃でのインキュベーションをさらに48時間マグノフロリン生産の場合と同様にして行った。培地を回収し、等容量のメタノールによるタンパク質沈降後の上清を用いてマグノフロリン/スコウレリン生産をLC-MSにより測定した。
ベンジルイソキノリンアルカロイド生産をLC-MS (API 3200TM、Applied Biosystems Japan Ltd.) により、AgilentTm HPLC システム: カラム、ODS-80Ts (4.6×250 mm; Tosoh Inc.)を用いて測定した; 溶媒系、0.1% 酢酸を含有する20% アセトニトリル; 流速、0.5 ml/分、40℃。生成物を標準化学物質との共溶出、およびLC-MS/MSにおいて断片化スペクトルについての標準化学物質との比較 (図8) により同定した。
Claims (20)
- ドーパミンを基質とし、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを作用させることを含む、レチクリンを生産する工程、および、
得られたレチクリンを出発物質とし、イソキノリンアルカロイド生合成酵素を作用させる工程を含む、イソキノリンアルカロイドの製造方法。 - イソキノリンアルカロイド生合成酵素が、コリツベリンシンターゼ(CYP80G2)およびコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼであり、
レチクリンにコリツベリンシンターゼを作用させてコリツベリンを得る工程、および、
コリツベリンにコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼを作用させてマグノフロリンを得る工程、
を含む、請求項1に記載のイソキノリンアルカロイドの製造方法。 - イソキノリンアルカロイド生合成酵素が、ベルベリン架橋酵素であり、
レチクリンにベルベリン架橋酵素を作用させてスコウレリンを得る工程、
を含む、請求項1に記載のイソキノリンアルカロイドの製造方法。 - モノアミンオキシダーゼが微生物由来であり、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼおよびイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものである、請求項1から3いずれかに記載の方法。
- 第一のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されてなる、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを発現する第一の組換え宿主細胞を提供する工程、
第二のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子を導入して、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を発現する第二の組換え宿主細胞を提供する工程、
ドーパミンの存在下に、該第一の組換え宿主細胞および第二の組換え宿主細胞を培養する工程、
を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法。 - レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、コリツベリンシンターゼ(CYP80G2)およびコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼであり、得られるイソキノリンアルカロイドがマグノフロリンである請求項5に記載の方法。
- レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、ベルベリン架橋酵素であり、得られるイソキノリンアルカロイドがスコウレリンである請求項5に記載の方法。
- イソキノリンアルカロイド非生産性細胞が、大腸菌、酵母、枯草菌、糸状菌、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項5〜7いずれかに記載の方法。
- 第一のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞が大腸菌であり、第二のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞が酵母である、請求項8に記載の方法。
- 第一の組換え宿主細胞と第二の組換え宿主細胞とを共培養する、請求項5〜9いずれかに記載の方法。
- 第一の組換え宿主細胞を培養してレチクリンを得る工程、
得られたレチクリンの存在下に第二の組換え宿主細胞を培養する工程、
を含む、請求項5〜9いずれかに記載の方法。 - 一種のイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子が導入されてなる、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を発現する組換え宿主細胞を提供する工程、
ドーパミンの存在下に、該組換え宿主細胞を培養する工程、
を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法。 - レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、コリツベリンシンターゼ(CYP80G2)およびコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼであり、得られるイソキノリンアルカロイドがマグノフロリンである請求項12に記載の方法。
- レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、ベルベリン架橋酵素であり、得られるイソキノリンアルカロイドがスコウレリンである請求項12に記載の方法。
- イソキノリンアルカロイド非生産性細胞が、大腸菌、酵母、枯草菌、糸状菌、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項12〜14いずれかに記載の方法。
- 各々が、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素からなる群から選択される1以上の酵素を発現する1種以上の細胞からなり、全細胞を合わせると、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素のすべてを発現する1種以上の細胞を提供する工程、
ただし、該1種以上の細胞を構成する細胞のうち少なくとも1種は、イソキノリンアルカロイド非生産性細胞である、
該1種以上の細胞から、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼおよびレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を含む酵素抽出液を得る工程、
該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を用いてイソキノリンアルカロイドを産生させる工程、
を含む、ドーパミンからイソキノリンアルカロイドをインビトロで生産する方法。 - 該酵素抽出液とドーパミンとの混合液に、S-アデノシルメチオニンを添加することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 該イソキノリンアルカロイド非生産性細胞が、大腸菌、酵母、枯草菌、糸状菌、昆虫細胞、哺乳類細胞およびイソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞からなる群から選択される、請求項16または17に記載の方法。
- レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、コリツベリンシンターゼ(CYP80G2)およびコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼであり、得られるイソキノリンアルカロイドがマグノフロリンである請求項16〜18いずれかに記載の方法。
- レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素が、ベルベリン架橋酵素であり、得られるイソキノリンアルカロイドがスコウレリンである請求項16〜18いずれかに記載の方法。
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CN114262681A (zh) * | 2020-09-16 | 2022-04-01 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 小檗碱生产菌株、其建立方法及其应用 |
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-
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Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6012059992; J. Biol. Chem. Vol.282, No.9, 2007, p.6274-6282 * |
JPN6012059994; J. Biol. Chem. Vol.275, No.30, 2000, p.23398-23405 * |
JPN6012059995; J. Biol. Chem. Vol.277, No.1, 2002, p.830-835 * |
JPN6012059999; J. Biol. Chem. Vol.283, No.14, 20080129, p.8810-8821 * |
JPN6012060002; Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.268, 2000, p.293-297 * |
JPN6012060005; 丸尾文治、田宮信雄 監修: 「酵素ハンドブック」 , 1983, p.116-117, 株式会社 朝倉書店 * |
JPN6012060008; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.105, No.21, 20080527, p.7393-7398 * |
JPN6012060011; 化学と生物 Vol.47, No.8, 2009, p.528-530 * |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11214819B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-01-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (BIA) producing microbes, and methods of making and using the same |
US9534241B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-01-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (BIA) producing microbes, and methods of making and using the same |
US10017799B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-07-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (BIA) producing microbes, and methods of making and using the same |
US10988787B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (BIA) producing microbes, and methods of making and using the same |
US10858681B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (BIA) producing microbes, and methods of making and using the same |
US11124814B2 (en) | 2013-11-04 | 2021-09-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (BIA) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
US20160251688A1 (en) | 2013-11-04 | 2016-09-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
US10752903B2 (en) | 2015-05-04 | 2020-08-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (BIA) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
US10519453B2 (en) | 2015-05-04 | 2019-12-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (BIA) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
US11859225B2 (en) | 2015-05-08 | 2024-01-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of producing epimerases and benzylisoquinoline alkaloids |
US10544420B2 (en) | 2017-08-03 | 2020-01-28 | Antheia, Inc. | Engineered benzylisoquinoline alkaloid epimerases and methods of producing benzylisoquinoline alkaloids |
US11427827B2 (en) | 2017-08-03 | 2022-08-30 | Antheia, Inc. | Engineered benzylisoquinoline alkaloid epimerases and methods of producing benzylisoquinoline alkaloids |
CN114262681A (zh) * | 2020-09-16 | 2022-04-01 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 小檗碱生产菌株、其建立方法及其应用 |
CN114262681B (zh) * | 2020-09-16 | 2023-11-21 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 小檗碱生产菌株、其建立方法及其应用 |
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