JP2019536476A - ノル−オピオイドおよびナル−オピオイドベンジルイソキノリンアルカロイドの作製方法 - Google Patents

ノル−オピオイドおよびナル−オピオイドベンジルイソキノリンアルカロイドの作製方法 Download PDF

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Abstract

オピオイドを脱メチル化してノル-オピオイドにする方法を提供する。該方法は、オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程を含む。オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることにより、該オピオイドがノル-オピオイドに変換される。ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換する方法を提供する。該方法は、ノル-オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程を含む。ノル-オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることにより、該ノル-オピオイドがナル-オピオイドに変換される。

Description

相互参照
本出願は、2016年10月18日に出願された米国特許仮出願第62/409,837号および2017年3月17日に出願された米国特許仮出願第62/473,215号の恩典を主張するものである。これらの出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
医療用オピオイドは、中等度から重度の痛みを処置するために使用されるが、中毒を引き起こす特性を示す場合があり得る。医療用オピオイドが痛みを軽減する機序のため、この投薬物は、中でも現代医学において最も有効な痛み止めである。しかしながら、医療用オピオイドはさらに、広く乱用されもしている。医療用オピオイドの使用の取り組みにおいて、政策立案者には、痛みの過少治療とともにオピオイド乱用のリスクの緩和のバランスをとることが課される。オピオイド中毒の処置および予防には薬物療法が有効であることがわかっているが、このような治療法はコストが高いことが、処置プログラムの範囲および到達度の制限要因となっている。
本開示により、第1オピオイドを脱メチル化して第2オピオイドにするための方法を提供する。本開示により、さらに、オピオイドを脱メチル化してノル-オピオイドにするための方法を提供する。さらに、本開示により、オピオイドをナル-オピオイドに改変するための方法を提供する。さらに、本開示により、遺伝子操作された細胞内に存在しているオピオイドからノル-オピオイドを生成するための該遺伝子操作された細胞を提供する。また、本開示により、該遺伝子操作された細胞内に存在しているノル-オピオイドからナル-オピオイドを生成するための該遺伝子操作された細胞を提供する。
本発明の一局面では、第1オピオイドを脱メチル化して第2オピオイドにするための方法を提供する。該方法は、第1オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、第1オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、O-結合型メチル基の喪失によって第1オピオイドを第2オピオイドに変換する、工程を含み、ここで、第1オピオイドが、コデインおよびテバインからなる群より選択されることはない。
本発明の別の局面では、オピオイドを脱メチル化してノル-オピオイドにする方法を提供する。該方法は、第1オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、第1オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、O-結合型メチル基の喪失によって第1オピオイドを第2オピオイドに変換する、工程を含む。該方法はまた、第2オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、N-結合型メチル基の喪失によって第2オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程を含む。
本発明のさらなる一局面では、オピオイドを脱メチル化してノル-オピオイドにする別の方法を提供する。該方法は、オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、該オピオイドからのN-結合型メチル基の除去によって該オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程を含み、ここで、該オピオイドを該少なくとも1種の酵素にインビトロで接触させる場合、該オピオイドはテバインではない。
本発明のさらなる一局面では、オピオイドをナル-オピオイドに改変する方法を提供する。該方法は、オピオイドを少なくとも第1の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも第1の酵素と接触させることが、該オピオイドからのN-結合型メチル基の除去によって該オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程を含む。該方法はまた、該ノル-オピオイドを少なくとも第2の酵素と接触させる工程であって、補因子の存在下で該ノル-オピオイドを該少なくとも第2の酵素と接触させることが、該補因子からの側鎖の転移によって該ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換する、工程を含む。
本発明の別の局面では、オピオイドをナル-オピオイドに改変する別の方法を提供する。該方法は、第1オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、第1オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、O-結合型メチル基の喪失によって第1オピオイドを第2オピオイドに変換する、工程を含む。該方法はまた、第2オピオイドを少なくとも第2の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも第2の酵素と接触させることが、N-結合型メチル基の喪失によって第2オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程を含む。さらに、該方法は、該ノル-オピオイドを少なくとも第3の酵素と接触させる工程であって、補因子の存在下で該ノル-オピオイドを該少なくとも第3の酵素と接触させることが、該補因子からの側鎖の転移によって該ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換する、工程を含む。
本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された細胞内に存在しているオピオイドからノル-オピオイドを生成する、該遺伝子操作された細胞であって、該遺伝子操作された細胞によって産生されるN-デメチラーゼをコードしている異種コード配列を含み、ここで、該N-デメチラーゼは、該遺伝子操作された細胞内の該オピオイドを該ノル-オピオイドに変換し、該ノル-オピオイドは、該遺伝子操作された細胞内で生成される、該遺伝子操作された細胞を提供する。
本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された細胞内に存在しているノル-オピオイドからナル-オピオイドを生成する、該遺伝子操作された細胞であって、該遺伝子操作された細胞によって産生されるN-メチルトランスフェラーゼをコードしている異種コード配列を含み、ここで、該N-メチルトランスフェラーゼは、該ノル-オピオイドを該遺伝子操作された細胞内で該ナル-オピオイドに変換する、該遺伝子操作された細胞を提供する。
参照による組み入れ
本明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、参照により、あたかも個々の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられて具体的に個々に示されているのと同程度に、本明細書に組み入れられる。
本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲の詳細事項とともに示す。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を使用した実例の態様を示した以下の詳細説明、および添付の図面を参照することにより得られよう。
図1は、本発明の態様による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用およびサルベージ経路の例を示す。 図2は、本発明の態様による、グルコースの4-HPA、ドパミンおよび3,4-DHPAへの変換の生合成スキームを示す。 図3は、本発明の態様による、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド形成の一例の模式図を示す。 図4は、本発明の態様による、CYP-COR酵素のアミノ酸配列を示す。 図5は、本発明の態様による、ノルコクラウリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。 図6は、本発明の態様による、ノルラウダノソリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。 図7は、本発明の態様による、L-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。 図8は、本発明の態様による、半合成オピオイドの生成の生合成スキームを示す。 図9は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株内における糖からのレチクリン生成を改善する、チロシンヒドロキシラーゼ変異型を示す。 図10は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株内でのチロシンヒドロキシラーゼによるL-DOPA生成を改善する、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の共発現を示す。 図11Aは、遺伝子操作された酵母株内でのチロシンヒドロキシラーゼによるL-DOPA生成を改善する、培養培地への抗酸化剤の添加を示す。図11Bは、本発明の態様による、BH4レベルを高める、培養培地への抗酸化剤の添加を示す。 図12Aは、L-チロシンのビスBIAへの変換の生合成スキームを示す。図12Bは、本発明の態様による、ビスBIAを生合成するように遺伝子操作された酵母株を示す。 図13は、本発明の態様による、シトクロムP450オキシダーゼ-コデイノンレダクターゼ様（CYP-COR）融合体の系統樹を示す。 図14は、本発明の態様による、(S)-レチクリンをサルタリジンに変換するように遺伝子操作された酵母株のLC/MS-MS解析を示す。図14Aは、2つのエピメラーゼ変異体（CYP-COR_89405, CYP-COR_4328）および標準でのレチクリンおよびサルタリジンを示すクロマトグラム図を示す。図14Bは、標準との共溶出を示すように再プロットした場合の（A）のサルタリジンの同じクロマトグラム図を示す。 図15は、本発明の態様による、ラセミ体のノルラウダノソリンを(R)-レチクリンに変換するように遺伝子操作されたした酵母株のキラルLC/MS-MS解析を示す。 図16Aは、異種発現サルタリデイン（salutarideine）シンターゼのN-結合型グリコシル化状態を示す。図16Bは、本発明の態様による、植物ではなく酵母内で異種発現させた場合に観察されるタンパク質のN-結合型グリコシル化を解消するサルタリジンシンターゼの遺伝子操作された融合体を示す。 図17Aおよび図17Bは、本発明の態様による、ケイランチフォリン（cheilanthifoline）シンターゼ-サルタリジンシンターゼ融合体の設計を示す。 図18は、本発明の態様による、サルタリジンシンターゼのコドン最適化および、酵母における活性を改善する遺伝子操作された融合体を示す。 図19Aおよび図19Bは、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母が(R)-レチクリンのテバインへの変換およびrac-ノルラウダノソリンのテバインへの変換を触媒する小規模バッチ式発酵のLC/MS-MS解析を示す。 図20は、本発明の態様による、ランダム変異誘発およびスクリーニングによる、酵母において向上した活性を示すCODM酵素変異体の作出を示す。 図21A、図21Bおよび図21Cは、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母による(R)-レチクリンのテバインへの変換のための発酵の最適化を示す。 図22は、本発明の態様による、L-チロシンからの重要な分岐点中間体のレチクリンの生成のためのプラットフォーム酵母株を示す。 図23は、本発明の態様による、オピオイド3-O-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。 図24は、本発明の態様による、オピオイドN-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。 図25は、本発明の態様による、N-メチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を示す。 図26は、本発明の態様による、微生物細胞内での生合成スキームを示す。 図27は、本発明の態様による、BM3変異体の機能性発現を示す。 図28は、本発明の態様による、酵素発現および遺伝子操作のためのプラスミド/YACベクターを示す。 図29は、本発明の態様による、CODMの機能性発現を示す。 図30は、本発明の態様による、半合成オピオイドの生成の生合成スキームを示す。
発明の詳細な説明
ナル-オピオイドは、オピオイド中毒およびオピオイド関連副作用に対処するための重要なクラスの薬物療法薬である。コデインおよびモルヒネなどのアヘン剤はケシ由来の植物分子であり、これは、脳、脊椎、腸および末梢感覚器内に存在するμ-オピオイド受容体に結合して体の自然な痛みの減衰を模倣することを可能にする特有の五環式構造を有する。このような同じアヘン剤分子は、アンタゴニスト（例えば、ナルトレキソンおよびナロキソン）として作用するように修飾され得る。一部の例では、オピオイド分子は、オピオイド受容体への結合を可能にするが下流のシグナル伝達応答の活性化は抑制する化学修飾を導入することにより修飾され得る。他の分子、例えばブプレノルフィンは、オピオイド受容体に結合して混合型部分アゴニストとして作用し得る。
アンタゴニストと混合型部分アゴニストオピオイドの組は、集合的にナル-オピオイドと称され、強力なオピオイドアゴニストを摂取した患者の受容体結合部位を占有し得る競合的モジュレータのツールキットを構成し得る。一例として、中毒患者集団には、ナル-オピオイドは:（1）強力なアンタゴニスト、例えばナロキソンを投与することによる過剰摂取の処置;（2）混合型部分アゴニスト、例えばブプレノルフィンで症状を管理することによる解毒;および/または（3）例えば、ブプレノルフィン/ナロキソン合剤で報酬応答をブロックすることによる維持のために使用され得る。重度の痛みを伴う患者集団には、ナル-オピオイドは:（4）例えば、該薬物を誤用した場合の多幸感および陶酔をブロックし得る乱用抑止アゴニスト/アンタゴニスト複合製剤、例えばモルヒネ/ナルトレキソン合剤による抑制;および/または（5）腸内の受容体から便秘を引き起こし得るオピオイドアゴニストを移動させ得る末梢作用性アンタゴニスト、例えば、ナロキソンのポリマーコンジュゲート（Movantik（商標））を投与することによる副作用の低減のために使用され得る。
ナル-オピオイドの合成のための原料出発物質は、ケシの薬物作物から抽出される天然アヘン剤、例えばテバインである。従来より、このような分子は、次いで半合成アンタゴニスト、弱いアゴニストおよび混合型部分アゴニストに、ナル-オピオイド生成物を出発物質および反応中間体から単離するための触媒、溶媒、試薬および精製方法の使用が必要とされる一連の非効率的な反応工程によって化学修飾される。現在使用されている半合成作製法は非効率的であり、全過程に対してかなりのコストが付加される。
本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での多様なナル-オピオイドの生成のための方法を提供する。また、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での多様なノル-オピオイドの生成のための方法も提供する。さらに、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのO-デメチラーゼおよびN-デメチラーゼの産生のための方法を提供する。特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でオピオイドのノル-オピオイドへの脱メチル化によりノル-オピオイド生成物を生成するための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、N-結合型側鎖を付加し得る酵素、例えばN-メチルトランスフェラーゼでノル-オピオイドを修飾することによって多様なナル-オピオイドを生成するための方法を提供する。
本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのナル-オピオイドおよびノル-オピオイド化合物の生成のための方法を提供する。本開示全体を通して、用語「化合物」は、2種類以上の要素を含むもの、例えば、ナル-オピオイド分子またはナル-オピオイド組成物を示すために使用され得る。ナル-オピオイド化合物は、ナル-オピオイドのおおむね純粋な組成物、または不純物が含有されていてもそうでなくてもよいナル-オピオイドの組成物を示し得る。
関心対象のナル-オピオイド
関心対象のBIAを生成する宿主細胞を提供する。一部の例では、遺伝子操作された株である宿主細胞、例えば、本明細書において論考した態様の遺伝子操作された株は、関心対象のナル-オピオイド、例えば非限定的に:ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン（axelopran）、ベベンプラン（bevenpran）、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミンおよびジプレノルフィンを生成するためのプラットフォームを提供し得る。
関心対象のノル-オピオイド
関心対象のノル-オピオイドを生成する宿主細胞を提供する。一部の例では、遺伝子操作された株である宿主細胞、例えば、本明細書において論考した態様の遺伝子操作された株は、関心対象のノル-オピオイド、例えば非限定的に:ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノン、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンを生成するためのプラットフォームを提供し得る。
関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）
関心対象のBIAを生成する宿主細胞を提供する。一部の例では、遺伝子操作された株である宿主細胞、例えば、本明細書において論考した態様の遺伝子操作された株は、いくつかの構造分類、例えば非限定的に、前駆体BIA、ベンジルイソキノリン、プロモルフィナン、モルフィナンなどの関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイドおよびその修飾体を生成するためのプラットフォームを提供し得る。これらの分類の各々は、該分類のメンバーをもたらし得る遺伝子操作された宿主細胞の生合成経路の任意の簡便なメンバーの生合成前駆体、中間体およびその代謝産物を包含していることを意味する。化合物の非限定的な例を以下に、これらの構造分類の各々について示す。一部の場合において、所与の例の構造は、それ自体がベンジルイソキノリンアルカロイドと特性評価される場合もあり、されない場合もある。一部の場合では、本発明での化学物質は、考えられ得るすべての異性体、例えば1種のエナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマー混合物および中間体混合物を包含していることを意味する。
BIA前駆体としては、非限定的に、ノルコクラウリン（NC）およびノルラウダノソリン（NL）、ならびにNCおよびNL前駆体、例えばチロシン、チラミン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（4-HPA）、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸（4-HPPA）、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、およびドパミンが挙げられ得る。いくつかの態様では、1種または複数種の該BIA前駆体が3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）とドパミンである。一部の特定の場合では、1種または複数種の該BIA前駆体が4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（4-HPA）とドパミンである。特に、NLおよびNCは、それぞれ前駆体分子からピクテ・スペングラー縮合反応から合成され得、この場合、反応は自発的に起こり得るか、または任意の簡便な酵素によって触媒され得る。
ベンジルイソキノリンとしては、非限定的に、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、コクラウリン、3'-ヒドロキシコクラウリン、4'-O-メチルノルラウダノソリン、4'-O-メチル-ラウダノソリン、N-メチルノルコクラウリン、ラウダノソリン、N-メチルコクラウリン、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、パパベリン、ラウダニン、ラウダノシン、テトラヒドロパパベリン、1,2-ジヒドロパパベリン、およびオリエンタリン（orientaline）が挙げられ得る。
プロモルフィナンとしては、非限定的に、サルタリジン、サルタリジノール、およびサルタリジノール-7-O-アセテートが挙げられ得る。
モルフィナンとしては、非限定的に、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、およびヘテロコデインが挙げられ得る。
宿主細胞
任意の簡便な細胞が主題の宿主細胞および方法に使用され得る。一部の場合では、宿主細胞が非植物細胞である。一部の例では、宿主細胞が微生物細胞と特性評価され得る。一部の特定の場合では、宿主細胞が昆虫細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞または酵母細胞である。任意の簡便な型の宿主細胞が、主題のノル-オピオイド-またはナル-オピオイド-生成細胞を作製するのに使用され得、例えば、US2008/0176754およびUS2014/0273109（その開示内容は参照によりその全体が組み入れられる）を参照のこと。関心対象の宿主細胞としては、非限定的に、細菌細胞、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス属、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimuium）細胞、昆虫細胞、例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）S2およびツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）Sf9細胞、哺乳動物細胞、例えば、HeLaおよび293細胞、植物細胞、例えば、タバコBY-2細胞、ならびに酵母細胞、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびピキア酵母（Pichia pastoris）細胞が挙げられる。一部の例では、宿主細胞が酵母細胞または大腸菌（E. coli）細胞である。一部の場合では、宿主細胞が酵母細胞である。一部の例では、宿主細胞が、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドのBIA、例えばノルテバインまたはナロキソンを生成するために遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の例では、宿主細胞が、関心対象の酵素を産生するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の例では、宿主細胞が、O-デメチラーゼを産生するように遺伝子操作された酵母株に由来する。該O-デメチラーゼは、基質、例えば第1オピオイドを第2オピオイドに変換できるものであり得る。一部の例では、宿主細胞が、N-デメチラーゼを産生するように遺伝子操作された酵母株に由来する。該N-デメチラーゼは、基質、例えば第2オピオイドをノル-オピオイドに変換できるものであり得る。一部の例では、宿主細胞が、メチルトランスフェラーゼを産生するように遺伝子操作された酵母株に由来する。さらに、該メチルトランスフェラーゼは、ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換できるものであり得る。一部の例では、宿主細胞が、エピメラーゼを産生するように遺伝子操作された酵母株に由来する。該エピメラーゼはオキシダーゼとレダクターゼを有し得る。さらに、該エピメラーゼは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換できるものであり得る。さらに、該エピメラーゼは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用されるようにオキシダーゼ活性またはレダクターゼ活性を保持している、より小さい酵素に分離され得る。
Smolke et al.によるUS2008/0176754およびUS2014/0273109に記載の任意の宿主細胞が主題の細胞および方法における使用のために適合され得る。特定の態様では、酵母細胞が出芽酵母（S. cerevisiae）種であり得る。特定の態様では、酵母細胞が分裂酵母種であり得る。特定の態様では、酵母細胞がピキア酵母種であり得る。酵母は、シトクロムP450タンパク質がその活性が維持されるように小胞体膜内に適正にフォールディングされ得るため、宿主細胞として関心対象である。一例では、シトクロムP450タンパク質が関心対象のいくつかの生合成経路に関与している。さらなる例では、シトクロムP450タンパク質が、関心対象のBIA、例えばナロキソンまたはナルトレキソンの生成に関与している。さらなる例では、シトクロムP450タンパク質が、関心対象の酵素、例えば、オキシダーゼとレダクターゼを有するエピメラーゼの産生に関与している。
本明細書において有用性が見出され得る関心対象の酵母株としては、非限定的に、CEN.PK（遺伝子型:MATa/α ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2）、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、Σ1278B、AB972、SK1、およびFL100が挙げられる。一部の特定の場合では、該酵母株が、S288C（MATα; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1 hap1）、BY4741（MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0）、BY4742（MATα; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0）、BY4743（MATa/MATα; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; met15Δ0/MET15; LYS2/lys2Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0）、ならびにWAT11またはW(R)、それぞれシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）NADPH-P450レダクターゼATR1および酵母NADPH-P450レダクターゼCPR1を発現するW303-B株（MATa; ade2-1; his3-11、-15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr＋）の誘導体のいずれかである。別の態様では、酵母細胞がW303α（MATα; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1）である。さらなる関心対象の酵母株の実体および遺伝子型は、EUROSCARF（web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html）において知得され得る。
一部の場合では、宿主細胞が真菌細胞である。特定の態様では、真菌細胞がアスペルギルス属の種のものであり得、菌株としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（ATCC 1015、ATCC 9029、CBS 513.88）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（ATCC 56747、RIB40）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（NIH 2624、ATCC 20542）およびアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）（FGSC A4）が挙げられる。
特定の態様では、異種コード配列がアスペルギルス属の一種内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）、MbfAプロモーター、シトクロムcオキシダーゼサブユニットプロモーター（CoxA）、SrpBプロモーター、TvdAプロモーター、リンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（MdhA）、β-マンノシダーゼプロモーター（ManB）から選択され得る。特定の態様では、ターミネーターが、グルコアミラーゼターミネーター（GlaA）またはTrpCターミネーターから選択され得る。特定の態様では、プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、または宿主のゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばハイグロマイシンでの選択により、または窒素源の利用により、例えばアセトアミドを単独窒素源として用いて行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えば、プロトプラスト形質転換、酢酸リチウムまたはエレクトロポレーションを用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体MEもしくは固形MEA（3％麦芽エキス,0.5％ペプトンおよび±1.5％寒天）中またはVogel最少培地中で選択ありもしくはなしで培養され得る。
一部の場合では、宿主細胞が細菌細胞である。細菌細胞は任意の細菌属から選択され得る。細菌細胞が由来し得る属の例としては、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック（Leucononstoc）属、マクロコッカス（Macrococcus）属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコキスティス（Synechocystis）属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属が挙げられる。本開示の方法で使用され得る細菌の種の例としては、アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アルスロバクター・アリライテンシス（Arthrobacter arilaitensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス（Brachybacterium tyrofermentans）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium divergens）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Corynebacterium flavescens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、グルコナセトバクター・エウロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコナセトバクター・ホハンナエ（Gluconacetobacter johannae）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongata）、コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）、ラクトバチルス・アシディファリナエ（Lactobacillus acidifarinae）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ロイコノストク・シトレウム（Leuconostoc citreum）、マクロコッカス・カセオリティカス（Macrococcus caseolyticus）、マイクロバクテリウム・フォリオルム（Microbacterium foliorum）、ミクロコッカス・ライレ（Micrococcus lylae）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Propionibacterium acidipropionici）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、サイクロバクター・セラー（Psychrobacter celer）、スタフィロコッカス・コンディメンティ（Staphylococcus condimenti）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Streptomyces griseus）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）、ワイセラ・チバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・コレエンシス（Weissella koreensis）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）・ビフィドゥム（bifidum）/ブレーベ（breve）/ロンガム（longum）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、シュードアルテロモナス・シトレア（Pseudoalteromonas citrea）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、クロストリジウム（Clostridium）・リュングダリイ（ljungdahlii）/アセティカム（aceticum）/アセトブチリカム（acetobutylicum）/ベエイジェリンキー（beijerinckii）/ブチリカム（butyricum）、およびムーレラ（Moorella）・テモセルム（themocellum）/サーモアセチカ（thermoacetica）が挙げられる。
特定の態様では、細菌細胞が大腸菌株のものであり得る。特定の態様では、大腸菌株は、BL21、DH5α、XL1-Blue、HB101、BL21およびK12から選択され得る。特定の態様では、異種コード配列が大腸菌内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、T7プロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（tet）、lacオペロンプロモーター（lac）、lacO1プロモーターから選択され得る。特定の態様では、プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、またはゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、プラスミドが、pUC19またはpBADから選択される。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンまたはアンピシリンでの選択により行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えばコンジュゲーション、ヒートショック化学的形質転換またはエレクトロポレーションを用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体ルリア-ベルターニ（LB）培地中で37℃にて抗生物質ありまたはなしで培養され得る。
特定の態様では、細菌細胞が枯草菌株であり得る。特定の態様では、枯草菌（B. subtilis）株は、1779、GP25、RO-NN-1、168、BSn5、BEST195、1A382および62178から選択され得る。特定の態様では、異種コード配列がバチルス属の一種内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、gracプロモーター、p43プロモーターまたはtrnQプロモーターから選択され得る。特定の態様では、該プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、またはゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、プラスミドが、pHP13 pE194、pC194、pHT01またはpHT43から選択される。特定の態様では、組込みベクター、例えばpDG364またはpDG1730が、発現カセットをゲノム内に組込むために使用され得る。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばエリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびスペクチノマイシンでの選択により行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えば自然形質転換能、ヒートショックまたは化学的形質転換を用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体ルリア-ベルターニ（LB）培地中で37℃にて、またはM9培地＋グルコースおよびトリプトファン中で培養され得る。
宿主細胞に対する遺伝子修飾
宿主細胞は、関心対象のBIAの生成をもたらす1つまたは複数の修飾（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の修飾）を含むように遺伝子操作され得る。付加的または代替的に、宿主細胞は、関心対象の酵素の産生をもたらす1つまたは複数の修飾（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の修飾）を含むように遺伝子操作され得る。一部の場合では、修飾は遺伝子修飾、例えば、遺伝子もしくはその断片の変異、付加もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写調節である。本明細書で用いる場合、用語「変異」は、参照の配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換をいう。変異は特異的変異として、天然遺伝子の本来の遺伝子座に組込まれ得る。一部の場合では、変異は、別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入された遺伝子の追加コピーとして、またはエピゾーマルベクター上、例えば、2μもしくはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。一部の特定の場合では、該酵素の基質阻害コピーが天然細胞の転写調節下に存在している。一部の例では、該酵素の基質阻害コピーが、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的な調節を伴って導入される。一部の例では、1つまたは複数の修飾の対象物が天然遺伝子であり得る。一部の例では、1つまたは複数の修飾の対象物が非天然遺伝子であり得る。一部の例では、非天然遺伝子が宿主細胞内に挿入され得る。さらなる例では、非天然遺伝子が、宿主細胞内に挿入される前に1つまたは複数の修飾によって改変され得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の関心対象のノル-オピオイドBIAを過剰生成し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の関心対象のナル-オピオイドBIAを過剰生成し得る。過剰生成するとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非修飾細胞）と比べて関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIA分子の改善または増大した生成を有することを意味する。改善または増大した生成とは、対照が関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成を有しない場合での、いくらかの量の関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成、ならびに対照がいくらかの関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成を有する状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意味する。
遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のノル-オピオイドを過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がノル-オピオイドの生成を有しない場合は、いくらかの量の関心対象のノル-オピオイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象のノル-オピオイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種のナル-オピオイドをさらに過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がナル-オピオイドの生成を有しない場合は、いくらかの量の関心対象のナル-オピオイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象のナル-オピオイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の関心対象のBIAを過剰生成し得る。過剰生成するとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非修飾細胞）と比べて関心対象のBIA分子の改善または増大した生成を有することを意味する。改善または増大した生成とは、対照は関心対象のBIAの生成を有していない場合のいくらかの量の関心対象のBIAの生成、ならびに対照はいくらかの関心対象のBIAの生成を有している状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意味する。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有していない場合は、いくらかの量の関心対象の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有している状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをさらに過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有しない場合は、いくらかの量の関心対象の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。遺伝子操作された宿主細胞は、モルフィナンアルカロイドおよびプロモルフィナンアルカロイドのうちの1種または複数種をさらに過剰生成し得る。
一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、該1つまたは複数の修飾（例えば、本明細書に記載のようなもの）がない対照宿主細胞と比べて増大量の(R)-レチクリンを生成することができる。一部の特定の場合では、(R)-レチクリンの該増大量は、対照宿主細胞と比べて約10％以上、例えば、対照宿主細胞と比べて約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、約2倍以上、約5倍以上、またはさらには約10倍以上である。一部の場合では、(R)-レチクリンは、遺伝子操作された宿主細胞内でのエピマー化反応の生成物である。このような場合、(S)-レチクリンはエピマー化反応の基質であり得る。
さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の関心対象の酵素を過剰産生し得る。過剰産生するとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非修飾細胞）と比べて関心対象の酵素の改善または増大した産生を有することを意味する。改善または増大した産生とは、対照が産生を有しない場合のいくらかの量の関心対象の酵素の産生、ならびに対照がいくらかの関心対象の酵素の産生を有する状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意味する。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種のO-デメチラーゼ（ODM）酵素を過剰産生し得る。本明細書に記載の態様において使用され得るODM酵素の例は表3において知得される。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がODM酵素の産生を有しない場合は、いくらかの量のODM酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのODM酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種のN-デメチラーゼ（NDM）酵素を過剰産生し得る。本明細書に記載の態様において使用され得るNDM酵素の例は表4において知得される。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がNDM酵素の産生を有しない場合は、いくらかの量のODM酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのNDM酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種のN-メチルトランスフェラーゼ（NMT）酵素を過剰産生し得る。本明細書に記載の態様において使用され得るNMT酵素の例は表5において知得される。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がNMT酵素の産生を有しない場合は、いくらかの量のNMT酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのNMT酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種のCYP-COR酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がCYP-COR酵素の産生を有しない場合は、いくらかの量のCYP-COR酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのCYP-COR酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、CYP-COR酵素に由来する1種または複数種の酵素をさらに過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照がCYP-COR酵素に由来する酵素の産生を有しない場合は、いくらかの量でCYP-COR酵素に由来する酵素を産生し得る、ならびに対照がCYP-COR酵素に由来する酵素のいくらかの産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。
一部の場合では、該1つまたは複数（例えば、2つ以上、3つ以上、または4つ以上）の修飾は:生合成酵素遺伝子における基質阻害緩和変異;生合成酵素遺伝子における産物阻害緩和変異;補因子回復促進機構;生合成酵素遺伝子におけるフィードバック阻害緩和変異;生合成酵素遺伝子の転写モジュレーション修飾;酵素遺伝子における不活性化変異;エピマー化修飾;ビスBIA生成修飾;および酵素をコードしている異種コード配列から選択され得る。1つまたは複数の修飾を含む細胞は遺伝子操作された細胞と称され得る。
基質阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非修飾細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「基質阻害緩和変異」は、該細胞の基質阻害制御機構を緩和する変異をいう。
基質阻害を緩和する変異は、関心対象の細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させ、調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC50を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、遺伝子操作された宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。
関心対象のナル-オピオイドもしくはノル-オピオイドのBIAまたはその前駆体のレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における基質阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が基質阻害緩和のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該1つまたは複数の変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、1種または複数種のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードしている。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の基質阻害緩和変異が、TyrHである生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の基質阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。
特定の態様では、該1つまたは複数の基質阻害緩和変異がTyrH遺伝子内に存在している。TyrH遺伝子は、チロシンをL-DOPAに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードしている。しかしながら、TyrHは、その基質チロシンによって阻害される。例えばヒトまたはラットにみられる哺乳動物チロシンヒドロキシラーゼ活性は、TyrH遺伝子に対する基質阻害を軽減する変異によって改善することができる。特に、チロシンによる基質阻害は、TyrH遺伝子内における点変異W166Yによって軽減させることができる。また、TyrH遺伝子内における点変異W166Yにより、チロシンのL-DOPAへの反応を触媒するためのチロシンヒドロキシラーゼの共基質BH4の結合が改善され得る。TyrHの該変異型（例えば、米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）は、糖からBIAを生成するために酵母株において発現させた場合、BIAの生成を有意に改善し得る。
任意の簡便な数および型の変異が、基質阻害制御機構を緩和するために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の基質阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の基質阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
補因子回復促進機構
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回復促進機構（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非修飾細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「補因子回復促進機構」は、該細胞の補因子回復制御機構を促進させる機構をいう。
関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドのBIAまたはその前駆体のレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における補因子回復のさまざまな制御機構および生合成酵素が補因子回復促進のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回復促進機構を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードしている異種コード配列を含み得る。DHFRが発現されると、これにより7,8-ジヒドロビオプテリン（BH2）がテトラヒドロビオプテリン（BH4）に変換され得、それによりBH4がTyrH共基質として回復し得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の補因子回復促進機構を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。
任意の簡便な数および型の機構が、補因子回復制御機構を促進させるために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の補因子回復促進機構、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の補因子回復促進機構を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
産物阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の産物阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非修飾細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「産物阻害緩和変異」は、遺伝子操作された宿主細胞の短期間および/または長期間の産物阻害の制御機構を緩和する変異をいう。短期間の産物阻害は、共基質の結合部位への競合的結合がみられる該細胞の制御機構である。長期間の産物阻害は、所望の経路外の化合物の不可逆的結合がみられる該細胞の制御機構である。
産物阻害を緩和する変異は、関心対象の細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させ、調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC50を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、遺伝子操作された宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。
関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドのBIAのレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における産物阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が産物阻害緩和のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の産物阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、1種または複数種のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードしている。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の産物阻害緩和変異が、TyrHである生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の産物阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに含む。
特定の態様では、該1つまたは複数の産物阻害緩和変異がTyrH遺伝子内に存在している。TyrH遺伝子は、チロシンをL-DOPAに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードしている。TyrHは、ヒドロキシル化反応を触媒するための共基質としてテトラヒドロビオプテリン（BH4）を必要とする。一部の微生物株、例えば出芽酵母はBH4を天然に産生しないが、図1に示すような4-酵素合成/再利用経路により、この基質を産生するように遺伝子操作され得る。図1は、本発明の態様による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用およびサルベージ経路の例を示す。図1は、酵素PTPS,ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ;SepR,セピアプテリンレダクターゼ;PCD,プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ;QDHPR,ジヒドロプテリジンレダクターゼ;およびDHFR,ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を示す。図1に示した酵素のうち、酵母は内因性GTPシクロヒドロラーゼIを合成する。GTPおよびジヒドロネオプテリン三リン酸は酵母内で天然に合成される。さらに、図1における他の代謝産物は酵母内で天然に生成されない。
TyrHは、その産物L-DOPAならびに他のカテコールアミン、特にドパミンによって阻害される。例えばヒトまたはラット由来の哺乳動物チロシンヒドロキシラーゼ活性は、産物阻害を軽減する変異によって改善することができる。例えば、短期間の産物阻害、例えば共基質の結合部位への競合的結合は、TyrH遺伝子における点変異W166Yによって軽減され得る。特に、TyrH遺伝子における点変異W166Yにより共基質の結合が改善され得る。さらに、共基質の結合部位への競合的結合を軽減するための短期間の産物阻害は、TyrH遺伝子における点変異S40Dによっても改善され得る。また、短期間の産物阻害はTyrH遺伝子におけるR37E,R38E共同（joint）変異によっても改善され得る。特に、R37E,R38E変異は一緒になって、ドパミンの存在下でのチロシンヒドロキシラーゼ活性を明確に改善し得る。
さらに、長期間の産物阻害はTyrH遺伝子における点変異によって軽減され得る。長期間の産物阻害の軽減としては、チロシンヒドロキシラーゼ活性の産物阻害因子として作用するカテコールアミンの存在が少なくなるような、活性部位での鉄へのカテコールアミンの不可逆的結合が挙げられ得る。長期間の産物阻害は、それぞれTyrH遺伝子における変異E332DおよびY371Fによって軽減させることができる。
複数の型の基質阻害および産物阻害を軽減させてTyrHの活性をさらに改善するために変異の組合せ（例えば、一度に2つもしくは3つ、またはそれ以上の変異）を行なってもよい。TyrHの該変異型（例えば、米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）は、糖から関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを生成するために酵母株において発現させた場合、ノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイド生成物の生成を有意に改善し得る。
任意の簡便な数および型の変異が、産物阻害の制御機構を緩和するために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の産物阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の産物阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
フィードバック阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非修飾細胞内に存在する）。付加的または代替的に、一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「フィードバック阻害緩和変異」は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害の制御機構を緩和する変異をいう。フィードバック阻害は、調節対象化合物の合成経路内の酵素が、該化合物がある一定レベルまで蓄積されたら阻害され、それにより細胞内の該化合物の量を均衡する該細胞の制御機構である。フィードバック阻害を緩和する変異は、遺伝子操作された宿主細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させる。このようにして、遺伝子操作された宿主細胞は調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC50を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。
関心対象のBIAのレベル調節に指向される、フィードバック阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が宿主細胞における緩和のために標的化され得る。宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異を該細胞にとって天然の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該1つまたは複数の変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼおよびコリスミ酸ムターゼから選択される1種または複数種の酵素をコードしているものであり得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼをコードしている。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子はコリスミ酸ムターゼをコードしているものであり得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO4およびARO7から選択される生合成酵素遺伝子内に存在し得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO4である生合成酵素遺伝子内に存在し得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO7である生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。
任意の簡便な数および型の変異が、フィードバック阻害の制御機構を緩和するために使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「変異」は、参照の配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換をいう。変異は特異的変異として、天然遺伝子の本来の遺伝子座に組込まれ得る。一部の場合では、変異は、別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入された遺伝子の追加コピーとして、またはエピゾーマルベクター上、例えば、2μもしくはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。一部の特定の場合では、該酵素のフィードバック阻害コピーが天然細胞の転写調節下に存在している。一部の例では、該酵素のフィードバック阻害コピーが、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入される。
特定の態様では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異がARO4遺伝子内に存在し得る。関心対象のARO4変異としては、非限定的に、229位のリシン残基のロイシンでの置換、166位のグルタミン残基のリシン残基での置換、またはHartmann M, et al.（（2003）Proc Natl Acad Sci U S A 100（3）:862-867）もしくはFukuda, et al.（（1992）J Ferment Bioeng 74（2）:117-119）に記載の変異が挙げられ得る。一部の例では、フィードバック阻害を付与するための変異は、変異誘発された酵素変異型ライブラリーから選択され得る。かかる選出体の例としては、Fukuda, et al.（（1990）Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of β-Phenylethyl Alcohol and β-Phenylethyl Acetate. Agr Biol Chem Tokyo 54（1）:269-271）に記載のような過剰のチロシンを有する培地中でのo-フルオロ-D,L-フェニルアラニンの増加またはaro3変異型酵母株の増殖の救済が挙げられ得る。
特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上のフィードバック阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15のフィードバック阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。
転写モジュレーション修飾
宿主細胞は、該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の1つまたは複数の転写モジュレーション修飾（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の修飾）を含み得る。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。該細胞の任意の簡便な生合成酵素遺伝子が転写モジュレーションのために標的化され得る。転写モジュレーションとは、修飾細胞内の関心対象の遺伝子の発現が、対照細胞（例えば、非修飾細胞）と比べてモジュレートされる、例えば、増大または低減、向上または抑制されることを意味する。一部の場合では、関心対象の該遺伝子の転写モジュレーションとしては、発現の増大または増強が挙げられる。発現の増大または増強とは、関心対象の該遺伝子の発現レベルが、対照、すなわち修飾されていない同じ細胞での発現と比べて（例えば、任意の簡便な遺伝子発現アッセイを使用することにより）2倍以上、例えば5倍以上、場合によっては25-、50-もしくは100倍以上、特定の態様では300倍以上またはそれより大きく増大していることを意味する。代替的に、細胞における関心対象の該遺伝子の発現が非常に少なくて検出不可能である場合では、関心対象の該遺伝子の発現レベルは、発現が容易に検出可能であるレベルまで増大しているならば、増大しているとみなす。一部の特定の場合では、関心対象の該遺伝子の転写モジュレーションとしては、発現の低減または抑制が挙げられる。発現の低減または抑制とは、関心対象の該遺伝子の発現レベルが、対照と比べて2倍以上、例えば5倍以上、場合によっては25-、50-もしくは100倍以上、特定の態様では300倍以上またはそれより大きく低減されていることを意味する。一部の場合では、発現は、検出不可能なレベルまで低減される。主題の宿主細胞における使用のために適合され得る関心対象の宿主細胞プロセスの修飾は、Smolke et al.による米国特許出願公開第20140273109（14/211,611）号に記載されており、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
任意の簡便な生合成酵素遺伝子が転写モジュレートされ得、非限定的に、図2に記載の生合成酵素が挙げられ得る。特に、図2は、本発明の態様による、グルコースの4-HPA、ドパミンおよび3,4-DHPAへの変換の生合成スキームを示す。図2に記載の酵素の例としては、ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9およびTKLが挙げられる。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ARO10、ARO9およびTKLから選択され得る。一部の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がARO10であり得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がARO9であり得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がTKLであり得る。いくつかの態様では、宿主細胞が、1つまたは複数の遺伝子、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに対する1つまたは複数の転写モジュレーション修飾を含む。
いくつかの態様では、転写モジュレーション修飾としては、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の天然プロモーターの強力なプロモーターでの置換または強力なプロモーターの制御下での追加コピーの該遺伝子の発現が挙げられ得る。関心対象の該遺伝子の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいが、該プロモーターは宿主細胞内で活性であり得るものとする。関心対象の該遺伝子は、その天然プロモーターによって発現されるものであってもよい。付加的または代替的に、関心対象の該遺伝子は、非天然プロモーターによって発現されるものであってもよい。必要条件ではないが、かかるプロモーターは、これが使用される宿主において中程度から高度の強度であり得る。プロモーターは調節されていてもよく構成的であってもよい。いくつかの態様では、グルコース抑制型でないか、または培養培地中のグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターを使用してもよい。数多くの好適なプロモーターが存在しており、その例としては、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、枯草菌tsr遺伝子（フルクトースビリン酸（biphosphate）アルドラーゼをコードしている）のプロモーターまたは出芽酵母（グリセルアルデヒド-リン酸デヒドロゲナーゼをコードしている）（Bitter G. A., Meth. Enzymol. 152:673-684（1987））由来のGAPDHプロモーターが挙げられる。他の関心対象の強力なプロモーターとしては、非限定的に、パン酵母のADHIプロモーター（Ruohonen L., et al, J. Biotechnol. 39:193-203（1995））、リン酸欠乏誘導型プロモーター、例えば、酵母のPHO5プロモーター（Hinnen A., et al, in Yeast Genetic Engineering, Barr P. J., et al. eds, Butterworths（1989）、B.リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のアルカリホスファターゼプロモーター（Lee. J. W. K., et al, J. Gen. Microbiol. 137:1127-1133（1991））、GPD1、およびTEF1が挙げられる。酵母の関心対象のプロモーターとしては、非限定的に、誘導性プロモーター、例えば、Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、抑制性プロモーターMet25、tetO、および構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GPD）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH）、翻訳-伸長因子-1-αプロモーター（TEF）、シトクロムc-オキシダーゼプロモーター（CYC1）、MRP7プロモーターなどが挙げられる。一部の例では、該強力なプロモーターがGPD1である。一部の特定の場合では、該強力なプロモーターがTEF1である。ホルモン、例えばグルココルチコイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンにより誘導性のプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターもまた公知であり、非限定的に、グルコルチコイド（glucorticoid）応答エレメント（GRE）および甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）が挙げられ、例えば、米国特許第7,045,290号に記載のプロモーターを参照のこと。構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHの）を含むベクターが使用され得る。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBどおり）もまた、関心対象の遺伝子の発現を駆動させるために使用することができよう。宿主細胞に特異的な任意の簡便なプロモーター、例えば、大腸菌T7プロモーター、lacプロモーターまたはtetOプロモーターが選択され得ることは理解されよう。一部の場合では、プロモーターの選択は、転写、したがって酵素レベルを最適化して産生を最大限にするとともにエネルギー資源を最小限にするために使用され得る。
不活性化変異
遺伝子操作された宿主細胞は、該細胞の酵素に対する1つまたは複数の不活性化変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を含み得る。1つまたは複数の不活性化変異を含めることにより、合成経路の遺伝子操作された宿主細胞のフラックスが、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドBIAまたはこれをもたらす望ましい酵素もしくは前駆体のレベルが上昇するように修飾され得る。一部の例では、該1つまたは複数の不活性化変異が、該細胞にとって天然の酵素に対するものである。付加的または代替的に、該1つまたは複数の不活性化変異が、該細胞にとって非天然の酵素に対するものである。本明細書で用いる場合、「不活性化変異」とは、該細胞の遺伝子または調節性DNA配列に対する1つまたは複数の変異であって、該変異により、関心対象の該遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が不活性化されることを意味する。一部の場合では、該遺伝子は該細胞にとって天然である。一部の例では、該遺伝子は、不活性化され、かつ、宿主細胞が生成する関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの合成経路の一部であるかまたは該合成経路と関連している酵素を、コードしている。一部の例では、不活性化変異は、関心対象の遺伝子を制御する調節性DNA配列内に配置される。一部の特定の場合では、不活性化変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。任意の簡便な変異（例えば、本明細書に記載のようなもの）が、関心対象の遺伝子または調節性DNA配列を不活性化させるために使用され得る。「不活性化される」または「不活性化させる」とは、変異された該遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が、非変異対照遺伝子によって発現される対照タンパク質と比べて10％以上、例えば20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上または99％以上低下することを意味する。一部の場合では、該タンパク質が酵素であり、不活性化変異によって該酵素の活性が低下する。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、該細胞にとって天然の酵素における不活性化変異含む。任意の簡便な酵素が不活性化のために標的化され得る。関心対象の酵素としては、非限定的に、合成経路内における遺伝子操作された宿主細胞の作用が関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドのレベルを低下させる傾向にある表2に記載の酵素が挙げられ得る。一部の場合では、該酵素がグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がZWF1である。一部の場合では、該酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。いくつかの態様では、不活性化変異を含む酵素が、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1から選択される。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH2である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH3である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH4である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH5である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH6である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH7である。一部の場合では、該酵素がアルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有する。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素が、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6から選択される。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD2である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD3である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD4である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD5である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD6である。いくつかの態様では、宿主細胞が、表2に記載の1つまたは複数の遺伝子に対する1つまたは複数の不活性化変異を含む。
エピマー化修飾
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよび系により、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を説明する。このような方法、プロセスおよび系の一部は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が、基質の多様な範囲のアルカロイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換がエピマー化反応を含む。一部の場合では、基質アルカロイドのエピマー化が、図3に示し、スキーム1に一般的に示すように、(S)-基質を対応するシッフ塩基またはイミン中間体に酸化させ、次いで、この中間体を(R)-生成物に立体特異的に還元することにより行なわれ得る。スキーム1に示すように、R1、R2、R3およびR4はHまたはCH3であり得る。R5はH、OHまたはOCH3であり得る。
Figure 2019536476
一部の例では、(S)-基質の(R)-生成物への変換が、少なくとも1つの酸化反応と少なくとも1つの還元反応を伴い得る。一部の場合では、酸化反応の後に任意で還元反応が行なわれる。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が酵素の存在下で行なわれる。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が酵素によって触媒される。一部の場合では、酸化反応と還元反応がどちらも、少なくとも1種の酵素の存在下で行なわれる。一部の場合では、該少なくとも1種の酵素が、該酸化反応と還元反応を触媒するのに有用である。酸化反応と還元反応が同じ酵素によって触媒されてもよい。
本明細書に記載の一部の方法、プロセスおよび系では、酸化反応が酵素の存在下で行なわれ得る。一部の例では、該酵素がオキシダーゼであり得る。該オキシダーゼは(S)-1-ベンジルイソキノリンを基質として使用し得る。該オキシダーゼは、(S)-基質を対応するイミンまたはシッフ塩基誘導体に変換し得る。該オキシダーゼは1,2-デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）と称され得る。本開示における(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの酸化に適した酵素の非限定的な例としては、シトクロムP450オキシダーゼ、2-オキソグルタル酸依存性オキシダーゼ、およびフラボタンパク質オキシダーゼが挙げられる。例えば、(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（STOX, E.C 1.3.3.8）は、(S)-ノルレチクリンおよび他の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを1,2-デヒドロノルレチクリンおよび他の対応する1,2-デヒドロ生成物に酸化させ得る。一部の例では、先の例のいずれか1つのオキシダーゼドメインを含むタンパク質が酸化を行ない得る。一部の例では、該オキシダーゼが、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主細胞内での酸化反応を触媒し得る。
一部の例では、還元反応に続いて酸化反応が行なわれ得る。還元反応は酵素によって行なわれ得る。一部の例では、該レダクターゼが、1-ベンジルイソキノリンに由来するイミンまたはシッフ塩基を基質として使用し得る。該レダクターゼは、該イミンまたはシッフ塩基誘導体を(R)-1-ベンジルイソキノリンに変換し得る。該レダクターゼは1,2-デヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）と称され得る。(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するイミンまたはシッフ塩基の還元に適した酵素の非限定的な例としては、アルド-ケトレダクターゼ（例えば、コデイノンレダクターゼ様酵素（EC 1.1.1.247））および短鎖デヒドロゲナーゼ（例えば、サルタリジンレダクターゼ様酵素（EC 1.1.1.248））が挙げられる。一部の例では、先の例のいずれか1つのレダクターゼドメインを含むタンパク質が還元を行ない得る。さらなる一態様では、還元が立体特異的である。一部の例では、該レダクターゼが、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主細胞内での還元反応を触媒し得る。
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピマー化反応を行ない得る酵素の一例としては、オキシダーゼドメインとレダクターゼドメインを有するエピメラーゼが挙げられる。特に、該エピメラーゼは、シトクロムP450オキシダーゼ82Y2様ドメインを有し得る。さらに、該エピメラーゼは、コデイノンレダクターゼ様ドメインを有し得る。さらに、シトクロムP450オキシダーゼ82Y2様ドメインを有し、コデイノンレダクターゼ様ドメインもまた有するエピメラーゼはCYP-COR酵素と称され得る。特に、CYP-COR酵素は融合酵素であり得る。また、CYP-COR酵素はDRS-DRR（デヒドロレチクリンシンターゼ-デヒドロレチクリンレダクターゼ）とも称され得る。
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を行なうために使用され得るCYP-COR酵素のアミノ酸配列の一例を図4に示す。特に、図4は、本発明の態様による、CYP-COR酵素のアミノ酸配列を示す。図4に見られるように、下線部の文字は、シトクロムP450 CYP82Y2様ドメインを表す（AFB74617.1との同一性は59％）。点線の下線部の文字は、アルド-ケトレダクターゼNADPH依存性コデイノンレダクターゼ様ドメインを表す（ACM44066.1との同一性は75％）。CYP-COR酵素のさらなるアミノ酸配列を表1に示す。(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに使用されるエピメラーゼのアミノ酸配列は、表1に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように改変されている。
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、この場合、該エピメラーゼは:SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14および15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるエピメラーゼを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。一部の場合では、該エピメラーゼが1種または複数種の酵素に分割され得る。さらに、該エピメラーゼの分割によって産生される1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞から回収してもよい。該エピメラーゼの分割によって生じるこのような1種または複数種の酵素もまた、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を触媒するために使用され得る。特に、該エピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞から回収された該1種または複数種の酵素は、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスに使用され得る。該プロセスは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるのに充分な量のエピメラーゼと接触させることを含み得る。いくつかの例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも5％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにインビボで接触させてもよい。さらに、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよく、または、遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、(S)-基質の(R)-生成物へのエピマー化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドが、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するもの、例えば、4環式のプロモルフィナンアルカロイドおよび5環式のモルフィナンアルカロイドなどである。別の態様では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、モルフィナンアルカロイドおよびプロモルフィナンアルカロイドからなる群より選択される。
一部の例では、(S)-基質が、(S)-ノルレチクリン、(S)-レチクリン、(S)-テトラヒドロパパベリン、(S)-ノルコクラウリン、(S)-コクラウリン、(S)-N-メチルコクラウリン、(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、(S)-ノルイソオリエンタリン、(S)-オリエンタリン、(S)-イソオリエンタリン、(S)-ノルプロトシノメニン、(S)-プロトシノメニン、(S)-ノルラウダノソリン、(S)-ラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルラウダノソリン、(S)-6-O-メチルノルラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドである。
一部の例では、(S)-基質が、式I:
Figure 2019536476
の化合物またはその塩であり、式中:
R1、R2、R3およびR4は独立して、水素およびメチルから選択され;
R5は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される。
他の一部の例では、R1、R2、R3、R4およびR5のうちの少なくとも1つが水素である。
さらに他の例では、(S)-基質が、式II:
Figure 2019536476
の化合物またはその塩であり、式中:
R3は、水素およびC1〜C4アルキルから選択され;
R6およびR7は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1〜C4アシル、C1〜C4アルキルおよびC1〜C4アルコキシから選択され;
nは0、1、2、3または4であり;
n'は0、1、2、3、4または5である。
結合が環を横切って示されている場合、これは、置換が環内の不特定の原子または位置に存在し得ることを意味する。例えば、上記に示した式IIでは、6員環の任意の-CH-の水素がR7で置き換えられて-CR7-を形成し得る。
一部の例では、R6およびR7が独立して、メチルまたはメトキシである。他の一部の例では、nおよびn'が独立して1または2である。さらに他の態様では、R3が水素またはメチルである。
一部の例では、該方法により、(S)-レチクリンからアルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞を提供する。(S)-レチクリンの(R)-レチクリンへのエピマー化は、前駆体からの多様なアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る。一部の例では、前駆体がL-チロシンまたは糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド生成物としては、非限定的に、モルフィナンアルカロイドおよびプロモルフィナンアルカロイドが挙げられ得る。
任意の適当な炭素源が、エピマー化1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの前駆体として使用され得る。好適な前駆体としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）またはその組合せが挙げられ得る。一部の例では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマスの加水分解生成物）。さらに他の態様では、炭素前駆体が1炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。また他の態様では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸（例えば、L-チロシン）が使用され得る。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、例えば、ノルラウダノソリン、ラウダノソリン、ノルレチクリンおよびレチクリンなどが遺伝子操作された宿主細胞に直接添加され得る。なおさらなる態様では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが遺伝子操作された宿主細胞に、1種のエナンチオマー（例えば、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド）またはエナンチオマー混合物、例えばラセミ混合物などとして添加され得る。
一部の例では、該方法により、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心のエピマー化を提供する。さらなる一態様では、該方法は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程を含む。該少なくとも1種の酵素は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心の立体化学的配置を反対の立体化学的配置に反転させ得る。一部の例では、該少なくとも1種の酵素は、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する。該少なくとも1種の酵素を使用するこの(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換の一部の例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、(S)-ノルレチクリン、(S)-レチクリン、(S)-テトラヒドロパパベリン、(S)-ノルコクラウリン、(S)-コクラウリン、(S)-N-メチルコクラウリン、(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、(S)-ノルイソオリエンタリン、(S)-オリエンタリン、(S)-イソオリエンタリン、(S)-ノルプロトシノメニン、(S)-プロトシノメニン、(S)-ノルラウダノソリン、(S)-ラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルラウダノソリン、(S)-6-O-メチルノルラウダノソリンおよび(S)-4'-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される。
さらに他の態様では、エピマー化される1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが2つ以上の立体中心を含み得、この2つ以上の立体中心のうち1個だけが反転されて該基質のジアステレオマーが生成する（例えば、(S,R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R,R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される）。該少なくとも1種の酵素と接触させた場合に1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の1つだけが反転される例で、生成物は1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマーと称される。
一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが該酵素に1種の立体異性体として提示される。他の一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが該酵素に立体異性体混合物として提示される。なおさらなる態様では、立体異性体混合物がラセミ混合物であり得る。他の一部の例では、立体異性体混合物は、1種の立体異性体が別の立体異性体と比べて富化されたものであり得る。
一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を回収する。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物から回収する。なおさらなる態様では、回収された1-ベンジルイソキノリンアルカロイドは、1種の立体異性体が、該酵素に提示される1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの本来の混合物と比べてエナンチオマー的に富化されている。なおさらなる態様では、回収された1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。
「異性体」は、同じ分子式を有する異なる化合物である。「立体異性体」は、空間内での原子の配列様式のみが異なる異性体である。「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせられない鏡像である1対の立体異性体である。1対のエナンチオマーの1:1の混合物が「ラセミ」混合物である。「ジアステレオ異性体」または「ジアステレオマー」は、少なくとも2個の不斉原子を有しているが互いに鏡像でない立体異性体である。用語「エピマー」は、本明細書で用いる場合、同一の化学式を有するが、ある特定の位置の光学配置が異なる化合物をいう。例えば、ある化合物の(R,S)立体異性体と(S,S)立体異性体は互いにエピマーである。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドがそのエピマー（例えば、epi-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド）に変換される。立体化学的絶対配置は、カーン・インゴルド・プレローグR-S体系に従って指定される。化合物が純粋なエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学的配置はRまたはSのいずれかで指定され得る。絶対配置が不明である分割された化合物は、ナトリウムD線の波長の直線偏光を回転させる方向（右旋性-または左旋性）に応じて（＋）または（-）と表示され得る。本明細書に記載の一部の特定の化合物は1つまたは複数の不斉中心を含み、したがって、エナンチオマー、ジアステレオマー、および立体化学的絶対配置に関して(R)-または(S)-で規定され得る他の立体異性体形態が生じ得る。
（表１）CYP-COR融合酵素の部分長および完全長のアミノ酸配列の例
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ビスBIA生成修飾
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよび系により、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスBIA）の生成を説明する。ビスBIAは、2つのBIA単量体間のカップリング反応によって形成され得る二量体型分子である。一例では、ビスBIAは炭素-酸素間のカップリング反応によって形成され得る。他の例では、ビスBIAは炭素-炭素間のカップリング反応によって形成され得る。一部の例では、ビスBIA二量体型分子は、2つの同一のBIA単量体を含むホモ二量体である。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が1種のBIA単量体を生成し得る。このような例では、BIA単量体は、1種または複数種のカップリング酵素と接触させた場合、ホモ二量体を形成し得る。他の例では、ビスBIA二量体型分子が、2つの異なるBIA単量体を含むヘテロ二量体である。例えば、ビスBIAは、互いにエナンチオマーであるBIA単量体を含むヘテロ二量体であり得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が2種類以上のBIA単量体を生成し得る。このような例では、BIA単量体は、1種または複数種のカップリング酵素と接触させた場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し得る。
ビスBIAの生成を説明する一部のこのような方法、プロセスおよび系は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、BIA単量体を生成し、これがさらにビスBIAの形成のための構成単位分子として使用され得るように遺伝子操作され得る。ビスBIAを形成するために使用され得るBIA単量体の例としては、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3'-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニン、ラウダノシン、およびパパベリンが挙げられる。特に、遺伝子操作された宿主細胞は、BIA単量体をノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンから、異種酵素、例えば、O-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルトランスフェラーゼ、および3'-ヒドロキシラーゼの発現によって合成し得る。O-メチルトランスフェラーゼの例としては、サリクラム・フラバム（Thalicrum flavum）、ハス（Nelumbo nucifera）、コトカケヤナギ（Populus euphratica）または別の種に由来するノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）が挙げられ得る。O-メチルトランスフェラーゼのさらなる例としては、ヒト（Homo sapiens）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、ニシゴリラ（Gorilla）または別の種に由来するカテコールO-メチルトランスフェラーゼ（COMT）が挙げられ得る。N-メチルトランスフェラーゼのさらなる例としては、キバナカラマツソウ（T. flavum）、ハス（N. nucifera）、アリストロキア・フィンブリアタ（Aristolochia fimbriata）または別の種に由来するコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）が挙げられ得る。3'ヒドロキシラーゼの例としては、ハナビシソウ（Eschscholzia californica）、キバナカラマツソウ、ハスまたは別の種に由来するN-メチルコクラウリン3'-ヒドロキシラーゼ（CYP80B1）が挙げられ得る。
遺伝子操作された宿主細胞は、任意の所与のBIA単量体の(S)または(R)のいずれかのエナンチオマーを生成し得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、両エナンチオマーの混合物を生成し得る。(S)と(R)のエナンチオマーの比率は、BIA単量体を合成する該1種または複数種の酵素の基質と生成物の特異性によって求められ得る。代替的に、存在する各エナンチオマーの量を、上記に論考したように1種の立体異性体の別の立体異性体へのエピマー化を行なうさらなる酵素（1種または複数種）の発現によって修正してもよい。
このようなBIA単量体を二量体型ビスBIA骨格に融合させてもよい。特に、BIA単量体は二量体型ビスBIA骨格に、遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素を用いて融合され得る。付加的または代替的に、BIA単量体は二量体型ビスBIA骨格に、遺伝子操作された宿主細胞にとって外部である供給源からBIA単量体に供給される1種または複数種の酵素を用いて融合され得る。該1種または複数種の酵素は、2つのBIA単量体を1、2または3つの位置で融合させるための炭素-酸素間および/または炭素-炭素間のカップリング反応を形成するために使用され得る。一部の例では、2つのBIA単量体はエーテル結合によって連結され得る。一部の例では、炭素-炭素間の直接結合が、2つのBIA単量体を連結させるために使用され得る。一部の例では、2つのBIA単量体を融合させることにより形成されるビスBIAは1つのジフェニルエーテル結合を含み得る。一部の例では、2つのBIA単量体が融合されて、2つのジフェニルエーテル結合を含むビスBIAを形成し得る。一部の例では、2つのBIA単量体で形成されたビスBIAは3つのジフェニルエーテル結合を含み得る。一部の例では、ビスBIAが、1つのジフェニルエーテル結合と1つのベンジルフェニルエーテル結合を含み得る。一部の場合では、ビスBIAが、1つのベンジルフェニルエーテル結合と2つのジフェニルエーテル結合を含み得る。
一例では、BIA単量体を、前記BIA単量体の少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％がビスBIAに変換されるような充分な量の、2つのBIA単量体を融合させるためのカップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素と接触させ得る。BIA単量体をビスBIAに二量体するために使用され得る該1種または複数種の酵素をBIA単量体にインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、BIA単量体をビスBIAに二量体するために使用され得る該1種または複数種の酵素をBIA単量体にインビボで接触させてもよい。さらに、該1種または複数種のビスBIA二量体化酵素を、BIA単量体を生成する宿主細胞内で発現させてもよい。代替的に、BIA単量体を、ビスBIA二量体化酵素を発現する遺伝子操作された宿主細胞に供給してもよい。代替的に、該1種または複数種のビスBIA二量体化酵素を、BIA単量体を内部に有する細胞に供給してもよく
一部の例では、ビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、式Va〜Vu:
Figure 2019536476
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のいずれか1つの化合物またはその塩であり、式中:
R1a、R1b、R2aおよびR2bは独立して、水素およびC1〜C4アルキルから選択され;
R3a、R3b、R6a、R6b、R8aおよびR8bは独立して、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1〜C4アシル、C1〜C4アルキル、およびC1〜C4アルコキシから選択され;
R4aおよびR5aは独立して、水素およびC1〜C4アルキルから選択されるか、またはR4aとR5aが一体となってメチレン結合を形成しており;
R4bおよびR5bは独立して、水素およびC1〜C4アルキルから選択されるか、またはR4bとR5bが一体となってメチレン結合を形成しており;および
R7a、R7bおよびR9aは独立して、水素およびC1〜C4アルキルから選択される。
一部の例では、R1aおよびR1bが各々、水素であり;R2aおよびR2bが各々、メチルであり;R3aおよびR3bが各々、水素であり;R4aおよびR5aが独立して、水素またはメチルであり;R4bおよびR5bが独立して、水素またはメチルであるか、またはR4bとR5bが一体となってメチレン結合を形成しており;R6a、R6b、R8aおよびR8bが各々、水素であり;R7a、R7bおよびR9aが独立して、水素またはメチルである。
上記に示したように、式Va、VbおよびVdのビスBIA化合物は、1つの炭素-酸素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。さらに、式Vc、VfおよびVhのビスBIA化合物は、1つの炭素-酸素間のカップリング反応と1つの炭素-炭素間のカップリング反応の両方を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。さらに、式Ve、Vg、Vi、Vj、Vk、Vl、Vm、Vo、VpおよびVqのビスBIA化合物は、2つの炭素-酸素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。式VnのビスBIA化合物は、2つの炭素-酸素間のカップリング反応と1つの炭素-炭素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。さらに、式VrのビスBIA化合物は、3つの炭素-酸素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。
カップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素としては、公知のシトクロムP450、例えば、ベルベリス・ストロニフェラ（Berberis stolonifera）CYP80A1または該化合物を天然に合成する他の植物に由来する同様のシトクロムP450酵素が挙げられ得る。代替的に、カップリング反応を、シトクロムP450でない酵素によって行なってもよい。カップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、非天然の基質を受容するように遺伝子操作してもよい。したがって、カップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、非天然のビスBIA分子を生じさせるために使用され得る。一例では、該1種または複数種の酵素により天然のBIA単量体が非天然のBIA単量体と融合して非天然のビスBIA分子が生成し得る。他の例では、該1種または複数種の酵素により2つの非天然のBIA単量体が融合して非天然のビスBIA分子が生成し得る。遺伝子操作された酵素ストラテジーは、BIA単量体を融合させてビスBIAを生成する、カップリング反応を構成するために使用され得る1種または複数種の酵素を同定するために使用され得る。一例では、酵素遺伝子操作ストラテジーとして、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発およびスクリーニング、DNAシャッフリング、およびスクリーニングが挙げられ得る。
ビスBIAが形成されたら、ビスBIAをさらに誘導体化または修飾してもよい。ビスBIAは、遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素を用いて誘導体化または修飾され得る。特に、ビスBIAは、ビスBIAを遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素と接触させることにより誘導体化または修飾され得る。付加的または代替的に、ビスBIAは、ビスBIAを、遺伝子操作された宿主細胞にとって外部である供給源からビスBIAに供給される1種または複数種の酵素と接触させることにより誘導体化または修飾され得る。ビスBIAを誘導体化または修飾するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、テーラリング（tailoring）反応を行なうために使用され得る。テーラリング反応の例としては、酸化、還元、O-メチル化、N-メチル化、O-脱メチル化、アセチル化、メチレンジオキシ結合形成、およびO,O-デメチレン化が挙げられる。ビスBIAは、1つまたは複数のテーラリング反応を用いて誘導体化または修飾され得る。
テーラリング反応の例を表8に示す。一部の例では、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれる炭素-炭素間のカップリング反応を触媒するためにテーラリング酵素が使用され得る。炭素-炭素間のカップリング反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ（Papaver somniferum）、ハナビシソウ、オウレン（Coptis japonica）、ベルベリス・ストロニファー（Berberis stolonifer）、キバナカラマツソウ（Thalictrum flavum）または別の種に由来するベルベリンブリッジ酵素（BBE）;ケシまたは別の種に由来するサルタリジンシンターゼ（SalSyn）;およびオウレンまたは別の種に由来するコリツベリンシンターゼ（CorSyn）が挙げられる。テーラリング酵素によって触媒され得る反応の非限定的な例をスキーム2に示し、ここで、Ra、Rb、RcおよびRdは独立して、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C1〜C4アシル、C1〜C4アルキル、およびC1〜C4アルコキシから選択される。一部の例では、Ra、Rb、およびこれらが結合している炭素原子が任意で炭素環または複素環を形成している。一部の例では、Rc、Rdおよびこれらが結合している炭素原子が任意で炭素環または複素環を形成している。
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一部の例では、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれる酸化反応を触媒するために使用され得る。酸化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、オウレン、アザミゲシ（Argemone mexicana）、ベルベリス・ウィルソニエー（Berberis wilsonae）または別の種に由来するテトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（STOX）;ケシまたは別の種に由来するジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ（DBOX）;ケシまたは別の種に由来するメチルスチロピンヒドロキシラーゼ（MSH）;およびケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するプロトピン6-ヒドロキシラーゼ（P6H）が挙げられる。
また、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるメチレンジオキシブリッジ形成反応を触媒するために使用され得る。メチレンジオキシブリッジ形成反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するスチロピンシンターゼ（StySynまたはSTS）;ケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するケイランチフォリンシンターゼ（CheSynまたはCFS）;およびキバナカラマツソウ、トウオウレン（Coptis chinensis）または別の種に由来するカナジンシンターゼ（CAS）が挙げられる。
他の例では、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるO-メチル化反応を触媒するために使用され得る。O-メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、ハカマオニゲシ（Papaver bracteatum）または別の種に由来するノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）;ケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、トウオウレンまたは別の種に由来する3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ（4'OMT）;ケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するレチクリン7-O-メチルトランスフェラーゼ（7OMT）;およびケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、トウオウレンまたは別の種に由来するスコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ（9OMT）が挙げられる。
さらに、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるN-メチル化反応を触媒するために使用され得る。N-メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）;ケシ、ハナビシソウ、ハカマオニゲシまたは別の種に由来するテトラヒドロプロトベルベリンN-メチルトランスフェラーゼ（TNMT）が挙げられる。
さらに、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるO-脱メチル化反応を触媒するために使用され得る。O-脱メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシまたは別の種に由来するテバインデメチラーゼ（T6ODM）;およびケシまたは別の種に由来するコデインデメチラーゼ（CODM）が挙げられる。
また、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれる還元反応を触媒するために使用され得る。還元反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、ハカマオニゲシまたは別の種に由来するサルタリジンレダクターゼ（SalR）;ケシまたは別の種に由来するコデイノンレダクターゼ（COR）;およびハナビシソウまたは別の種に由来するサングイナリンレダクターゼ（SanR）が挙げられる。他の例では、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるアセチル化反応を触媒するために使用され得る。アセチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の一例としては、ケシまたは別の種に由来するサルタリジンアセチルトランスフェラーゼ（SalAT）が挙げられる。
O-脱メチル化修飾
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよび系により、O-結合型メチル基の除去による第1ベンジルイソキノリンアルカロイドの第2ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよび系は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1ベンジルイソキノリンアルカロイドの第2ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が、基質のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がデメチラーゼ反応を含む。
図23は、本発明の態様による、オピオイド3-O-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、3位の炭素に結合している酸素からメチル基を除去する作用を行ない得る。
ODM酵素のアミノ酸配列の例を表3に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるODMのアミノ酸配列は、表3に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように改変されている。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するODMを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該ODMは、表3に列記した所与のアミノ酸配列を含む。1種または複数種のODM酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるODMを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のODMと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触してもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのO-脱メチル化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、モルヒネ、オキシモルヒネ、オリパビン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、14-ヒドロキシモルヒネ、モルヒノンおよび14-ヒドロキシモルヒノンからなる群より選択される。
一部の例では、基質アルカロイドが、コデイン、オキシコドン、テバイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、コデイノンおよび14-ヒドロキシコデイノンからなる群より選択されるオピオイドである。
N-脱メチル化修飾
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよび系により、N-結合型メチル基の除去による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよび系は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換が、基質のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がデメチラーゼ反応を含む。
図24は、本発明の態様による、オピオイドN-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、その窒素からメチル基を除去する作用を行ない得る。
第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を行なうために使用され得るN-デメチラーゼ酵素のアミノ酸配列の例を表4に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるNDMのアミノ酸配列は、表4に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように改変されている。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するNDMを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該NDMは、表4に列記したアミノ酸配列を含む。1種または複数種のNDM酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるNDMを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のNDMと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触させてもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのN-脱メチル化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択される。
一部の例では、基質アルカロイドが、コデイン、オキシコドン、テバイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、コデイノンおよび14-ヒドロキシコデイノン、モルヒネ、オキシモルホン、オリパビン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、14-ヒドロキシ-モルヒネ、モルヒノンまたは14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択されるオピオイドである。
N-メチルトランスフェラーゼ修飾
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよび系により、N-結合型側鎖基の付加による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよび系により、共基質から第1アルカロイドへの側鎖基の転移による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよび系は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換が、基質のナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がメチルトランスフェラーゼ反応を含む。
図25は、本発明の態様による、N-メチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、その窒素にメチル基または他の炭素部分を付加する作用を行ない得る。S-アデノシルメチオニン（SAM）は、官能基（メチル、アリル、シクロプロピルメチルまたは多のもの）の供与体として作用し得る。
NMT酵素のアミノ酸配列の例を表5に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるNMTのアミノ酸配列は、表5に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように改変されている。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するNMTを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該NMTは、表5に示すアミノ酸配列を含む。1種または複数種のNMT酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるNMTを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のNMTと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。
第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触させてもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。
一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのN-メチルトランスフェラーゼがアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、ナロキソン、ナルトレキソンおよびナルメフェンを含む群から選択される。
一部の例では、基質アルカロイドが、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択されるオピオイドである。一部の例では、共基質がS-アデノシルメチオニン、アリル-S-アデノシルメチオニンまたはシクロプロピルメチル-S-アデノシルメチオニンである。
異種コード配列
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作された宿主細胞が所望の関心対象の酵素および/または関心対象のBIA、例えば、本明細書に記載のようなものを生成することを可能にする活性（1つまたは複数）をコードしている1つまたは複数の異種コード配列（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上）を有している。本明細書で用いる場合、用語「異種コード配列」は、宿主生物体内には通常存在しないが適正な条件下で該宿主の細胞内で発現され得るペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードしているか、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すために用いている。そのため、「異種コード配列」は、宿主細胞内には通常存在するコード配列の多重コピーを含んでおり、該細胞が、該細胞内には通常存在しないコード配列のさらなるコピーを発現するようになる。異種コード配列は、RNAもしくはその任意の型、例えばmRNA、DNAもしくはその任意の型、例えばcDNA、またはRNA/DNAハイブリッドであり得る。関心対象のコード配列としては、非限定的に、コード配列、イントロン、プロモーター領域、3'-UTRおよびエンハンサー領域などの特徴を含む完全長の転写単位が挙げられる。
また、遺伝子操作された宿主細胞は、異種コード配列を適応させるための1つまたは複数の遺伝子改変を有するように修飾され得る。天然の宿主ゲノムの改変としては、非限定的に、所望の経路に干渉し得る特定のタンパク質の発現を低減または除去するためのゲノムの修飾が挙げられる。かかる天然タンパク質の存在は、該経路の中間体または最終産物のうちの1種を、代謝産物または所望の経路において利用可能でない他の化合物に急速に変換し得る。したがって、天然酵素の活性を低下させるか、または完全になくした場合、生成した中間体は、所望の産物への組込みに、より容易に利用可能となり得る。
異種コード配列としては、非限定的に、植物において通常、関心対象のBIAの生成を担う野生型配列または等価な配列のいずれかである酵素をコードしている配列が挙げられる。一部の場合では、異種配列にコードされる酵素は、1-BIA経路内の任意の酵素であり得、任意の簡便な供給源に由来するものであり得る。具体的な合成経路での異種コード配列にコードされた酵素の選択および数は、所望の産物に基づいて選択され得る。特定の態様では、宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の異種コード配列、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の異種コード配列を含み得る。
本明細書で用いる場合、用語「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のcDNAまたはmRNAの配列、ならびに完全長の転写単位のコード部分、すなわち、イントロンとエキソンを含む遺伝子、ならびに酵素をコードしているか、またはその等価なアミノ酸配列をコードしている「コドン最適化」配列、切断型配列または他の形態の改変配列も包含しているが、該等価なアミノ酸配列は機能性タンパク質を産生させるものとする。かかる等価なアミノ酸配列は1個または複数のアミノ酸の欠失を有し得、該欠失はN-末端、C-末端または内部である。切断型形態は、これが本明細書に示した触媒能を有している限り想定される。また、経路内での代謝産物の移行を容易にするために2種類以上の酵素の融合体も想定されるが、触媒活性が維持されているものとする。
動作可能な断片、変異型または切断型形態はモデリングおよび/またはスクリーニングによって同定され得る。一部の場合では、これは、例えばタンパク質のN-末端、C-末端または内部の領域の段階的な様式での欠失の後、得られた誘導体を所望の反応に対するその活性に関して本来の配列と比較して解析することによって行なわれる。当該誘導体がこの能力を動作させる場合、これは該酵素の等価な誘導体を適正に構成しているとみなされる。
例では、一部の異種タンパク質は、組換え宿主において発現させた場合、不正確にプロセッシングされるという事態を示し得る。例えば、微生物系生産宿主において発現させたシトクロムP450酵素などの植物タンパク質は、不正確なプロセッシングの事態を有し得る。特に、サルタリジンシンターゼは、酵母において異種発現させた場合、N-結合型グリコシル化が起こり得る。このN-結合型グリコシル化は植物では観察され得ず、異種微生物宿主内での該酵素の活性を低下させるような生成中のSalSyn転写物の不正確なN-末端選別を示し得る。かかる例では、N-結合型グリコシル化パターンを除去するような生成中の転写物のN-末端選別の修正に指向されるプロテインエンジニアリングにより、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の改善がもたらされ得る。これを以下の実施例8でさらに説明する。
また、本発明の一部の局面は、種々の該酵素の天然アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列をコードしている異種コード配列に関する。「等価な」アミノ酸配列は、具体的なアミノ酸配列と同一ではないが、所望の目的に使用した場合、具体的な該アミノ酸配列の同様の活性と比べて、そのタンパク質の生物学的活性に本質的に影響しない少なくともいくつかのアミノ酸変化（欠失、置換、反転、挿入など）を含むアミノ酸配列と定義する。生物学的活性は、エピメラーゼの例では、その触媒活性をいう。また、等価な配列は、本来のアミノ酸配列とは異なる特性を有するように遺伝子操作された、および/または進化したものも包含していることを意味している。関心対象の変異可能な特性としては、触媒活性、基質特異性、選択性、安定性、可溶性、局在性などが挙げられる。
一部の例では、各型の酵素の発現が、さらなる遺伝子コピー（すなわち、多重コピー）によって高まり、これにより、中間体の蓄積および/または関心対象のBIAの生成が増大する。本発明のいくつかの態様は、1種または複数種類の酵素の複数種類の種の変異体の同時発現による宿主細胞における関心対象のBIAの生成の増大を含む。一部の場合では、1種または複数種類の酵素のさらなる遺伝子コピーが宿主細胞に含まれている。任意の簡便な方法、例えば、宿主細胞内の酵素の異種コード配列の多重コピーが使用され得る。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、酵素の異種コード配列の多重コピー、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上、5種類以上、またはさらには10種類以上のコピーを含む。特定の態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1種または複数種の酵素の異種コード配列の多重コピー、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上などの多重コピーを含む。一部の場合では、酵素の異種コード配列の多重コピーが、宿主細胞と比べて2種類以上の異なる生物体源に由来する。例えば、遺伝子操作された宿主細胞が1つの異種コード配列の多重コピーを含み得、このとき、該コピーの各々が異なる生物体源に由来する。そのため、各コピーは、明示的な配列において、異種コード配列にコードされた関心対象の酵素の種間差に基づくいくらかの多様性を含み得る。
遺伝子操作された宿主細胞の培地は、関心対象のBIAの生成について試料採取され、モニタリングされ得る。関心対象のBIAは、任意の簡便な方法を用いて観察および測定され得る。関心対象の方法としては、非限定的にLC-MS法（例えば、本明細書に記載のようなもの）が挙げられ、この場合、関心対象の試料は既知量の標準化合物との比較によって解析される。さらに、関心対象のBIAが観察および/または測定され得る他の方法も存在する。BIAの観察および/または測定の代替的な方法の例としては、とりわけ、GC-MS、UV-vis分光法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC、キャピラリー電気泳動が挙げられる。実体は、例えばm/zおよびMS/MS断片化パターンによって確認され得、化合物の定量または測定は、既知保持時間のLC図のピークおよび/または該化合物の既知量の標準の対応するLC-MS解析を参照することによるEIC MSピーク解析によって行なわれ得る。
さらに、遺伝子操作された宿主細胞の培養物は、関心対象の酵素、例えばCYP-COR酵素の産生について試料採取され、モニタリングされ得る。関心対象の酵素は、任意の簡便な方法を用いて観察および測定され得る。関心対象の方法としては、酵素活性アッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一酸化炭素分光法およびウエスタンブロット解析が挙げられる。
方法
BIA生成のために宿主細胞を培養するための方法
上記に要約したように、本発明の一部の局面は、関心対象のノル-オピオイドおよびナル-オピオイドのBIAを調製する方法を含む。さらに、本発明の一部の局面は、関心対象の酵素を調製する方法を含む。そのため、本発明の一部の局面は、遺伝子操作された宿主細胞を、1つまたは複数の宿主細胞修飾（例えば、本明細書に記載のようなもの）が機能的に発現されて該細胞が関心対象の出発化合物を生成物である関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAに変換するような条件下で培養することを含む。また、遺伝子操作された宿主細胞を、1つまたは複数の異種コード配列が機能的に発現されて関心対象の出発化合物が、生成物である酵素あるいは関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAに変換されるようなタンパク質の産生に適した条件下で培養することを含む方法も提供する。一例では、該方法は、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを調製する方法であって、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）を培養する工程;出発化合物を該細胞培養物に添加する工程;および、該ノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドを該細胞培養物から回収する工程を含む、方法である。一部の例では、該方法は、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）を培養する工程;出発化合物を該細胞培養物に添加する工程;および、該酵素を該細胞培養物から回収する工程を含む、酵素を調製する方法である。
発酵培地には適当な炭素基質が含有され得る。本開示の方法を行なうのに適した炭素の供給源には多種多様な炭素含有基質が包含され得る。好適な基質としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）、またはその組合せが挙げられ得る。一部の場合では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物が使用され得る（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽）。一部の場合では、炭素基質が1炭素基質（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素基質（例えば、エタノール）であり得る。他の場合では、他の炭素含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸が使用され得る。
遺伝子操作された宿主細胞を培養する任意の簡便な方法が、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成のために使用され得る。使用される具体的なプロトコルは、例えば、遺伝子操作された宿主細胞、異種コード配列、関心対象の酵素、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAなどに応じてさまざまであり得る。細胞は、任意の簡便な環境、例えば、該細胞が1種または複数種の機能性の異種酵素を発現できる環境に存在させ得る。いくつかの態様では、細胞は、酵素発現を誘導性の条件下で、インビボでの関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成を可能にすることに利用可能な適切な基質を用いて培養される。いくつかの態様では、機能性の該酵素が、インビトロ条件下での関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成のために遺伝子操作された宿主から抽出される。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が多細胞宿主生物体に戻される。遺伝子操作された宿主細胞は任意の増殖期、例えば非限定的に静止期および対数増殖期などのものであり得る。また、培養自体は連続培養であってもよく、バッチ式培養であってもよい。
細胞は、適切な発酵培地中で14〜40℃の温度にて培養され得る。細胞を、任意の簡便な速度（例えば、200 rpm）で振盪しながら培養してもよい。細胞は適当なpHで培養され得る。この発酵に好適なpH範囲はpH 5〜9であり得る。発酵は、好気性、嫌気性または微好気性条件下で行なわれ得る。任意の適当な増殖培地が使用され得る。好適な増殖培地としては、非限定的に、一般的な市販の調製培地、例えば、合成規定（SD）最少培地または酵母エキスペプトンデキストロース（YEPD）富化培地が挙げられ得る。微生物に適切な任意の他の富化、規定または合成の増殖培地を使用してもよい。
細胞は、本質的に任意のサイズおよび形状の槽内で培養され得る。本開示の方法を行なうのに適した槽の例としては、非限定的に、マルチウェル振盪プレート、試験管、フラスコ（バッフル付きおよびバッフルなし）ならびにバイオリアクターが挙げられ得る。培養容量は、10マイクロリットルから10,000リットルより多くまでの範囲であり得る。
増殖培地に対して、アルカロイドの生成に望ましい様式で代謝をモジュレートすることが公知の剤の添加を含めてもよい。非限定的な一例では、異化代謝産物抑制をモジュレートするために環状アデノシン2'3'-一リン酸が増殖培地に添加され得る。
具体的な細胞型に対して任意の簡便な細胞培養条件が使用され得る。特定の態様では、1つまたは複数の修飾を含む宿主細胞が、標準的な条件または容易に最適化される条件下で標準的な細胞培養培地と補給物を用いて培養される。一例として、標準的な増殖培地は、プラスミド維持のための選択圧が必要とされない場合、20 g/Lの酵母エキス、10 g/Lのペプトンおよび20 g/Lのデキストロース（YPD）を含有するものであり得る。プラスミドを含む宿主細胞は、1.7 g/Lの酵母窒素ベース、5 g/Lの硫酸アンモニウムおよび20 g/Lのデキストロースを含有しており、増殖と選択に必要とされる適切なアミノ酸を補給した合成の完全（SC）培地中で培養される。誘導性酵素発現に有用であり得る代替的な炭素源としては、非限定的に、スクロース、ラフィノースおよびガラクトースが挙げられる。細胞は、任意の簡便な温度（例えば、30℃）で任意の簡便な速度（例えば、200 rpm）にて振盪しながら、槽内、例えば試験管もしくはフラスコ内で1〜1000 mLの範囲の容量で、またはより大容量でラボラトリーにて培養される。
培養容量を、例えば工業用プロセスの一部として、より大型の発酵槽内での培養のためにスケールアップしてもよい。工業用発酵プロセスは、密閉系バッチ、フェッドバッチもしくは連続恒成分条件下で、または任意の適当な発酵様式で行なわれ得る。一部の場合では、細胞が基質上に全細胞触媒として固定化され、アルカロイド生成のための発酵条件に供され得る。
バッチ式発酵は閉鎖系であり、この場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵プロセス中は変更されない。所望の生物体を発酵の開始時に培地中に播種する。一部の例では、バッチ式発酵は、pHおよび酸素濃度などの要素を制御するために系に対してなされる（が炭素に対してはしない）変更を伴って行なわれる。この型の発酵系では、系のバイオマスおよび代謝産物の組成が、発酵過程で連続的に変化する。細胞は典型的には誘導期から、次いで対数期（高増殖速度）、次いで静止期（増殖速度が低下または停止）、最終的に死滅期（未処理で放置した場合）と進行する。
連続発酵は開放系であり、この場合、規定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、加工処理のために等量の発酵培地がこの槽から連続的に除去される。連続発酵系は一般的に、定常状態の増殖条件を維持するために操作され、そのため、培地の除去による細胞減損が発酵中の増殖速度によって均衡されなければならない。連続発酵は一般的に、細胞が高い定細胞密度である条件で操作される。連続発酵により、目的生成物濃度および/または細胞増殖に影響する1つまたは複数の因子のモジュレーションが可能である。
液体培地としては、非限定的に、上記の付加的成分を有する富化または合成の規定培地が挙げられ得る。培地成分は水に溶解され、熱、圧力、濾過、放射線、化学薬品またはその任意の組合せによって滅菌され得る。いくつかの培地成分は、別個に調製され、滅菌され、次いで発酵槽内で合わされ得る。培養培地は、発酵全体を通して一定のpHが維持されることが補助されるように緩衝され得る。
プロセスパラメータ、例えば温度、溶存酸素、pH、撹拌、エアレーション速度および細胞密度が発酵過程でモニタリングまたは制御され得る。例えば、発酵プロセスの温度は、培養培地中に浸漬させた温度プローブによってモニタリングされ得る。培養温度は、ジャケット温度を調節することにより設定点に制御され得る。水が外部冷却機内で冷却され、次いでバイオリアクターのコントロールタワー内に流され、ジャケットに、槽内の設定点温度が維持されるのに必要とされる温度で循環され得る。
さらに、ガス流パラメータが発酵プロセス中にモニタリングされ得る。例えば、ガスはスパージャーから培地中に流され得る。本開示の方法に適したガスとしては、圧縮空気、酸素および窒素が挙げられ得る。ガス流は固定速度であってもよく、設定点の溶存酸素が維持されるように調節してもよい。
また、培養培地のpHもモニタリングされ得る。一例では、該pHが、槽内部の培養培地中に浸漬させたpHプローブによってモニタリングされ得る。pH制御を実施する場合、pHは、各溶液を培地に必要とされる速度で添加する酸ポンプおよび塩基ポンプによって調整され得る。pHを制御するために使用される酸溶液は硫酸または塩酸であり得る。pHを制御するために使用される塩基溶液は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化アンモニウムであり得る。
さらに、培養培地中の溶存酸素が、培養培地中に浸漬させた溶存酸素プローブによってモニタリングされ得る。溶存酸素調節を実施する場合、酸素レベルは、撹拌速度を増減させることにより調整され得る。また、溶存酸素レベルは、ガス流速を増減させることによっても調整され得る。ガスは圧縮空気、酸素または窒素であり得る。
また、撹拌速度も発酵プロセス中にモニタリングされ得る。一例では、撹拌機のモーターでアジテータが駆動され得る。撹拌機の速度は発酵全体を通して一貫したrpmに設定してもよく、設定した溶存酸素レベルが維持されるように動的に調節してもよい。
さらに、濁度が発酵プロセス中にモニタリングされ得る。一例では、細胞密度が濁度プローブを用いて測定され得る。代替的に、細胞密度は、試料をバイオリアクターから採取し、これを分光測光器で解析することにより測定され得る。さらに、試料をバイオリアクターから、滅菌試料採取装置によって間隔をあけて取り出してもよい。試料は、宿主細胞によって生成されるアルカロイドについて解析され得る。また、試料は、他の代謝産物および糖類、培養培地成分の枯渇または細胞密度についても解析され得る。
別の例では、フィードストックパラメータが発酵プロセス中にモニタリングされ得る。特に、外部のポンプを用いて発酵に加えられ得る糖類および他の炭素源、栄養物ならびに補因子などのフィードストック。また、他の成分、例えば非限定的に、消泡剤、塩類、キレート剤、界面活性剤および有機液を発酵中に添加してもよい。
宿主細胞内での異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するための任意の簡便なコドン最適化手法が、主題の宿主細胞および方法における使用のために適合され得、例えば、Gustafsson C., et al.（2004）Trends Biotechnol, 22, 346-353（これは参照によりその全体が組み入れられる）を参照のこと。
また、主題の方法に、出発化合物を該細胞培養物に添加することを含めてもよい。任意の簡便な添加方法が主題の方法における使用のために適合され得る。細胞培養物には、充分な量の関心対象の出発物質（例えば、本明細書に記載のようなもの）、例えばmM〜μM範囲、例えば約1〜5 mMの量の出発化合物が補給され得る。出発物質の添加量、添加のタイミングおよび速度、添加する物質の形態などは、さまざまな要素に応じて異なり得ることは理解されよう。出発物質はそのままで添加してもよく、適当な溶媒（例えば、細胞培養培地、水または有機溶媒）に事前に溶解させてもよい。出発物質を濃縮形態（例えば、所望の濃度の10倍）で添加し、添加時の細胞培養培地の希薄化が最小限となるようにしてもよい。出発物質は1回または複数回のバッチ式で添加してもよく、長期間（例えば、数時間または数日間）にわたる連続添加によって添加してもよい。
生成物を発酵培地から単離するための方法
また、主題の方法に、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを細胞培養物から回収する工程を含めてもよい。分離および単離の任意の簡便な方法（例えば、クロマトグラフィー法または沈降法）が、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを細胞培養物から回収するための主題の方法における使用のために適合され得る。濾過法は、細胞培養物の可溶性画分を不溶性画分から分離するために使用され得る。一部の場合では、液体クロマトグラフィー法（例えば、逆相HPLC、サイズ排除または順相クロマトグラフィー）が、関心対象のBIAを細胞培養物の他の可溶性成分から分離するために使用され得る。一部の場合では、抽出法（例えば、液体抽出、pHに基づいた精製、固相抽出、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換など）が、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを細胞培養物の他の成分から分離するために使用され得る。
生成したアルカロイドは発酵培地から、当技術分野において公知の方法を用いて単離され得る。所望の生成物の最初の回収で発酵の直後（または一部の場合では発酵中に）、複数回の回収工程が行なわれ得る。このような工程により、アルカロイド（例えば、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド）が細胞、細胞デブリおよび老廃物から分離され得、他の栄養物、糖類および有機分子は、使用済み培養培地中に残存し得る。このプロセスは、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド-富化生成物を得るために使用され得る。
例では、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物を有する生成物流が、遺伝子操作された酵母細胞と、栄養物および水を含むフィードストックをバッチ式反応器に供給することにより形成される。特に、遺伝子操作された酵母細胞は、ノル-オピオイド生成物またはナル-オピオイド生成物と細胞材料とを含む溶液を生成するために、遺伝子操作された酵母細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、発酵に供され得る。遺伝子操作された酵母細胞が発酵に供されたら、少なくとも1つの分離ユニットがノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物を細胞材料から分離するために使用され、該ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物を含む生成物流が得られ得る。特に、該生成物流には、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物ならびにさらなる成分、例えば清澄化した酵母培養培地が含まれ得る。さらに、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物は、1種または複数種の関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド、例えば1種または複数種のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド化合物を含み得る。
いろいろな方法を用いて、関心対象の酵素および/またはノル-オピオイドもしくはナル-オピオイドを含むバイオリアクター培地から細胞が除去され得る。一例では、細胞は経時的な沈殿によって除去され得る。この沈殿プロセスを冷やすことにより、または清澄剤、例えばシリカの添加によって加速させてもよい。次いで、使用済み培養培地が反応器の上面から吸い上げられ得るか、または細胞が反応器の底面からデカンテーションされ得る。代替的に、細胞は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって除去され得る。また、細胞は、例えば連続フロー遠心分離による遠心分離または連続抽出装置の使用によっても除去され得る。
いろいろな方法を用いて、関心対象のBIA、例えばナロキソンまたはナルトレキソンを含むバイオリアクター培地から細胞が除去され得る。一例では、細胞は経時的な沈殿によって除去され得る。この沈殿プロセスを冷やすことにより、または清澄剤、例えばシリカの添加によって加速させてもよい。次いで、使用済み培養培地が反応器の上面から吸い上げられ得るか、または細胞が反応器の底面からデカンテーションされ得る。代替的に、細胞は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって除去され得る。また、細胞は、例えば連続フロー遠心分離による遠心分離または連続抽出装置の使用によっても除去され得る。
いくらかの貴重な関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAが細胞内部に存在している場合、細胞は透過処理または溶解され得、細胞デブリが上記のいずれかの方法によって除去され得る。細胞を透過処理するために使用される剤としては、非限定的に、有機溶媒（例えば、DMSO）または塩（例えば、酢酸リチウム）が挙げられ得る。細胞を溶解させるための方法としては、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの添加、またはビーズミリングもしくは超音波処理による機械的破壊が挙げられ得る。
関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAは清澄化した使用済み培養培地から、水性の該培養培地と非混和性である有機液の添加による液液抽出によって抽出され得る。一例では、液液抽出の使用は、他の加工処理工程に加えて用いられ得る。適当な有機液の例としては、非限定的に、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、クロロホルム、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、オレイン酸メチル、トルエン、オレイルアルコール、酪酸エチルが挙げられる。有機液は水性培地の容量の10％という少量で添加してもよく、100％という多量で添加してもよい。
一部の場合では、有機液は発酵の開始時に添加され得るか、または発酵中の任意の時点で添加され得る。この抽出発酵プロセスにより、ノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドが該有機相に連続的に除去されることによって、宿主細胞からの関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの収率が高まり得る。
アジテーションにより、該有機相が水性の該培養培地とエマルジョンを形成するようにしてもよい。2つの相がそれぞれの層に分離するのを促す方法としては、非限定的に、乳化破壊剤もしくは核生成剤の添加、またはpHの調整が挙げられ得る。また、エマルジョンを、例えば連続コニカルプレート遠心分離によって遠心分離し、2つの相に分離してもよい。
代替的に、該有機相は水性の該培養培地から、抽出後に物理的に除去され得るように単離してもよい。例えば、溶媒の膜内への封入であり得る。
例では、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAは発酵培地から、吸着法を用いて抽出され得る。一例では、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドが清澄化した使用済み培養培地から、樹脂、例えばAmberlite（登録商標）XAD4またはノル-オピオイドもしくはナル-オピオイドを吸着によって除去する別の剤の添加によって抽出され得る。次いで、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドが該樹脂から有機溶媒を用いて放出され得る。好適な有機溶媒の例としては、非限定的に、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはアセトンが挙げられる。
また、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドを発酵培地から濾過を用いて抽出してもよい。高pHでは、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドは、バイオリアクター内で結晶様析出物を形成し得る。この析出物は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって直接除去され得る。また、この析出物を遠心分離および/またはデカンテーションによって収集してもよい。
上記の抽出法は、インサイチュー（バイオリアクター内）またはエクスサイチュー（ex situ）（例えば、培地がバイオリアクターから流れ出て抽出剤と接触され、次いで再循環されて槽内に戻る外部ループ内）のいずれかで行なわれ得る。代替的に、抽出法は、発酵が終了した後に、バイオリアクター槽から取り出した清澄化した培地を用いて行なわれ得る。
アルカロイド富化溶液から生成物を精製するための方法
後続の精製工程は、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物が富化された発酵後の溶液を、関心対象の個々の生成物種を高純度で回収するための当技術分野において公知の方法を用いて処理することを伴い得る。
一例では、有機相中に抽出された関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドは水溶液に移され得る。一部の場合では、有機溶媒が熱および/または真空によって蒸発され得、得られた粉末が適当なpHの水溶液中に溶解され得る。さらなる一例では、関心対象のBIAが有機相から、水相中への関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの抽出を促進させる適当なpHの水溶液の添加によって抽出され得る。次いで、水相はデカンテーション、遠心分離または別の方法によって除去され得る。
このノル-オピオイドまたはナル-オピオイド含有溶液は、金属類を除去するために、例えば適当なキレート剤で処理することによってさらに処理され得る。関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド含有溶液は、他の不純物、例えばタンパク質およびDNAを除去するために沈降によってさらに処理され得る。一例では、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド含有溶液は適切な沈降剤で、例えば、エタノール、メタノール、アセトンまたはイソプロパノールで処理される。代替的な一例では、DNAおよびタンパク質は透析によって、または低分子のアルカロイドを混入生体高分子から分離する他のサイズ排除法によって除去され得る。
さらなる例では、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドを含有している溶液は、連続クロスフロー濾過によって当技術分野において公知の方法を用いて高純度に抽出され得る。
該溶液が関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの混合物を含有している場合、これは酸-塩基処理に供され、当技術分野において公知の方法を用いて個々の関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド種が得られ得る。このプロセスでは、水溶液のpHが、個々のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドが析出するように調整される。
高純度小規模調製では、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドは液体クロマトグラフィーによる1回の工程で精製され得る。
LCMS法:
関心対象のBIA化合物、例えばナロキソンまたはナルトレキソンは液体クロマトグラフィーを用いて分離され、質量分析を用いて検出および定量され得る。化合物の実体は特性溶出時間、質量電荷比（m/z）および断片化パターン（MS/MS）によって確認され得る。定量は、化合物のピーク面積を既知の参照標準化合物の標準曲線と比較することによって行なわれ得る。さらに、関心対象のBIAは、代替的な方法、例えばGC-MS、UV-vis分光法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLCおよびキャピラリー電気泳動によって検出され得る。
purpaldアッセイ法
脱メチル化反応のハイスループットスクリーニングには、purpaldアッセイが使用され得る。例えば、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される脱メチル化により、ホルムアルデヒドが、一般化学反応式:［基質］＋2-オキソグルタレート＋O2 ⇔［生成物］＋ホルムアルデヒド＋スクシネート＋CO2に示す生成物として生成する。アルカリ性条件でのpurpald試薬はホルムアルデヒドの存在下で色変化を生じ、これが、1 nMという低濃度まで分光測光器で510 nmにて定量され得る。
酵母由来アルカロイドAPI 対 植物由来API
清澄化した酵母培養培地（CYCM）中には複数種の不純物が含まれ得る。清澄化した酵母培養培地は真空および/または熱によって脱水され、アルカロイド富化粉末が得られ得る。この生成物は、ケシを栽培している国が輸出し、医薬品有効成分（API）製造業者が購入するけしがら濃縮物（concentrate of poppy straw）（CPS）と類似している。本発明の解釈上、CPSは、所望のアルカロイド生成物が最終的にさらに精製され得る任意の型の精製植物エキスの代表例である。表9および表10に、CYCMもしくはCPSのいずれかに特異的であり得るかまたは両方に存在し得る、この2種類の生成物中の不純物を明示している。したがって、このようなノル-オピオイドまたはナル-オピオイドは、不純物について非着色不純物に基づいて評価され得る。起源不明の生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、酵母系生産宿主に由来するのか植物系生産宿主に由来するのかを判定することができよう。
API等級の医薬品成分は高度に精製された分子である。そのため、APIの植物起源または酵母起源を示している可能性がある不純物（例えば、表9および表10に列記したもの）は、API段階の生成物には存在し得ない。実際、本発明の酵母株に由来するAPI生成物の多くは、従来の植物由来APIとおおむね区別不可能であり得る。しかしながら、一部の場合では、慣用的なアルカロイド化合物が化学合成アプローチを用いた化学修飾に供され得、これにより、かかる化学修飾を必要とする植物ベース生成物中の化学物質不純物が現れる場合があり得る。例えば、化学的誘導体化では多くの場合、化学合成プロセスに関連する一連の不純物が生じ得る。一部の特定の状況では、このような修飾が酵母系生産プラットフォーム内で生物学的に行なわれ、それにより、化学的誘導体化に付随する不純物の一部が酵母由来生成物中に存在することが回避され得る。特に、化学的誘導体化生成物のこのような不純物は、化学合成プロセスを用いて生成されたAPI生成物中には存在し得るが、酵母由来生成物を用いて生成されたAPI生成物中には非存在であり得る。代替的に、酵母由来生成物を化学的誘導生成物と混合した場合、生じる不純物は存在し得るが、化学的誘導生成物のみを含むAPIまたは主として化学的誘導生成物を含むAPIにおいて予測され得るものより少ない量であり得る。この例では、API生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、酵母系生産宿主に由来するのか従来の化学的誘導体化経路に由来するのかを判定することができよう。
化学的に誘導体化されたモルフィナンAPI中に存在し得るが生合成API中には存在し得ない不純物の非限定的な例としては、APIコデイン中のコデイン-O（6）-メチルエーテル不純物;APIオキシコドン中の8,14-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロコデイノン;およびAPIヒドロコドン中のテトラヒドロテバインが挙げられる。コデイン-O（6）-メチルエーテルはモルヒネの化学的過剰メチル化によって形成され得る。APIオキシコドン中の8,14-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロコデイノンはテバインの化学的過剰酸化によって形成され得る。さらに、APIヒドロコドン中のテトラヒドロテバインはテバインの化学的過剰還元によって形成され得る。
しかしながら、酵母由来化合物および植物由来化合物がどちらも化学合成アプローチによる化学修飾に供された場合、化学合成プロセスに付随する同じ不純物が生成物中に存在することが予測され得る。かかる状況では、出発物質（例えば、CYCMまたはCPS）は、上記のようにして解析され得る。
宿主細胞由来ナル-オピオイド 対 化学的誘導ナル-オピオイド
化学合成によって作製されるナル-オピオイド中には複数種の不純物が含まれ得る。このような不純物は、多くの異なる原因、例えば、未反応の出発物質、不完全な反応、副生成物の形成、中間体の残存、二量体化または分解によって生じ得る。未反応の出発物質の一例は、ナルトレキソンの調製において残存するオキシモルホンであり得る。不完全な反応により生じる不純物の一例は、テバインの不完全な3-O-脱メチル化により生じる3-O-メチルブプレノルフィンであり得る。化学修飾によりオフターゲット部位の官能基の付加または除去がもたらされ得る。例えば、ナルトレキソン合成において10-ヒドロキシナルトレキソンおよび10-ケトナルトレキソンが生じるC10の酸化、またはブプレノルフィン合成において6-O-デスメチルブプレノルフィンが得られる6-O-メチル基の除去。不純物は、反応中間体の残存、例えば、N-脱メチル化プロセス中に形成されるオキシモルホンN-オキシドなどのN-オキシドの残存により生じ得る。不純物の別の原因は二量体化である、2つのオピオイド分子、例えば、2つのブプレノルフィン分子（2,2'-ビスブプレノルフィン）、2つのナルトレキソン分子（2,2'-ビスナルトレキソン）または2つのナロキソン分子（2,2'-ビスナロキソン）のコンジュゲーションである。不純物は、出発物質、反応中間体または反応生成物の分解によっても生じ得る。化学合成において使用される極端な物理的条件は分解の存在をより起こりやすくする。分解により生じ得る不純物の一例は、ブプレノルフィン合成時の酸化条件によって生じるデヒドロブプレノルフィンである。
宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイドには、化学合成によって作製されるナル-オピオイドとは異なる不純物が含まれ得る。宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイド中に含まれ得る不純物は化学合成によって作製されるナル-オピオイド中より少ない。宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイドには化学合成によって作製されるナル-オピオイドにみられる一部の特定の不純物がない場合があり得る。例において、酵素合成のカギとなる特徴としては、（1）酵素が特異的な基質と残基を高い忠実度で標的化する;（2）酵素が、該分子の安定性を障害しない穏やかな細胞内生理学的条件で反応を行なう;および（3）酵素が、反応を終了へと推進する効率的な触媒となるように遺伝子操作されていることが挙げられ得る。
表11に、化学的に作製したナル-オピオイドに特異的であり得るいくつかの不純物を明示している。したがって、ナル-オピオイドは、表11のいずれかの不純物の有無を調べるために不純物について評価され得る。起源不明の生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、化学合成に由来するのか酵素的合成に由来するのかを判定することができよう。
宿主細胞の遺伝子操作方法
また、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを生成する目的のための宿主細胞の遺伝子操作方法も含む。宿主細胞内へのDNAの挿入は任意の簡便な方法を用いて行なわれ得る。該方法は、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞内に、該宿主細胞が酵素を機能的に発現し、関心対象の出発化合物を生成物である関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAに変換するように挿入するために使用される。
任意の簡便なプロモーターが、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法において使用され得る。異種コード配列の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいが、該プロモーターは遺伝子操作された宿主細胞内で活性であるものとする。異種コード配列は、その天然プロモーターによって発現されるものであってもよく、非天然プロモーターを使用してもよい。かかるプロモーターは、これが使用される宿主において低度から高度の強度であり得る。プロモーターは調節されていてもよく構成的であってもよい。特定の態様では、グルコース抑制型でないか、または培養培地中のグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターが使用される。関心対象のプロモーターとしては、非限定的に、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、枯草菌tsr遺伝子（フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター領域をコードしている）のプロモーターまたはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD、GAPDHもしくはTDH3）をコードしている出芽酵母遺伝子由来のプロモーター、パン酵母のADH1プロモーター、リン酸欠乏誘導型プロモーター、例えば、酵母のPHO5プロモーター、B.リケニフォルミス由来のアルカリホスファターゼプロモーター、酵母の誘導性プロモーター、例えば、Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、抑制性プロモーターMet25、tetO、および構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GPD）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH）、翻訳-伸長因子-1-αプロモーター（TEF）、シトクロムc-オキシダーゼプロモーター（CYC1）、MRP7プロモーターなどが挙げられる。また、ホルモン、例えばグルココルチコイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンにより誘導性のプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターも使用され得、非限定的に、グルコルチコイド応答エレメント（GRE）および甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）が挙げられ得る。これらおよび他の例は米国特許第7,045,290号に記載されており、これは参照により、これに引用された参考文献も含めて組み入れられる。構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGH）を含むさらなるベクターが使用され得る。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBどおり）もまた、遺伝子発現を駆動させるために使用することができよう。宿主細胞に対して任意の簡便な適切なプロモーターが選択され得、大腸菌細胞において使用され得るプロモーターの例としては、T7、lacおよびtetOプロモーターが挙げられる。プロモーターの選択を、転写物、したがって酵素レベルを最適化して産生を最大限にするとともにエネルギー資源を最小限にするために使用してもよい。
任意の簡便なベクターが、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法において使用され得る。関心対象のベクターとしては、酵母および他の細胞における使用のためのベクターが挙げられる。酵母ベクターの型は、4つの一般カテゴリー:組込み型ベクター（YIp）、自律複製型高コピー数ベクター（YEpまたは2μプラスミド）、自律複製型低コピー数ベクター（YCpまたはセントロメアプラスミド）および大型断片のクローニング用ベクター（YAC）に分けられ得る。ベクターDNAは原核生物細胞または真核生物細胞内に、任意の簡便な形質転換またはトランスフェクション手法によって導入される。別の供給源のDNA（例えば、PCR生成二本鎖DNA産物、または合成の二本鎖もしくは一本鎖のオリゴヌクレオチド）を、ゲノム内への組込みによる酵母の遺伝子操作のために使用してもよい。任意の単一の形質転換事象は、宿主細胞を遺伝子修飾するための1つまたはいくつかの核酸（ベクター、二本鎖または一本鎖DNA 断片）を含み得る。
有用性
例えば上記のもののような本明細書に開示した遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな用途における利用が見出される。関心対象の用途としては、非限定的に:研究用途および治療用途が挙げられる。本明細書に開示した方法は、さまざまな異なる用途、例えば、ノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成が関心対象の任意の簡便な用途における利用が見出される。
主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな治療用途における利用が見出される。関心対象の治療用途としては、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドを含む医薬製剤品の調製が関心対象である用途が挙げられる。本明細書に記載の遺伝子操作された宿主細胞は、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドと関心対象の酵素を生成する。レチクリンは、最終生成物、例えばオピオイド生成物を生成するための遺伝子操作作業を含むBIAの合成における関心対象の主要な分岐点中間体である。主題の宿主細胞は、関心対象のBIA（レチクリン、およびBIA最終生成物、例えばノル-オピオイドまたはナル-オピオイドを含む）の生成における利用が見出され得る単純で廉価な出発物質から関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドを生成するために使用され得る。そのため、主題の宿主細胞は、治療活性な関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの供給における利用が見出される。
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞および方法は、化学合成では収量が少なく、大規模生産には実行可能な手段でない商業規模の量のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの生産における利用が見出される。一部の特定の場合では、宿主細胞および方法は、治療製剤品用の関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの迅速生産を可能にする例えば5,000〜200,000リットル容のバイオリアクター（発酵槽）を含み得る発酵施設内で使用される。かかる用途としては、発酵性炭素源、例えば、セルロース、デンプンおよび遊離糖からの関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの工業規模の生産が挙げられ得る。
主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな研究用途における利用が見出される。主題の宿主細胞および方法は、さまざまな関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生合成経路に対するさまざまな酵素の効果を解析するために使用され得る。また、遺伝子操作された宿主細胞は、今のところまだわかっていない治療的機能における関心対象の生理活性についての試験における利用が見出される関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAが生成するように遺伝子操作され得る。一部の場合では、さまざまな酵素をコードしているさまざまな異種コード配列を含めるという宿主細胞の遺伝子操作により、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAへの高収量生合成経路が解明されている。一部の特定の場合では、研究用途としては、次いで所望の生成物にさらに化学修飾もしくは誘導体化され得る関心対象の治療用分子用の、または関心対象の治療活性の増大についてスクリーニング用の関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成が挙げられる。一部の例では、宿主細胞株は、かかる経路において関心対象である酵素活性についてスクリーニングするために使用され、これにより、このような細胞株内で生成したノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの代謝産物の変換により酵素の発見がもたらされ得る。
主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、植物に特殊な代謝産物の生産プラットフォームとして使用され得る。主題の宿主細胞および方法は、薬物ライブラリーの開発ならびに植物酵素の発見のプラットフォームとして使用され得る。例えば、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、興味対象の骨格分子、例えばノルコデインまたはノルテバインを生成する酵母株を採用し、該化合物の構造をコンビナトリアル生合成または化学的手段によってさらに機能性にすることにより、天然産物ベースの薬物のライブラリーの開発における利用が見出され得る。このようにして薬物ライブラリーを作成することにより、潜在的薬物ヒット（あれば）が既に、大規模での培養および生産に適した生産宿主に付随している。別の例として、このような主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、植物酵素の発見における利用が見出され得る。主題の宿主細胞により、新たな酵素活性を同定するために植物ESTライブラリーを発現させるための規定の代謝産物のクリーンなバックグラウンド（clean background）が提供される。主題の宿主細胞および方法により、酵母における植物酵素の機能性発現および活性増大のための発現方法および培養条件が提供される。
キットおよび系
本発明の一部の局面は、本明細書に開示した方法において使用される1種または複数種の成分、例えば、本明細書に記載のような遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培養培地などを含み得るキットおよび系をさらに含む。いくつかの態様では、主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）と、以下のもの:出発化合物、異種コード配列および/または該配列を含むベクター、ベクター、増殖用フィードストック、発現系における使用に適した成分（例えば、細胞、クローニングベクター、マルチクローニングサイト（MCS）、双方向プロモーター、内部リボソーム進入部位（IRES）など）および培養培地から選択される 1種または複数種の成分とを含む。
本明細書に記載の任意の成分、例えば、1つまたは複数の修飾を含む宿主細胞、出発化合物、培養培地などがキット内に備えられ得る。異種コード配列、クローニングベクターおよび発現系の作製および使用における使用に適したさまざまな成分が、主題のキットにおいて利用が見出され得る。また、キットにチューブ、バッファーなど、および使用説明書を含めてもよい。キットの種々の試薬成分は、所望により、別々の容器内に存在させてもよく、該成分の一部または全部を単一の容器内で事前に合わせて試薬混合物にしておいてもよい。
また、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを生成するための系であって、1つまたは複数の修飾（例えば、本明細書に記載のようなもの）を含む遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、培養培地、発酵槽および発酵設備、例えば、宿主細胞の増殖条件を維持するのに適した装置、試料採取およびモニタリングの設備および成分などを含み得る系も提供する。酵母細胞の大規模発酵における使用に適したさまざまな要素が主題の系において利用が見出され得る。
一部の場合では、系は、遺伝子操作された宿主細胞の大規模発酵ならびに発酵させた宿主細胞によって生成されるノル-オピオイドまたはナル-オピオイド化合物のモニタリングおよび精製のための要素を含む。特定の態様では、1種または複数種の出発化合物（例えば、本明細書に記載のようなもの）を、系に、発酵槽内の遺伝子操作された宿主細胞によって関心対象の1種または複数の所望のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物が生成される条件下で添加する。一部の例では、宿主細胞が関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド（例えば、本明細書に記載のようなもの）を生成する。一部の特定の場合では、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物がオピオイドアンタゴニスト、例えばナロキソン、ナルトレキソン、ナルメフェンまたはナロルフィンである。一部の特定の場合では、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物がオピオイドアンタゴニスト、例えば、ナルトルインドールまたはノルビナルトルフィミンである。一部の例では、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物が部分アゴニスト、例えばブプレノルフィンである。
一部の場合では、系は、主題の宿主細胞によって生成される1種または複数種の関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIA化合物をモニタリングおよびまたは解析するためのプロセスを含む。例えば、本明細書に記載のようなLC-MS解析の系、クロマトグラフィーの系、または試料が解析されて標準と比較され得る任意の簡便な系、例えば、本明細書に記載のようなもの。発酵培地は、発酵前および発酵中の任意の簡便な時点で試料採取および解析によってモニタリングされ得る。出発化合物の関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物への変換が完全である場合、発酵は停止され得、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物の精製が行なわれ得る。そのため、一部の場合では、主題の系は、関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物を、これが生成された宿主細胞培地から精製するのに適した精製要素を含む。精製要素としては、発酵によって生成された関心対象のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド生成物を精製するために使用され得る任意の簡便な手段、例えば非限定的に、シリカクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HICクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体抽出およびpH抽出法が挙げられ得る。一部の場合では、主題の系により、該系に1種または複数種の出発化合物を投入した後に関心対象の酵素および/またはノル-オピオイドまたはナル-オピオイド発酵産物の生成および単離がもたらされる。
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのようにして作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するために示し、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が行なわれる実験のすべて、または唯一の実験であることを表していることを意図するものでもない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確性が確保されるように努力したが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮されたい。特に記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
酵素リストの論考
宿主細胞は、関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成をもたらす1つまたは複数の修飾（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の修飾）を含むように遺伝子操作され得る。表2に、遺伝子操作された宿主細胞において関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成および/または関心対象の酵素の産生をもたらすような1つまたは複数の修飾に作用され得る例示的な遺伝子を列記する。
表2に示す遺伝子の修飾は、増殖に必要とされる最低限の栄養物を含有している培地が供給された遺伝子操作された宿主細胞から関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを生成するために使用され得る。この最少培地には炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン類および塩類が含有され得る。例えば、表2に示す遺伝子の修飾は、糖質が供給された遺伝子操作された宿主細胞から関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAを生成するために使用され得る。さらに、表2に示す1つまたは複数の遺伝子の修飾は、薬物生産のために遺伝子操作され得る宿主細胞の生合成プロセスを増大させるために使用され得る。
さらに、遺伝子操作された宿主細胞において関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生成および/または関心対象の酵素の産生をもたらすためのこのような修飾の使用は、遺伝子によって産生され得る酵素の単なる同定からは容易にわかることではない。特に、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば酵母細胞内で再構築された合成経路は、単一の生物体において天然状態で一緒になって作用するものでないさまざまな酵素を含む。さらに、本明細書において論考した酵素のうちの一部のものは、その天然の状況ではノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAの生合成のために作用しない。さらに、本明細書に記載の酵素のうちの一部のものは、特定の宿主細胞、例えば酵母細胞において機能するように進化せず、一緒になって機能するように進化しない。さらに、生成するノル-オピオイドまたはナル-オピオイドのうちの一部のものは天然に存在しない。このような場合、該酵素が、宿主細胞内、例えば酵母内の合成ノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイド経路の状況において経路内で充分なフラックスを有し、下流のノル-オピオイドまたはナル-オピオイド最終生成物を生成するような充分な活性を示すであろうことは自明ではないであろう。
例えば、植物酵素は多くの場合、異種微生物宿主、例えば酵母において機能的に発現させることが困難である。多くの場合、該酵素は、ミスフォールディングされ得る、宿主細胞内に正しく局在化され得ない、および/または不正確にプロセッシングされ得る。タンパク質の翻訳およびプロセッシングにおける酵母と植物間の違いにより、このような酵素が示す酵母宿主内における活性はかなり低いものから検出不可能なまでの程度となり得る。このような課題は一般的に、内膜に局在する酵素、例えばシトクロムP450について生じ、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドの前駆体が生成するBIA経路内で強く示される。酵素活性が低い場合であっても、複雑なBIAを生成するように酵母を遺伝子操作することにはかなりの課題が提示され得、所望のBIA生成物の高レベルの蓄積を確保するために各工程で充分な活性が必要とされる。
さらに、一部の宿主細胞、例えば酵母には、BIA経路内の初期段階の前駆体（すなわち、チロシンからノルコクラウリンまでの中間体）の多くに対して作用し得る内因性酵素/経路が存在し、したがって、このような競合性の内因性経路を考慮すると、異種経路による充分なフラックスが存在して相当なBIA生成が達成され得るであろうことは容易に明らかでないかもしれない。例えば、酵母におけるErlich経路（Hazelwood, et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 2259-66; Larroy, et al. 2003. Chem. Biol. Interact. 143-144: 229-38; Larroy, et al. 2002. Eur. J. Biochem. 269: 5738-45）は、初期段階のBIA経路の中間体の多くを望ましくない生成物に変換し、フラックスを合成経路からそらすために作用する可能性がある主要な内因性経路である。
さらに、本明細書において論考し、表2に示した酵素の多くは、天然の植物宿主内では非常に特異的な調節ストラテジー下、例えば空間的調節下で機能を果たし得るが、これは、異種酵母宿主に移されると失われ得る。また、植物は、酵母細胞と非常に異なる、該酵素が機能を果たすように進化する生化学的環境、例えば、pH、レドックス状態、ならびに基質、共基質、補酵素および補因子利用能を提示する。天然宿主と異種酵母宿主間の生化学的環境および調節ストラテジーの違いを考慮すると、該酵素が酵母環境の状況下における場合で相当な活性を示すであろうことは自明でなく、さらに、該酵素が一緒になって、単純な前駆体、例えば糖を複雑なBIA化合物に指向するように動作するであろうことは自明でない。酵母宿主内で該酵素の活性が維持されることは特に重要であり、それは、該経路の多くが多くの反応工程（>10）を有しており、したがってこれらの工程が効率的でなければ所望の下流産物の蓄積が期待され得ないためである。
また、天然の植物宿主では、このような経路に付随する代謝産物が異なる細胞型および組織型にまたがって局在し得る。いくつかの例では、生合成に特殊化され得る細胞型および代謝産物の蓄積のために合成され得る細胞型が存在する。このような型の細胞の特殊化は、異種酵母宿主内で該経路を発現させた場合は失われ得、該細胞に対するこのような代謝産物の毒性の制御に重要な役割を果たし得る。したがって、酵母が、このような代謝産物を、このような化合物の毒性によって害されることなく生合成して蓄積させるように、成功裡に遺伝子操作され得るであろうことは自明でない。
一例として、天然の植物宿主では、酵素BBEが動的細胞内局在を有することが報告されている。特に、酵素BBEは、最初はER内から始まり、次いで液胞内に分取される（Bird and Facchini. 2001. Planta. 213: 888-97）。植物におけるBBEのER結合（Alcantara, et al. 2005. Plant Physiol. 138: 173-83）がBBE活性のための最適な塩基性pH（pH約8.8）を提供していることが示唆されている（Ziegler and Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69）。別の例として、サングイナリン生合成が植物細胞内の特殊な小胞内で起こるという証拠がある（Amann, et al. 1986. Planta. 167: 310-20）が、この小胞内には一部の中間体しか蓄積されない。これは、該中間体を他の酵素活性および/または毒性効果から隔離するために起こるのかもしれない。
別の例として、モルフィナン経路分岐内の生合成酵素がすべて、植物の維管束組織の一部である師部に局在する。師部内では、経路内酵素が2つの細胞型:すべての植物に一般的な篩要素、および特殊な二次代謝産物を作り出すある特定の植物にのみ存在する特殊な細胞型である乳管にさらに分けられ得る。上流酵素（すなわち、NCSからSalATまで）は主に篩要素内に存在し、下流酵素（すなわち、T6ODM、COR、CODM）はほとんどが乳管内に存在する（Onoyovwe, et al. 2013. Plant Cell. 25: 4110-22）。さらに、ノスカピン生合成経路の最終工程は乳管内で起こることが見出された（Chen and Facchini. 2014. Plant J. 77: 173-84）。この区分けは、中間体を単離または輸送し、最適なpHを提供し、補因子の供給を増強させることによる生合成の調節に非常に重要であると考えられるが、ケシの乳管の微小環境の性質はまだ究明中である（Ziegler and Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69）。さらに、該酵素のうちのいくつかは、植物の二次代謝に一般的な多酵素複合体または代謝チャネルとしての機能を果たし得ることが予測される（Kempe, et al. 2009. Phytochemistry. 70: 579-89; Allen, et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 1559-66）。異なる宿主に由来する生合成酵素を合わせた場合および/または生合成酵素を異種酵母細胞内で組換え発現させた場合、このような複合体またはチャネルが天然宿主内の場合のように形成されることは明白でない。さらなる一例において、オウレンでは、ベルベリンが根の組織内で生合成され、次いで、特殊なATP結合カセット輸送タンパク質の作用によって地下茎内に蓄積される（Shitan, et al. 2013. Phytochemistry. 91: 109-16）。ケシでは、モルフィナンアルカロイドがラテックス（乳管細胞の細胞質）中に蓄積される（Martin, et al. 1967. Biochemistry. 6: 2355-63）。
さらに、このような考慮事項がない場合であっても、本明細書に記載の経路内の工程のいくつかで、植物酵素がまだ特性評価されていないという場合もある。例えば、初期段階のベンジルイソキノリンアルカロイド骨格であるノルコクラウリンへのチロシンの変換はまだ特性評価されていない。したがって、本明細書に記載の経路内の工程のいくつかで、通常、天然状態ではBIAの生合成のために一緒に存在しない酵素活性を一緒にすること、または再構築経路に使用される新たな酵素活性をゲノム配列情報から同定することにより代替的な生合成スキームをもたらした。
例えば、チロシンのドパミンへの二工程変換は、天然では一緒に存在せず、この経路の状況で、または植物酵素とともに機能を果たすように進化しなかった少なくとも5種類の哺乳動物酵素と1種の細菌酵素を合わせることにより行なわれ得る。このような場合では、このような酵素を、これが天然状態ではそのために進化しなかった化合物の生合成のために使用すること、および異種微生物宿主およびこの経路の状況において有効に機能を果たし得るであろうことは自明とはなり得ない。
関心対象のノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAが生成および/または関心対象の酵素が産生するような修飾の対象物である遺伝子の例を以下に論考する。さらに、該遺伝子を、関心対象のBIAならびにノル-オピオイドおよび/またはナル-オピオイドのBIAおよび/または関心対象の酵素の産生に使用される経路を示す一連の図の状況において論考する。
［TLK1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素トランスケトラーゼの発現を修飾し得る。トランスケトラーゼはTKL1遺伝子にコードされている。一例では、トランスケトラーゼは、図2に示すようなフルクトース-6-リン酸＋グリセルアルデヒド-3-リン酸 ⇔ キシロース-5-リン酸＋エリトロース-4-リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTKL1遺伝子の構成的過剰発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTKL1遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTKL1遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TKL1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞において組込まれるように修飾され得る。TKL1遺伝子は出芽酵母または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TKL1遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［ZWF1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの発現を修飾し得る。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼはZWF1遺伝子にコードされている。一例では、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、図2に示すようなグルコース-6-リン酸→6-ホスホグルコノラクトンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のZWF1遺伝子のコード領域が欠失するように修飾され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりZWF1遺伝子の機能性が無効になるように修飾され得る。
［ARO4］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼの発現を修飾し得る。DAHPシンターゼはARO4遺伝子にコードされている。一例では、DAHPシンターゼは、図2に示すようなエリトロース-4-リン酸＋ホスホエノールピルビン酸→DAHPの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞はARO4遺伝子を、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が組込まれるように修飾し得る。特に、フィードバック阻害緩和変異（例えば、ARO4FBR）は、天然型ARO4遺伝子の本来の遺伝子座に特異的変異として;別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入される追加コピーとして;またはエピゾーマルベクター、例えば2μmまたはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。変異ARO4FBRの識別表示「FBR」は、フィードバック耐性の変異型および変異をいう。DAHPシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、例えば遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞である場合、天然酵母の転写調節下に存在し得る。代替的に、DAHPシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、遺伝子操作された宿主細胞に、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入され得る。一部の場合では、ARO4遺伝子は出芽酵母に由来するものであり得る。一部の場合では、ARO4遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。ARO4遺伝子に対する修飾の例としては、フィードバック阻害耐性変異、K229LまたはQ166Kが挙げられる。
［ARO7］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コリスミ酸ムターゼの発現を修飾し得る。コリスミ酸ムターゼはARO7遺伝子にコードされている。一例では、コリスミ酸ムターゼは、図2に示すようなコリスメート→プレフェネートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞はARO7遺伝子を、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が組込まれるように修飾し得る。特に、フィードバック阻害緩和変異（例えば、ARO7FBR）は、天然型ARO7遺伝子の本来の遺伝子座に特異的変異として;別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入される追加コピーとして;またはエピゾーマルベクター、例えば2μmまたはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。変異ARO7FBRの識別表示「FBR」は、フィードバック耐性の変異型および変異をいう。コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、例えば遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞である場合、天然酵母の転写調節下に存在し得る。代替的に、コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、遺伝子操作された宿主細胞に、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入され得る。一部の場合では、ARO7遺伝子は出芽酵母に由来するものであり得る。一部の場合では、ARO7遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。ARO7遺伝子に対する修飾の例としては、フィードバック阻害耐性変異またはT226Iが挙げられる。
［ARO10］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの発現を修飾し得る。フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼはARO10遺伝子にコードされている。一例では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート→4-ヒドロキシフェニルアセテート（4HPA）の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO10遺伝子の構成的過剰発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO10遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO10遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、ARO10遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。ARO10遺伝子は出芽酵母または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、ARO10遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［ADH2-7、SFA1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の発現を修飾し得る。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アルコールデヒドロゲナーゼは、4HPA→チロソールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数のコード領域が欠失するように修飾され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数の機能性が無効になるように修飾され得る。
［ALD2〜6］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルデヒドオキシダーゼ酵素の発現を修飾し得る。アルデヒドオキシダーゼ酵素は、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アルデヒドオキシダーゼは、4HPA→ヒドロキシフェニル酢酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数のコード領域が欠失するように修飾され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数の機能性が無効になるように修飾され得る。
［ARO9］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。芳香族アミノトランスフェラーゼはARO9遺伝子にコードされている。一例では、芳香族アミノトランスフェラーゼは、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート＋グルタメート→チロシン＋α-ケトグルテレートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO9遺伝子の構成的過剰発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO9遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO9遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、ARO9遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。ARO9遺伝子は出芽酵母または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、ARO9遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TYR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシナーゼの発現を修飾し得る。チロシナーゼはTYR遺伝子にコードされている。一例では、チロシナーゼは、図2に示すようなチロシン→L-DOPAの反応を触媒する。他の例では、チロシナーゼは、L-DOPA→ドパキノンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TYR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。TYR遺伝子は青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、ツクリタケ（Agaricus bisporus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TYR遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TyrH］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシンヒドロキシラーゼの発現を修飾し得る。チロシンヒドロキシラーゼはTyrH遺伝子にコードされている。一例では、チロシンヒドロキシラーゼは、図2および5に示すようなチロシン→L-DOPAの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTyrH遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTyrH遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTyrH遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TyrH遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。TyrH遺伝子はヒト、ドブネズミ、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TyrH遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［DODC］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素L-DOPAデカルボキシラーゼの発現を修飾し得る。L-DOPAデカルボキシラーゼはDODC遺伝子にコードされている。一例では、L-DOPAデカルボキシラーゼは、図2および5に示すようなL-DOPA→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDODC遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDODC遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDODC遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DODC遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。DODC遺伝子はシュードモナス・プチダ、ドブネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DODC遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［TYDC］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシン/DOPAデカルボキシラーゼの発現を修飾し得る。チロシン/DOPAデカルボキシラーゼはTYDC遺伝子にコードされている。一例では、チロシン/DOPAデカルボキシラーゼは、図2に示すようなL-DOPA→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYDC遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYDC遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYDC遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TYDC遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。TYDC遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TYDC遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［MAO］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モノアミンオキシダーゼの発現を修飾し得る。モノアミンオキシダーゼはMAO遺伝子にコードされている。一例では、モノアミンオキシダーゼは、図2に示すようなドパミン→3,4-DHPAの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMAO遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMAO遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのMAO遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、MAO遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、MAO遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。MAO遺伝子は大腸菌、ヒト、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、MAO遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［NCS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリンシンターゼの発現を修飾し得る。ノルコクラウリンシンターゼはNCS遺伝子にコードされている。一例では、ノルコクラウリンシンターゼは、図5に示すような4HPA＋ドパミン→(S)-ノルコクラウリンの反応を触媒する。特に、図5は、本発明の態様による、ノルコクラウリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図5は、酵素TyrH,チロシンヒドロキシラーゼ;DODC,DOPAデカルボキシラーゼ;NCS,ノルコクラウリンシンターゼ（本明細書において論考したもの）;6OMT,6-O-メチルトランスフェラーゼ;CNMT,コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ;CYP80B1,シトクロムP450 80B1;CPR,シトクロムP450 NADPHレダクターゼ;4'OMT,3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ. L-DOPA,L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン;および4-HPA,4-ヒドロキシフェニルアセチルアルデヒドの使用を示す。図5に示した酵素のうち、4-HPAおよびL-チロシンは酵母内で天然に合成される。示された他のすべての代謝産物は酵母内で天然に生成されない。さらに、TyrHがL-チロシンのL-DOPAへの変換を触媒すると示されているが、本明細書に記載のように他の酵素もまた、この工程を行なうために使用され得る。例えば、チロシナーゼもまた、L-チロシンのL-DOPAへの変換を行なうために使用され得る。また、他の酵素、例えばシトクロムP450オキシダーゼもまた、L-チロシンのL-DOPAへの変換を行なうために使用され得る。かかる酵素は、関連BIA前駆体化合物、例えばL-DOPAおよびL-チロシンに対してオキシダーゼ活性を示し得る。
さらに、ノルコクラウリンシンターゼは、図6に示すような3,4-DHPA＋ドパミン→(S)-ノルラウダノソリンの反応を触媒する。特に、図6は、本発明の態様による、ノルラウダノソリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図6は、酵素TyrH,チロシンヒドロキシラーゼ;DODC,DOPAデカルボキシラーゼ;maoA,モノアミンオキシダーゼ;NCS,ノルコクラウリンシンターゼ;6OMT,6-O-メチルトランスフェラーゼ;CNMT,コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ;4'OMT,3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ.L-DOPA,L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン;および3,4-DHPA,3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドの使用を示す。図6に示した酵素のうち、L-チロシンは酵母内で天然に合成される。図6に示された他の代謝産物は酵母内で天然に生成されない。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のNCS遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のNCS遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのNCS遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、NCS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。さらに、ノルコクラウリンシンターゼはN-末端切断部を有し得る。一部の場合では、NCS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。NCS遺伝子はオウレン、ケシ、パパヴェール・ブラクテアタム（Papver bracteatum）、サリシタム・フラバム（Thalicitum flavum）、コリダリス・サキシコラ（Corydalis saxicola）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、NCS遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。
［6OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは6OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは、図5に示すようなノルコクラウリン→コクラウリンの反応を触媒する。他の例では、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは、ノルラウダノソリン→3'ヒドロキシコクラウリンの反応、ならびに本明細書に詳述した他の反応、例えば図6に示したものを触媒する。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の6OMT遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の6OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーの6OMT遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、6OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。6OMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、6OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［CNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼはCNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼは、図5に示すようなコクラウリン→N-メチルコクラウリンの反応を触媒する。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ酵素が、3'ヒドロキシコクラウリン→3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンの反応を触媒し得る。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼが、図26に示すようなノルオキシモルホン→ナロキソンの反応を触媒し得る。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼが、本明細書に詳述した他の反応、例えば図6に示したものを触媒し得る。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCNMT遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCNMT遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCNMT遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CNMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。CNMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［4'OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素4'-O-メチルトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。4'-O-メチルトランスフェラーゼは4'OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、4'-O-メチルトランスフェラーゼは、図5に示すような3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン→レチクリンの反応を触媒する。他の例では、4'-O-メチルトランスフェラーゼは、本明細書に詳述した他の反応、例えば図6に示したものを触媒する。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の4'OMT遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の4'OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーの4'OMT遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、4'OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。4'OMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、4'OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［CYP80B1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムP450 80B1の発現を修飾し得る。シトクロムP450 80B1はCYP80B1遺伝子にコードされている。一例では、シトクロムP450 80B1は、図5に示すようなN-メチルコクラウリン→3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のシトクロムP450 80B1遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のシトクロムP450 80B1遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのシトクロムP450 80B1遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、シトクロムP450 80B1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、CYP80B1遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。シトクロムP450 80B1遺伝子はケシ、ハナビシソウ（E. californica）、キバナカラマツソウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、P450 80B1遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［FOL2］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素GTPシクロヒドロラーゼの発現を修飾し得る。GTPシクロヒドロラーゼはFOL2遺伝子にコードされている。一部の例では、GTPシクロヒドロラーゼは、図1に示すようなGTP→ジヒドロネオプテリン三リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のFOL2遺伝子の構成的過剰発現を含むように修飾され得る。また、遺伝子操作された宿主細胞は天然の調節を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のFOL2遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのFOL2遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、FOL2遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。FOL2遺伝子は出芽酵母、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、FOL2遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［PTPS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素6-ピルボイルテトラヒドロビオプテリン（PTP）シンターゼの発現を修飾し得る。ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼはPTPS遺伝子にコードされている。一部の例では、6-ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、図1に示すようなジヒドロネオプテリン三リン酸→PTPの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPTPS遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPTPS遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPTPS遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PTPS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、PTPS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。PTPS遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、PTPS遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。
［SepR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素セピアプテリンレダクターゼの発現を修飾し得る。セピアプテリンレダクターゼはSepR遺伝子にコードされている。一部の例では、セピアプテリンレダクターゼは、図1に示すようなPTP→BH4の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSepR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSepR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSepR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SepR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、SepR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。SepR遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SepR遺伝子は天然に存在する遺伝子と72％類似しているものであり得る。
［PCD］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン（プテリン-4α-カルビノールアミン）デヒドラターゼの発現を修飾し得る。4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼはPCD遺伝子にコードされている。一部の例では、4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、図1に示すような4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン→H2O＋キノノイドジヒドロプテリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPCD遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPCD遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPCD遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PCD遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、PCD遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。PCD遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、PCD遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。
［QDHPR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼの発現を修飾し得る。キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼはQDHPR遺伝子にコードされている。一部の例では、キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、図1に示すようなキノノイドジヒドロプテリジン→BH4の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のQDHPR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のQDHPR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのQDHPR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、QDHPR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、QDHPR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。QDHPR遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、QDHPR遺伝子は天然に存在する遺伝子と75％類似しているものであり得る。
［DHFR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現を修飾し得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼはDHFR遺伝子にコードされている。一部の例では、ジヒドロ葉酸レダクターゼは、図1に示すような7,8-ジヒドロビオプテリン（BH2）→5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン（BH4）の反応を触媒する。この反応は、図5に示すようなチロシンのL-DOPAへの変換のための共基質としてBH4の回収に有用であり得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDHFR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDHFR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDHFR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DHFR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、DHFR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。DHFR遺伝子はドブネズミ、ヒトまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DHFR遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［CYP-COR］1-BIAのエピマー化に関して上記に論考したように、遺伝子操作された宿主細胞は、BIAエピメラーゼの発現を修飾し得る。BIAエピメラーゼはCYP-COR遺伝子（例えば、CYP82Y2-COR遺伝子）にコードされている。また、CYP-COR遺伝子はDRS-DRR遺伝子とも称され得る。一部の例では、BIAエピメラーゼは、図7に示すような(S)-1-BIA→(R)-1-BIAの変換を触媒する。特に、図7は、本発明の態様による、L-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。図7は、酵素CPR,シトクロムP450レダクターゼ;CYP-COR,シトクロムP450 CYP82Y1様コデイノンレダクターゼ様融合体;SalSyn,サルタリジンシンターゼ;SalR,サルタリジンレダクターゼ;SalAT,サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ;T6ODM,テバイン6-O-デメチラーゼ;COR,コデイノンレダクターゼ;およびCODM,コデイン-O-デメチラーゼの使用を示す。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP-COR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP-COR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCYP-COR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CYP-COR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。CYP-COR遺伝子はハカマオニゲシ、ケシ、アツミゲシ（Papaver setigerum）、クサノオウ（Chelidonium majus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CYP-COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。
［CPR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムP450レダクターゼの発現を修飾し得る。シトクロムP450レダクターゼはCPR遺伝子にコードされている。一部の例では、シトクロムP450レダクターゼは、図7に示すような(R)-レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。さらに、シトクロムP450レダクターゼは、他の反応、例えば本出願の至る箇所の図に示したものを触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCPR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCPR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCPR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CPR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。CPR遺伝子はハナビシソウ、ケシ、ヒト（H. sapiens）、出芽酵母、シロイヌナズナ（A. thaliana）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CPR遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。
［SalSyn］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンシンターゼの発現を修飾し得る。サルタリジンシンターゼはSalSyn遺伝子にコードされている。一部の例では、サルタリジンシンターゼは、図7に示すような(R)-レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalSyn遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalSyn遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalSyn遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalSyn遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、SalSyn遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。一部の例では、SalSynはN-末端が修飾され得る。SalSyn遺伝子はケシ、ケシ属の種、クサノオウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalSyn遺伝子は天然に存在する遺伝子と78％類似しているものであり得る。
［SalR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンレダクターゼの発現を修飾し得る。サルタリジンレダクターゼはSalR遺伝子にコードされている。一部の例では、サルタリジンレダクターゼは、図7に示すようなサルタリジノール→サルタリジンの反応を可逆的に触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、SalR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。SalR遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、ケシ属の種、クサノオウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalR遺伝子は天然に存在する遺伝子と80〜100％類似しているものであり得る。
［SalAT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼはSalAT遺伝子にコードされている。一部の例では、アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼは、図7に示すようなアセチル-CoA＋サルタリジノール→CoA＋7-O-アセチルサルタリジノールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalAT遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalAT遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalAT遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalAT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、SalAT遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。SalAT遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、オニゲシ（Papaver orientale）、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalAT遺伝子は天然に存在する遺伝子と77〜80％類似しているものであり得る。
［T6ODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テバイン6-O-デメチラーゼの発現を修飾し得る。テバイン6-OデメチラーゼはT6ODM遺伝子にコードされている。一部の例では、テバイン6-O-デメチラーゼは、図7に示すようなテバイン→ネオピノンの反応を触媒する。ネオピノンが生成されたら、ネオピノンはコデイノンに変換され得る。ネオピノン→コデイノンの変換は自発的に起こり得る。代替的に、ネオピノン→コデイノンの変換は、触媒された反応の結果として起こり得る。他の例では、T6ODM酵素が、テバイン以外の基質のO-脱メチル化を触媒し得る。例えば、T6ODMはオリパビンをO-脱メチル化してモルヒノンを生成させ得る。代替的に、T6ODMは、1-ベンジルイソキノリン、プロトベルベリンまたはプロトピン類型のBIA、例えばそれぞれ、パパベリン、カナジンおよびアロクリプトピンのO-脱メチル化を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のT6ODM遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のT6ODM遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのT6ODM遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、T6ODM遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、T6ODM遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。T6ODM遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、T6ODM遺伝子は天然に存在する遺伝子と76.2％類似しているものであり得る。
［COR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデイノンレダクターゼの発現を修飾し得る。コデイノンレダクターゼはCOR遺伝子にコードされている。一部の例では、コデイノンレダクターゼは、図7に示すようなコデイノンのコデインへの反応を触媒する。一部の場合では、コデイノンレダクターゼは、ネオピノンのネオピンへの反応を触媒し得る。他の例では、CORは、他のモルフィナンの還元、例えば、ヒドロコドン→ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン→14-ヒドロキシコデイン、およびヒドロモルホン→ジヒドロモルヒネを触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCOR遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCOR遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCOR遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、COR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、COR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。付加的または代替的に、COR遺伝子は、ミトコンドリア、液胞、小胞体またはその組合せに対する標的化配列の付加を有するように修飾され得る。COR遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と76〜78％類似しているものであり得る。一例では、COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と76.8％、77.0％、77.3％または77.7％類似しているものであり得る。
［CODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデインO-デメチラーゼの発現を修飾し得る。コデインO-デメチラーゼはCODM遺伝子にコードされている。一部の例では、コデインO-デメチラーゼは、図7に示すようなコデインのモルヒネへの反応を触媒する。コデインO-デメチラーゼはまた、ネオピンのネオモルヒネへの反応も触媒し得る。コデインO-デメチラーゼはまた、テバインのオリパビンへの反応も触媒し得る。他の例では、CODMが、1-ベンジルイソキノリン、アポルフィンおよびプロトベルベリン類型のBIA、例えばそれぞれ、レチクリン、イソコリジンおよびスコウレリンのO-脱メチル化を触媒し得る。他の例では、CODM酵素が、プロトピン内のメチレンジオキシブリッジ構造を切断するためのO,O-デメチレン化反応を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCODM遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCODM遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCODM遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CODM遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、CODM遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。付加的または代替的に、CODM遺伝子は、ミトコンドリアに対する標的化配列の付加を有するように修飾され得る。CODM遺伝子はケシ、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CODM遺伝子は天然に存在する遺伝子と75％類似しているものであり得る。一例では、CODM遺伝子が天然に存在する遺伝子と75.2％類似しているものであり得る。
［BBE］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ベルベリンブリッジ酵素の発現を修飾し得る。ベルベリンブリッジ酵素はBBE遺伝子にコードされている。一部の例では、ベルベリンブリッジ酵素は、(S)-レチクリン→(S)-スコウレリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のBBE遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のBBE遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのBBE遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、BBE遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。BBE遺伝子はケシ、アザミゲシ、ハナビシソウ、ベルベリス・ストロニフェラ、サリクトラム・フラバム・グロウカム（Thalictrum flavum subsp. glaucum）、オウレン、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、BBE遺伝子は天然に存在する遺伝子と99％類似しているものであり得る。
［S9OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼはS9OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼは、S-アデノシル-L-メチオニン＋(S)-スコウレリン→S-アデノシル-L-ホモシステイン＋(S)-テトラヒドロコルンバミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のS9OMT遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のS9OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのS9OMT遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、S9OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、S9OMT遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。S9OMT遺伝子はサリクトラム・フラバム・グロウカム、オウレン、トウオウレン、ケシ、カラマツソウ属の種、オウレン属の種、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、S9OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。一例では、S9OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。
［CAS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素(S)-カナジンシンターゼの発現を修飾し得る。(S)-カナジンシンターゼはCAS遺伝子にコードされている。一部の例では、(S)-カナジンシンターゼは、(S)-テトラヒドロコルンバミン→(S)-カナジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子を発現するように修飾され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCAS遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CAS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。CAS遺伝子はサリクトラム・フラバム・グロウカム、オウレン、カラマツソウ属の種、オウレン属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CAS遺伝子は100％であり得る。
［STOX］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼの発現を修飾し得る。(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼはSTOX遺伝子にコードされている。一部の例では、(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼは、(S)-テトラヒドロベルベリン＋2 O2→ベルベリン＋2 H2O2の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTOX遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTOX遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTOX遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STOX遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の例では、STOXはN-末端が修飾され得る。一部の場合では、STOX遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。STOX遺伝子はベルベリス・ウィルソニエー、オウレン、メギ属の種、オウレン属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STOX遺伝子は天然に存在する遺伝子と78％類似しているものであり得る。
［TNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼの発現を修飾し得る。テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼはTNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、カナジン→N-メチルカナジンの反応を触媒する。一部の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、図26に示すようなノルオキシモルホン→ナロキソンの反応を触媒する。
他の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、スチロピン→cis-N-メチルスチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTNMT遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTNMT遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTNMT遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TNMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、TNMT遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。TNMT遺伝子はケシ、ハナビシソウ、ハカマオニゲシ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。一例では、TNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と81％類似しているものであり得る。
［CFS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ケイランチフォリンシンターゼの発現を修飾し得る。ケイランチフォリンシンターゼはCFS遺伝子にコードされている。一例では、ケイランチフォリンシンターゼは、スコウレリン→ケイランチフォリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCFS遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCFS遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCFS遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CFS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。CFS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシ（A. mexicana）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CFS遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、CFS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。
［STS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素スチロピンシンターゼの発現を修飾し得る。スチロピンシンターゼはSTS遺伝子にコードされている。一例では、スチロピンシンターゼは、ケイランチフォリン→スチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTS遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。STS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STS遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、STS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。
［MSH］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼの発現を修飾し得る。cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼはMSH遺伝子にコードされている。一例では、cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼは、cis-N-メチルスチロピン→プロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMSH遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMSH遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのMSH遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、MSH遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。MSH遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、MSH遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。さらに、MSH遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。
［P6H］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素プロトピン-6-ヒドロキシラーゼの発現を修飾し得る。プロトピン-6-ヒドロキシラーゼはP6H遺伝子にコードされている。一例では、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼは、プロトピン→6-ヒドロキシプロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のP6H遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のP6H遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのP6H遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CFS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。P6H遺伝子はケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、P6H遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。さらに、P6H遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。
［DBOX］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼの発現を修飾し得る。ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼはDBOX遺伝子にコードされている。一例では、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼは、ジヒドロサングイナリン→サングイナリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDBOX遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDBOX遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDBOX遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DBOX遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。DBOX遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DBOX遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。さらに、DBOX遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。
［morA］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒネデヒドロゲナーゼの発現を修飾し得る。モルヒネデヒドロゲナーゼはmorA遺伝子にコードされている。一部の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、図8に示すようなモルヒネ→モルヒノンの反応を触媒する。他の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、同じく図8に示すようなコデイノン→コデインの反応を触媒する。図8は、本発明の態様による、半合成オピオイド（opiod）の生成の生合成スキームを示す。特に、図8は、morA,モルヒネデヒドロゲナーゼ;およびmorB,モルヒネレダクターゼを組込むことによる酵母内でのテバインの拡張形質転換を示す。図30は、本発明の態様による、テバインのさらなる形質転換を示す。
遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorA遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorA遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのmorA遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、morA遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、morA遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。morA遺伝子はシュードモナス・プチダまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、morA遺伝子は天然に存在する遺伝子と73.7％類似しているものであり得る。
［morB］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒノンレダクターゼの発現を修飾し得る。モルヒノンレダクターゼはmorB遺伝子にコードされている。一部の例では、モルヒノンレダクターゼは、図8に示すようなコデイノン→ヒドロコドンの反応を触媒する。他の例では、モルヒノンレダクターゼは、同じく図8に示すようなモルヒノン→ヒドロモルホンの反応を触媒する。他の例では、モルヒノンレダクターゼは、14-ヒドロキシコデイノン→オキシコドンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorB遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorB遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのmorB遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、morB遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、morB遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。morB遺伝子はシュードモナス・プチダまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、morB遺伝子は天然に存在する遺伝子と67.2％類似しているものであり得る。
［CYP80A1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素ベルバムニン（berbamunine）シンターゼを発現し得る。ベルバムニンシンターゼはシトクロムP450酵素80A1（CYP80A1）の遺伝子にコードされている。一部の例では、CYP80A1は、(S)-N-メチルコクラウリン＋(R)-N-メチルコクラウリン→ベルバムニンの反応を触媒する。他の例では、CYP80A1は、(R)-N-メチルコクラウリン＋(R)-N-メチルコクラウリン→ガテガウメリン（guattegaumerine）の反応を触媒する。他の例では、CYP80A1は、(R)-N-メチルコクラウリン＋(S)-コクラウリン→2'ノルベルバムニンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP80A1遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP80A1遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCYP80A1遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CYP80A1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、CYP80A1遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。CYP80A1遺伝子はベルベリス・ストロニフェラまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CYP80A1遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％類似しているものであり得る。
［PODA］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素プロトピンO-デアルキラーゼを発現し得る。プロトピンO-デアルキラーゼは遺伝子PODAにコードされている。一部の例では、PODAは、プロトベルベリンおよびプロトピン、例えば、カナジン、スチロピン、ベルベリン、クリプトピン、アロクリプトピンおよびプロトピンのO,O-デメチレン化を触媒する。一部の例では、PODAは、BIA、例えばテトラヒドロパパベリン、テトラヒドロパルマチンおよびクリプトピンのO-脱メチル化を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPODA遺伝子の構成的発現を含むように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPODA遺伝子の発現を合成的に調節するように修飾され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPODA遺伝子が組込まれるように修飾され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PODA遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように修飾され得る。一部の場合では、PODA遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。PODA遺伝子はケシまたは他の種に由来するものであり得る。一部の例では、PODA遺伝子は天然に存在する遺伝子と70〜100％類似しているものであり得る。
［BM3］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素BM3を発現し得る。BM3は、天然宿主内での脂肪酸への一酸素添加に関与している巨大菌（Bacillus megaterium）シトクロムP450である。一部の場合では、BM3は、図27に示すようにオピオイドをN-脱メチル化してノル-オピオイドを生成する。また、これは酵母および細菌内で、活性な異種酵素として容易に発現される。BM3は、生合成酵素としてのいくつかの利点、例えば、可溶性であること、融合レダクターゼパートナータンパク質が付随していること、および新たな基質を受容するように容易に遺伝子操作され得ることを有する。さらに、表6は、BM3 N-デメチラーゼ変異体を示す。
前述の遺伝子の例は、宿主細胞内のいくつかの異なるプラットフォーム、例えばプラスミド（2μ、ARS/CEN）、YACまたはゲノムにより発現させることができる。また、前述の遺伝子配列の例は天然または所望の異種宿主（例えば、出芽酵母）での発現のためにコドン最適化されたもののいずれかであり得る。
以下の実施例は、本発明の種々の態様の実例を示す目的で示しており、本発明をいかなる様式でも限定することを意味するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現時点で好ましい代表的な態様であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の趣旨に包含される、本実施例における変更および他の使用は当業者が思いつくであろう。
実施例1:チロシンヒドロキシラーゼ変異型は遺伝子操作された酵母株内でのレチクリン生成を改善する
ドブネズミ（R. norvegicus）由来のチロシンヒドロキシラーゼを酵母用にコドン最適化し、合成し、低コピー数プラスミド内にクローニングした。単一変異型（W166Y、E332D、S40DおよびR37ER38E）、二重変異型（W166YとE332D、W166YとS40D、W166YとR37ER38E）、ならびに1つの三重変異型（W166Y、R37ER38EおよびE332D）を部位特異的変異誘発によって作製した。各TyrH変異型を、GPDプロモーターを有する低コピー数プラスミドにより、中央代謝に対する以下の変異（米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）:ARO4FBR、ΔZWF1、およびGPD-TKL1プロモーター交換を含む酵母株内で発現させた。また、この株は、P.プチダ（P. putida）由来DOPAデカルボキシラーゼ（DODC）の染色体組込みコピー、共基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体組込み遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ,PTPS;セピアプテリンレダクターゼ,SepR;プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ,PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ,QDHPR）、GPDプロモーターを有する低コピー数プラスミドにより発現させたオウレン（C. japonica）由来ノルコクラウリンシンターゼ（NCS）、およびノルコクラウリンからのレチクリンの生合成のための5つの遺伝子（ケシの6-O-メチルトランスフェラーゼ,Ps6OMT;ケシのコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ,PsCNMT;ハナビシソウのシトクロムP450 80B1、EcCYP80B1;ケシのシトクロムP450 NADPHレダクターゼ,PsCPR;およびケシの3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ,Ps4'OMT）を発現した。TyrH変異型を有する株を、2％のデキストロースを含むチロシンなしの選択的規定培地（YNB）中で96時間培養し、培地中におけるレチクリンの生成を、LC-MS/MSにより330 m/zから137 m/zまでのトランジションのMRMモードで測定した。図9は、このアッセイの結果を示し、TyrH変異型は、野生型TyrHと比較した場合、レチクリン生成を5倍も大きく改善し得ることを示す。そのため、図9は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株内における糖からのレチクリン生成を改善する、チロシンヒドロキシラーゼ変異型を示す。
実施例2:DHFRの発現により遺伝子操作された酵母株内でのチロシンヒドロキシラーゼ活性が改善される
ドブネズミ由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）を酵母用にコドン最適化し、合成し、GPDプロモーターの制御下の低コピー数プラスミド内にクローニングした。DHFRを野生型RnTyrH（GPDプロモーターを有する低コピー数プラスミド）とともに、中央代謝に対する以下の変異（米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）:ARO4FBR、ΔZWF1、およびGPD-TKL1プロモーター交換を含む酵母株内で共発現させた。また、この株は、共基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体組込み遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ,PTPS;セピアプテリンレダクターゼ,SepR;プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ,PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ,QDHPR）を発現した。DHFRおよび野生型RnTyrHを発現する株を、2％のデキストロースを含むチロシンなしの選択的規定培地（YNB）中で96時間培養し、培地中におけるL-DOPAの生成を、LC-MS/MSにより198 m/zから152 m/zまでのトランジションのMRMモードで測定した。野生型RnTyrHでのDHFRの発現では、図10に示されるように、L-DOPA生成が1.8倍増大する。そのため、図10は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株内でのチロシンヒドロキシラーゼによるL-DOPA生成を改善する、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の共発現を示す。
実施例3:増殖培地への抗酸化剤の添加により遺伝子操作された酵母株内でのチロシンヒドロキシラーゼ活性が改善される
中央代謝に対する以下の変異（米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）:ARO4FBR、ΔZWF1、およびGPD-TKL1プロモーター交換を含み、共基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体組込み遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ,PTPS;セピアプテリンレダクターゼ,SepR;プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ,PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ,QDHPR）ならびに野生型RnTyrHをGPDプロモーターの制御下の低コピー数プラスミドにより発現する酵母株を、2％のガラクトースおよび2 mMのアスコルビン酸を含むチロシンなしの選択的規定培地（YNB）中で96時間培養した。
培地中におけるL-DOPAの生成を、LC-MS/MSにより198 m/zから152 m/zまでのトランジションのMRMモードで測定した。2 mMのアスコルビン酸の添加により野生型RnTyrHによるL-DOPA生成が1.8倍改善される。また、BH4中間体の濃度を、LC-MS/MSにより以下のトランジション:B,238 m/zから178 m/z;BH2,240 m/zから165 m/zおよびBH4,242 m/zから166 m/zのMRMモードで測定した。また、アスコルビン酸の添加によって培地中のBH4が増加し、これはBH4のBH2への酸化が抑制されていることを示す。
したがって、図11Aは、遺伝子操作された酵母株内でのチロシンヒドロキシラーゼによるL-DOPA生成を改善する培養培地への抗酸化剤の添加、および（B）本発明の態様による、BH4レベルを高める培養培地への抗酸化剤の添加を示す。特に、図11Aは、野生型RnTyrH（GPDプロモーターの制御下の低コピー数プラスミドにより発現）が、中央代謝に対する以下の変異（米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）:ARO4FBR、ΔZWF1、およびGPD-TKL1プロモーター交換を含む酵母株内で発現されたことを示す。また、この株は、共基質テトラヒドロビオプテリンを生成するドブネズミ由来の4つの染色体組込み遺伝子（ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ,PTPS;セピアプテリンレダクターゼ,SepR;プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ,PCD;ジヒドロプテリジンレダクターゼ,QDHPR）を発現した。野生型RnTyrHを発現する株を、2％のデキストロースを含み、2 mMのアスコルビン酸（aa）ありおよびなしでチロシンなしの選択的規定培地（YNB）中で96時間培養した。培地中におけるL-DOPAの生成を、LC-MS/MSにより198 m/zから152 m/zまでのトランジションのMRMモードで測定した。さらに、図11Bは、図11Aに示したものと同じ株において、2 mMのアスコルビン酸（aa）ありおよびなしで培養した株の培地中におけるBH4中間体の濃度を、以下のトランジション:BH4,242 m/zから166 m/zのLC-MS/MS MRMモードで測定したことを示す。
実施例4.エピメラーゼ酵素の同定
本明細書に開示した方法のエピマー化反応を行なわせるのに適したエピメラーゼ酵素を同定するため、シトクロムP450オキシダーゼ82Y1様ドメインおよびコデイノンレダクターゼ様ドメインを、一般公開されている植物トランスクリプトームの1つのオープンリーディングフレーム（CYP-COR）内に同定した。このCYP-COR融合体は、1000 Plants Project（Matasci, et al. 2014. Gigascience. 3: 17）およびPhytoMetaSyn（Facchini, et al. 2012. Trends Biotechnol. 30: 127-31; Xiao, et al. 2013. J. Biotechnol. 166: 122-34）トランスクリプトームのBLAST検索により、レチクリン蓄積をもたらす既報のCORサイレンシングVIGS構築物（Wijekoon and Facchini. 2012. Plant J. 69: 1052-63）の配列であるクエリーを有するblastnを用いて同定した。1つのCYP-COR融合配列がヒットとして観察されたら、該配列を翻訳し、そのアミノ酸配列を、tblastnを用いた両方のデータベースの第2の検索のためのクエリーとして使用した。データベースから同定されたCYP-COR融合酵素の系統樹を図13に示す。配列は、1000 Plants ProjectおよびPhytoMetaSynトランスクリプトームデータベースからバイオインフォマティクス検索に基づいて同定した。さらに、上記に論考したような一例のアミノ酸配列を図4に示す。さらに、表1に、種々の植物、例えばケシ（opium poppy）、アツミゲシ（poppy of Troy）、ハカマオニゲシ（Iranian poppy）およびクサノオウ（greater celandine）に由来する、このCYP-COR酵素について同定されたアミノ酸配列の種々の例を列記する。
実施例5.遺伝子操作された非植物宿主細胞内での(S)-レチクリンの(R)-レチクリンへのエピマー化
非植物宿主細胞を、本明細書に記載の酵素を異種発現するように遺伝子操作されたした。例えば、酵母株（出芽酵母）を、実施例4に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させるため、およびこの微生物宿主の状況でのその機能を確認するために遺伝子操作されたした。アミノ酸部分配列pbr.PBRST1PF_4328およびpbr.PBRST1PF_89405の酵母-コドン最適化DNAコード配列をSSDU-2015634のアミノ酸1〜40の酵母-コドン最適化コード配列に対してインフレームで合成し（表1）、それぞれ、CYP-COR_4328およびCYP-COR_89405を作製した。これらのCYP-CORコード配列を、URA3選択マーカーを有する低コピー数プラスミド内にクローニングし、TDH3プロモーターにより発現させた。このプラスミドで、染色体内に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット（PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2）を有する酵母株を形質転換した。2種類のプラスミドを有するこのような酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Ura-Trp）を含む合成完全培地中で培養した。酵母株に(S)-レチクリンを供給し、BIA代謝産物を、72時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。
実施例6.遺伝子操作された酵母細胞内での(S)-レチクリンからのサルタリジンの生成
酵母株（出芽酵母）を、実施例4に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させるため、およびこの微生物宿主の状況でのその機能を確認するために遺伝子操作されたした。アミノ酸部分配列pbr.PBRST1PF_4328およびpbr.PBRST1PF_89405の酵母-コドン最適化DNAコード配列をSSDU-2015634のアミノ酸1〜40の酵母-コドン最適化コード配列に対してインフレームで合成し（表1）、それぞれ、CYP-COR_4328およびCYP-COR_89405を作製した。これらのCYP-CORコード配列を、URA3選択マーカーを有する低コピー数プラスミド内にクローニングし、TDH3プロモーターにより発現させた。サルタリジンシンターゼ（SalSyn）コード配列を、TRP1選択マーカーを有する低コピー数プラスミド内にクローニングし、TDH3プロモーターにより発現させた。このプラスミドで、染色体内に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット（PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2）を有する酵母株を形質転換した。2種類のプラスミドを有するこのような酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Ura-Trp）を含む合成完全培地中で培養した。酵母株に(S)-レチクリンを供給し、BIA代謝産物を、72時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。この解析により、遺伝子操作された酵母細胞は(S)-レチクリンを(R)-レチクリンに変換することができ、(R)-レチクリンは次いで、サルタリジンシンターゼによる作用を受けて、4環式のプロモルフィナンアルカロイドであるサルタリジンを形成することが示された（図7、図14）。サルタリジンシンターゼは、(R)-レチクリンに対して作用し、(S)-レチクリンに対して観察可能な活性を示さないことが以前に示されている（Gesell, et al. 2009. J. Biol. Chem. 284: 24432-42）。
図7に示すように、CYP-CORは(S)-レチクリンの(R)-レチクリンへの変換を触媒し、(R)-レチクリンは次いでサルタリジンシンターゼによる作用を受け、プロモルフィナンアルカロイドであるサルタリジンが作製される。図14は、（A）2つのエピメラーゼ変異体（CYP-COR_89405, CYP-COR_4328）および標準でのレチクリンおよびサルタリジンを示すクロマトグラム図を示す。また、図14は、（B）標準との共溶出を示すように再プロットした場合の（A）のサルタリジンの同じクロマトグラム図も示す。この実験では、酵母は、URA3およびTRP1選択マーカー、TDH3プロモーターならびにCYP-CORおよびSalSynコード配列を有する2種類の低コピー数CEN/ARSプラスミドを含む。酵母を新鮮形質転換コロニーから3 mLの選択培地中で一晩培養し、3.5 mLの培地中でOD 0.8まで戻し希釈（back-dilute）し、7時間培養し、ペレット化し、次いで、100μMの(S)-レチクリン（Specs）を有するpH 7.4のHEPESバッファー中に再懸濁させた。スピナー上で30℃にて16時間後、酵母をペレット化し、バッファーの上清みをLC-MS/MSによって解析した。各図は、2つのうちの代表的な1つの試料のものである。ピークを、すべてのクロマトグラムにおいて最大ピークが100％となるように正規化する。
実施例7.遺伝子操作された非植物宿主細胞内でのラセミ体のノルラウダノソリンからの(R)-レチクリンの生成
酵母株（出芽酵母）を、実施例4に記載の同定されたエピメラーゼを異種発現させるため、およびこの微生物宿主の状況でのその機能を確認するために遺伝子操作した。実施例5に記載の酵母-コドン最適化DNAコード配列CYP-COR_89405を、URA3選択マーカーを有する低コピー数プラスミド内にクローニングし、TDH3プロモーターにより発現させた。このプラスミドで、染色体内に組込まれたシトクロムP450レダクターゼ（PTEF1-ATR1またはPTEF1-PsCPRv2）の発現カセットならびに3つのメチルトランスフェラーゼ（ケシのノルコクラウリン-6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ、および3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ,すべてPTEF1により発現）を有する酵母株を形質転換した。このプラスミドを有する酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Ura）を含む合成完全培地中で培養した。酵母株にラセミ体のノルラウダノソリンを供給し、BIA代謝産物を、72時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。キラルのキャラクタリゼーションのため、5 mLの酵母培養液をペレット化して120 mgのXAD-4樹脂を4 mLの上清みに添加し、回転装置上で室温にて一晩インキュベートし、0.5 mLのメタノールで溶出させることにより、レチクリンを酵母培地から濃縮した。この濃縮物を逆相HPLC（Pursuit XRs-C18, 5μm, 50 mm×10 mm）により、定組成の0.1％ギ酸含有15％メタノールを用いて6.5分間にわたり、5 mL/分の流速および40〜50μLのインジェクション容量で分画した。ピークに基づいておよそ4.5分の画分を収集した。画分をプールし、凍結乾燥させ、0.5 mLのイソプロパノール中に再懸濁させた。濃度に応じて、0.5〜5μLをキラルカラム（Phenomenex Luxセルロース-1, 3μm, 150 mm×2 mm）上にインジェクションし、定組成の72％のN-ヘキサン,28％のイソプロパノール,0.1％のジエチルアミンを用いて0.3 mL/分の流速で分離し、MSおよび250 nm UVにより検出した。MS検出は、Agilent 6320 Ion Trap質量分析計を用いて、ESI源ガス温度350℃、ガス流10 L/分、ネブライザー圧力40 PSIおよび単離は幅1.0にてm/z 330.1で行なった。レチクリンピークの保持時間を、基準の(S)-レチクリン標準および(R)-レチクリン標準のものと比較した。この解析により、CYP-COR プラスミドを含む遺伝子操作された酵母細胞はラセミ体のノルラウダノソリンを(R)-レチクリンに変換できるが、空のプラスミドを有する遺伝子操作された酵母細胞は排他的に(S)-レチクリンを生成することが示された（図15）。
実施例8:微生物宿主内で発現させた場合のプロセッシングおよび活性を改善するためのサルタリジンシンターゼのプロテインエンジニアリング
異種タンパク質は、組換え宿主において発現させた場合、不正確にプロセッシングされる場合があり得る（例えば、微生物の生産宿主内でのシトクロムP450酵素などの植物タンパク質の発現）。例えば、(R)-レチクリンをサルタリジンに変換するサルタリジンシンターゼは、酵母内で異種発現させた場合、N-結合型グリコシル化を受ける（図16Aおよび図16B）。サルタリジンシンターゼで観察されるN-結合型グリコシル化パターンは、該酵素が植物内で発現される場合は観察されず、生成中のSalSyn転写物の不正確なN-末端選別を示し、これにより異種微生物宿主内での該酵素の活性が低下する。したがって、生成中の転写物のN-末端選別の修正に指向されるプロテインエンジニアリングおよびそれによるN-結合型グリコシル化パターンの除去によって、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の改善がもたらされるであろう。
例えば、ケイランチフォリンシンターゼ（CFS）のN-末端α-ヘリックスをサルタリジンシンターゼのN-末端α-ヘリックス（SalSyn,図17）の代わりに使用した。この融合体の接合点は、CFSおよびSalSynの二次構造モチーフに基づいて、またはCFSおよびSalSynのアミノ酸アラインメントに基づいて選択した。融合体を、CFSのN-末端断片とSalSynのC-末端断片を他方の断片と15〜40個のヌクレオチドがオーバーラップするように増幅させることによってクローニングし、次いで、お互いおよびベクター骨格とギブソンアセンブリによってアセンブリングし、完全融合オープンリーディングフレームを形成した（Gibson, et al. 2009. Nat Methods. 6: 343-5）。
別の例として、サルタリジンシンターゼのシトクロムP450ドメインのコード配列を、他の安定的発現シトクロムP450、例えばBM3酵素のP450コード領域内に直接配置した。例えば、サルタリジンシンターゼの保存されたシトクロムP450ドメインおよび巨大菌P450モノオキシゲナーゼCYP102A1（BM3,（Michener and Smolke. 2012. Metab. Eng. 14: 306-16））の遺伝子操作された変異体のシトクロムP450ドメインがNCBI保存ドメイン検索によって同定された。プライマーを、BM3の最初の数個のアミノ酸のコード配列がサルタリジンシンターゼのP450ドメインのコード配列に融合し、その後にP450ドメインのC-末端側のBM3ドメインのコード配列が続くように設計した。先のとおり、この構築物をギブソンアセンブリによってアセンブリングした。
遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体をウエスタンブロット解析によって解析し、酵母内での完全長発現およびN-結合型グリコシル化パターンの修飾または消失を確認した（図16Aおよび図16B）。サルタリジンシンターゼ酵素およびタンパク質融合体のC-末端をヒトインフルエンザ血球凝集素（HA）エピトープでタグ化し、酵母発現および植物発現に適切な発現プラスミド内にクローニングした。酵母では、酵素コード配列を、URA3選択マーカーを有する低コピー数酵母/大腸菌シャトルベクター内にクローニングし、TDH3プロモーターにより発現させた。植物では、配列を、カナマイシン耐性ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）浸潤による植物での一過性発現のためのササゲモザイクウイルスRNA-2由来フランキング5'および3'-非翻訳領域を有するカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターを有する大腸菌/アグロバクテリウム・ツメファシエンスシャトルベクター内にクローニングした。サルタリジンシンターゼを発現するように遺伝子操作された酵母は、N-結合型グリコシル化を示すバンド形成パターンを示した。本発明者らは、このパターンが、グリコシル化部位で部位特異的変異誘発が起こることによるN-結合型グリコシル化によるものであることを確認した。対照的に、この酵素の植物発現では、図16Aに見られるように、N-結合型グリコシル化を示すバンド形成パターンはもたらされなかった。N-結合型グリコシル化部位は非修飾であったが、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体は、酵母内で発現させた場合、図16Bに見られるように、N-グリコシル化されなかった。ウエスタンブロットにより、本発明者らは、酵母発現融合酵素が、植物発現親酵素で観察される発現と同様に単一のバンドとして存在することを示し、これは、N-結合型グリコシル化をもたらす酵母内での生成中のタンパク質のミスプロセッシングが該遺伝子操作された融合体によって修復されたことを示す。
遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体を、酵母内で異種発現させた場合の酵素活性の改善について解析した。サルタラジンシン（salutaradine）シンターゼおよび遺伝子操作された融合体のコード配列を、URA3選択マーカーを有する低コピー数プラスミド内にクローニングし、TDH3プロモーターにより発現させた。酵母は、TRP1遺伝子座に組込まれたPTEF1-PsCPRv2を有し、URA3選択マーカーおよびサルタリジンシンターゼコード配列をTDH3プロモーターとともに有する単一の低コピー数プラスミドを含む。酵母を新鮮形質転換コロニーから1 mLの選択培地（-Ura）中で一晩培養し、10∝M(R)-レチクリン（Toronto Research Chemicals）を有する96ウェルプレート内の0.5 mLの選択培地中で1:20に戻し希釈した。振盪インキュベータ内で72〜96時間後、酵母をペレット化し、培地の上清みをLC-MS/MSによって解析した。この解析により、遺伝子操作されたサルタラジンシンシンターゼ酵素は、酵母内で異種発現させた場合、野生型配列のものと比べて活性の改善を示すことが示された（図18）。
図18は、本発明の態様による、酵母における活性を改善する、サルタリジンシンターゼのコドン最適化および遺伝子操作された融合体を示す。図18に見られるように、黒のバーは、サルタリジンシンターゼPsCYP719B1天然の野生型配列を示す。黒の輪郭を有するグレーのバーは、ケシ由来の酵母用にコドン最適化した変異体およびハカマオニゲシ由来の新たに同定された配列である。斜線パターンを有するバーは、ハカマオニゲシ配列ベースの最も改善された遺伝子操作された融合体を示す。エラーバーは、少なくとも2回の生物学的反復の範囲を示す。ハカマオニゲシ、ケシもしくはアツミゲシ（または関連植物）由来のサルタリジンシンターゼの天然、合成のコドン最適化型および/またはプロテインエンジニアリング型の変異体がこのような遺伝子操作された株において使用され得る。
遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼタンパク質融合体は、下流のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の生成を増大させるための生合成経路の状況において使用され得る。一例において、酵母を、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ融合体、ハカマオニゲシのサルタリジンレダクターゼおよびケシのサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼをコードしている酵母用にコドン最適化した遺伝子を異種発現するように遺伝子操作されたした。3つの発現カセット（PTDH3-D94yPsSS, PTPI1-yPbSalR, PTEF1-yPsSalAT）を、TRP1セクション（section）マーカーを有する酵母人工染色体（YAC）内にアセンブリングした。このYACを、染色体内に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット（PTEF1-ATR1またはPTEF1-yPsCPRv2）を有する酵母内に入れた。酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Trp）を含む合成完全培地中で培養し、(R)-レチクリンを供給した。BIA代謝産物を、96時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。この解析は、図19の（A）に示すように、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ酵素および他の経路の酵素を有するように遺伝子操作された酵母株ではモルフィナンアルカロイドのテバインが生成することを示す。
したがって、図19は、（A）本発明の態様による、遺伝子操作された酵母が(R)-レチクリンのテバインへの変換を触媒する小規模バッチ式発酵のLC/MS-MS解析を示す。図19の（A）に示すように、酵母株は、TRP1遺伝子座に組込まれたPTEF1-ATR1発現カセットを有し、かつTRP1選択マーカーを有する単一の酵母人工染色体 ならびに3つの発現カセット:PTDH3- yEcCFS1-83-yPsSS95-505、PTPI1-yPbSalR、およびPTEF1-yPsSalATを含むように遺伝子操作される。酵母を新鮮形質転換コロニーから3 mLの選択培地中で一晩培養し、100μM(R)-レチクリン（Toronto Research Chemicals）を有する培養チューブ内の0.5 mLの選択培地（-Trp）中で1:20に戻し希釈した。振盪インキュベータ内で72時間後、酵母をペレット化し、培地の上清みをLC-MS/MSによって解析した。クロマトグラム図は、この株によって生成されたテバインならびに蓄積されたサルタリジノールおよびサルタリジンを標準とともに示す。これらの図は2つの試料のうちの代表的なものである。
実施例9:異種微生物宿主によるモルフィナン生成物の生成を改善するための下流のモルフィナン分岐の酵素のプロテインエンジニアリング
本発明の一態様では、経路内酵素が、関心対象のBIAの生成を増大させるための活性の増大を示すように遺伝子操作される。この例では、変異を、特定の経路内酵素のオープンリーディングフレーム内に、Mutazyme IIでの増幅によって導入した（表11参照）。遺伝子1つあたり1〜4つのヌクレオチド置換の変異率となるように充分な鋳型DNAを増幅反応に含めた。変異誘発ライブラリーをpYES1Lベクター内に、酵母内での直接ギャップ修復によってクローニングした。いくつかの場合では、ライブラリー発現のために選択した酵母株に、変異誘発酵素の基質を生じる遺伝子コピーの組込みを含めた。例えば、CODM変異体のライブラリーで、T6ODMおよびCOR1.3のコピーが組込まれた株を形質転換し、培養培地中にテバインを供給した。このような株内でのT6ODMおよびCOR1.3の発現により、コデインおよびネオピンが導入された各CODM変異体の基質として利用可能になることが保証された。個々のコロニーを96ウェルプレート内に播種し、96時間培養し、次いで、その生成物の生成について液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によってアッセイした。CODMライブラリーの例では、スクリーニング対象の生成物はモルヒネとネオモルヒネであった。各スクリーニングでは、BIA生成の向上を有する変異体をシーケンシングし、確証のために再クローニングした。表11は、スクリーニングによって同定された、酵母においてBIA生成の増大をもたらした変異型酵素変異体の要約を含む。
図20は、このような変異型のうちの1つの確証された活性の向上のデータを示す。特に、図20は、本発明の態様による、ランダム変異誘発およびスクリーニングによる、酵母において向上した活性を示すCODM酵素変異体の作出を示す。CODM変異体のライブラリーは、エラープローンPCRによってコード領域に変異誘発することにより作成した。このライブラリーのスクリーニングによって同定された変異体CODMN35S,G335Vを再クローニングし、組込まれたT6ODMおよびCOR1.3のコピーを有する酵母株内で発現させた。この株および野生型CODMを発現する別の対照株を、1 mMのテバインを含む液体培地中で培養した。96時間後、培養培地をCODM活性についてLC-MSによって解析した。変異体CODMN35S,G335Vでは野生型CODM発現株より1.4倍多いモルヒネおよび2.6倍多いネオモルヒネが生成した。
実施例10:異種微生物宿主によるベンジルイソキノリンアルカロイド生成を改善するための発現および増殖条件の最適化
遺伝子操作された微生物宿主によるベンジルイソキノリンアルカロイド生成は、経路内酵素の発現と増殖条件を最適化することにより、さらに改善することができる。一例では、酵母内でのサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼの発現を、一連の異なるプロモーターにより該酵素を発現させることにより改変した。酵母を、ケシのサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼをコードしている、酵母用にコドン最適化した遺伝子が異なるプロモーター（図21Aに示したとおり）により異種発現するように遺伝子操作されたした。2つの発現カセット（PTPI1-yPbSalR, PX-yPsSalAT）を、TRP1セクションマーカーを有する酵母人工染色体（YAC）内にアセンブリングした。このYACを酵母内に入れ、細胞を、専用のドロップアウト溶液（-Trp）を含む合成完全培地中で培養し、サルタリジンを供給した。BIA代謝産物を、72時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。経路内酵素発現レベルの最適化により、モルフィナンアルカロイドのテバインの生成の増大をもたらすことができる（図21Aに示したとおり）。
株の培養条件、例えば非限定的に、糖の供給源、培養温度およびpHの最適化が、遺伝子操作された酵母株によるベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を増大させるために使用され得る（図21Bおよび図21Cに示したとおり）。一例では、遺伝子操作された酵母株によるテバイン生成を増大させるためにpHを変更した。2つの発現カセット（PTPI1-yPbSalR, PTEF1-yPsSalAT）を、TRP1セクションマーカーを有する酵母人工染色体（YAC）内にアセンブリングした。このYACを酵母内に入れ、細胞を、専用のドロップアウト溶液（-Trp）を含む合成完全培地中で培養し、pH 5.7〜9のバッファー中に再懸濁させ、サルタリジンを供給した。BIA代謝産物を、16時間のインキュベーション後にLC-MS/MS解析によって解析した。4環式のプロモルフィナンアルカロイドのサルタリジノールおよび5環式のモルフィナンアルカロイドのテバインのレベルは、pH上昇の関数として上昇した（図21の（B）に示したとおり）。
別の例では、遺伝子操作された酵母株によるテバイン生成を増大させるために温度、糖および培地のバッファー含有量を変更した。3つの発現カセット（PTDH3-D94yPsSS, PTPI1-yPbSalR, PTEF1-yPsSalAT）を、TRP1セクションマーカーを有する酵母人工染色体（YAC）内にアセンブリングした。このYACを、染色体内に組込まれたシトクロムP450レダクターゼの発現カセット（PTEF1-ATR1またはPTEF1-yPsCPRv2）を有する酵母内に入れた。酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Trp）を含む合成完全培地中で培養し、(R)-レチクリンを供給した。BIA代謝産物を、72時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。この解析は、モルフィナンアルカロイドのテバインの微生物による生成が、ある特定の培養条件下（デキストロースを含む30℃の緩衝培地、図21Cに示したとおり）で増大することを示す。
したがって、図21A、図21Bおよび図21Cは、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母による(R)-レチクリンのテバインへの変換のための発酵の最適化を示す。（A）SalATプロモーター変異体、（B）異なるpH条件下で培養したSalRおよびSalAT株、ならびに（C）糖の供給源、培養温度および培地のバッファー含有量の最適化の全細胞緩衝アッセイのLC/MS-MS解析。（A）TRP1選択マーカーならびに2つの発現カセット:PTPI1-yPbSalRとPX-yPsSalATをいろいろなSalATプロモーターとともに有する単一の酵母人工染色体を含むように遺伝子操作されたした酵母株。酵母を新鮮形質転換コロニーから3 mLの選択培地中で一晩培養し、100μMのサルタリジン（Specs）を含む培養チューブ内の0.5 mLの培地中で1:20に戻し希釈した。振盪インキュベータ内で72時間後、酵母をペレット化し、培地の上清みをLC-MS/MSによって解析した。（B）TRP1選択マーカーならびに2つの発現カセット:PTPI1-yPbSalRとPTEF1-yPsSalATを有する単一の酵母人工染色体を含むように遺伝子操作されたした酵母株。酵母を新鮮形質転換コロニーから3 mLの選択培地中で一晩培養し、3.5 mLの培地中でOD 0.8まで戻し希釈し、7時間培養し、ペレット化し、次いで、pH 5.7のMOPS、またはpH 7、8もしくは9のTrisバッファー（10μMのサルタリジン（Specs）を含む）中に再懸濁させた。スピナー上で30℃にて16時間後、酵母をペレット化し、バッファーの上清みをLC-MS/MSによって解析した。エラーバーは2つの試料の範囲を示す。（C）糖の供給源、培養温度および培地のバッファー含有量の最適化。この実験では、酵母株を、TRP1遺伝子座に組込まれたPTEF1-ATR1を有し、かつTRP1選択マーカーならびに3つの発現カセット:PTDH3- yEcCFS1-83-yPsSS95-505, PTPI1-yPbSalRおよびPTEF1-yPsSalATを有する単一の酵母人工染色体を含むように遺伝子操作されたする。酵母を新鮮形質転換コロニーから3 mLの選択培地中で一晩培養し、100μM(R)-レチクリン（Toronto Research Chemicals）を含む培養チューブ内の0.5 mLの培地中で1:20に戻し希釈した。振盪インキュベータ内で72時間後、酵母をペレット化し、培地の上清みをLC-MS/MSによって解析した。
実施例11:初期段階の1-ベンジルイソキノリンアルカロイド骨格からのテバインの生成のために遺伝子操作された酵母
酵母株は、初期段階の1-ベンジルイソキノリンアルカロイドからのモルフィナンアルカロイドのテバインまたはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、遺伝子操作された酵母株はモルフィナンアルカロイド生成物を、ラセミ体もしくは(S)-ノルコクラウリンまたはラセミ体もしくは(S)-ノルラウダノソリンから生成し得る（図5、6および7ならびに23の（B））。酵母株は、酵母ゲノム内への3つまたは5つの発現カセットの組込みにより、(S)-ノルコクラウリンまたはラセミ体もしくは(S)-ノルラウダノソリンから(S)-レチクリンを生成するように遺伝子操作される。ラセミ体または(S)-ノルラウダノソリンから(S)-レチクリンを生成するためには、組込む発現カセットに、ケシのノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（Ps6OMT, EC 2.1.1.128）、4'-O-メチルトランスフェラーゼ（Ps4'OMT, EC 2.1.1.116）、およびコクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ（CNMT, EC 2.1.1.140）をコードさせ、各々にTEF1プロモーターを含める（Hawkins and Smolke. 2008. Nat. Chem. Biol. 4: 564-73）。ラセミ体または(S)-ノルコクラウリンから(S)-レチクリンを生成するためには、該株に、酵母用にコドン最適化したハナビシソウのN-メチルコクラウリン3'-ヒドロキシラーゼ（yEcCYP80B1, EC 1.14.13.71）およびTDH3またはTEF1プロモーターにより発現されるATR1またはyPsCPRv2シトクロムP450レダクターゼ（CPR, EC 1.6.2.4）の発現カセットの組込みをさらに含める。このような株は、ラセミ体もしくは(S)-ノルコクラウリンまたはラセミ体もしくは(S)-ノルラウダノソリンをモルフィナンアルカロイドのテバインまたはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドに変換するためのエピマー化触媒酵素（例えば、CYP-COR）、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼおよびサルタリジノールアセチルトランスフェラーゼを組込むためにさらに遺伝子操作される（図7）。エピマー化触媒酵素の発現の代替法として、6OMT、4'OMT、CNMTおよび/またはCYP80B1を、rac-レチクリンがrac-ノルコクラウリンまたはrac-ノルラウダノソリンから生成するように遺伝子操作してもよい。
一例では、酵母株を、rac-ノルラウダノソリンがテバインに変換されるように遺伝子操作されたした。この酵母株は、Ps6OMT、Ps4'OMT、CNMTおよびyPsCPRv2をコードしている発現カセット（各々にTEF1プロモーターを含める）の組込みを有する。4つの発現カセット（PTDH3-yEcCFS1-83-yPsSS95-505, PTPI1-yPbSalR, PTEF1-yPsSalAT, PHXT7- CYP-COR_89405）を、この株のTRP1選択マーカーを有する酵母人工染色体（YAC）内にアセンブリングした。このYACおよび組込まれたカセットを有する酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Trp）および1 mMのrac-ノルラウダノソリン基質を含む合成完全培地中で培養した。96時間の培養後、培地をBIA代謝産物についてLC-MS/MS解析によって解析した。ほぼ200 nMのテバインが検出された（図19の（B））。他の遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ変異体もまた、この株において使用され得る（図18、実施例8）。
実施例12:L-チロシンからのレチクリンの生成のために遺伝子操作されたプラットフォーム酵母株
BIAのカギとなる分岐点中間体(S)-レチクリンをL-チロシンから生成するプラットフォーム酵母株を構築した（図5）。具体的には、4種類の多遺伝子発現構築物を酵母株のゲノム内に組込んだ。この4つの構築物の組成を図22に示す。各構築物は、強力な構成的プロモーターにより発現される4つまたは5つの遺伝子で構成されている。遺伝子は各遺伝子座に、模式図上部のアノテーションに明記したとおりのプロモーター、遺伝子のオープンリーディングフレームおよびターミネーターを含む完全発現カセットとして位置している。模式図には、所与の遺伝子を表す矢印の方向によって各発現カセットの向きを示している。選択マーカーをアノテーションにおいてイタリック体で示し、模式図においてグレーの矢印で示す。各選択マーカーは、遺伝子座からの該マーカーの除去を可能にするloxP部位にフランキングされている。さらに、各構築物は、該マーカーがCreレコンビナーゼによって除去され得るようにloxP部位にフランキングされた選択マーカーを有する。
第1の組込み構築物には、ドブネズミ由来の4つの異種遺伝子をYBR197C遺伝子座内にG418選択マーカー（KanMX）と一緒に組込む。RnPTPS、RnSepR、RnPCDおよびRnQDHPRが、酵母の内因性葉酸誘導体（folate）合成経路によるテトラヒドロビオプテリン（BH4）の合成および再生に必要とされる。各遺伝子を酵母内での発現のためにコドン最適化する。
第2の組込み構築物には、4つの異種遺伝子をHIS3遺伝子座内にHIS5選択マーカーと一緒に組込む。ドブネズミのチロシンヒドロキシラーゼ（RnTyrH）はチロシンをL-DOPAに、先の組込み構築物によって生成される共基質BH4を用いて変換する。RnTyrH遺伝子は、野生型または活性の向上を付与する改善された変異型（例えば、W166Y、R37EおよびR38E、実施例1）の任意のものであり得る。第2のドブネズミ遺伝子RnDHFRは、ジヒドロビオプテリン（BH4の酸化生成物）をBH4に還元する酵素をコードしており、このようにして、この共基質の利用能が高まる。また、第3の構築物には、L-DOPAをドパミンに変換する酵素であるシュードモナス・プチダ由来のPpDODCを含める。第4の酵素はオウレン由来のCjNCSであり、これは4-HPAとドパミンを縮合させてノルコクラウリンを作製する。各遺伝子を酵母内での発現のためにコドン最適化する。
第3の組込み構築物には、植物由来の5つの異種遺伝子とLEU2選択マーカーを遺伝子座YDR514C内に組込む。Ps6OMT、Ps4'OMTおよびPsCNMTはケシ由来のメチルトランスフェラーゼであり、天然植物ヌクレオチド配列として発現される。第4のケシ遺伝子yPsCPRv2は、酵母用にコドン最適化され、ハナビシソウ由来のシトクロムP450、EcCYP80A1の活性を補助するレダクターゼをコードしている。EcCYP80A1は、その植物ヌクレオチド配列として発現される。この構築物にコードされた酵素は、先の組込み構築物によって生成されたノルコクラウリンからレチクリンを生成するための2つのO-メチル化、N-メチル化およびヒドロキシル化を行なう。
最後の組込み構築物には、さらなるコピーの出芽酵母内因性遺伝子ARO4 Q166K、ARO7 T226I、TKL1およびARO10をARO4遺伝子座内にハイグロマイシン耐性選択マーカーと一緒に組込む。ARO4 Q166KおよびARO7 T226Iは、各々が野生型配列と比べて単一塩基対置換をコードしているARO4およびARO10のフィードバック耐性変異型である。TKL1およびARO10は天然酵母遺伝子と同一であるが、強力なプロモーターの後ろ（behind）で発現される。Aro4pおよびAro7pは、チロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成における酵素である。このような酵素からフィードバック阻害を取り除くと内因性チロシン生合成の上方調節がもたらされる。Tkl1pの過剰発現により、チロシンの前駆体であるエリトロース4-リン酸（E4P）の供給の向上をもたらすペントースリン酸経路が上方調節される。Aro10pの過剰発現により4-HPAの生成が増大する。
プラットフォーム酵母株は、この4つの発現カセットのうちの任意の数を有するように構築され得る。具体的には、プラットフォーム酵母株を、組込み構築物1〜4および組込み構築物1〜3を有するように構築した。チロシン過剰生成構築物（構築物4）を除いた後者の株では、レチクリンの生合成を補助するために、さらなるチロシンが培養培地中に供給され得る。下流のBIAの生成およびBIA生合成へのフラックスの増大を補助するためのさらなる遺伝子修飾をプラットフォーム株に組込んでもよい。
酵母株を、専用のアミノ酸ドロップアウト溶液を含む合成完全培地中で25℃および30℃にて培養した。培地の上清み中のBIA代謝産物を、48時間および96時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。
実施例13:L-チロシンからのテバインおよび他のモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作されたした酵母
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからのモルフィナンアルカロイドのテバインまたはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例12に記載のプラットフォーム酵母株は、L-チロシンからモルフィナンアルカロイド生成物が生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図7）。
L-チロシンから(S)-レチクリンを生成するプラットフォーム酵母株（実施例12の説明参照）を、生合成された(S)-レチクリンをモルフィナンアルカロイドのテバインまたはテバインに由来するモルフィナンアルカロイドに変換するためのエピマー化触媒酵素、例えば新たに同定されたCYP-COR、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼおよびサルタリジノールアセチルトランスフェラーゼが組込まれるようにさらに遺伝子操作した（図7）。3つの発現カセット（PTDH3-yEcCFS1-26-yPbSS33-504, PTPI1-yPbSalR, PTEF1-yPsSalAT）を、プラットフォーム酵母株内に直接TRP1選択マーカーを有する酵母人工染色体（YAC）内にアセンブリングした。また、他の遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ変異体をYAC内に組込んでもよい。（図18、実施例8）。また、得られた酵母株を、URA3選択マーカー、TDH3プロモーターおよびCYP-CORコード配列を有する低コピー数CEN/ARSプラスミドで形質転換した。
YAC、低コピー数プラスミドおよび組込みカセットを有する酵母株を、専用のドロップアウト溶液（-Ura-Trp）を含む合成完全培地中で25℃および30℃にて培養した。96時間の培養後、培地をBIA代謝産物についてLC-MS/MS解析によって解析した。BIA生成を改善するために、温度、炭素源、pH条件および培地組成に関するさらなる培養最適化を行なった。
テバインに由来するモルフィナンアルカロイドを生成するためのさらなる遺伝子修飾を酵母株に導入してもよい（図7）。一例では、発現カセットPADH1-T6ODM-TADH1, PHXT7-COR-TPGK1およびPTEF1-CODM-TCYC1を直接アセンブリングし、テバイン生成酵母株のtrp1遺伝子座内に組込んだ（Thodey et al., 2014）。別の例では、このような酵母株は、さらなるモルヒネアルカロイドが生成されるように、発現カセットPGPD-morA-TCYC1, PPGK1-morB-TPHO5を直接アセンブリングし、この構築物を染色体上のura3遺伝子座内に組込むことにより、さらに遺伝子操作され得る（Thodey et al., 2014）。
実施例14:オピオイド分子のO-脱メチル化
脱メチル化反応のハイスループットスクリーニングのため、purpaldアッセイを使用した。例えば、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される脱メチル化により、ホルムアルデヒドが、一般化学反応式:［基質］＋2-オキソグルタレート＋O2［生成物］＋ホルムアルデヒド＋スクシネート＋CO2に示す生成物として生成する。アルカリ性条件でのpurpald試薬はホルムアルデヒドの存在下で色変化を生じ、これが、1 nMという低濃度まで分光測光器で510 nmにて定量され得る。
ノル-オピオイド化合物の生成における重要な工程はオキシコドンなどの分子のO-脱メチル化である（図23参照）。この工程を行なうことができる酵素を同定するため、表3の配列を、出芽酵母内での発現用のコドン最適化に供し、合成遺伝子として注文した（Integrated DNA Technologies製）。コドン最適化配列を、いろいろな強度のプロモーター配列を有する図28に示す発現ベクターpA24、pA25またはpA26（あるいは同様のベクター）内に、Cen.PK2酵母宿主株におけるギャップ修復により標準的な分子生物学的手順に従ってクローニングした。個々のコロニーを単離し、PCRおよびシーケンシング（ELIM biopharmaceuticals）によって確証した。
図28は、本発明の態様による、酵素発現および遺伝子操作のためのプラスミド/YACベクターを示す。候補酵素および遺伝子操作された酵素を、出芽酵母株内での発現のためのこれらのベクター内にクローニングした。pA24、pA25およびpA26の配列の例を表7に示す。
推定O-デメチラーゼ酵素を発現している株を次いで、図23に列記した種々の基質に対する活性の基底レベルについて試験した。活性を検出するため、細胞培養物を、選択培地（上記のとおり）中で培養し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させ、基質とともに、レドックス分子および他の補因子（例えば、酵素の必要条件に応じていろいろな濃度のNADH、NADPHおよび鉄）の存在下でインキュベートした。次いで、基質（例えば非限定的に、図23に示したもの）のO-脱メチル化を、実験試料および対照試料のLC-MSによる解析（例えば、オキシコドンおよびオキシモルホンの定量された量など）によって検出した。
改善されたO-脱メチル化活性を有する遺伝子操作された酵素を同定するため、表3に列記した酵素をコードしている配列をランダム変異誘発に供し、次いで、ハイスループット比色アッセイによってスクリーニングした。最初のライブラリーを、Mutazyme II（Agilent Technologies）を用いたエラープローンPCRによって作成し、変異体をpA24（または同様の）ベクター内に、Cen.PK2スクリーニング用宿主におけるギャップ修復によってクローニングした。遺伝子シャッフリングまたは他の方法によって導入した個々の変異または変異の組合せのいずれかを有する変異型酵素を発現している株を、96ウェルプレート形式の選択培地中でいろいろな発酵条件（例えば、異なる培地成分、pHおよび温度）下で培養し、ペレット化し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。ライセートを基質（図23に列記）とともにインキュベートし、purpaldアッセイにおいてホルムアルデヒド生成についてアッセイした。改善されたO-脱メチル化活性を有する酵素を、培養培地中におけるO-脱メチル化生成物（例えば、オキシモルホン）の形成をLC-MSによって直接測定することにより確証した。
実施例15:オピオイド分子のN-脱メチル化
N-デメチラーゼ活性によってオピオイド基質分子（例えば、オキシモルホン）内に存在するN-メチル基が除去され、ナル-オピオイドの最終的な生合成の重要な中間体であるノル-オピオイド化合物（例えば、ノルオキシモルホン）が生成する。この工程を行なうことができる酵素を同定するため、表4の配列を、出芽酵母内での発現用のコドン最適化に供し、合成遺伝子として注文した（Integrated DNA Technologies製）。コドン最適化配列を、いろいろな強度のプロモーター配列を有する図28に示す発現ベクターpA24、pA25またはpA26（あるいは同様のベクター）内に、Cen.PK2酵母宿主株におけるギャップ修復により標準的な分子生物学的手順に従ってクローニングした。個々のコロニーを単離し、PCRおよびシーケンシング（ELIM biopharmaceuticals）によって確証した。
推定O-デメチラーゼ酵素を発現している株を次いで、図24に列記した種々の基質に対する活性の基底レベルについて試験した。活性を検出するため、細胞培養物を、選択培地（上記のとおり）中で培養し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させ、基質とともに、レドックス分子および他の補因子（例えば、NADH、NADPHおよび鉄）の存在下でインキュベートした。次いで、基質のN-脱メチル化を実験試料および対照試料のLC-MSによる解析によって検出した。
改善されたN-脱メチル化活性を有する遺伝子操作された酵素を同定するため、表4に列記した酵素をコードしている配列をランダム変異誘発に供し、次いで、ハイスループット比色アッセイによってスクリーニングした。最初のライブラリーを、Mutazyme II（Agilent Technologies）を用いたエラープローンPCRによって作成し、変異体をpA24（または同様の）ベクター内に、Cen.PK2スクリーニング用宿主におけるギャップ修復によってクローニングした。遺伝子シャッフリングまたは他の方法によって導入した個々の変異または変異の組合せのいずれかを有する変異型酵素を発現している株を、96ウェルプレート形式の選択培地中でいろいろな発酵条件（例えば、異なる培地成分、pHおよび温度）下で培養し、ペレット化し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。ライセートを基質（図24に列記）とともにインキュベートし、purpaldアッセイにおいてホルムアルデヒド生成についてアッセイした。改善されたN-脱メチル化活性を有する酵素を、培養培地中におけるN-脱メチル化生成物（例えば、ノルオキシモルホン）の形成をLC-MSによって直接測定することにより確証した。
実施例16:ナル-オピオイドを生成するためのノル-オピオイド化合物の修飾
ノル-オピオイド分子は、オピオイド中毒およびオピオイド関連副作用に対処するための重要な類型の薬物療法薬であるナル-オピオイド（図25参照）を生成するために、露出している窒素が修飾され得る。ノル-オピオイド分子を修飾できる酵素を同定するため、表5の配列を、出芽酵母内での発現用のコドン最適化に供し、合成遺伝子として注文した（Integrated DNA Technologies製）。コドン最適化配列を、いろいろな強度のプロモーター配列を有する図28に示す発現ベクターpA24、pA25またはpA26（あるいは同様のベクター）内に、Cen.PK2酵母宿主株におけるギャップ修復により標準的な分子生物学的手順に従ってクローニングした。個々のコロニーを単離し、PCRおよびシーケンシング（ELIM biopharmaceuticals）によって確証した。
推定修飾性酵素を発現している株を次いで、図25に列記した種々の基質に対する活性の基底レベルについて試験した。活性を検出するため、細胞培養物を、選択培地（上記のとおり）中で培養し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させ、基質とともに、レドックス分子および他の補因子（例えば、NADH、NADPHおよび鉄）の存在下でインキュベートした。基質のN-メチル化を、S-アデノシルメチオニン（SAM）を共基質として用いて試験し、次いで、酵素のさらなる修飾活性を、SAMアナログ（図25の「共基質」参照）を用いて試験した。BIA基質の修飾を実験試料および対照試料のLC-MSによって検出した。
改善されたBIA修飾活性を有する遺伝子操作された酵素を同定するため、表5に列記した酵素をコードしている配列をランダム変異誘発に供し、次いで、ハイスループット比色アッセイによってスクリーニングした。最初のライブラリーを、Mutazyme II（Agilent Technologies）を用いたエラープローンPCRによって作成し、変異体をpA24（または同様の）ベクター内に、Cen.PK2スクリーニング用宿主におけるギャップ修復によってクローニングした。遺伝子シャッフリングまたは他の方法によって導入した個々の変異または変異の組合せのいずれかを有する変異型酵素を発現している株を、96ウェルプレート形式の選択培地中でいろいろな発酵条件（例えば、異なる培地成分、pHおよび温度）下で培養し、ペレット化し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。ハイスループットスクリーニングにおいてN-メチル化活性を検出するため、ライセートを基質（例えば、ノルオキシモルホン）とともに、脱メチル化活性を有するBM3変異体の存在下でインキュベートし、purpaldアッセイにおいて（メチル化の間接的測定のため）ホルムアルデヒド生成についてアッセイした。この場合、ホルムアルデヒドの形成は、関心対象の酵素によってN-メチル化されている基質に対するBM3の活性によってのみ起こり得る。改善された修飾活性を有する酵素を、細胞ライセートにおける活性について種々のSAMアナログを共基質として用いて（図25参照）さらに試験し、生成物の形成をLC-MSによって直接測定することにより確証した。最良の変異体酵素を、基質分子のナル-オピオイド化合物への効率的な生物変換反応のために選択した。
実施例17:オピオイド分子に対するBM3酵素のデメチラーゼ活性
BM3は、その天然宿主内での脂肪酸への一酸素添加に関与している巨大菌シトクロムP450である。また、これは酵母および細菌内で、活性な異種酵素として容易に発現される。BM3は、生合成酵素としてのいくつかの利点、例えば、可溶性であること、融合レダクターゼパートナータンパク質が付随していること、および新たな基質を受容するように容易に遺伝子操作され得ることを有する。いくつかの公知のBM3変異体は、剛直なモルフィナンの五環式構造が活性部位に到達することを可能にする特定のアラニン置換を有する。このような変異体を酵母内で発現させるとテバインのノルテバインへのN-脱メチル化が観察された。
具体的には、BM3変異体4H9、7A1および8F11（表6に列記）を個々の酵母株（CEN.PK2）のゲノム内に組込み、100μMのテバインを含むクエン酸-リン酸バッファー（pH 5.0、6.0、7.0）およびTris-HClバッファー（pH 7.5、8.0、8.5）中で20時間インキュベートした。BM3オープンリーディングフレームを除いたこと以外は同一の遺伝子構築物を組込み、無酵素対照株を作製した。BM3発現細胞では、7.0より上の試験したすべてのpHレベルでノルテバインが生成した。この酵母株によって生成されたノルテバインを液体クロマトグラフィー質量分析によって定量した。ノルテバインの質量スペクトル（m/z 298）には、脱メチル化窒素と整合するm/z 58のプロダクトイオンがなかった（図27参照）。
図27は、本発明の態様による、BM3変異体の機能性発現を示す。特に、図27は、酵母内でテバインN-デメチラーゼ活性を有するBM3変異体の機能性発現を示す。BM3変異体4H9、7A1および8F11を個々の酵母株（CEN.PK2）のゲノム内に組込み、100μMのテバインを含むクエン酸-リン酸バッファー（pH 5.0、6.0、7.0）およびTris-HClバッファー（pH 7.5、8.0、8.5）中で20時間インキュベートした。BM3オープンリーディングフレームを除いたこと以外は同一の遺伝子構築物を組込み、無酵素対照株を作製した。BM3発現細胞では、7.0より上の試験したすべてのpHレベルでノルテバインが生成した。この酵母株によって生成されたノルテバインを液体クロマトグラフィー質量分析によって定量した。ノルテバインの質量スペクトル（m/z 298）には、脱メチル化窒素と整合するm/z 58のプロダクトイオンがなかった。
実施例18:O-脱メチル化オピオイド分子の生物学的産生
BIA分子（例えば、表2に列記したもの）に対してO-デメチラーゼ活性を示した、実施例14に記載し、表3に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（出芽酵母または大腸菌のいずれか）に組込んだ。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたチロシンが使用される。2分子のチロシンが修飾され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに修飾されて(S)-レチクリンを形成し、次いで、エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、(R)-レチクリンが生じる。(R)-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに修飾された後、酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図26参照）。表2に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
図26は、本発明の態様による、微生物細胞内での生合成スキームを示す。細胞によって内因性に生成された、および/または培養培地中に供給されたチロシンがオキシコドンに変換される（点線の矢印は多酵素工程を表す）。次いで、オキシコドンは、3-O-脱メチル化されてオキシモルホンとなり、N-脱メチル化されてノルオキシモルホンとなる。最後に、N-メチルトランスフェラーゼがSAMアナログからアリル炭素部分およびシクロプロピルメチル炭素部分を受容し、それぞれ、ナロキソンおよびナルトレキソンを生成する。
モルフィナンアルカロイド分子生成（図26参照）株におけるO-デメチラーゼ活性を検出するため、プラスミドベクターまたは染色体組込みカセットのいずれかにより候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ、細胞上清みを収集し、全オピオイドプロフィールを解析した（上記のとおり）。完全なBIA経路を有する株内でのオピオイド分子のO-脱メチル化をLC-MSによって検出した（上記のとおり）。具体的には、オキシコドンのオキシモルホンへの変換を検出した。生物触媒作用によるO-脱メチル化活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートに、オピオイド基質（図23参照）および酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。オピオイド分子のO-脱メチル化をLC-MSによって検出した。
実施例19:N-脱メチル化オピオイド分子の生物学的産生
BIA分子（例えば、表2に列記したもの）に対してN-デメチラーゼ活性を示した、実施例15に記載し、表4に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（出芽酵母または大腸菌のいずれか）に組込んだ。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたチロシンが使用される。2分子のチロシンが修飾され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに修飾されて(S)-レチクリンを形成し、次いで、エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、(R)-レチクリンが生じる。(R)-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに修飾された後、酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図26参照）。表2に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
モルフィナンアルカロイド分子生成（図26参照）株におけるN-デメチラーゼ活性を検出するため、プラスミドベクターまたは染色体組込みカセットのいずれかにより候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ、細胞上清みを収集し、全オピオイドプロフィールを解析した（上記のとおり）。完全なBIA経路を有する株内でのオピオイド分子のN-脱メチル化をLC-MSによって検出した（上記のとおり）。具体的には、オキシモルホンのノルオキシモルホンへの変換を検出した。生物触媒作用によるN-脱メチル化活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートに、オピオイド基質（図24参照）および酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。オピオイド分子のN-脱メチル化をLC-MSによって検出した。
実施例20:ナル-オピオイド化合物の生物学的産生
BIA分子（例えば、表2に列記したもの）に対してN-メチラーゼ活性を示した、実施例16に記載し、表5に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（出芽酵母または大腸菌のいずれか）に組込んだ。図26は、前駆体分子テバインから最終ナル-オピオイド化合物のナロキソンおよびナルトレキソンまでの完全な反応スキームの一例を示す。このような株は、完全なBIA経路によるノル-オピオイド化合物の生成を担う、実施例1および2ならびに表1および2の酵素をさらに発現する。また、N-メチラーゼ酵素を、生合成経路がない微生物株内（例えば、出芽酵母ではCen.PK2または大腸菌ではBL21のいずれか）で発現させ、外来的に供給したいくつかの異なる基質分子の生物触媒作用が可能な株を作製した。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたチロシンが使用される。2分子のチロシンが修飾され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに修飾されて(S)-レチクリンを形成し、次いで、エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、(R)-レチクリンが生じる。(R)-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに修飾された後、酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図26参照）。表2に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
ノル-オピオイドまでの完全なBIA経路（図26参照）を有する株におけるN-修飾活性を検出するため、候補酵素を発現している細胞を発酵（上記のとおり）によって増殖させ、SAMまたはSAMアナログ、例えば図25に列記したものとともにインキュベートした。完全なBIA経路を有する株内におけるノル-オピオイドまたは他のBIA分子の酵素的修飾を、上清み中でLC-MSによって検出した（上記のとおり）。生物触媒作用によるN-修飾活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートに、SAMまたはSAMアナログおよび酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。具体的には、ノルオキシモルホンのナロキソンおよびナルトレキソンへの変換（図25に示すようにSAMアナログであるアリル-SAMまたはシクロプロパン-SAMを使用）を検出した。ノル-オピオイドまたは他のBIA分子の修飾をLC-MSによって検出した。完全なBIA経路を有していない株における生物触媒作用によるN-修飾活性を検出するため、実施例16に記載の酵素を発現しているCen.PK2株を選択培地中で培養し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートに、SAMまたはSAMアナログ、酵素機能に必要な補因子、ならびにノル-オピオイド分子、例えば、図25および表2に列記したものを外来的に供給した。このような化合物の修飾をLC-MSによって検出した。
実施例21:オピオイド分子に対するCODMのO-デメチラーゼ活性
図29は、本発明の態様による、CODMの機能性発現を示す。特に、図29は、オキシコドン3-O-デメチラーゼ活性を有するCODMの酵母内における機能性発現を示す。酵母用にコドン最適化したCODM遺伝子を酵母株W303のゲノム内に組込み、合成完全培地中で16時間培養した。また、親W303株も合成完全培地中で16時間、無酵素対照として培養した。細胞をペレット化し、1 mLのブレイク（breaking）バッファー（100 mMのTris-HCl pH 7.5,10％のグリセロール,14 mMの2-メルカプトエタノール,1×プロテアーゼ阻害薬）で洗浄した。細胞を200μLのブレイクバッファー中に再懸濁させ、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。粗製細胞ライセートを10 mMのアスコルビン酸、0.5 mMの硫酸鉄（II）、基質として0.1 mMのオキシコドンおよび共基質として10 mMの2-オキソグルタレートとともに、総容量100μLでインキュベートした。また、鉄をFe2＋状態に維持するための還元剤として4 mMのDTTも添加した。反応液を30℃で3時間インキュベートし、0.1％の酢酸を含むエタノール中で1:1に希釈することによってクエンチした。CODM発現酵母株によって生成されたオキシモルホンをLC-MSによって検出した。この酵母株によって生成されたオキシモルホンの質量電荷比（m/z 302）、保持時間および質量スペクトルは購入したオキシモルホン標準品のものと一致した（図29参照）。
（表２）酵素リスト
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（表３）O-デメチラーゼ候補酵素
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（表４）N-デメチラーゼ候補酵素
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（表５）N-メチルトランスフェラーゼおよびN-修飾性候補酵素
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（表６）BM3 N-デメチラーゼの変異体
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（表７）pA24、pA25およびpA26の配列
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（表８）テーラリング酵素
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（表９）けしがら濃縮物および清澄化した酵母培養培地中に存在し得る不純物の比較
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（表１０）清澄化した酵母培養培地（CYCM）中に存在する相違する分子群。けしがら濃縮物（CPS）とは異なり、酵母宿主株は、他の類型のアルカロイドが存在しないように所定の類型のアルカロイド分子（すなわち、一株につき1つの生合成経路のみ）が生成するように遺伝子操作され得る。したがって、CYCM中には、単一の生合成経路内の分子、例えば、1つまたは2つのカラムにまたがる分子のサブセットが含まれ得るが、CPS中には多くのカラムにおける分子のサブセットが含まれ得る。
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（表１１）化合物の化学合成調製物中に存在し得る不純物
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本発明の好ましい態様を本明細書において図示および記載してきたが、当業者にはかかる態様は一例とした示したものにすぎないことが明らかであろう。ここに、当業者には、本発明から逸脱することなく数多くの変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する種々の代替例が本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、およびこの特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにその均等物が特許請求の範囲に包含されることを意図する。

Claims (67)

  1. 第1オピオイドを脱メチル化して第2オピオイドにする方法であって、以下の工程：
    第1オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、第1オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、O-結合型メチル基の喪失によって第1オピオイドを第2オピオイドに変換する、工程
    を含み、
    ここで、第1オピオイドが、コデインおよびテバインからなる群より選択されることはない、
    前記方法。
  2. オピオイドを脱メチル化してノル-オピオイドにする方法であって、以下の工程：
    第1オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、第1オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、O-結合型メチル基の喪失によって第1オピオイドを第2オピオイドに変換する、工程;および
    第2オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、N-結合型メチル基の喪失によって第2オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程
    を含む、前記方法。
  3. オピオイドを脱メチル化してノル-オピオイドにする方法であって、以下の工程：
    オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、該オピオイドからのN-結合型メチル基の除去によって該オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程
    を含み、
    ここで、該オピオイドを該少なくとも1種の酵素にインビトロで接触させる場合、該オピオイドはテバインではない、
    前記方法。
  4. オピオイドをナル-オピオイドに改変する方法であって、以下の工程：
    オピオイドを少なくとも第1の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも第1の酵素と接触させることが、該オピオイドからのN-結合型メチル基の除去によって該オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程;および
    該ノル-オピオイドを少なくとも第2の酵素と接触させる工程であって、補因子の存在下で該ノル-オピオイドを該少なくとも第2の酵素と接触させることが、該補因子からの側鎖の転移によって該ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換する、工程
    を含む、前記方法。
  5. オピオイドをナル-オピオイドに改変する方法であって、以下の工程：
    第1オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、第1オピオイドを該少なくとも1種の酵素と接触させることが、O-結合型メチル基の喪失によって第1オピオイドを第2オピオイドに変換する、工程;
    第2オピオイドを少なくとも第2の酵素と接触させる工程であって、該オピオイドを該少なくとも第2の酵素と接触させることが、N-結合型メチル基の喪失によって第2オピオイドをノル-オピオイドに変換する、工程;および
    該ノル-オピオイドを少なくとも第3の酵素と接触させる工程であって、補因子の存在下で該ノル-オピオイドを該少なくとも第3の酵素と接触させることが、該補因子からの側鎖の転移によって該ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換する、工程
    を含む、前記方法。
  6. 第2オピオイドが、少なくとも1種の酵素をコードするためのコード配列を含む遺伝子操作された細胞を培養することによって生成される、請求項1記載の方法。
  7. ノル-オピオイドが、第1の酵素をコードするためのコード配列を含む遺伝子操作された細胞を培養することによって生成される、請求項2記載の方法。
  8. ノル-オピオイドが、第1の酵素および第2の酵素をコードするためのコード配列を含む遺伝子操作された細胞を培養することによって生成される、請求項3記載の方法。
  9. ナル-オピオイドが、第1の酵素および第2の酵素をコードするためのコード配列を含む遺伝子操作された細胞を培養することによって生成される、請求項4記載の方法。
  10. ノル-オピオイドが、第1の酵素、第2の酵素および第3の酵素をコードするためのコード配列を含む遺伝子操作された細胞を培養することによって生成される、請求項5記載の方法。
  11. 第2オピオイドを細胞培養物から回収する工程
    をさらに含む、請求項6記載の方法。
  12. ノル-オピオイドを細胞培養物から回収する工程
    をさらに含む、請求項7または8のいずれか一項記載の方法。
  13. ナル-オピオイドを細胞培養物から回収する工程
    をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
  14. (S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物に添加する工程
    をさらに含む、請求項6〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. ノル-オピオイドが、遺伝子操作された細胞内で、L-チロシンで始まる代謝経路によって生成される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  16. ナル-オピオイドが、遺伝子操作された細胞内で、L-チロシンで始まる代謝経路によって生成される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  17. 遺伝子操作された細胞内に存在しているオピオイドからノル-オピオイドを産生する、該遺伝子操作された細胞であって、該遺伝子操作された細胞によって産生されるN-デメチラーゼをコードしている異種コード配列を含み、該N-デメチラーゼは、該遺伝子操作された細胞内の該オピオイドを該ノル-オピオイドに変換し、該ノル-オピオイドは該遺伝子操作された細胞内で生成される、該遺伝子操作された細胞。
  18. N-メチルトランスフェラーゼをコードしている異種コード配列をさらに含む、請求項17記載の遺伝子操作された細胞。
  19. オピオイドが、遺伝子操作された細胞内で、L-チロシンで始まる代謝経路によって生成される、請求項17記載の遺伝子操作された細胞。
  20. 遺伝子操作された細胞内に存在しているノル-オピオイドからナル-オピオイドを産生する、該遺伝子操作された細胞であって、該遺伝子操作された細胞によって産生されるN-メチルトランスフェラーゼをコードしている異種コード配列を含み、該N-メチルトランスフェラーゼは、該ノル-オピオイドを該遺伝子操作された細胞内で該ナル-オピオイドに変換する、該遺伝子操作された細胞。
  21. ナル-オピオイドが遺伝子操作された細胞内で生成される、請求項20記載の遺伝子操作された細胞。
  22. ナル-オピオイドが、遺伝子操作された細胞内で、L-チロシンで始まる代謝経路によって生成される、請求項20記載の遺伝子操作された細胞。
  23. 遺伝子操作された細胞が、遺伝子操作された非植物細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  24. 遺伝子操作された非植物細胞が遺伝子操作された酵母細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  25. O-結合型メチル基の喪失が3'位で起こる、請求項1または2記載の方法。
  26. 遺伝子操作された細胞によって産生されるナル-オピオイド。
  27. 化学合成に付随する1種または複数種の検出可能な不純物を含有していない、ナル-オピオイド化合物。
  28. ナル-オピオイドがブプレノルフィンであり、化学合成に付随する1種または複数種の不純物が、15,16-デヒドロブプレノルフィン、17,18-デヒドロブプレノルフィン、18,19-デメチルブプレノルフィン、19,19'-エチルブプレノルフィン、2,2'-ビスブプレノルフィン、3-デスヒドロキシブプレノルフィン、3-O-メチルブプレノルフィン、3-O-メチル-N-シアノノルブプレノルフィン、3-O-メチル-N-メチルノルブプレノルフィン、6-O-デスメチルブプレノルフィン、ブプレノルフィンN-オキシド、N-ブト-3-エニルノルブプレノルフィン、N-ブト-3-エニルノルメチルブプレノルフィン、N-ブチルノルブプレノルフィン、N-メチルブプレノルフィン、ノルブプレノルフィン、およびテトラメチルフランブプレノルフィンを含む、請求項27記載のナル-オピオイド化合物。
  29. ナル-オピオイドがオキシモルホンであり、化学合成に付随する1種または複数種の不純物が、1-ブロモオキシモルホン、6-βオキシモルホール、10-α-ヒドロキシオキシモルホン、10-ケトオキシモルホン、2,2-ビスオキシモルホン、ノルオキシモルホン、オキシモルホンN-オキシド、10-ヒドロキシオキシモルホン、4-ヒドロキシオキシモルホン、8-ヒドロキシオキシモルホン、およびヒドロモルヒノールを含む、請求項27記載のナル-オピオイド化合物。
  30. ナル-オピオイドがナルトレキソンであり、化学合成に付随する1種または複数種の不純物が、10-ヒドロキシナルトレキソン、10-ケトナルトレキソン、14-ヒドロキシ-17-シクロプロピルメチルノルモルヒノン、2,2'-ビスナルトレキソン、3-シクロプロピルメチルナルトレキソン、3-O-メチルナルトレキソン、8-ヒドロキシナルトレキソン、N-（3-ブテニル）-ノルオキシモルホン、ナルトレキソンアルドール二量体、およびN-ホルミル-ノルオキシモルホンを含む、請求項27記載のナル-オピオイド化合物。
  31. ナル-オピオイドがナロキソンであり、化学合成に付随する1種または複数種の不純物が、10-α-ヒドロキシナロキソン、10-β-ヒドロキシナロキソン、10-ケトナロキソン、3-O-アリルナロキソン、7,8-ジデヒドロナロキソン、2,2'-ビスナロキソン、およびナロキソンN-オキシドを含む、請求項27記載のナル-オピオイド化合物。
  32. ナル-オピオイドがナルブフィンであり、化学合成に付随する1種または複数種の不純物が、ナルブフィンのβ-エピマー、2,2'-ビスナルブフィン、6-ケトナルブフィン、10-ケトナルブフィン、α-ノルオキシモルホール、N-（シクロブチルカルボニル）-α-ノルオキシモルホール、およびN-ホルミル-6-α-ノルオキシモホールを含む、請求項27記載のナル-オピオイド化合物。
  33. 化学合成によって作製されるナル-オピオイドと比べて、以下の1種または複数種の不純物:15,16-デヒドロブプレノルフィン、17,18-デヒドロブプレノルフィン、18,19-デメチルブプレノルフィン、19,19'-エチルブプレノルフィン、2,2'-ビスブプレノルフィン、3-デヒドロキシブプレノルフィン、3-O-メチルブプレノルフィン、3-O-メチル-N-シアノノルブプレノルフィン、3-O-メチル-N-メチルノルブプレノルフィン、6-O-デスメチルブプレノルフィン、ブプレノルフィンN-オキシド、N-ブト-3-エニルノルブプレノルフィン、N-ブト-3-エニルノルメチルブプレノルフィン、N-ブチルノルブプレノルフィン、N-メチルブプレノルフィン、ノルブプレノルフィン、テトラメチルフランブプレノルフィン、1-ブロモオキシモルホン、6-βオキシモルホール、10-α-ヒドロキシオキシモルホン、10-ケトオキシモルホン、2,2-ビスオキシモルホン、ノルオキシモルホン、オキシモルホンN-オキシド、10-ヒドロキシオキシモルホン、4-ヒドロキシオキシモルホン、8-ヒドロキシオキシモルホン、ヒドロモルヒノール、10-ヒドロキシナルトレキソン、10-ケトナルトレキソン、14-ヒドロキシ-17-シクロプロピルメチルノルモルヒノン、2,2'-ビスナルトレキソン、3-シクロプロピルメチルナルトレキソン、3-O-メチルナルトレキソン、8-ヒドロキシナルトレキソン、N-（3-ブテニル）-ノルオキシモルホン、ナルトレキソンアルドール二量体、N-ホルミル-ノルオキシモルホン、10-α-ヒドロキシナロキソン、10-β-ヒドロキシナロキソン、10-ケトナロキソン、3-O-アリルナロキソン、7,8-ジデヒドロナロキソン、2,2'-ビスナロキソン、ナロキソンN-オキシド、ナルブフィンのβ-エピマー、2,2'-ビスナルブフィン、6-ケトナルブフィン、10-ケトナルブフィン、α-ノルオキシモルホール、N-（シクロブチルカルボニル）-α-ノルオキシモルホール、またはN-ホルミル-6-α-ノルオキシモホールをより少なく含む、ナル-オピオイド化合物。
  34. ナル-オピオイドがブプレノルフィン化合物であり、化学合成ブプレノルフィンと比べて、以下の1種または複数種の不純物:15,16-デヒドロブプレノルフィン、17,18-デヒドロブプレノルフィン、18,19-デメチルブプレノルフィン、19,19'-エチルブプレノルフィン、2,2'-ビスブプレノルフィン、3-デスヒドロキシブプレノルフィン、3-O-メチルブプレノルフィン、3-O-メチル-N-シアノノルブプレノルフィン、3-O-メチル-N-メチルノルブプレノルフィン、6-O-デスメチルブプレノルフィン、ブプレノルフィンN-オキシド、N-ブト-3-エニルノルブプレノルフィン、N-ブト-3-エニルノルメチルブプレノルフィン、N-ブチルノルブプレノルフィン、N-メチルブプレノルフィン、ノルブプレノルフィン、またはテトラメチルフランブプレノルフィンをより少なく含む、請求項33記載のナル-オピオイド化合物。
  35. ナル-オピオイドがオキシモルホンであり、化学合成オキシモルホンと比べて、以下の1種または複数種の不純物:1-ブロモオキシモルホン、6-βオキシモルホール、10-α-ヒドロキシオキシモルホン、10-ケトオキシモルホン、2,2-ビスオキシモルホン、ノルオキシモルホン、オキシモルホンN-オキシド、10-ヒドロキシオキシモルホン、4-ヒドロキシオキシモルホン、8-ヒドロキシオキシモルホン、またはヒドロモルヒノールをより少なく含む、請求項33記載のナル-オピオイド化合物。
  36. ナル-オピオイドがナルトレキソンであり、化学合成ナルトレキソンと比べて、以下の1種または複数種の不純物:10-ヒドロキシナルトレキソン、10-ケトナルトレキソン、14-ヒドロキシ-17-シクロプロピルメチルノルモルヒノン、2,2'-ビスナルトレキソン、3-シクロプロピルメチルナルトレキソン、3-O-メチルナルトレキソン、8-ヒドロキシナルトレキソン、N-（3-ブテニル）-ノルオキシモルホン、ナルトレキソンアルドール二量体、またはN-ホルミル-ノルオキシモルホンをより少なく含む、請求項33記載のナル-オピオイド化合物。
  37. ナル-オピオイドがナロキソンであり、化学合成ナロキソンと比べて、以下の1種または複数種の不純物:10-α-ヒドロキシナロキソン、10-β-ヒドロキシナロキソン、10-ケトナロキソン、3-O-アリルナロキソン、7,8-ジデヒドロナロキソン、2,2'-ビスナロキソン、またはナロキソンN-オキシドをより少なく含む、請求項33記載のナル-オピオイド化合物。
  38. ナル-オピオイドがナルブフィンであり、化学合成ナルブフィンと比べて、以下の1種または複数種の不純物:ナルブフィンのβ-エピマー、2,2'-ビスナルブフィン、6-ケトナルブフィン、10-ケトナルブフィン、α-ノルオキシモルホール、N-（シクロブチルカルボニル）-α-ノルオキシモルホール、またはN-ホルミル-6-α-ノルオキシモホールをより少なく含む、請求項33記載のナル-オピオイド化合物。
  39. ナル-オピオイドを産生する遺伝子操作された細胞。
  40. ノル-オピオイドを産生する遺伝子操作された細胞。
  41. 前記遺伝子操作された細胞が異種コード配列を含んでおり、該異種コード配列が、N-デメチラーゼからなる群より選択される酵素をコードしている、請求項26または40記載の方法。
  42. 前記遺伝子操作された細胞が少なくとも第1および第2の異種コード配列を含んでおり、該第1の異種コード配列が、N-デメチラーゼからなる群より選択される酵素をコードしており、該第2の異種コード配列が、N-メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素をコードしている、請求項26記載の方法。
  43. 前記遺伝子操作された細胞が第3の異種コード配列をさらに含み、該第3の異種コード配列が、O-デメチラーゼからなる群より選択される酵素をコードしている、請求項42記載の方法。
  44. 前記遺伝子操作された細胞が、L-DOPAデカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ、シトクロムP450 80B1、シトクロムP450レダクターゼ、4'-O-メチルトランスフェラーゼ、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドエピメラーゼ、サルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ、テバイン6-O-デメチラーゼ、コデイノンレダクターゼ、コデインO-デメチラーゼ、N-メチルトランスフェラーゼ、O-デメチラーゼおよびN-デメチラーゼからなる群より選択される少なくとも1種の酵素をさらに含む、請求項42または43記載の方法。
  45. 遺伝子操作された細胞の培養によって産生される前記ナル-オピオイドがLC-MS（液体クロマトグラフィー-質量分析）によって検出可能である、請求項42、43または44記載の方法。
  46. ノル-オピオイドをナル-オピオイドに改変する方法であって、以下の工程：
    該ノル-オピオイドを少なくとも1種の酵素と接触させる工程であって、補因子の存在下で該ノル-オピオイドを該酵素と接触させることが、該補因子からの側鎖の転移によって該ノル-オピオイドをナル-オピオイドに変換する、工程
    を含む、前記方法。
  47. 基質からナル-オピオイドを生成することができる遺伝子操作された細胞を含む、基質からナル-オピオイドを調製する方法。
  48. 前記基質が糖である、請求項47記載の方法。
  49. 前記基質がチロシンである、請求項47記載の方法。
  50. 前記基質がテバインである、請求項47記載の方法。
  51. 前記テバインが遺伝子操作された細胞内で生成される、請求項50記載の方法。
  52. 前記基質がレチクリンである、請求項47記載の方法。
  53. 前記レチクリンが遺伝子操作された細胞内で生成される、請求項52記載の方法。
  54. 前記基質がオピオイドである、請求項47記載の方法。
  55. 前記オピオイドが遺伝子操作された細胞内で生成される、請求項54記載の方法。
  56. 前記基質がノル-オピオイドである、請求項47記載の方法。
  57. 前記ノル-オピオイドが遺伝子操作された細胞内で生成される、請求項56記載の方法。
  58. 遺伝子操作された細胞をタンパク質産生に適した条件下で培養する工程をさらに含み、前記遺伝子操作された細胞が2つの異種コード配列を含み、該2つの異種コード配列は、基質をナル-オピオイドに変換する代謝経路に関与している第1および第2の酵素をそれぞれコードしており、該第1および第2の酵素は、該代謝経路に沿って動作可能に連結されている、請求項47記載の方法。
  59. ナル-オピオイドを生成する代謝経路に関与している前記第1および第2の酵素の各々が、N-デメチラーゼおよびN-メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
  60. ナル-オピオイドを細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項47記載の方法。
  61. ナル-オピオイドが、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン、ベベンプラン、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミンおよびジプレノルフィンからなる群より選択される、請求項47記載の方法。
  62. 基質からノル-オピオイドを生成することができる遺伝子操作された細胞を含む、該基質から該ノル-オピオイドを調製する方法。
  63. ナル-オピオイド生成物を有する生成物流を形成するための方法であって、以下の工程：
    i. 遺伝子操作された細胞と、栄養物および水を含むフィードストックとをバッチ式反応器に供給する工程であって、該遺伝子操作された細胞は、N-デメチラーゼ酵素とN-メチルトランスフェラーゼ酵素とを含む少なくとも2つの異種コード配列を有する、工程;
    ii. 前記バッチ式反応器内で、ナル-オピオイドと細胞材料とを含む溶液を生成するために、該遺伝子操作された細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、該遺伝子操作された細胞を発酵に供する工程;ならびに
    iii. 該ナル-オピオイドを含む該生成物流を得るために、少なくとも1つの分離ユニットを用いて該ナル-オピオイドを該細胞材料から分離する、工程
    を含む、前記方法。
  64. 前記遺伝子操作された細胞が、O-デメチラーゼ酵素を含む第3の異種コード配列をさらに含む、請求項63記載の方法。
  65. ノル-オピオイド生成物を有する生成物流を形成するための方法であって、以下の工程：
    i. 遺伝子操作された細胞と、栄養物および水を含むフィードストックとをバッチ式反応器に供給する工程であって、該遺伝子操作された細胞は、N-デメチラーゼ酵素を含む少なくとも1つの異種コード配列を有する、工程;
    ii. 前記バッチ式反応器内で、ノル-オピオイドと細胞材料とを含む溶液を生成するために、該遺伝子操作された細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、該遺伝子操作された細胞を発酵に供する工程;ならびに
    iii. 該ノル-オピオイドを含む該生成物流を得るために、少なくとも1つの分離ユニットを用いて該ノル-オピオイドを該細胞材料から分離する、工程
    を含む、前記方法。
  66. ナル-オピオイドの作製方法であって、遺伝子操作された宿主細胞を準備する工程、発酵反応物を生成するために、該遺伝子操作された細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、該遺伝子操作された細胞を発酵に供する工程、および、該発酵反応物から該ナル-オピオイドを精製する工程を含む、前記方法。
  67. ノル-オピオイドの作製方法であって、遺伝子操作された宿主細胞を準備する工程、発酵反応物を生成するために、該遺伝子操作された細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、該遺伝子操作された細胞を発酵に供する工程、および、該発酵反応物から該ノル-オピオイドを精製する工程を含む、前記方法。
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