JP2020529848A

JP2020529848A - 遺伝子操作されたベンジルイソキノリンアルカロイドエピメラーゼおよびベンジルイソキノリンアルカロイドの生成方法

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Publication number: JP2020529848A
Application number: JP2020505492A
Authority: JP
Inventors: クリスティーナディー．スモルケ; デレクエイチ．ウェルズ
Original assignee: アンテイアインコーポレイテッド
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2020-10-15
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: US10544420B2; JP7199417B2; US20190078100A1; BR112020002050A2; GB2579940B; US20200157551A1; US11427827B2; IL272363A; WO2019028390A1; GB2579940A; GB202002867D0

Abstract

本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたエピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物の生成を増大させるためのシステムおよび方法を提供する。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させる。前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させることにより、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される。

Description

相互参照
本出願は、2017年8月3日に出願された米国特許仮出願第62/541,038号の恩典を主張するものであり、この出願は、参照により本明細書に組み入れられる。

本開示により、遺伝子操作されたエピメラーゼを含む遺伝子操作された宿主細胞内での多様なベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）の生成のための方法を提供する。さらに、本開示により、遺伝子操作されたエピメラーゼの産生のための方法を提供する。遺伝子操作されたエピメラーゼは遺伝子操作された融合型エピメラーゼおよび遺伝子操作された分割型エピメラーゼを含み得る。遺伝子操作された融合型エピメラーゼは、遺伝子操作された融合型エピメラーゼのオキシダーゼ部分に1つまたは複数の改変を有し得る。このような1つまたは複数の改変はエピメラーゼの活性を高め得る。一部の態様では、遺伝子操作された融合型酵素は、それぞれ異なる親酵素に由来するオキシダーゼ酵素部分とレダクターゼ酵素部分を有し得る。

また、遺伝子操作されたエピメラーゼは遺伝子操作された分割型エピメラーゼも含み得る。一部の態様では、分割型エピメラーゼが、2つの別個の成分を有するエピメラーゼ系を含み得る。一部の態様では、分割型エピメラーゼが、オキシダーゼ成分を含む第1のタンパク質とレダクターゼ成分を含む第2の別個のタンパク質とを含み得る。一部の場合では、分割型エピメラーゼのオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分が別個のmRNAにコードされている。一部の場合では、分割型エピメラーゼのオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分が同じmRNAにコードされており、別個の翻訳開始部位から翻訳される。一部の場合では、分割型エピメラーゼのオキシダーゼ成分が第1のmRNAにコードされており、同じ分割型エピメラーゼのレダクターゼ成分が第2の別個のmRNAにコードされている。一部の場合では、分割型エピメラーゼのオキシダーゼ成分が第1の分子を含み、同じ分割型エピメラーゼのレダクターゼ成分が第2の分子を含む。一部の場合では、分割型エピメラーゼが、第1のゲノム内位置の第1の転写ユニットにコードされた第1のタンパク質と第2のゲノム内位置の第2の転写ユニットにコードされた第2のタンパク質とを含む。

一部の態様では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、遺伝子操作された宿主細胞内で、オキシダーゼおよびレダクターゼをコードしている2つの分離型酵素を含み得る。一部の態様では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、該エピメラーゼの活性を高めるための1つまたは複数の改変を有する遺伝子操作されたオキシダーゼ部分をさらに含み得る。一部の態様では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、融合型親酵素から分割されたオキシダーゼ酵素およびレダクターゼ酵素を有し得る。一部の態様では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、第1の融合型親酵素から分割されたオキシダーゼ酵素と、第1の融合型親酵素とは異なる第2の融合型親酵素から分割されたレダクターゼ酵素を有し得る。一部の態様では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、第1の親酵素の一部分に由来するオキシダーゼ酵素と第2の親酵素の一部分に由来するレダクターゼ酵素とを有し得る。

一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマー化により、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。一部の方法では、該方法は、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程を含み、ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される。

一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。一部の方法では、該方法は、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程を含み、ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼはオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含み、前記オキシダーゼ成分はSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含み、前記レダクターゼ成分はSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む。

一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された分割型エピメラーゼを含む遺伝子操作された宿主細胞であって、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を、同様の条件下での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換と比べて増大させる、遺伝子操作された宿主細胞を提供する。

一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたエピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。さらなる態様では、本開示により、オキシダーゼおよびレダクターゼをコードしている2つの分離型酵素を含む遺伝子操作されたエピメラーゼを介する（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへのエピマー化により、野生型エピメラーゼを介する（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへのエピマー化による多様なアルカロイド生成物の生成と比較して多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。

本発明のさらなる一局面により、1種または複数種の遺伝子操作されたエピメラーゼを用いることによって（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化の効率を野生型エピメラーゼと比べて高める方法を提供する。該方法は、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを1種または複数種の遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させる工程を含む。一部の態様では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、オキシダーゼおよびレダクターゼをコードしている2つの分離型酵素を含む。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された分割型エピメラーゼのオキシダーゼ酵素と、および別個に遺伝子操作された分割型エピメラーゼのレダクターゼ酵素と接触することにより、野生型エピメラーゼと比べてより多くの（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される。

遺伝子操作された分割型エピメラーゼは、親エピメラーゼまたは野生型エピメラーゼに由来する分離型のオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素を含み得るが、遺伝子操作されたエピメラーゼはまた、別個の親エピメラーゼまたは野生型エピメラーゼに由来する分離型のオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素を含んでいてもよい。オキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を有する親エピメラーゼの例は:表1に列記したSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14および15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明のさらなる一局面により、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、少なくとも1つの改変を含む遺伝子操作されたオキシダーゼおよび（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるのに充分な量のレダクターゼと接触させる工程を含む、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するための方法を提供する。遺伝子操作されたオキシダーゼは、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を改善する1つまたは複数の改変を有し得る。一部の態様では、遺伝子操作されたオキシダーゼが遺伝子操作された分割型エピメラーゼ内に存在し得、このとき該遺伝子操作されたオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素は分離されている。一部の態様では、遺伝子操作されたオキシダーゼが遺伝子操作された融合型エピメラーゼ内に存在し得、このとき該遺伝子操作されたオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素は融合されている。

本発明の別の局面では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心をエピマー化させる方法を提供する。該方法は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを少なくとも1種の遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させる工程を含む。1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の立体化学的配置が1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の反対の立体化学的配置に、野生型エピメラーゼを使用するより効率的に反転される。

一部の例では、遺伝子操作された非植物細胞が、表3に列記した酵素の群から選択される酵素が各々にコードされている複数のコード配列を含む。一部の例では、異種コード配列が奏功可能に関連し得る。奏功可能に関連した異種コード配列は、遺伝子操作されたオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素を含む遺伝子操作されたエピメラーゼの活性により特定のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を生成させる同じ経路内に存在し得る。

本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼを使用し、野生型エピメラーゼの使用とは対照的な増大量のビスベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された融合型エピメラーゼを使用し、野生型エピメラーゼの使用とは対照的な増大量のビスベンジルイソキノリン生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。ビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、遺伝子操作された非植物細胞内に存在しているカップリング酵素を用いて生成される。さらに、遺伝子操作された非植物細胞は、遺伝子操作された非植物細胞内での少なくとも1種類のベンジルイソキノリンアルカロイド単量体の生成に使用される、分離型オキシダーゼ酵素と分離型レダクターゼ酵素を有する遺伝子操作された分割型エピメラーゼをコードしている少なくとも2つの異種コード配列を含む。さらに、該少なくとも1種類のカップリング酵素は、遺伝子操作された非植物細胞内で2つのベンジルイソキノリンアルカロイド単量体を二量体化し、それによりビスベンジルイソキノリンアルカロイドを形成させる。

本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼを使用し、野生型エピメラーゼの使用とは対照的な増大量のプロモルフィナンまたはモルフィナンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された融合型エピメラーゼを使用し、野生型エピメラーゼの使用とは対照的な増大量のプロモルフィナンまたはモルフィナンアルカロイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。遺伝子操作された非植物細胞は、遺伝子操作された非植物細胞内での少なくとも1種のモルフィナンアルカロイドの生成に使用される、分離型オキシダーゼ酵素と分離型レダクターゼ酵素を有する遺伝子操作された分割型エピメラーゼをコードしている少なくとも2つの異種コード配列を含む。

本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼを使用し、野生型エピメラーゼの使用とは対照的な増大量のナル-オピオイドまたはノル-オピオイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。本発明のさらなる一局面では、遺伝子操作された融合型エピメラーゼを使用し、野生型エピメラーゼの使用とは対照的な増大量のナル-オピオイドまたはノル-オピオイド生成物を産生する遺伝子操作された非植物細胞を提供する。遺伝子操作された非植物細胞は、遺伝子操作された非植物細胞内での少なくとも1種のナル-オピオイドまたはノル-オピオイドの生成に使用される、分離型オキシダーゼ酵素と分離型レダクターゼ酵素を有する遺伝子操作された分割型エピメラーゼをコードしている少なくとも2つの異種コード配列を含む。

一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインシンターゼによるプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。さらなる態様では、本開示により、テバインシンターゼによるサルタリジノール-7-O-アセテートのテバインへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。親テバインシンターゼの例には:表2に列記したSEQ ID NO:30、31、32、33および34からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれる。

一部の態様では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたテバインシンターゼによるプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。さらなる態様では、本開示により、遺伝子操作されたテバインシンターゼによるサルタリジノール-7-O-アセテートのテバインへの変換による多様なアルカロイド生成物の生成を増大させるための方法を提供する。

一部の態様では、遺伝子操作されたテバインシンターゼが融合酵素である。さらなる態様では、テバインシンターゼがアセチルトランスフェラーゼ酵素に融合されている。さらなる態様では、テバインシンターゼがアセチルトランスフェラーゼ酵素内にコードされている。他の態様では、テバインシンターゼがレダクターゼ酵素に融合されている。

参照による組み入れ
本明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、参照により、あたかも個々の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられて具体的に個々に示されているのと同程度に、本明細書に組み入れられる。

本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲の詳細事項とともに示す。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を使用した実例の態様を示した以下の詳細説明、および添付の図面を参照することにより得られよう。

図1は、本発明の態様による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用およびサルベージ経路の例を示す。図2は、本発明の態様による、グルコースの4-HPA、ドパミンおよび3,4-DHPAへの変換の生合成スキームを示す。図3は、本発明の態様による（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの形成の一例の模式図を示す。図4は、本発明の態様による親DRS-DRR融合酵素のアミノ酸配列を示す。図5は、本発明の態様による、それぞれ図4に示す親融合酵素に由来するDRS酵素およびDRR酵素のアミノ酸配列を示す。図6は、本発明の態様による、オピオイド3-O-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。図7は、本発明の態様による、オピオイドN-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。図8は、本発明の態様による、N-メチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を示す。図9は、本発明の態様によるBM3変異体の機能性発現を示す。図10は、本発明の態様による、微生物細胞内でのL-チロシンのノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換の生合成スキームを示す。図11は、本発明の態様による、酵素発現および遺伝子操作用のDRS-DRRならびにDRSおよびDRR酵素のコドン最適化アミノ酸配列を含むプラスミド/YACベクターを示す。図12は、本発明の態様による、ノルコクラウリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図13は、本発明の態様による、ノルラウダノソリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図14は、本発明の態様による、L-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。図15は、本発明の態様による、半合成オピオイドの生成の生合成スキームを示す。図16は、本発明の態様による、オピオイドの生成の生合成スキームを示す。図17は、（A）L-チロシンのビスBIAへの変換の生合成スキームおよび（B）本発明の態様による、ビスBIAを生合成するように遺伝子操作された酵母株を示す。図18は、本発明の態様による分離したDRSとDRRの発現により融合型の親と比べて多くの量のサルタリジンが生成したことを示す。図19は、本発明の態様による分離したDRSとDRR酵素発現株では融合型親発現株と比べて、ほぼすべての経路中間体の濃度が高まったことを示す。図20は、本発明の態様によるレチクリンのキラル分離を示す。図21は、DRS発現が高く（TDH3プロモーター）、DRR発現が低い（いずれかのCYC1プロモーター）場合、本発明の態様により、およそ20μMの最大量のサルタリジンが生成されたことを示す。図22は、本発明の態様による、4NKXをベースにしたDRSの相同性モデルを示す。図23は、本発明の態様による、4NKXをベースにしたDRSの相同性モデルを示す。図24は、本発明の態様によるPbDRS-DRR、PrDRSおよびPrDRR間のアラインメントを示す。図25は、本発明の態様による分離したDRS変異体とDRR変異体の発現により親DRS変異体と比べて多くの量のテバインが生成したことを示し、ここで、DRS変異体は、向上変異を有するように遺伝子操作されている。図26は、本発明の態様によるL-チロシンからのレチクリンの生成用のプラットフォーム酵母株を示す。図27は、本発明の態様によるL-チロシンからのテバインおよびヒドロコドンの生成用の酵母株を示す。図28は、本発明の態様による、四環系骨格を五環系骨格に変換する一般的な閉環反応を示す。図29は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株での糖およびL-チロシンからのモルフィナンアルカロイドテバインの生成を示す。図30は、本発明の態様による、遺伝子操作された酵母株での糖およびL-チロシンからのプロモルフィナンアルカロイドおよびモルフィナンアルカロイドテバインの生成を示す。

発明の詳細な説明
本開示により、デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）とデヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）酵素の独立した発現ならびに（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化におけるDRS酵素とDRR酵素の使用により、多様なアルカロイド生成物の生成を融合型DRS-DRRエピメラーゼの使用と比べて増大させる方法を提供する。また、本開示により、遺伝子操作されたエピメラーゼを用いた遺伝子操作された宿主細胞内での多様なベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）の生成のための方法を提供する。さらに、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での一組の遺伝子操作されたエピメラーゼの産生のための方法を提供する。一部の場合では、DRS酵素およびDRR酵素が親エピメラーゼに由来し得る。一部の場合では、DRS酵素およびDRR酵素が各々、分離型の親エピメラーゼに由来し得る。一部の場合では、DRS酵素およびDRR酵素が1種または複数種の親エピメラーゼに由来し得る。本明細書において論考しているように、DRSとDRRの独立した発現では、融合型DRS-DRRの発現と比較した場合、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの、例えば（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換が相当改善される。特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換の増大によってビスベンジルイソキノリン、プロモルフィナン、モルフィナン、ナル-オピオイドおよびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内での（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換の増大によってプロモルフィナン、モルフィナン、ナル-オピオイドおよびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換の増大によって多様なアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。

（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換は、ケシ（opium poppy）におけるモルフィナンアルカロイド生成の重要な工程である。近年、いくつかの異なる学術研究グループが、独立して、この工程を行う融合型DRS-DRR変異体を同定した（Winzer et al.2015,Farrow et al.2015,Galanie et al.2015）。この酵素の注目すべき特徴は、モルフィナンアルカロイド生成植物では、2つの酵素、シトクロムP450とアルド-ケトレダクターゼ間の翻訳時融合がみられることである。このような化合物を生成しない近縁植物では、これらの酵素は融合されず、したがって別々に発現される。この2つの酵素融合により、（S）-レチクリンをデヒドロレチクリンに変換する第1の酵素の産生物が、デヒドロレチクリンを（R）-レチクリンに変換する第2の酵素の直接的な基質となるため、基質チャンネリングの改善が可能になると考えられる（Winzer et.al.2015）。

本出願では、親分子と比べて活性の相当な高まりをもたらしたDRS-DRR変異体に対するプロテインエンジニアリングインプルーブメント（protein engineering improvement）を記載する。実験結果は、進化的に融合された親酵素に由来する2つの酵素、デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）と称されるシトクロムP450とデヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）と称されるアルド-ケトレダクターゼとの分離および独立した発現により、異種酵母宿主細胞内での（S）-レチクリンから（R）-レチクリンへの変換が相当改善されたことを示す。また、変異誘発およびスクリーニングによるDRSに対する改善によっても該酵素の活性が改善された。

本明細書において論考する実施例は、ベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）経路を有する株内における、1種または複数種の親エピメラーゼに由来するDRS酵素およびDRR酵素の分離および独立した発現により、サルツリジン（saluturidine）シンターゼ（SalSyn）の活性が生成される（R）-レチクリンの量に対して制限的でない場合、サルタリジン生成の相当な増大がもたらされたことを示す。DRSとDRRを別々に発現する株は、サルタリジンまでのすべてのBIA経路中間体の定量的な増加をさらに示した。酵母からレチクリンをキラル分離すると、DRSとDRRを別々に発現した細胞は、同等量の（S）-レチクリンと（R）-レチクリンが生成された親DRS-DRR融合酵素と比べて主に（R）-レチクリンを生成した。独立したDRSとDRRのどちらの活性が制限的であるのかを究明するため、さまざまなプロモーター強度を有する一連のベクターを構築した。DRSとDRRの差次的発現により、細胞内DRS活性はDRRと比べて制限的であることが示された。酵母内におけるDRSの機能をよりよく理解するため、およびプロテインエンジニアリングインプルーブメントによって同定された有益な残基に機能を帰属させるため、ヒトステロイド産生シトクロムP450 CYP17A1の既存の構造に基づいて構造的相同性モデルを構築した。細胞内DRS活性を改善するため、DRSのORFにランダムに変異誘発し、ほぼ5,000個の独立した変異型変異体をサルタリジン生成についてスクリーニングした。これらの変異体から、6つの異なる変異を含むコンビナトリアル変異体を同定し、BIA生成株内への導入と発現用に選択した。

特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によってプロモルフィナン、モルフィナン、ナル-オピオイドおよびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、遺伝子操作された宿主細胞内でのプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によってモルフィナン、ナル-オピオイドおよびノル-オピオイドアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。さらなる特定の場合では、本開示により、プロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換の増大によって多様なアルカロイド生成物を生成させるための方法を提供する。

関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）
関心対象のBIAを生成する宿主細胞を提供する。一部の例では、宿主細胞の遺伝子操作された株、例えば、本発明の遺伝子操作された株は、いくつかの構造分類、例えば非限定的に、前駆体BIA、ベンジルイソキノリン、プロモルフィナン、モルフィナン、ビスベンジルイソキノリン、ナル-オピオイド、ノル-オピオイドなどを越えて関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイドおよびその改変体を生成するためのプラットフォームを提供し得る。これらの分類の各々は、該分類のメンバーをもたらし得る遺伝子操作された宿主細胞の生合成経路の任意の簡便なメンバーの生合成前駆体、中間体およびその代謝産物を包含していることを意味する。化合物の非限定的な例を以下に、これらの構造分類の各々について示す。一部の場合において、所与の例の構造は、それ自体がベンジルイソキノリンアルカロイドと特性評価される場合もあり、されない場合もある。本発明での化学物質は、考えられ得るすべての異性体、例えば1種のエナンチオマー、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態、ジアステレオマー混合物および中間体混合物を包含していることを意味する。

ベンジルイソキノリンアルカロイド前駆体としては、非限定的に、ノルコクラウリン（NC）およびノルラウダノソリン（NL）、ならびにNCおよびNL前駆体、例えばチロシン、チラミン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（4-HPA）、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸（4-HPPA）、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）、3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）、およびドパミンが挙げられ得る。いくつかの態様では、1種または複数種の該BIA前駆体が3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（3,4-DHPA）とドパミンである。一部の特定の場合では、1種または複数種の該BIA前駆体が4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（4-HPA）とドパミンである。特に、NLおよびNCは、それぞれ前駆体分子からピクテ・スペングラー縮合反応から合成され得、この場合、反応は自発的に起こり得るか、または任意の簡便な酵素によって触媒され得る。

ベンジルイソキノリンとしては、非限定的に、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、コクラウリン、3'-ヒドロキシコクラウリン、4'-O-メチルノルラウダノソリン、4'-O-メチル-ラウダノソリン、N-メチルノルコクラウリン、ラウダノソリン、N-メチルコクラウリン、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、パパベリン、ラウダニン、ラウダノシン、テトラヒドロパパベリン、1,2-ジヒドロパパベリン、およびオリエンタリン（orientaline）が挙げられ得る。

プロモルフィナンとしては、非限定的に、サルタリジン、サルタリジノール、およびサルタリジノール-7-O-アセテートが挙げられ得る。

モルフィナンとしては、非限定的に、テバイン、コデイノン、コデイン、モルヒネ、モルヒノン、オリパビン、ネオピノン、ネオピン、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン、オキシコドン、14-ヒドロキシコデイン、モルヒノン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、ジヒドロエトルフィン、エチルモルヒネ、エトルフィン、メトポン、ブプレノルフィン、フォルコジン、およびヘテロコデインが挙げられ得る。

ビスベンジルイソキノリンとしては、非限定的に、ベルバムニン、ガテガウメリン（guattegaumerine）、ダウリシンおよびリエンシニンが挙げられ得る。

ナル-オピオイドとしては、非限定的に、ナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン（axelopran）、ベベンプラン（bevenpran）、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミンおよびジプレノルフィンが挙げられ得る。

ノル-オピオイドとしては、非限定的に、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンが挙げられ得る。

一部の特定の態様では、本発明の遺伝子操作株は、テトラヒドロビオプテリン合成に関する化合物、例えば非限定的に、ジヒドロネオプテリン三リン酸、6-ピルボイルテトラヒドロプテリン、5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン、7,8-ジヒドロビオプテリン、テトラヒドロビオプテリン4a-カルビノールアミン、キノノイドジヒドロビオプテリンおよびビオプテリンを生成させるためのプラットフォームを提供し得る。

宿主細胞
任意の簡便な細胞が主題の宿主細胞および方法に使用され得る。一部の場合では、宿主細胞が非植物細胞である。一部の例では、宿主細胞が微生物細胞であると特性評価され得る。一部の特定の場合では、宿主細胞が昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞または酵母細胞である。任意の簡便な型の宿主細胞が、主題のBIA生成細胞を作製するのに使用され得、例えばUS2008/0176754、US2014/0273109、PCT/US2014/063738、PCT/US2016/030808、PCT/US2015/060891、PCT/US2016/031506およびPCT/US2017/057237を参照されたく、これらの開示内容は参照によりその全体が組み入れられる。関心対象の宿主細胞としては、非限定的に、細菌細胞、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス属、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、マクロコッカス（Macrococcus）属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、ザイモモナス属、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimuium）細胞、昆虫細胞、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）S2およびツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）Sf9細胞、ならびに酵母細胞、例えば出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびピキア酵母（Pichia pastoris）細胞が挙げられる。一部の例では、宿主細胞が酵母細胞または大腸菌（E.coli）細胞である。一部の場合では、宿主細胞が酵母細胞である。一部の場合では、宿主細胞が、関心対象のBIA、例えば（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の場合では、宿主細胞が、関心対象の酵素を生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の場合では、宿主細胞が、遺伝子操作されたエピメラーゼを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の態様では、遺伝子操作されたエピメラーゼが、遺伝子操作された分割型エピメラーゼであり得る。一部の態様では、遺伝子操作されたエピメラーゼが、遺伝子操作された融合型エピメラーゼであり得る。一部の態様では、エピメラーゼ活性が分離型のオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素にコードされ得る。さらに、一部の態様では、遺伝子操作されたエピメラーゼが（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに、親エピメラーゼと比べてより効率的に変換でき得る。一部の態様では、親エピメラーゼが野生型エピメラーゼであり得る。一部の態様では、親エピメラーゼが野生型エピメラーゼとかなり類似したものであり得る。一部の場合では、野生型エピメラーゼとかなり類似している親エピメラーゼが、野生型エピメラーゼのアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上類似しているアミノ酸配列を有し得る。一部の態様では、遺伝子操作されたエピメラーゼが、対応する親エピメラーゼと比べて（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにより効率的に変換するオキシダーゼ活性とレダクターゼ活性を示す小型酵素に分離され得る。

一部の場合では、宿主細胞が、テバインシンターゼを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。テバインシンターゼはサルタリジノール-7-O-アセテートをテバインに、自然な反応と比べてより効率的に変換でき得る。一部の場合では、宿主細胞が、遺伝子操作されたテバインシンターゼを生成するように遺伝子操作された酵母株に由来する。一部の態様では、遺伝子操作されたテバインシンターゼが遺伝子操作された融合酵素であり得る。さらに、遺伝子操作されたテバインシンターゼはサルタリジノール-7-O-アセテートをテバインに、親テバインシンターゼと比べてより効率的に変換でき得る。一部の態様では、親テバインシンターゼが野生型テバインシンターゼであり得る。一部の態様では、親テバインシンターゼが、野生型テバインシンターゼとかなり類似したものであり得る。一部の場合では、野生型テバインシンターゼとかなり類似している親テバインシンターゼが、野生型テバインシンターゼのアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上類似しているアミノ酸配列を有し得る。遺伝子操作されたテバインシンターゼは、親テバインシンターゼと比べてサルタリジノール-7-O-アセテートをテバインにより効率的に変換するための別の酵素との融合酵素として遺伝子操作されてもよい。

Smolke et al.によるUS2008/0176754、US2014/0273109、PCTUS2014/063738、PCT/US2016/030808、PCT/US2015/060891、PCT/US2016/031506、PCT/US2017/057237、および米国特許仮出願第62/627,264号に記載の任意の宿主細胞が主題の細胞および方法における使用のために適合され得る。特定の態様では、酵母細胞が出芽酵母（S. cerevisiae）種であり得る。特定の態様では、酵母細胞が分裂酵母種であり得る。特定の態様では、酵母細胞がピキア酵母種であり得る。酵母は、シトクロムP450タンパク質がその活性が維持されるように小胞体膜内に適正にフォールディングされ得るため、宿主細胞として関心対象である。一例では、シトクロムP450タンパク質が関心対象のいくつかの生合成経路に関与している。さらなる例では、シトクロムP450タンパク質が、関心対象のBIAの生成に関与している。さらなる例では、シトクロムP450タンパク質が、関心対象の酵素の産生に関与している。

本明細書において有用性が見出される関心対象の酵母株としては、非限定的に、CEN.PK（遺伝子型:MATa/α ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2）、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、Σ1278B、AB972、SK1、およびFL100が挙げられる。一部の特定の場合では、該酵母株が、S288C（MATα; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1 hap1）、BY4741（MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0）、BY4742（MATα; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0）、BY4743（MATa/MATα; his3Δ1/his3Δ1; leu2Δ0/leu2Δ0; met15Δ0/MET15; LYS2/lys2Δ0; ura3Δ0/ura3Δ0）、ならびにWAT11またはW(R)、それぞれシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）NADPH-P450レダクターゼATR1および酵母NADPH-P450レダクターゼCPR1を発現するW303-B株（MATa; ade2-1; his3-11、-15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr＋）の誘導体のいずれかである。別の態様では、酵母細胞がW303α（MATα; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1）である。さらなる関心対象の酵母株の実体および遺伝子型は、EUROSCARF（web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html）において知得され得る。

一部の場合では、宿主細胞が真菌細胞である。特定の態様では、真菌細胞がアスペルギルス属の種のものであり得、菌株としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（ATCC 1015、ATCC 9029、CBS 513.88）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（ATCC 56747、RIB40）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（NIH 2624、ATCC 20542）およびアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）（FGSC A4）が挙げられる。

特定の態様では、異種コード配列がアスペルギルス属の一種内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）、MbfAプロモーター、シトクロムcオキシダーゼサブユニットプロモーター（CoxA）、SrpBプロモーター、TvdAプロモーター、リンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（MdhA）、β-マンノシダーゼプロモーター（ManB）から選択され得る。特定の態様では、ターミネーターが、グルコアミラーゼターミネーター（GlaA）またはTrpCターミネーターから選択され得る。特定の態様では、プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、または宿主のゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばハイグロマイシンでの選択により、または窒素源の利用により、例えばアセトアミドを単独窒素源として用いて行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えば、プロトプラスト形質転換、酢酸リチウムまたはエレクトロポレーションを用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体MEもしくは固形MEA（3％麦芽エキス,0.5％ペプトンおよび±1.5％寒天）中またはVogel最少培地中で選択ありもしくはなしで培養され得る。

一部の場合では、宿主細胞が細菌細胞である。細菌細胞は任意の細菌属から選択され得る。細菌細胞が由来し得る属の例としては、アナベナ属、アルスロバクター属、アセトバクター属、アセトバクテリウム属、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、ブラキバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エシェリキア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、ハフニア属、ハロモナス属、クレブシエラ属、コクリア属、ラクトバチルス属、ロイコノストック（Leucononstoc）属、マクロコッカス（Macrococcus）属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロセラ属、メチロコッカス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミクロキスティス属、ムーレラ属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、プロクロロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、プロテウス属、シュードアルテロモナス属、シュードモナス属、サイクロバクター属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、セラチア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、シネコキスティス（Synechocystis）属、テトラジェノコッカス属、ワイセラ属、およびザイモモナス属が挙げられる。本開示の方法で使用され得る細菌の種の例としては、アルスロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アルスロバクター・アリライテンシス（Arthrobacter arilaitensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ブラキバクテリウム・チロファーメンタンス（Brachybacterium tyrofermentans）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、カルノバクテリウム・ディバージェンス（Carnobacterium divergens）、コリネバクテリウム・フラベセンス（Corynebacterium flavescens）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、グルコナセトバクター・エウロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコナセトバクター・ホハンナエ（Gluconacetobacter johannae）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongata）、コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）、ラクトバチルス・アシディファリナエ（Lactobacillus acidifarinae）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ロイコノストク・シトレウム（Leuconostoc citreum）、マクロコッカス・カセオリティカス（Macrococcus caseolyticus）、マイクロバクテリウム・フォリオルム（Microbacterium foliorum）、ミクロコッカス・ライレ（Micrococcus lylae）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Propionibacterium acidipropionici）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、サイクロバクター・セラー（Psychrobacter celer）、スタフィロコッカス・コンディメンティ（Staphylococcus condimenti）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Streptomyces griseus）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）、ワイセラ・チバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・コレエンシス（Weissella koreensis）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）・ビフィドゥム（bifidum）/ブレーベ（breve）/ロンガム（longum）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、シュードアルテロモナス・シトレア（Pseudoalteromonas citrea）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、クロストリジウム（Clostridium）・リュングダリイ（ljungdahlii）/アセティカム（aceticum）/アセトブチリカム（acetobutylicum）/ベエイジェリンキー（beijerinckii）/ブチリカム（butyricum）、およびムーレラ（Moorella）・テモセルム（themocellum）/サーモアセチカ（thermoacetica）が挙げられる。

特定の態様では、細菌細胞が大腸菌株のものであり得る。特定の態様では、大腸菌株は、BL21、DH5α、XL1-Blue、HB101、BL21およびK12から選択され得る。特定の態様では、異種コード配列が大腸菌内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、T7プロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（tet）、lacオペロンプロモーター（lac）、lacO1プロモーターから選択され得る。特定の態様では、プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、またはゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、プラスミドが、pUC19またはpBADから選択される。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンまたはアンピシリンでの選択により行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えばコンジュゲーション、ヒートショック化学的形質転換またはエレクトロポレーションを用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体ルリア-ベルターニ（LB）培地中で約37℃にて抗生物質ありまたはなしで培養され得る。

特定の態様では、細菌細胞が枯草菌株であり得る。特定の態様では、枯草菌（B. subtilis）株は、1779、GP25、RO-NN-1、168、BSn5、BEST195、1A382および62178から選択され得る。特定の態様では、異種コード配列がバチルス属の一種内での発現のためにコドン最適化され得、適切なプロモーターにより発現され得る。特定の態様では、該プロモーターが、gracプロモーター、p43プロモーターまたはtrnQプロモーターから選択され得る。特定の態様では、該プロモーター、異種コード配列およびターミネーターからなる発現カセットが、プラスミドにより発現され得るか、またはゲノム内に組込まれ得る。特定の態様では、プラスミドが、pHP13 pE194、pC194、pHT01またはpHT43から選択される。特定の態様では、組込みベクター、例えばpDG364またはpDG1730が、発現カセットをゲノム内に組込むために使用され得る。特定の態様では、該プラスミドまたは組込みカセットを維持する細胞の選択が、抗生物質、例えばエリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびスペクチノマイシンでの選択により行なわれ得る。特定の態様では、DNA構築物が宿主細胞内に、確立された形質転換方法、例えば自然形質転換能、ヒートショックまたは化学的形質転換を用いて導入され得る。特定の態様では、細胞は、液体ルリア-ベルターニ（LB）培地中で37℃にて、またはM9培地＋グルコースおよびトリプトファン中で培養され得る。

宿主細胞に対する遺伝子改変
宿主細胞は、関心対象のBIAの生成をもたらす1つまたは複数の改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含むように遺伝子操作され得る。付加的または代替的に、宿主細胞は、関心対象の酵素の産生をもたらす1つまたは複数の改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含むように遺伝子操作され得る。一部の場合では、改変は遺伝子改変、例えば、遺伝子もしくはその断片の変異、付加もしくは欠失、または遺伝子もしくはその断片の転写調節である。本明細書で用いる場合、用語「変異」は、参照の配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換をいう。変異は特異的変異として、天然遺伝子の本来の遺伝子座に組込まれ得る。一部の場合では、変異は、別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入された遺伝子の追加コピーとして、またはエピゾーマルベクター上、例えば、2μもしくはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。一部の特定の場合では、該酵素の基質阻害コピーが天然細胞の転写調節下に存在している。一部の例では、該酵素の基質阻害コピーが、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の遺伝子操作された構成的または動的な調節を伴って導入される。一部の例では、1つまたは複数の改変の対象物が天然遺伝子であり得る。一部の例では、1つまたは複数の改変の対象物が非天然遺伝子であり得る。一部の例では、非天然遺伝子が宿主細胞内に挿入され得る。さらなる例では、非天然遺伝子が、宿主細胞内に挿入される前に1つまたは複数の改変によって変更され得る。

遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の関心対象のBIAを過剰生成し得る。過剰生成するとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非改変細胞）と比べて関心対象のBIA分子の改善または増大した生成を有することを意味する。改善または増大した生成とは、対照は関心対象のBIAの生成を有していない場合のいくらかの量の関心対象のBIAの生成、ならびに対照はいくらかの関心対象のBIAの生成を有している状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意味する。

遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有していない場合は、いくらかの量の関心対象の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象の(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有している状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。

遺伝子操作された宿主細胞は、1種または複数種の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをさらに過剰生成し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞は、対照が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有しない場合は、いくらかの量の関心対象の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを生成し得る、ならびに対照がいくらかの関心対象の(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのうちの1種または複数種をさらに過剰生成し得る。

遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のモルフィナンアルカロイドをさらに過剰生成させ得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、対照がモルフィナンアルカロイドの生成を有しない場合はいくらかの量の関心対象のモルフィナンアルカロイドを生成させ得る、ならびに対照がいくらかの関心対象のモルフィナンアルカロイドの生成を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。一部の場合では、モルフィナンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞内の遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒されるエピマー化反応の1-ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物またはその誘導体から形成される。遺伝子操作されたエピメラーゼは、エピメラーゼの反応を生じさせるように働く2つの分離型酵素を含み得る。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドのうちの1種または複数種をさらに過剰生成させ得る。

一部の場合では、遺伝子操作された分割型エピメラーゼを有する遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作された融合型エピメラーゼを有する宿主細胞と比べて増大量の（R）-レチクリンを生成することができる。一部の場合では、遺伝子操作されたエピメラーゼのオキシダーゼ部分に改変を有する遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作されたエピメラーゼのオキシダーゼ部分に該1つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）がない対照宿主細胞と比べて増大量の（R）-レチクリンを生成することができる。一部の特定の場合では、（R）-レチクリンの増大量が対照宿主細胞と比べて約10％以上、例えば対照宿主細胞と比べて約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、約2倍以上、約5倍以上またはさらには約10倍以上である。一部の場合では、（R）-レチクリンが、遺伝子操作された宿主細胞内の少なくとも1種の遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒されるエピマー化反応の生成物である。このような場合、（S）-レチクリンはこのエピマー化反応の基質であり得る。

一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）がない対照宿主細胞と比べて増大量のテバインを生成することができる。一部の場合では、テバインシンターゼを有する遺伝子操作された宿主細胞が、テバインシンターゼがない宿主細胞と比べて増大量のテバインを生成することができる。一部の場合では、遺伝子操作されたテバインシンターゼを有する遺伝子操作された宿主細胞が、親テバインシンターゼ（例えば、本明細書に記載のようなもの）を有する宿主細胞と比べて増大量のテバインを生成することができる。一部の特定の場合では、テバインの増大量が対照宿主細胞と比べて約10％以上、例えば対照宿主細胞と比べて約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、約2倍以上、約5倍以上またはさらには約10倍以上である。一部の場合では、テバインが遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインシンターゼの反応の生成物である。一部の場合では、テバインが、遺伝子操作された宿主細胞内の少なくとも1種の遺伝子操作されたテバインシンターゼによって触媒されるテバインシンターゼの反応の生成物である。このような場合、サルタリジノール-7-O-アセテートは、このテバインシンターゼの反応の基質であり得る。

さらに、遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種の関心対象の酵素を過剰産生し得る。過剰産生させるとは、該細胞が、対照細胞（例えば、非改変細胞）と比べて関心対象の酵素の改善または増大した産生を有することを意図する。改善または増大した産生とは、対照が関心対象の酵素の産生を有しない場合のいくらかの量の関心対象の酵素の産生、ならびに対照がいくらかの関心対象の酵素の産生を有する状況での約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意図する。

遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種の遺伝子操作されたDRS-DRR酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、対照がDRS-DRR酵素の産生を有しない場合、または対照が遺伝子操作された宿主細胞と比べて同レベルの野生型エピメラーゼの産生を有する場合はいくらかの量の遺伝子操作されたDRS-DRRエピメラーゼを産生し得る、ならびに対照がいくらかのDRS-DRR酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRRエピメラーゼが、遺伝子操作された分割型エピメラーゼであり得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRRエピメラーゼが、遺伝子操作された融合型エピメラーゼであり得る。

遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のテバインシンターゼ酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、対照がテバインシンターゼ酵素の産生を有しない場合はいくらかの量のテバインシンターゼ酵素を産生し得る、ならびに対照がいくらかのテバインシンターゼ酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。

遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種の遺伝子操作されたテバインシンターゼ酵素を過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、対照がテバインシンターゼ酵素の産生を有しない場合、または対照が遺伝子操作された宿主細胞と比べて同レベルの野生型テバインシンターゼの産生を有する場合はいくらかの量の遺伝子操作されたテバインシンターゼを産生し得る、ならびに対照がいくらかのテバインシンターゼ酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。一部の場合では、遺伝子操作されたテバインシンターゼが遺伝子操作された融合酵素であり得る。

遺伝子操作された宿主細胞は、テバインシンターゼ酵素に由来する1種または複数種の酵素をさらに過剰産生し得る。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、対照がテバインシンターゼ酵素に由来する酵素の産生を有しない場合はテバインシンターゼ酵素に由来するいくらかの量の該酵素を産生し得る、ならびに対照がテバインシンターゼ酵素に由来するいくらかの該酵素の産生を有する状況では約10％以上、例えば約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大をもたらし得る。

さらに、遺伝子操作された宿主細胞は1種または複数種のビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスBIA）を過剰生成させ得る。特に、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）、例えば遺伝子操作されたエピメラーゼを有することに関連する改変がない対照宿主細胞と比べて増大量のビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスBIA）を生成することができる。一部の特定の場合では、ビスBIAの増大量が対照宿主細胞と比べて約10％以上、例えば対照宿主細胞と比べて約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約80％以上、約100％以上、約2倍以上、約5倍以上またはさらには約10倍以上である。一部の場合では、ビスBIAが、遺伝子操作された宿主細胞内の遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒されるエピマー化反応の生成物である少なくとも1種のBIA単量体またはその誘導体から形成される。遺伝子操作されたエピメラーゼは、エピメラーゼの反応を生じさせるように働く2つの分離型酵素を含み得る。遺伝子操作された宿主細胞は、セファランチン、ファングチノリン（fangchinoline）、リエンシニン、ネフェリン（neferine）、ツボクラリン、ダウリシン、テトランドリン、クリン、ベルバムニン、ガテガウメリン、2’-ノルベルバムニンおよびベルバミンのうちの1種または複数種をさらに過剰生成させ得る。

一部の場合では、該1つまたは複数（例えば、2つ以上、3つ以上または4つ以上）の改変が:局在変異;シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異;到達性（accessibility）変異;活性向上変異;遺伝子操作された融合型エピメラーゼ改変;遺伝子操作された融合型テバインシンターゼ改変;および遺伝子操作された分割型エピメラーゼ改変から選択され得る。1つまたは複数の改変を含む細胞は遺伝子操作された細胞と称され得る。

基質阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「基質阻害緩和変異」は、該細胞の基質阻害制御機構を緩和する変異をいう。

基質阻害を緩和する変異は、関心対象の細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させ、調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC₅₀を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、遺伝子操作された宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。

関心対象のBIAまたはその前駆体のレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における基質阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が基質阻害緩和のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の基質阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該1つまたは複数の変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、1種または複数種のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードしている。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の基質阻害緩和変異が、TyrHである生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の基質阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。

特定の態様では、該1つまたは複数の基質阻害緩和変異がTyrH遺伝子内に存在している。TyrH遺伝子は、チロシンをL-DOPAに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードしている。しかしながら、TyrHは、その基質チロシンによって阻害される。例えばヒトまたはラットにみられる哺乳動物チロシンヒドロキシラーゼ活性は、TyrH遺伝子に対する基質阻害を軽減する変異によって改善することができる。特に、チロシンによる基質阻害は、TyrH遺伝子内における点変異W166Yによって軽減させることができる。また、TyrH遺伝子内における点変異W166Yにより、チロシンのL-DOPAへの反応を触媒するためのチロシンヒドロキシラーゼの共基質BH₄の結合が改善され得る。TyrHの該変異型（例えば、米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）は、糖からBIAを生成するために酵母株において発現させた場合、BIAの生成を有意に改善し得る。

任意の簡便な数および型の変異が、基質阻害制御機構を緩和するために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の基質阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の基質阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。

補因子回復促進機構
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回復促進機構（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「補因子回復促進機構」は、該細胞の補因子回復制御機構を促進させる機構をいう。

関心対象のBIAまたはその前駆体のレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における補因子回復のさまざまな制御機構および生合成酵素が補因子回復促進のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の補因子回復促進機構を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードしている異種コード配列を含み得る。DHFRが発現されると、これにより7,8-ジヒドロビオプテリン（BH₂）がテトラヒドロビオプテリン（BH₄）に変換され得、それによりBH₄がTyrH共基質として回復し得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の補因子回復促進機構を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表2に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。

任意の簡便な数および型の機構が、補因子回復制御機構を促進させるために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の補因子回復促進機構、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の補因子回復促進機構を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。

産物阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の産物阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「産物阻害緩和変異」は、遺伝子操作された宿主細胞の短期間および/または長期間の産物阻害の制御機構を緩和する変異をいう。短期間の産物阻害は、共基質の結合部位への競合的結合がみられる該細胞の制御機構である。長期間の産物阻害は、所望の経路外の化合物の不可逆的結合がみられる該細胞の制御機構である。

産物阻害を緩和する変異は、関心対象の細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させ、調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC₅₀を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、遺伝子操作された宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。

関心対象のBIAのレベル調節に指向される、遺伝子操作された宿主細胞における産物阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が産物阻害緩和のために標的化され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数の産物阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、1種または複数種のチロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードしている。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の産物阻害緩和変異が、TyrHである生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数の産物阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに含む。

特定の態様では、該1つまたは複数の産物阻害緩和変異がTyrH遺伝子内に存在している。TyrH遺伝子は、チロシンをL-DOPAに変換する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼをコードしている。TyrHは、ヒドロキシル化反応を触媒するための共基質としてテトラヒドロビオプテリン（BH₄）を必要とする。一部の微生物株、例えば出芽酵母はBH₄を天然に産生しないが、図1に示すような4-酵素合成/再利用経路により、この基質を産生するように遺伝子操作され得る。図1は、本発明の態様による、テトラヒドロビオプテリンの合成、再利用およびサルベージ経路の例を示す。図1は、酵素PTPS,ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ;SepR,セピアプテリンレダクターゼ;PCD,プテリン4a-カルビノールアミンデヒドラターゼ;QDHPR,ジヒドロプテリジンレダクターゼ;およびDHFR,ジヒドロ葉酸レダクターゼの使用を示す。図1に示した酵素のうち、酵母は内因性GTPシクロヒドロラーゼIを合成する。GTPおよびジヒドロネオプテリン三リン酸は酵母内で天然に合成される。さらに、図1における他の代謝産物は酵母内で天然に生成されない。

TyrHは、その産物L-DOPAならびに他のカテコールアミン、特にドパミンによって阻害される。例えばヒトまたはラット由来の哺乳動物チロシンヒドロキシラーゼ活性は、産物阻害を軽減する変異によって改善することができる。例えば、短期間の産物阻害、例えば共基質の結合部位への競合的結合は、TyrH遺伝子における点変異W166Yによって軽減され得る。特に、TyrH遺伝子における点変異W166Yにより共基質の結合が改善され得る。さらに、共基質の結合部位への競合的結合を軽減するための短期間の産物阻害は、TyrH遺伝子における点変異S40Dによっても改善され得る。また、短期間の産物阻害はTyrH遺伝子におけるR37E,R38E共同（joint）変異によっても改善され得る。特に、R37E,R38E変異は一緒になって、ドパミンの存在下でのチロシンヒドロキシラーゼ活性を明確に改善し得る。

さらに、長期間の産物阻害はTyrH遺伝子における点変異によって軽減され得る。長期間の産物阻害の軽減としては、チロシンヒドロキシラーゼ活性の産物阻害因子として作用するカテコールアミンの存在が少なくなるような、活性部位での鉄へのカテコールアミンの不可逆的結合が挙げられ得る。長期間の産物阻害は、それぞれTyrH遺伝子における変異E332DおよびY371Fによって軽減させることができる。

複数の型の基質阻害および産物阻害を軽減させてTyrHの活性をさらに改善するために変異の組合せ（例えば、一度に2つもしくは3つ、またはそれ以上の変異）を行なってもよい。TyrHの該変異型（例えば、米国特許仮出願第61/899,496号に記載のもの）は、糖からBIAを生成するために酵母株において発現させた場合、BIAの生成を有意に改善し得る。

任意の簡便な数および型の変異が、産物阻害の制御機構を緩和するために使用され得る。特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の産物阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の産物阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。

フィードバック阻害緩和変異
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含む細胞である。一部の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である（例えば、非改変細胞内に存在する）。付加的または代替的に、一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。本明細書で用いる場合、用語「フィードバック阻害緩和変異」は、遺伝子操作された宿主細胞のフィードバック阻害の制御機構を緩和する変異をいう。フィードバック阻害は、調節対象化合物の合成経路内の酵素が、該化合物がある一定レベルまで蓄積されたら阻害され、それにより細胞内の該化合物の量を均衡する該細胞の制御機構である。フィードバック阻害を緩和する変異は、遺伝子操作された宿主細胞における調節対象酵素の阻害を対照細胞と比べて低減させる。このようにして、遺伝子操作された宿主細胞は調節対象化合物またはその下流の生合成産物のレベル上昇をもたらす。一部の場合では、調節対象酵素の阻害を緩和するとは、阻害のIC₅₀を2倍以上、例えば3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上またはさらにはそれ以上、高めることを意味する。レベル上昇とは、宿主細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のレベルが対照細胞内の調節対象化合物またはその下流産物のものの110％以上、例えば120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上もしくは200％以上、例えば少なくとも3倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも10倍以上またはさらにはそれ以上になることを意味する。

関心対象のBIAのレベル調節に指向される、フィードバック阻害のさまざまな制御機構および生合成酵素が宿主細胞における緩和のために標的化され得る。宿主細胞は、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異を該細胞にとって天然の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。該1つまたは複数の変異は、該生合成酵素が調節制御に供される任意の簡便な生合成酵素遺伝子内に配置され得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼおよびコリスミ酸ムターゼから選択される1種または複数種の酵素をコードしているものであり得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は3-デオキシ-d-アラビノース-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼをコードしている。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子はコリスミ酸ムターゼをコードしているものであり得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO4およびARO7から選択される生合成酵素遺伝子内に存在し得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO4である生合成酵素遺伝子内に存在し得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が、ARO7である生合成酵素遺伝子内に存在している。いくつかの態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異を1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに含み得る。

任意の簡便な数および型の変異が、フィードバック阻害の制御機構を緩和するために使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「変異」は、参照の配列またはモチーフに対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換をいう。変異は特異的変異として、天然遺伝子の本来の遺伝子座に組込まれ得る。一部の場合では、変異は、別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入された遺伝子の追加コピーとして、またはエピゾーマルベクター上、例えば、2μもしくはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。一部の特定の場合では、該酵素のフィードバック阻害コピーが天然細胞の転写調節下に存在している。一部の例では、該酵素のフィードバック阻害コピーが、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入される。

特定の態様では、該1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異がARO4遺伝子内に存在し得る。関心対象のARO4変異としては、非限定的に、229位のリシン残基のロイシンでの置換、166位のグルタミン残基のリシン残基での置換、またはHartmann M, et al.（（2003）Proc Natl Acad Sci U S A 100（3）:862-867）もしくはFukuda, et al.（（1992）J Ferment Bioeng 74（2）:117-119）に記載の変異が挙げられ得る。一部の例では、フィードバック阻害を付与するための変異は、変異誘発された酵素変異型ライブラリーから選択され得る。かかる選出体の例としては、Fukuda, et al.（（1990）Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of β-Phenylethyl Alcohol and β-Phenylethyl Acetate. Agr Biol Chem Tokyo 54（1）:269-271）に記載のような過剰のチロシンを有する培地中でのo-フルオロ-D,L-フェニルアラニンの増加またはaro3変異型酵母株の増殖の救済が挙げられ得る。

特定の態様では、本発明の遺伝子操作された宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上のフィードバック阻害緩和変異、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15のフィードバック阻害緩和変異を該遺伝子操作された宿主細胞内の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子内に含み得る。

転写モジュレーション改変
宿主細胞は、該細胞の1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の1つまたは複数の転写モジュレーション改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含み得る。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって天然である。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は該細胞にとって非天然である。該細胞の任意の簡便な生合成酵素遺伝子が転写モジュレーションのために標的化され得る。転写モジュレーションとは、改変細胞内の関心対象の遺伝子の発現が、対照細胞（例えば、非改変細胞）と比べてモジュレートされる、例えば、増大または低減、向上または抑制されることを意味する。一部の場合では、関心対象の該遺伝子の転写モジュレーションとしては、発現の増大または増強が挙げられる。発現の増大または増強とは、関心対象の該遺伝子の発現レベルが、対照、すなわち改変されていない同じ細胞での発現と比べて（例えば、任意の簡便な遺伝子発現アッセイを使用することにより）2倍以上、例えば5倍以上、場合によっては25-、50-もしくは100倍以上、特定の態様では300倍以上またはそれより大きく増大していることを意味する。代替的に、細胞における関心対象の該遺伝子の発現が非常に少なくて検出不可能である場合では、関心対象の該遺伝子の発現レベルは、発現が容易に検出可能であるレベルまで増大しているならば、増大しているとみなす。一部の特定の場合では、関心対象の該遺伝子の転写モジュレーションとしては、発現の低減または抑制が挙げられる。発現の低減または抑制とは、関心対象の該遺伝子の発現レベルが、対照と比べて2倍以上、例えば5倍以上、場合によっては25-、50-もしくは100倍以上、特定の態様では300倍以上またはそれより大きく低減されていることを意味する。一部の場合では、発現は、検出不可能なレベルまで低減される。主題の宿主細胞における使用のために適合され得る関心対象の宿主細胞プロセスの改変は、Smolke et al.による米国特許出願公開第20140273109（14/211,611）号に記載されており、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

任意の簡便な生合成酵素遺伝子が転写モジュレートされ得、非限定的に、図2に記載の生合成酵素が挙げられ得る。特に、図2は、本発明の態様による、グルコースの4-HPA、ドパミンおよび3,4-DHPAへの変換の生合成スキームを示す。図2に記載の酵素の例としては、ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9、ARO8およびTKLが挙げられる。一部の例では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子は、ARO10、ARO9、ARO8およびTKLから選択され得る。一部の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がARO10であり得る。一部の特定の場合では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がARO9であり得る。いくつかの態様では、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子がTKLであり得る。いくつかの態様では、宿主細胞が、1つまたは複数の遺伝子、例えば表3に記載の遺伝子のうちの1つに対する1つまたは複数の転写モジュレーション改変を含む。

いくつかの態様では、転写モジュレーション改変としては、該1つまたは複数の生合成酵素遺伝子の天然プロモーターの強力なプロモーターでの置換または強力なプロモーターの制御下での追加コピーの該遺伝子の発現が挙げられ得る。関心対象の該遺伝子の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいが、該プロモーターは宿主細胞内で活性であり得るものとする。関心対象の該遺伝子は、その天然プロモーターによって発現されるものであってもよい。付加的または代替的に、関心対象の該遺伝子は、非天然プロモーターによって発現されるものであってもよい。必要条件ではないが、かかるプロモーターは、これが使用される宿主において中程度から高度の強度であり得る。プロモーターは調節されていてもよく構成的であってもよい。いくつかの態様では、グルコース抑制型でないか、または培養培地中のグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターを使用してもよい。数多くの好適なプロモーターが存在しており、その例としては、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、枯草菌tsr遺伝子（フルクトースビリン酸（biphosphate）アルドラーゼをコードしている）のプロモーターまたは出芽酵母（グリセルアルデヒド-リン酸デヒドロゲナーゼをコードしている）（Bitter G. A., Meth. Enzymol. 152:673-684（1987））由来のGAPDHプロモーターが挙げられる。他の関心対象の強力なプロモーターとしては、非限定的に、パン酵母のADHIプロモーター（Ruohonen L., et al, J. Biotechnol. 39:193-203（1995））、リン酸欠乏誘導型プロモーター、例えば、酵母のPHO5プロモーター（Hinnen A., et al, in Yeast Genetic Engineering, Barr P. J., et al. eds, Butterworths（1989）、B.リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のアルカリホスファターゼプロモーター（Lee. J. W. K., et al, J. Gen. Microbiol. 137:1127-1133（1991））、GPD1、およびTEF1が挙げられる。酵母の関心対象のプロモーターとしては、非限定的に、誘導性プロモーター、例えば、Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、抑制性プロモーターMet25、tetO、および構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GPD）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH）、翻訳-伸長因子-1-αプロモーター（TEF）、シトクロムc-オキシダーゼプロモーター（CYC1）、MRP7プロモーターなどが挙げられる。一部の例では、該強力なプロモーターがGPD1である。一部の特定の場合では、該強力なプロモーターがTEF1である。ホルモン、例えばグルココルチコイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンにより誘導性のプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターもまた公知であり、非限定的に、グルコルチコイド（glucorticoid）応答エレメント（GRE）および甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）が挙げられ、例えば、米国特許第7,045,290号に記載のプロモーターを参照のこと。構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHの）を含むベクターが使用され得る。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBどおり）もまた、関心対象の遺伝子の発現を駆動させるために使用することができよう。例えば大腸菌の宿主細胞に特異的な任意の簡便なプロモーターが選択され得ることは理解されよう。一部の場合では、プロモーターの選択は、転写、したがって酵素レベルを最適化して産生を最大限にするとともにエネルギー資源を最小限にするために使用され得る。

不活性化変異
遺伝子操作された宿主細胞は、該細胞の酵素に対する1つまたは複数の不活性化変異（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上）を含み得る。1つまたは複数の不活性化変異を含めることにより、合成経路の遺伝子操作された宿主細胞のフラックスが、関心対象のBIAまたはこれをもたらす望ましい酵素もしくは前駆体のレベルが上昇するように改変され得る。一部の例では、該1つまたは複数の不活性化変異が、該細胞にとって天然の酵素に対するものである。付加的または代替的に、該1つまたは複数の不活性化変異が、該細胞にとって非天然の酵素に対するものである。本明細書で用いる場合、「不活性化変異」とは、該細胞の遺伝子または調節性DNA配列に対する1つまたは複数の変異であって、該変異により、関心対象の該遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が不活性化されることを意味する。一部の場合では、該遺伝子は該細胞にとって天然である。一部の例では、該遺伝子は、不活性化され、かつ、宿主細胞が生成する関心対象のBIAの合成経路の一部であるかまたは該合成経路と関連している酵素を、コードしている。一部の例では、不活性化変異は、関心対象の遺伝子を制御する調節性DNA配列内に配置される。一部の特定の場合では、不活性化変異は、遺伝子のプロモーターに対するものである。任意の簡便な変異（例えば、本明細書に記載のようなもの）が、関心対象の遺伝子または調節性DNA配列を不活性化させるために使用され得る。「不活性化される」または「不活性化させる」とは、変異された該遺伝子によって発現されるタンパク質の生物学的活性が、非変異対照遺伝子によって発現される対照タンパク質と比べて10％以上、例えば20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上または99％以上低下することを意味する。一部の場合では、該タンパク質が酵素であり、不活性化変異によって該酵素の活性が低下する。

一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、該細胞にとって天然の酵素における不活性化変異を含む。任意の簡便な酵素が不活性化のために標的化され得る。関心対象の酵素としては、非限定的に、合成経路内における遺伝子操作された宿主細胞の作用が関心対象のBIAレベルを低下させる傾向にある表3に記載の酵素が挙げられ得る。一部の場合では、該酵素がグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がZWF1である。一部の場合では、該酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。いくつかの態様では、不活性化変異を含む酵素が、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1から選択される。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH2である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH3である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH4である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH5である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH6である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がADH7である。一部の場合では、該酵素がアルデヒドオキシドレダクターゼ活性を有する。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素が、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6から選択される。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD2である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD3である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD4である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD5である。特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がALD6である。一部の場合では、該酵素がアリール-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。一部の態様では、不活性化変異を含む酵素が、AAD4、AAD6、AAD10、AAD14、AAD15、AAD16から選択される。一部の特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がAAD4である。一部の特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がAAD6である。一部の特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がAAD10である。一部の特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がAAD14である。一部の特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がAAD15である。一部の特定の態様では、不活性化変異を含む酵素がAAD16である。一部の態様では、宿主細胞が、表3に記載の1つまたは複数の遺伝子に対する1つまたは複数の不活性化変異を含む。

エピマー化改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を説明する。このような方法、プロセスおよびシステムの一部は遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が、基質の多様な範囲のアルカロイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が遺伝子操作されたエピメラーゼによるエピマー化反応を含む。一部の場合では、基質アルカロイドのエピマー化が、図3に示し、スキーム1に一般的に示すように、（S）-基質を対応するシッフ塩基またはイミン中間体に酸化させ、次いで、この中間体を（R）-生成物に立体特異的に還元することにより行われ得る。スキーム1に示すように、R₁、R₂、R₃およびR₄はHまたはCH₃であり得る。R₅はH、OHまたはOCH₃であり得る。
スキーム1

一部の例では、（S）-基質の（R）-生成物への変換が、少なくとも1つの酸化反応と少なくとも1つの還元反応を伴い得る。一部の場合では、酸化反応の後に任意で還元反応が行われる。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が酵素の存在下で行われる。一部の場合では、酸化反応と還元反応のうちの少なくとも一方が遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒される。一部の場合では、酸化反応と還元反応がどちらも、遺伝子操作された融合型エピメラーゼの存在下で行われる。一部の場合では、酸化反応と還元反応がどちらも、それぞれ別々に発現されるオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を有する遺伝子操作された分割型エピメラーゼの存在下で行われる。一部の場合では、遺伝子操作されたエピメラーゼが酸化反応と還元反応を触媒するのに有用である。酸化反応と還元反応が同じ遺伝子操作されたエピメラーゼによって触媒されてもよい。

本明細書に記載の一部の方法、プロセスおよびシステムでは、酸化反応が、遺伝子操作されたエピメラーゼの一部である酵素の存在下で行われ得る。一部の例では、遺伝子操作されたエピメラーゼがオキシダーゼ成分を有し得る。一部の場合では、オキシダーゼ成分が遺伝子操作された融合型エピメラーゼの成分であり得る。一部の場合では、オキシダーゼ成分が、遺伝子操作された分割型エピメラーゼの一部として独立して発現され得る。該オキシダーゼは（S）-1-ベンジルイソキノリンを基質として使用し得る。該オキシダーゼは、（S）-基質を対応するイミンまたはシッフ塩基誘導体に変換し得る。該オキシダーゼは1,2-デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）と称され得る。本開示における（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの酸化に適した酵素の非限定的な例としては、シトクロムP450オキシダーゼ、2-オキソグルタル酸依存性オキシダーゼ、およびフラボタンパク質オキシダーゼが挙げられる。例えば、（S）-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（STOX、E.C 1.3.3.8）は、（S）-ノルレチクリンおよび他の（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを1,2-デヒドロノルレチクリンおよび他の対応する1,2-デヒドロ生成物に酸化させ得る。一部の例では、先の例のいずれか1つのオキシダーゼドメインを含むタンパク質が酸化を行い得る。一部の例では、該オキシダーゼが、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主細胞内での酸化反応を触媒し得る。一部の場合では、該オキシダーゼが、本明細書において論考するような、ならびに実施例6および8に記載のような1つまたは複数の活性増大成分を有し得る。

一部の例では、還元反応に続いて酸化反応が行われ得る。還元反応は遺伝子操作されたエピメラーゼの一部である酵素によって行われ得る。一部の例では、該レダクターゼが、1-ベンジルイソキノリンに由来するイミンまたはシッフ塩基を基質として使用し得る。該レダクターゼは、該イミンまたはシッフ塩基誘導体を（R）-1-ベンジルイソキノリンに変換し得る。該レダクターゼは1,2-デヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）と称され得る。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するイミンまたはシッフ塩基の還元に適した酵素の非限定的な例としては、アルド-ケトレダクターゼ（例えば、コデイノンレダクターゼ様酵素（EC 1.1.1.247））および短鎖デヒドロゲナーゼ（例えば、サルタリジンレダクターゼ様酵素（EC 1.1.1.248））が挙げられる。一部の例では、先の例のいずれか1つのレダクターゼドメインを含むタンパク質が還元を行い得る。さらなる一態様では、還元が立体特異的である。一部の例では、該レダクターゼが、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主細胞内での還元反応を触媒し得る。

（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するエピマー化反応を行い得る酵素の一例としては、オキシダーゼドメインとレダクターゼドメインを有するエピメラーゼが挙げられる。特に、該エピメラーゼは、シトクロムP450オキシダーゼ82Y2様ドメインを有し得る。さらに、該エピメラーゼは、コデイノンレダクターゼ様ドメインを有し得る。シトクロムP450オキシダーゼ82Y2様ドメインを有し、またコデイノンレダクターゼ様ドメインも有するエピメラーゼはDRS-DRR酵素と称され得る。特に、DRS-DRR酵素は、融合エピメラーゼである融合酵素であり得る。さらに、DRS-DRR酵素が少なくとも1つの活性増大改変によって改変されている場合、該融合酵素は遺伝子操作された融合エピメラーゼであり得る。活性増大改変の例は以下の実施例6および8で論考している。

（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を行うために使用され得るDRS-DRR酵素のアミノ酸配列の一例を図4に示す。特に、図4は、本発明の態様による、コドン最適化されたDRS-DRR酵素のアミノ酸配列を示す。さらに、図5は、図4のDRS-DRR酵素の各々のオキシダーゼ部分とレダクターゼ部分を分割したものを示す。DRS-DRR酵素のさらなるアミノ酸配列を表1に示す。（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するのに使用されるエピメラーゼのアミノ酸配列は、表1に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、一部の特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的なアミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、コドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更される。

相同なエピメラーゼのアミノ酸残基は、SEQ ID NO.16のナンバリングスキームに従って言及され得、このナンバリングシステムが本開示全体を通して、SEQ ID NO.16と相同なエピメラーゼの具体的なアミノ酸残基を示すのに使用される。SEQ ID NO.16と相同なエピメラーゼは、SEQ ID NO.16と少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％または99％の配列同一性を有し得る。一部の場合では、相同なエピメラーゼの50位であると示されたアミノ酸は該相同なエピメラーゼ内の50番目のアミノ酸でないかもしれないが、該相同なエピメラーゼのSEQ ID NO.16とのタンパク質アラインメントにおいてSEQ ID NO.16内の50位のアミノ酸に対応するアミノ酸であり得る。一部の場合では、相同性の酵素はSEQ ID NO.16と、一次配列、二次構造または三次構造のいずれかに従ってアラインメントされ得る。

（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する遺伝子操作されたエピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、該エピメラーゼが:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17および18からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、表13に記載のような1つまたは複数の活性向上改変を有する、遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるエピメラーゼを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。一部の場合では、該エピメラーゼが1種または複数種の酵素に分割され得る。さらに、該エピメラーゼの分割によって生成する1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞から回収してもよい。該エピメラーゼの分割によって生じるこのような1種または複数種の酵素もまた、（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を触媒するために使用され得る。さらに、遺伝子操作された分割型エピメラーゼの使用は、細胞内でのベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の生成を、融合型エピメラーゼを用いた細胞内でのベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の生成と比較した場合に増大させるために用いられ得る。

さらなる場合では、該エピメラーゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞から回収された該1種または複数種の酵素は、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するためのプロセスに使用され得る。該プロセスは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるのに充分な量のエピメラーゼと接触させることを含み得る。いくつかの例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも5％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを、前記(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。

(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドにインビボで接触させてもよい。さらに、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよく、または、遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。

一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、(S)-基質の(R)-生成物へのエピマー化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドが(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドが、(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに由来するもの、例えば、4環式のプロモルフィナンアルカロイドおよび5環式のモルフィナンアルカロイドなどである。別の態様では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、1-ベンジルイソキノリン、モルフィナン、プロモルフィナン、ノル-オピオイド、ナル-オピオイド、またはビスベンジルイソキノリンアルカロイドからなる群より選択される。

一部の例では、(S)-基質が、(S)-ノルレチクリン、(S)-レチクリン、(S)-テトラヒドロパパベリン、(S)-ノルコクラウリン、(S)-コクラウリン、(S)-N-メチルコクラウリン、(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、(S)-ノルイソオリエンタリン、(S)-オリエンタリン、(S)-イソオリエンタリン、(S)-ノルプロトシノメニン、(S)-プロトシノメニン、(S)-ノルラウダノソリン、(S)-ラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルラウダノソリン、(S)-6-O-メチルノルラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドである。

一部の例では、(S)-基質が、式I:

の化合物またはその塩であり、式中:
R¹、R²、R³およびR⁴は独立して、水素およびメチルから選択され;
R⁵は、水素、ヒドロキシおよびメトキシから選択される。

他の一部の例では、R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵のうちの少なくとも1つが水素である。

さらに他の例では、(S)-基質が、式II:

の化合物またはその塩であり、式中:
R³は、水素およびC₁〜C₄アルキルから選択され;
R⁶およびR⁷は独立して、各存在において、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C₁〜C₄アシル、C₁〜C₄アルキルおよびC₁〜C₄アルコキシから選択され;
nは0、1、2、3または4であり;
n'は0、1、2、3、4または5である。

結合が環を横切って示されている場合、これは、置換が環内の不特定の原子または位置に存在し得ることを意味する。例えば、上記に示した式IIでは、6員環の任意の-CH-の水素がR⁷で置き換えられて-CR⁷-を形成し得る。

一部の例では、R⁶およびR⁷が独立して、メチルまたはメトキシである。他の一部の例では、nおよびn'が独立して1または2である。さらに他の態様では、R³が水素またはメチルである。

一部の例では、該方法により、(S)-レチクリンからアルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞を提供する。(S)-レチクリンの(R)-レチクリンへのエピマー化は、前駆体からの多様なアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る。一部の例では、前駆体がL-チロシンまたは糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド生成物としては、非限定的に、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、モルフィナンアルカロイド、プロモルフィナンアルカロイド、ノル-オピオイドアルカロイド、またはナル-オピオイドアルカロイドが挙げられ得る。

任意の適当な炭素源が、エピマー化1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの前駆体として使用され得る。好適な前駆体としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）またはその組合せが挙げられ得る。一部の例では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマスの加水分解生成物）。さらに他の態様では、炭素前駆体が1炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。また他の態様では、他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸（例えば、L-チロシン）が使用され得る。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、例えば、ノルラウダノソリン、ラウダノソリン、ノルレチクリンおよびレチクリンなどが本発明の遺伝子操作された宿主細胞に直接添加され得る。なおさらなる態様では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞に、1種のエナンチオマー（例えば、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド）またはエナンチオマー混合物、例えばラセミ混合物などとして添加され得る。

一部の例では、該方法により、遺伝子操作されたエピメラーゼを使用した、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心のエピマー化を提供する。さらなる一態様では、該方法は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させる工程を含む。該遺伝子操作されたエピメラーゼは、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体の立体中心の立体化学的配置を反対の立体化学的配置に反転させ得る。一部の例では、該遺伝子操作されたエピメラーゼは、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する。該遺伝子操作されたエピメラーゼを使用するこの(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの(R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換の一部の例では、(S)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、(S)-ノルレチクリン、(S)-レチクリン、(S)-テトラヒドロパパベリン、(S)-ノルコクラウリン、(S)-コクラウリン、(S)-N-メチルコクラウリン、(S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、(S)-ノルイソオリエンタリン、(S)-オリエンタリン、(S)-イソオリエンタリン、(S)-ノルプロトシノメニン、(S)-プロトシノメニン、(S)-ノルラウダノソリン、(S)-ラウダノソリン、(S)-4'-O-メチルラウダノソリン、(S)-6-O-メチルノルラウダノソリンおよび(S)-4'-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される。

さらに他の態様では、遺伝子操作されたエピメラーゼを使用してエピマー化される1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが2つ以上の立体中心を含み得、この2つ以上の立体中心のうち1個だけが反転されて該基質のジアステレオマーが生成する（例えば、(S,R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが(R,R)-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される）。該少なくとも1種の酵素と接触させた場合に1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの立体中心の1つだけが反転される例で、生成物は1-ベンジルイソキノリンアルカロイドのエピマーと称される。

一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが該酵素に1種の立体異性体として提示される。他の一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが該酵素に立体異性体混合物として提示される。なおさらなる態様では、立体異性体混合物がラセミ混合物であり得る。他の一部の例では、立体異性体混合物は、1種の立体異性体が別の立体異性体と比べて富化されたものであり得る。

一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドまたはその誘導体を回収する。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを細胞培養物から回収する。なおさらなる態様では、回収された1-ベンジルイソキノリンアルカロイドは、1種の立体異性体が、該酵素に提示される1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの本来の混合物と比べてエナンチオマー的に富化されている。なおさらなる態様では、回収された1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。

一部の例では、プロモルフィナンまたはその誘導体が回収される。一部の例では、プロモルフィナンが細胞培養物から回収される。なおさらなる態様では、回収されたプロモルフィナンが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。

一部の例では、モルフィナンまたはその誘導体が回収される。一部の例では、モルフィナンが細胞培養物から回収される。なおさらなる態様では、回収されたモルフィナンが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。

一部の例では、ビスベンジルイソキノリンまたはその誘導体が回収される。一部の例では、ビスベンジルイソキノリンが細胞培養物から回収される。なおさらなる態様では、回収されたビスベンジルイソキノリンは、1種の立体異性体が、該酵素に提示されるビスベンジルイソキノリンの本来の混合物と比較してエナンチオマー的に富化されている。なおさらなる態様では、回収されたビスベンジルイソキノリンが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。

一部の例では、ナル-オピオイドまたはその誘導体が回収される。一部の例では、ナル-オピオイドが細胞培養物から回収される。なおさらなる態様では、回収されたナル-オピオイドが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。

一部の例では、ノル-オピオイドまたはその誘導体が回収される。一部の例では、ノル-オピオイドが細胞培養物から回収される。なおさらなる態様では、回収されたノル-オピオイドが、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％のエナンチオマー過剰を有する。

「異性体」は、同じ分子式を有する異なる化合物である。「立体異性体」は、空間内での原子の配列様式のみが異なる異性体である。「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせられない鏡像である1対の立体異性体である。1対のエナンチオマーの1:1の混合物が「ラセミ」混合物である。「ジアステレオ異性体」または「ジアステレオマー」は、少なくとも2個の不斉原子を有しているが互いに鏡像でない立体異性体である。用語「エピマー」は、本明細書で用いる場合、同一の化学式を有するが、ある特定の位置の光学配置が異なる化合物をいう。例えば、ある化合物の(R,S)立体異性体と(S,S)立体異性体は互いにエピマーである。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイドがそのエピマー（例えば、epi-1-ベンジルイソキノリンアルカロイド）に変換される。立体化学的絶対配置は、カーン・インゴルド・プレローグR-S体系に従って指定される。化合物が純粋なエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学的配置はRまたはSのいずれかで指定され得る。絶対配置が不明である分解された化合物は、ナトリウムD線の波長の直線偏光を回転させる方向（右旋性-または左旋性）に応じて（＋）または（-）と表示され得る。本明細書に記載の一部の特定の化合物は1つまたは複数の不斉中心を含み、したがって、エナンチオマー、ジアステレオマー、および立体化学的絶対配置に関して(R)-または(S)-で規定され得る他の立体異性体形態が生じ得る。

（表１）DRS-DRR酵素、分割されたDRSおよびDRR酵素のアミノ酸配列、ならびに他のヌクレオチド配列の例

モルフィナンアルカロイド生成改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムによりプロモルフィナンアルカロイドのモルフィナンアルカロイドへの変換を説明する。一部の該方法、プロセスおよびシステムにより、四環系骨格の五環系骨格への変換を説明する（図28）。一部の該方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、四環式の前駆体またはプロモルフィナンアルカロイドからの五環式テバインまたはモルフィナンアルカロイドの生成を説明する。一部の例では、プロモルフィナンアルカロイドのテバインへの変換が、基質の多様な範囲のベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換のカギとなる工程である。

一部の例では、四環式の前駆体がサルタリジン、サルタリジノールまたはサルタリジノール-7-O-アセテートであり得る。四環式の前駆体は五環式テバインに、C-4とC-5間のオキシドブリッジの閉鎖によって変換され得る。一部の例では、四環式の前駆体サルタリジンが、閉環のために、C-7における段階的ヒドロキシル化およびO-アセチル化によって調製され得る。閉環は、アセテート脱離基の消失によって活性化され得る。一部の例では、アリル型消失およびテバインを生成させるオキシド閉環が自然に起こる。他の例では、五環式テバインを生成させる閉環反応が、pHまたは溶媒などの因子によって促進される。他の例では、テバイン生成閉環反応が、タンパク質または酵素との接触によって促進される。このような変換工程を図14に示し、スキーム2に一般的に示す。R₁、R₂およびR₃はHまたはCH₃であり得る。R₄はCH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂または他の適切なアルキル基であり得る。一部の場合では、R₁、R₂、R₃およびR₄が、図14に示したようにCH₃であり得る。
スキーム2

一部の例では、四環式の前駆体を調製する第1の酵素がサルタリジンレダクターゼ（SalR）である。一部の場合では、SalRは、基質サルタリジンのC-7位をヒドロキシル化する（式III参照）。この反応の生成物は1種または複数種のサルタリジノールエピマーであり得る。一部の例では、生成物が（7S）-サルタリジノールである。一部の例では、サルタリジンレダクターゼが、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内での還元反応を触媒し得る。

一部の例では、四環式の前駆体を調製する第2の酵素がサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ（SalAT）である。一部の場合では、SalATがアセチル-CoAのアセチルをサルタリジノールの7-OHに転移させる（式IV参照）。他の場合では、SalATが、新規な補因子、例えばn-プロピオニル-CoAを利用してプロピオニルをサルタリジノールの7-OHに転移させ得る。一部の例では、SalATの生成物が（7S）-サルタリジノール-7-O-アセテートである。一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼが、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内でのアセチル転移反応を触媒し得る。

一部の例では、テバインの四環式の前駆体が（7S）-サルタリジノール-7-O-アセテートである。一部の例では、（7S）-サルタリジノール-7-O-アセテートが不安定であり、C-7のアセテートが自然に消失し、C-4とC-5間のオキシドブリッジが閉じてテバインが形成される（式V参照）。一部の例では、アセテート脱離基の消失速度がpHによって促進される。一部の例では、アリル型消失とオキシドブリッジ閉鎖が、テバインシンターゼ活性を有する酵素またはテバインシンターゼによって触媒される。一部の例では、この酵素がBet v 1-フォールド（fold）タンパク質である。一部の例では、この酵素が遺伝子操作されたテバインシンターゼ、遺伝子操作されたSalAT、形成性操作（DIR）タンパク質またはカルコンイソメラーゼ（CHI）である。一部の例では、テバインシンターゼ活性をコードしている酵素が、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内での閉環反応を触媒し得る。

一部の例では、サルタリジンレダクターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ（Ranunculales）目の植物、例えばケシ（Papaver somniferum）に由来するSalRまたはSalR様酵素であり得る。他の例では、サルタリジンレダクターゼ活性を有する酵素は、内因性モルヒネを生合成する哺乳動物または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。

一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ酵素は、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するSalATまたはSalAT様酵素であり得る。他の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、内因性モルヒネを生合成する哺乳動物または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。

一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するBet v 1フォールドタンパク質であり得る。一部の例では、Bet v 1タンパク質が、N末端からC末端に向かって順に以下のドメイン:β-ストランド、1つまたは2つのα-ヘリックス、6つのβ-ストランドおよび1つまたは2つのα-ヘリックスを含む。このタンパク質は、Bet v 1フォールドと、大型でバルキーな疎水性の分子、例えばモルフィナンアルカロイドを受容する活性部位とを有するように組織化される。このタンパク質は、任意の植物Bet v 1タンパク質、感染特異的10タンパク質（PR-10）、メジャーラテックスタンパク質（MLP）、果物もしくは花粉アレルゲン、植物ホルモン結合タンパク質（例えば、サイトカイニンもしくはブラシノステロイドに結合する）、植物ポリケチドシクラーゼ様タンパク質、またはBet v 1フォールドを有するノルコクラウリンシンターゼ（NCS）関連タンパク質であり得る。他の非植物Bet v 1フォールドタンパク質の例はポリケチドシクラーゼ、Hsp90 ATPaseホモログ活性化因子1（AHA1）タンパク質、SMU440様タンパク質（例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）由来）、PA1206関連タンパク質（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、CalCカリケアミシン耐性タンパク質（例えば、ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Micromonospora echinospora）由来）、および一酸化炭素代謝性オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxidovorans）由来のCoxGタンパク質である。Bet v 1関連ファミリーのさらなる例としては、START脂質転移タンパク質、ホスファチジルイノシトール転移タンパク質、および環水酸化酵素が挙げられる。

一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来する形成性操作タンパク質であり得る。他の例では、該酵素が、植物由来の任意の形成性操作タンパク質であり得る。

一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するカルコンイソメラーゼタンパク質であり得る。他の例では、該酵素が、植物由来の任意のカルコンイソメラーゼタンパク質であり得る。

一部の例では、テバインシンターゼ酵素が、テバインを生合成するキンポウゲ目の植物、例えばケシに由来するSalAT様酵素であり得る。他の例では、該酵素が、植物由来の任意のSalAT様タンパク質であり得る。

一部の例では、テバインシンターゼ活性を有する酵素が、内因性モルヒネを生合成する哺乳動物または任意の他の脊椎動物もしくは無脊椎動物に由来し得る。

一部の例では、上記の酵素と一緒にさらなるアクセサリータンパク質との任意の組合せが、任意の四環式の前駆体をテバインに変換する機能を果たし得る。一部の例では、このような酵素が、本明細書に記載の宿主細胞、例えば遺伝子操作された宿主内での該反応を触媒する。

テバインシンターゼ活性のためのアミノ酸配列の例を表2に示す。四環式の前駆体をテバインにするのに用いられるテバインシンターゼのアミノ酸配列は、表2に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるテバインシンターゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、一部の特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的なアミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更される。

四環式の前駆体をテバインに変換するサルタリジンレダクターゼ、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼおよびテバインシンターゼを産生する遺伝子操作された宿主細胞であって、該テバインシンターゼが、SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36および37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。一部の場合では、テバインシンターゼが、他の酵素との融合タンパク質を形成し得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生される酵素を、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。このような1種または複数種の酵素は、四環式プロモルフィナン前駆体のテバインへの変換を触媒するためにも使用され得る。

他の例では、テバインシンターゼが、SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60および61からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

さらなる場合では、遺伝子操作された宿主細胞から回収される該1種または複数種の酵素が、四環式プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するための方法に使用され得る。該方法は、四環式プロモルフィナン前駆体を、前記四環式プロモルフィナン前駆体がテバインに変換されるのに充分な量の回収された該酵素と接触させる工程を含み得る。一例では、四環式プロモルフィナン前駆体を、前記四環式プロモルフィナン前駆体の少なくとも5％がテバインに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、四環式プロモルフィナン前駆体を、前記四環式プロモルフィナン前駆体の少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％がテバインに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。

一部の例では、プロセス条件が、遺伝子操作された宿主細胞内でのテバインの形成を補助するために実行される。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞をpH3.3で培養し、高細胞密度に達したら、pHをpH8.0に調整し、高pHでのテバインの生成の継続を補助する。一部の場合では、遺伝子操作された宿主細胞が、糖および他の単純な前駆体、例えばチロシンをテバインに変換するためのさらなる酵素を産生する。一部の場合では、SalAT酵素がpH8.0で高活性を示すように遺伝子操作されており、後期プロモーターにより発現される。

一部の例では、四環式プロモルフィナン前駆体をテバインに変換する酵素のうちの1種または複数種が細胞内区画に局在する。一部の例では、SalR、SalATおよびBet v 1が、これが自身を遺伝子操作された宿主細胞の小胞体膜に局在させる標的化配列をコードするように改変され得る。特に、一部の特定の場合では、宿主細胞が、Bet v 1および/またはSalRおよび/またはSalATを酵母細胞内の細胞小器官に局在させることによりサルタリジノールもしくはテバインまたはテバインがレチクリンもしくはその前駆体の前駆体である生成物の生成を増大させるために遺伝子操作され得る。Bet v 1および/またはSalRおよび/またはSalATは、Bet v 1および/またはSalRおよび/またはSalATとCYP2D2またはCYP2D6またはSalSynまたはレチクリンのサルタリジンへの変換を触媒する遺伝子操作されたシトクロムP450酵素との間の空間距離が小さくなるように酵母の小胞体に局在させ得る。生成の増大により、対照が関心対象の化合物の生成を有しない場合はいくらかの量の関心対象の該化合物の生成、ならびに対照がいくらかの関心対象の化合物の生成を有する状況では10％以上、例えば50％以上、例えば2倍以上、例えば5倍以上、例えば10倍以上の増大の両方を意図する。

他の例では、SalATとBet v 1を単一のタンパク質融合体に共局在させ得る。一部の例では、SalATとBet v 1との融合体は、いくつかの方法のうちの1つ、例えば直接融合、酵母の細胞小器官への共局在によって、または酵素共局在ツール、例えばロイシンジッパー、アダプタードメインを利用するタンパク質骨格、もしくはアプタマーを利用するRNA骨格によって作出される。テバイン合成酵素を共局在させると、酵素の活性部位間の基質チャンネリングが助長され、不安定な中間体、例えばサルタリジノール-7-O-アセテートの拡散が限定的となり得る。

一部の例では、遺伝子操作されたサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ（SalAT）酵素が、四環式プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するのに使用される。一部の例では、SalAT酵素が、2つの機能:（1）アセチル-CoAのアシル基のサルタリジノールの7-OHへの転移、ならびに（2）その後のアセチル基の消失およびC4炭素とC5炭素間のオキシドブリッジの閉鎖によるテバインの形成、を併せ持つように遺伝子操作されている。

一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素が、Bet v 1フォールドを有するペプチドに融合される。一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ酵素とBet v 1フォールドタンパク質が、N末端をC末端に、C末端をN末端に、N末端とN末端またはC末端とC末端の任意の順に融合され得る。一部の例では、この2つのタンパク質の配列が、直接融合され得るか、またはペプチドリンカー領域を介して融合され得る。

一部の例では、サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素が、Bet v 1フォールドを有するペプチドに、円順列置換変異によって融合される。一部の場合では、SalATのN末端とC末端が融合され、次いで、この配列内にBet v 1配列がランダムに挿入される。一部の場合では、得られた融合タンパク質ライブラリーがテバイン生成についてスクリーニングされる。他の場合では、円順列置換変異SalATライブラリーがまず、Bet v 1の非存在下での活性についてスクリーニングされる。他の場合では、SalATのN末端とC末端が融合され、該酵素が消化され、平滑末端クローニングされる。他の場合では、円順列置換変異SalATのこのライブラリーがサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ活性についてスクリーニングされる。他の場合では、円順列置換変異SalATライブラリーからの活性な変異体が、次いで、Bet v 1フォールドを有するペプチドとのタンパク質融合体を設計するために使用される。

四環式プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素は四環式プロモルフィナン前駆体とインビトロで接触され得る。付加的または代替的に、四環式プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素は四環式プロモルフィナン前駆体とインビボで接触され得る。さらに、四環式プロモルフィナン前駆体をテバインに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、内部に四環式プロモルフィナン前駆体を有する細胞に供給され得るか、または遺伝子操作された宿主細胞内で産生され得る。

一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成させる遺伝子操作された宿主細胞であって、四環式プロモルフィナン前駆体のテバインへの変換が該アルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞が得られる。一部の例では、アルカロイド生成物がテバインである。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、テバインに由来する、例えば下流のモルフィナンアルカロイドを含む。別の態様では、四環式プロモルフィナン前駆体が遺伝子操作された宿主細胞内での生成物のへの中間体である。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、モルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドからなる群より選択される。

一部の例では、還元反応の基質が、式III:

の化合物またはその塩であり、式中:
R₁、R₂およびR₃は独立して、水素およびメチルから選択される。

一部の他の例では、R₁、R₂およびR₃がメチルであり、還元反応がサルタリジンレダクターゼによって触媒される。

一部の例では、炭素鎖転移反応の基質が、式IV:

一部の他の例では、R₁、R₂およびR₃がメチルであり、炭素鎖転移反応がサルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼによって触媒される。

一部の例では、テバインシンターゼの基質が、式V:

の化合物またはその塩であり、式中:
R₁、R₂およびR₃は独立して、水素およびメチルから選択され;
R₄が、メチル、エチル、プロピルおよび他の適切なアルキル基から選択される。

一部の他の例では、R₁、R₂、R₃およびR₄がメチルであり、閉環反応がテバインシンターゼによって触媒される。一部の例では、テバインシンターゼがBet v 1タンパク質である。

一部の例では、該方法により、サルタリジンからアルカロイド生成物を生成させる遺伝子操作された宿主細胞が得られる。サルタルジン（salutardine）のテバインへの変換は、前駆体からの多様なアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る。一部の例では、前駆体がL-チロシンまたは糖（例えば、グルコース）である。多様なアルカロイド生成物としては、非限定的に、モルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドが挙げられ得る。

任意の適当な炭素源が、五環式モルフィナンアルカロイドへの前駆体として使用され得る。好適な前駆体としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）またはその組合せが挙げられ得る。一部の例では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物を使用することができる（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽、バイオマスの加水分解生成物）。さらに他の態様では、炭素前駆体が1炭素化合物（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素化合物（例えば、エタノール）であり得る。また他の態様では、他の炭素含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸（例えば、L-チロシン）が使用され得る。一部の例では、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、例えばノルラウダノソリン、ラウダノソリン、ノルレチクリンおよびレチクリンなどが本発明の遺伝子操作された宿主細胞に直接添加され得る。

一部の例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物またはその誘導体が回収される。一部の例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が細胞培養物から回収される。一部の例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物がモルフィナン、ノル-オピオイドまたはナル-オピオイドアルカロイドである。

（表２）モルフィナンアルカロイド生成酵素のアミノ酸配列の例.

ビスBIA生成改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、親エピメラーゼ酵素に由来する2つの分離型エピメラーゼ酵素を用いることによる、対応する融合型酵素を用いることによるビスBIAの生成と比較した場合のビスベンジルイソキノリンアルカロイド（ビスBIA）の生成の増大を説明する。一例では、対応する融合型酵素が、2つの分離型エピメラーゼ酵素の対応するオキシダーゼ領域とレダクターゼ領域を有する融合型エピメラーゼを含む。一例では、2つの分離型エピメラーゼ酵素がオキシダーゼとレダクターゼを含み得る。ビスBIAは、2つのBIA単量体間のカップリング反応によって形成され得る二量体型分子である。一例では、ビスBIAは炭素-酸素間のカップリング反応によって形成され得る。他の例では、ビスBIAは炭素-炭素間のカップリング反応によって形成され得る。一部の例では、ビスBIA二量体型分子は、2つの同一のBIA単量体を含むホモ二量体である。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が1種のBIA単量体を生成させ得る。このような例では、BIA単量体は、1種または複数種のカップリング酵素と接触させた場合、ホモ二量体を形成し得る。他の例では、ビスBIA二量体型分子が、2つの異なるBIA単量体を含むヘテロ二量体である。例えば、ビスBIAは、互いにエナンチオマーであるBIA単量体を含むヘテロ二量体であり得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が2種類以上のBIA単量体を生成させ得る。このような例では、BIA単量体は、1種または複数種のカップリング酵素と接触させた場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し得る。

ビスBIAの生成を説明する一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、BIA単量体を生成させるように遺伝子操作され得、これが次に、ビスBIAの形成のための構成単位分子として使用され得る。ビスBIAを形成するために使用され得るBIA単量体の例としては、コクラウリン、N-メチルコクラウリン、ラウダニン、ノルコクラウリン、ノルラウダノソリン、6-O-メチル-ノルラウダノソリン、3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、3’-ヒドロキシコクラウリン、レチクリン、ノルレチクリン、ノルラウダニン、ラウダノシンおよびパパベリンが挙げられる。特に、遺伝子操作された宿主細胞は、BIA単量体をノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンから、異種酵素、例えばO-メチルトランスフェラーゼ、N-メチルトランスフェラーゼおよび3’-ヒドロキシラーゼの発現によって合成し得る。O-メチルトランスフェラーゼの例としてはノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）が挙げられ得る。O-メチルトランスフェラーゼのさらなる例としてはカテコールO-メチルトランスフェラーゼ（COMT）が挙げられ得る。N-メチルトランスフェラーゼのさらなる例としてはコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）が挙げられ得る。3’ヒドロキシラーゼの例としてはN-メチルコクラウリン3’-ヒドロキシラーゼ（CYP80B1）が挙げられ得る。

遺伝子操作された宿主細胞は、任意の所与のBIA単量体の（S）または（R）のいずれかのエナンチオマーを生成させ得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、両エナンチオマーの混合物を生成させ得る。（S）と（R）のエナンチオマーの比率は、BIA単量体を合成する該1種または複数種の酵素の基質と生成物の特異性によって決定され得る。代替的に、存在する各エナンチオマーの量を、1種の立体異性体の別の立体異性体へのエピマー化を行う遺伝子操作されたエピメラーゼの2つの分離型のオキシダーゼ酵素とレダクターゼ酵素の発現およびエンゲージメント（engagement）によって修正してもよい。一部の場合では、存在する各エナンチオマーの量が、1種の立体異性体の別の立体異性体へのエピマー化を行う遺伝子操作された融合型エピメラーゼの発現およびエンゲージメントによって修正され得る。

このようなBIA単量体を二量体型ビスBIA骨格に融合させてもよい。特に、BIA単量体は二量体型ビスBIA骨格に、遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素を用いて融合され得る。付加的または代替的に、BIA単量体は二量体型ビスBIA骨格に、遺伝子操作された宿主細胞にとって外部である供給源からBIA単量体に供給される1種または複数種の酵素を用いて融合され得る。該1種または複数種の酵素は、2つのBIA単量体を1、2または3つの位置で融合させるための炭素-酸素間および/または炭素-炭素間のカップリング反応を形成するために使用され得る。一部の例では、2つのBIA単量体はエーテル結合によって連結され得る。一部の例では、炭素-炭素間の直接結合が、2つのBIA単量体を連結させるために使用され得る。一部の例では、2つのBIA単量体を融合させることにより形成されるビスBIAは1つのジフェニルエーテル結合を含み得る。一部の例では、2つのBIA単量体が融合されて、2つのジフェニルエーテル結合を含むビスBIAを形成し得る。一部の例では、2つのBIA単量体で形成されたビスBIAは3つのジフェニルエーテル結合を含み得る。一部の例では、ビスBIAが、1つのジフェニルエーテル結合と1つのベンジルフェニルエーテル結合を含み得る。一部の場合では、ビスBIAが、1つのベンジルフェニルエーテル結合と2つのジフェニルエーテル結合を含み得る。

一例では、BIA単量体を、前記BIA単量体の少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％がビスBIAに変換されるような充分な量の、2つのBIA単量体を融合させるためのカップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素と接触させ得る。BIA単量体をビスBIAに二量体するために使用され得る該1種または複数種の酵素をBIA単量体にインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、BIA単量体をビスBIAに二量体するために使用され得る該1種または複数種の酵素をBIA単量体にインビボで接触させてもよい。さらに、該1種または複数種のビスBIA二量体化酵素を、BIA単量体を生成する宿主細胞内で発現させてもよい。代替的に、BIA単量体を、ビスBIA二量体化酵素を発現する遺伝子操作された宿主細胞に供給してもよい。代替的に、該1種または複数種のビスBIA二量体化酵素を、BIA単量体を内部に有する細胞に供給してもよく

一部の例では、ビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、式Va〜Vu:

のいずれか1つの化合物またはその塩であり、式中:
R^1a、R^1b、R^2aおよびR^2bは独立して、水素およびC₁〜C₄アルキルから選択され;
R^3a、R^3b、R^6a、R^6b、R^8aおよびR^8bは独立して、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C₁〜C₄アシル、C₁〜C₄アルキル、およびC₁〜C₄アルコキシから選択され;
R^4aおよびR^5aは独立して、水素およびC₁〜C₄アルキルから選択されるか、またはR^4aとR^5aが一体となってメチレン結合を形成しており;
R^4bおよびR^5bは独立して、水素およびC₁〜C₄アルキルから選択されるか、またはR^4bとR^5bが一体となってメチレン結合を形成しており;および
R^7a、R^7bおよびR^9aは独立して、水素およびC₁〜C₄アルキルから選択される。

一部の例では、R^1aおよびR^1bが各々、水素であり;R^2aおよびR^2bが各々、メチルであり;R^3aおよびR^3bが各々、水素であり;R^4aおよびR^5aが独立して、水素またはメチルであり;R^4bおよびR^5bが独立して、水素またはメチルであるか、またはR^4bとR^5bが一体となってメチレン結合を形成しており;R^6a、R^6b、R^8aおよびR^8bが各々、水素であり;R^7a、R^7bおよびR^9aが独立して、水素またはメチルである。

上記に示したように、式Va、VbおよびVdのビスBIA化合物は、1つの炭素-酸素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。さらに、式Vc、VfおよびVhのビスBIA化合物は、1つの炭素-酸素間のカップリング反応と1つの炭素-炭素間のカップリング反応の両方を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。さらに、式Ve、Vg、Vi、Vj、Vk、Vl、Vm、Vo、VpおよびVqのビスBIA化合物は、2つの炭素-酸素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。式VnのビスBIA化合物は、2つの炭素-酸素間のカップリング反応と1つの炭素-炭素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。さらに、式VrのビスBIA化合物は、3つの炭素-酸素間のカップリング反応を用いて2つのBIA単量体を融合させることにより形成される。

カップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素としては、公知のシトクロムP450、例えば、ベルベリス・ストロニフェラ（Berberis stolonifera）CYP80A1または該化合物を天然に合成する他の植物に由来する同様のシトクロムP450酵素が挙げられ得る。代替的に、カップリング反応を、シトクロムP450でない酵素によって行なってもよい。カップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、非天然の基質を受容するように遺伝子操作してもよい。したがって、カップリング反応を構成するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、非天然のビスBIA分子を生じさせるために使用され得る。一例では、該1種または複数種の酵素により天然のBIA単量体が非天然のBIA単量体と融合して非天然のビスBIA分子が生成し得る。他の例では、該1種または複数種の酵素により2つの非天然のBIA単量体が融合して非天然のビスBIA分子が生成し得る。遺伝子操作された酵素ストラテジーは、BIA単量体を融合させてビスBIAを生成する、カップリング反応を構成するために使用され得る1種または複数種の酵素を同定するために使用され得る。一例では、酵素遺伝子操作ストラテジーとして、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発およびスクリーニング、DNAシャッフリング、およびスクリーニングが挙げられ得る。

ビスBIAが形成されたら、ビスBIAをさらに誘導体化または改変してもよい。ビスBIAは、遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素を用いて誘導体化または改変され得る。特に、ビスBIAは、ビスBIAを遺伝子操作された宿主細胞によって産生される1種または複数種の酵素と接触させることにより誘導体化または改変され得る。付加的または代替的に、ビスBIAは、ビスBIAを、遺伝子操作された宿主細胞にとって外部である供給源からビスBIAに供給される1種または複数種の酵素と接触させることにより誘導体化または改変され得る。ビスBIAを誘導体化または改変するために使用され得る該1種または複数種の酵素は、テーラリング（tailoring）反応を行なうために使用され得る。テーラリング反応の例としては、酸化、還元、O-メチル化、N-メチル化、O-脱メチル化、アセチル化、メチレンジオキシ結合形成、およびO,O-デメチレン化が挙げられる。ビスBIAは、1つまたは複数のテーラリング反応を用いて誘導体化または改変され得る。

テーラリング反応の例を表9に示す。一部の例では、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれる炭素-炭素間のカップリング反応を触媒するためにテーラリング酵素が使用され得る。炭素-炭素間のカップリング反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ（Papaver somniferum）、ハナビシソウ、オウレン（Coptis japonica）、ベルベリス・ストロニファー（Berberis stolonifer）、キバナカラマツソウ（Thalictrum flavum）または別の種に由来するベルベリンブリッジ酵素（BBE）;ケシまたは別の種に由来するサルタリジンシンターゼ（SalSyn）;およびオウレンまたは別の種に由来するコリツベリンシンターゼ（CorSyn）が挙げられる。テーラリング酵素によって触媒され得る反応の非限定的な例をスキーム3に示し、ここで、R^a、R^b、R^cおよびR^dは独立して、水素、ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、カルボキシアルデヒド、C₁〜C₄アシル、C₁〜C₄アルキル、およびC₁〜C₄アルコキシから選択される。一部の例では、R^a、R^b、およびこれらが結合している炭素原子が任意で炭素環または複素環を形成している。一部の例では、R^c、R^dおよびこれらが結合している炭素原子が任意で炭素環または複素環を形成している。
スキーム3

一部の例では、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれる酸化反応を触媒するために使用され得る。酸化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、オウレン、アザミゲシ（Argemone mexicana）、ベルベリス・ウィルソニエー（Berberis wilsonae）または別の種に由来するテトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ（STOX）;ケシまたは別の種に由来するジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ（DBOX）;ケシまたは別の種に由来するメチルスチロピンヒドロキシラーゼ（MSH）;およびケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するプロトピン6-ヒドロキシラーゼ（P6H）が挙げられる。

また、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるメチレンジオキシブリッジ形成反応を触媒するために使用され得る。メチレンジオキシブリッジ形成反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するスチロピンシンターゼ（StySyn）;ケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するケイランチフォリンシンターゼ（CheSyn）;およびキバナカラマツソウ、トウオウレン（Coptis chinensis）または別の種に由来するカナジンシンターゼ（CAS）が挙げられる。

他の例では、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるO-メチル化反応を触媒するために使用され得る。O-メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、ハカマオニゲシ（Papaver bracteatum）または別の種に由来するノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ（6OMT）;ケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、トウオウレンまたは別の種に由来する3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ（4'OMT）;ケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するレチクリン7-O-メチルトランスフェラーゼ（7OMT）;およびケシ、キバナカラマツソウ、オウレン、トウオウレンまたは別の種に由来するスコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼ（9OMT）が挙げられる。

さらに、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるN-メチル化反応を触媒するために使用され得る。N-メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するコクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ（CNMT）;ケシ、ハナビシソウ、ハカマオニゲシまたは別の種に由来するテトラヒドロプロトベルベリンN-メチルトランスフェラーゼ（TNMT）が挙げられる。

さらに、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるO-脱メチル化反応を触媒するために使用され得る。O-脱メチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシまたは別の種に由来するテバインデメチラーゼ（T6ODM）;およびケシまたは別の種に由来するコデインデメチラーゼ（CODM）が挙げられる。

また、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれる還元反応を触媒するために使用され得る。還元反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の例としては、ケシ、ハカマオニゲシまたは別の種に由来するサルタリジンレダクターゼ（SalR）;ケシまたは別の種に由来するコデイノンレダクターゼ（COR）;およびハナビシソウまたは別の種に由来するサングイナリンレダクターゼ（SanR）が挙げられる。他の例では、テーラリング酵素は、ビスBIAまたはその誘導体において行なわれるアセチル化反応を触媒するために使用され得る。アセチル化反応を触媒するために使用され得るテーラリング酵素の一例としては、ケシまたは別の種に由来するサルタリジンアセチルトランスフェラーゼ（SalAT）が挙げられる。

O-脱メチル化改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、O-結合型メチル基の除去による第1ベンジルイソキノリンアルカロイドの第2ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1ベンジルイソキノリンアルカロイドの第2ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換が、基質のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がデメチラーゼ反応を含む。

図6は、本発明の態様による、オピオイド3-O-デメチラーゼ（ODM）活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、3位の炭素に結合している酸素からメチル基を除去する作用を行ない得る。

ODM酵素のアミノ酸配列の例を表4に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるODMのアミノ酸配列は、表4に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更されている。

第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するODMを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該ODMは、表4に列記した所与のアミノ酸配列を含む。1種または複数種のODM酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるODMを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のODMと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。

第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触してもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。

一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのO-脱メチル化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、モルヒネ、オキシモルヒネ、オリパビン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、14-ヒドロキシモルヒネ、モルヒノンおよび14-ヒドロキシモルヒノンからなる群より選択される。

一部の例では、基質アルカロイドが、コデイン、オキシコドン、テバイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、コデイノンおよび14-ヒドロキシコデイノンからなる群より選択されるオピオイドである。

N-脱メチル化改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、N-結合型メチル基の除去による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換が、基質のノル-オピオイドまたはナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がデメチラーゼ反応を含む。

図7は、本発明の態様による、オピオイドN-デメチラーゼ活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、その窒素からメチル基を除去する作用を行ない得る。

第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を行なうために使用され得るN-デメチラーゼ（NDM）酵素のアミノ酸配列の例を表5に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるNDMのアミノ酸配列は、表5に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更されている。

第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するNDMを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該NDMは、表5に列記したアミノ酸配列を含む。1種または複数種のNDM酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるNDMを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のNDMと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。

第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビトロで接触させてもよい。付加的または代替的に、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドにインビボで接触させてもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を、第1アルカロイドを内部に有する細胞に供給してもよい。一部の例では、第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するために使用され得る該1種または複数種の酵素を遺伝子操作された宿主細胞内で産生させてもよい。

一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのN-脱メチル化がアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、該アルカロイド生成物が、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択される。

一部の例では、基質アルカロイドが、コデイン、オキシコドン、テバイン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、コデイノン、14-ヒドロキシコデイノン、モルヒネ、オキシモルホン、オリパビン、ヒドロモルホン、ジヒドロモルヒネ、14-ヒドロキシ-モルヒネ、モルヒノン、および14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択されるオピオイドである。

N-メチルトランスフェラーゼ改変
本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、N-結合型側鎖基の付加による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。本明細書において提供する一部の方法、プロセスおよびシステムにより、共基質から第1アルカロイドへの側鎖基の転移による第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換を説明する。一部のこのような方法、プロセスおよびシステムは遺伝子操作された宿主細胞を含み得る。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換が、基質のナル-オピオイドへの変換のカギとなる工程である。一部の例では、第1アルカロイドの第2アルカロイドへの変換がメチルトランスフェラーゼ反応を含む。

図8は、本発明の態様による、N-メチルトランスフェラーゼ（NMT）活性を有する酵素を示す。具体的には、該酵素は、任意のモルフィナンアルカロイド構造に対して、その窒素にメチル基または他の炭素部分を付加する作用を行ない得る。S-アデノシルメチオニン（SAM）は、官能基（メチル、アリル、シクロプロピルメチルまたはその他）の供与体として作用し得る。

NMT酵素のアミノ酸配列の例を表6に示す。第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するのに使用されるNMTのアミノ酸配列は、表6に列記した所与のアミノ酸配列と75％以上同一であり得る。例えば、かかるエピメラーゼのアミノ酸配列は、本明細書において提供するアミノ酸配列と少なくとも75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、特定の態様では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで、具体的な該アミノ酸配列との少なくとも80％〜99％の同一性を含む。一部の場合では、「同一の」アミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％およびそれ以上、一部の特定の場合では少なくとも95％、96％、97％、98％および99％の同一性を含む。一部の場合では、アミノ酸配列は同一であり得るが、DNA配列は例えば、例えばコドン使用頻度が宿主生物体に対して最適化されるように変更されている。

第1アルカロイドを第2アルカロイドに変換するNMTを産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得、ここで、該NMTは、表6に示すアミノ酸配列を含む。1種または複数種のNMT酵素を産生する遺伝子操作された宿主細胞が提供され得る。遺伝子操作された宿主細胞内で産生されるNMTを、生体触媒を形成するために回収して精製してもよい。該プロセスは、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドが第2アルカロイドに変換されるのに充分な量のNMTと接触させることを含み得る。一例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも5％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。さらなる例では、第1アルカロイドを、前記第1アルカロイドの少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.7％または100％が第2アルカロイドに変換されるような充分な量の該1種または複数種の酵素と接触させ得る。

一部の例では、該方法により、アルカロイド生成物を生成する遺伝子操作された宿主細胞であって、基質の生成物へのN-メチルトランスフェラーゼがアルカロイド生成物の生成のカギとなる工程を構成し得る遺伝子操作された宿主細胞を提供する。一部の例では、生成するアルカロイドがナル-オピオイドである。さらに他の態様では、生成するアルカロイドがノル-オピオイドまたはナル-オピオイドに由来する。別の態様では、第1アルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞の該生成物までの中間体である。さらに他の態様では、アルカロイド生成物が、ナロキソン、ナルトレキソンおよびナルメフェンを含む群から選択される。

一部の例では、基質アルカロイドが、ノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンからなる群より選択されるオピオイドである。一部の例では、共基質がS-アデノシルメチオニン、アリル-S-アデノシルメチオニンまたはシクロプロピルメチル-S-アデノシルメチオニンである。

異種コード配列
一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、遺伝子操作された宿主細胞が所望の関心対象の酵素および/または関心対象のBIA、例えば、本明細書に記載のようなものを生成することを可能にする活性（1つまたは複数）をコードしている1つまたは複数の異種コード配列（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上）を有している。本明細書で用いる場合、用語「異種コード配列」は、宿主生物体内には通常存在しないが適正な条件下で該宿主の細胞内で発現され得るペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードしているか、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すために用いている。そのため、「異種コード配列」は、宿主細胞内には通常存在するコード配列の多重コピーを含んでおり、該細胞が、該細胞内には通常存在しないコード配列のさらなるコピーを発現するようになる。異種コード配列は、RNAもしくはその任意の型、例えばmRNA、DNAもしくはその任意の型、例えばcDNA、またはRNA/DNAハイブリッドであり得る。関心対象のコード配列としては、非限定的に、コード配列、イントロン、プロモーター領域、3'-UTRおよびエンハンサー領域などの特徴を含む完全長の転写単位が挙げられる。

一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、酵素を、例えば表3に列記した酵素を各々がコードしている複数の非相同コード配列を含み得る。一部の例では、該複数の異種コード配列にコードされた該複数の酵素が互いに相違し得る。一部の例では、該複数の異種コード配列にコードされた該複数の酵素の一部のものは互いに相違し得、該複数の異種コード配列にコードされた該複数の酵素の一部のものは複製コピーであり得る。

一部の例では、異種コード配列が奏功可能に関連し得る。奏功可能に関連した異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物および/またはエピメラーゼ生成物を生成させる同じ経路内に存在し得る。一部の例では、奏功可能に関連した異種コード配列は、特定のベンジルイソキノリンアルカロイド生成物および/またはエピメラーゼ生成物を生成させる経路に沿って直に逐次的（directly sequential）であり得る。一部の例では、奏功可能に関連した異種コード配列は、該複数の異種コード配列にコードされた該酵素のうちの1種または複数種間に1種または複数種の天然酵素を有し得る。一部の例では、異種コード配列が、該複数の異種コード配列にコードされた該酵素のうちの1種または複数種間に1種または複数種の異種酵素を有し得る。一部の例では、異種コード配列が、該複数の異種コード配列にコードされた該酵素のうちの1種または複数種間に1種または複数種の非天然酵素を有し得る。

また、遺伝子操作された宿主細胞は、異種コード配列を適応させるための1つまたは複数の遺伝子改変を有するように改変され得る。天然の宿主ゲノムの改変としては、非限定的に、所望の経路に干渉し得る特定のタンパク質の発現を低減または除去するためのゲノムの改変が挙げられる。かかる天然タンパク質の存在は、該経路の中間体または最終産物のうちの1種を、代謝産物または所望の経路において利用可能でない他の化合物に急速に変換し得る。したがって、天然酵素の活性を低下させるか、または完全になくした場合、生成した中間体は、所望の産物への組込みに、より容易に利用可能となり得る。

異種コード配列としては、非限定的に、植物において通常、関心対象のBIAの生成を担う野生型配列または等価な配列のいずれかである酵素をコードしている配列が挙げられる。一部の場合では、異種配列にコードされる酵素は、1-ベンジルイソキノリンアルカロイド経路内の任意の酵素であり得、任意の簡便な供給源に由来するものであり得る。具体的な合成経路での異種コード配列にコードされた酵素の選択および数は、所望の産物に基づいて選択され得る。特定の態様では、本発明の宿主細胞は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上またはさらには15以上の異種コード配列、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の異種コード配列を含み得る。

本明細書で用いる場合、用語「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のcDNAまたはmRNAの配列、ならびに完全長の転写単位のコード部分、すなわち、イントロンとエキソンを含む遺伝子、ならびに酵素をコードしているか、またはその等価なアミノ酸配列をコードしている「コドン最適化」配列、切断型配列または他の形態の改変配列も包含しているが、該等価なアミノ酸配列は機能性タンパク質を産生させるものとする。かかる等価なアミノ酸配列は1個または複数のアミノ酸の欠失を有し得、該欠失はN-末端、C-末端または内部である。切断型形態は、これが本明細書に示した触媒能を有している限り想定される。また、経路内での代謝産物の移行を容易にするために2種類以上の酵素の融合体も想定されるが、触媒活性が維持されているものとする。

動作可能な断片、変異型または切断型形態はモデリングおよび/またはスクリーニングによって同定され得る。一部の場合では、これは、例えばタンパク質のN-末端、C-末端または内部の領域の段階的な様式での欠失の後、得られた誘導体を所望の反応に対するその活性に関して本来の配列と比較して解析することによって行なわれる。当該誘導体がこの能力を動作させる場合、これは該酵素の等価な誘導体を適正に構成しているとみなされる。

例では、一部の異種タンパク質は、組換え宿主において発現させた場合、不正確にプロセッシングされるという事態を示し得る。例えば、微生物系生産宿主において発現させたシトクロムP450酵素などの植物タンパク質は、不正確なプロセッシングの事態を有し得る。特に、サルタリジンシンターゼは、酵母において異種発現させた場合、N-結合型グリコシル化が起こり得る。このN-結合型グリコシル化は植物では観察され得ず、異種微生物宿主内での該酵素の活性を低下させるような生成中のSalSyn転写物の不正確なN-末端選別を示し得る。かかる例では、N-結合型グリコシル化パターンを除去するような生成中の転写物のN-末端選別の修正に指向されるプロテインエンジニアリングにより、組換え産生宿主におけるサルタリジンシンターゼ酵素の活性の改善がもたらされ得る。

また、本発明の局面は、種々の該酵素の天然アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列をコードしている異種コード配列に関する。「等価な」アミノ酸配列は、具体的なアミノ酸配列と同一ではないが、所望の目的に使用した場合、具体的な該アミノ酸配列の同様の活性と比べて、そのタンパク質の生物学的活性に本質的に影響しない少なくともいくつかのアミノ酸変化（欠失、置換、反転、挿入など）を含むアミノ酸配列と定義する。生物学的活性は、エピメラーゼの例では、その触媒活性をいう。また、等価な配列は、本来のアミノ酸配列とは異なる特性を有するように遺伝子操作された、および/または進化したものも包含していることを意味している。関心対象の変異可能な特性としては、触媒活性、基質特異性、選択性、安定性、可溶性、局在性などが挙げられる。

一部の例では、各型の酵素の発現が、さらなる遺伝子コピー（すなわち、多重コピー）によって高まり、これにより、中間体の蓄積および/または関心対象のBIAの生成が増大する。本発明の態様は、1種または複数種類の酵素の複数種類の種の変異体の同時発現による宿主細胞における関心対象のBIAの生成の増大を含む。一部の場合では、1種または複数種類の酵素のさらなる遺伝子コピーが宿主細胞に含まれている。任意の簡便な方法、例えば、宿主細胞内の酵素の異種コード配列の多重コピーが使用され得る。

一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、酵素の異種コード配列の多重コピー、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上、5種類以上、またはさらには10種類以上のコピーを含む。特定の態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1種または複数種の酵素の異種コード配列の多重コピー、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上などの多重コピーを含む。一部の場合では、酵素の異種コード配列の多重コピーが、宿主細胞と比べて2種類以上の異なる生物体源に由来する。例えば、遺伝子操作された宿主細胞が1つの異種コード配列の多重コピーを含み得、このとき、該コピーの各々が異なる生物体源に由来する。そのため、各コピーは、明示的な配列において、異種コード配列にコードされた関心対象の酵素の種間差に基づくいくらかの多様性を含み得る。

一部の特定の態様では、遺伝子操作された宿主細胞が、1種または複数種の酵素の多コピーの異種コード配列、例えば2種類以上、3種類以上、4種類以上などの多コピーを含む。一部の場合では、ある酵素の多コピーの異種コード配列が、宿主細胞と比較して2種類以上の異なる供給源生物体に由来する。例えば、遺伝子操作された宿主細胞が多コピーの1つの異種コード配列を含み得、このとき、該コピーの各々が異なる供給源生物体に由来する。そのため、各コピーは、明示的な配列において、異種コード配列にコードされた関心対象の酵素の種間差に基づくいくらかの多様性を含み得る。

遺伝子操作された宿主細胞の培地は、関心対象のBIAの生成について試料採取され、モニタリングされ得る。関心対象のBIAは、任意の簡便な方法を用いて観察および測定され得る。関心対象の方法としては、非限定的にLC-MS法（例えば、本明細書に記載のようなもの）が挙げられ、この場合、関心対象の試料は既知量の標準化合物との比較によって解析される。さらに、関心対象のBIAが観察および/または測定され得る他の方法も存在する。BIAの観察および/または測定の代替的な方法の例としては、とりわけ、GC-MS、UV-vis分光法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC、キャピラリー電気泳動が挙げられる。実体は、例えばm/zおよびMS/MS断片化パターン、MRMトランジションによって確認され得、化合物の定量または測定は、既知保持時間のLC図のピークおよび/または該化合物の既知量の標準の対応するLC-MS解析を参照することによるEIC MSピーク解析によって行なわれ得る。一部の場合では、実体は、質量分析を用いる多重反応モニタリングによって確認され得る。

さらに、遺伝子操作された宿主細胞の培養物は、関心対象の酵素、例えばDRS-DRR酵素の産生について試料採取され、モニタリングされ得る。関心対象の酵素は、任意の簡便な方法を用いて観察および測定され得る。関心対象の方法としては、酵素活性アッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一酸化炭素分光法およびウエスタンブロット解析が挙げられる。

方法
BIA生成のために宿主細胞を培養するための方法
上記に要約したように、本発明の一部の局面は、関心対象のベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）を調製する方法を含む。さらに、本発明の一部の局面は、関心対象の酵素を調製する方法を含む。そのため、本発明の一部の局面は、遺伝子操作された宿主細胞を、1つまたは複数の宿主細胞改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）が機能的に発現されて該細胞が関心対象の出発化合物を生成物である関心対象の酵素および/またはBIAに変換するような条件下で培養することを含む。また、遺伝子操作された宿主細胞を、1つまたは複数の異種コード配列が機能的に発現されて関心対象の出発化合物が、生成物である酵素あるいは関心対象のBIAに変換されるようなタンパク質の産生に適した条件下で培養する工程を含む方法も提供する。一例では、該方法は、ベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）を調製する方法であって、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）を培養する工程;出発化合物を該細胞培養物に添加する工程;および、該BIAを該細胞培養物から回収する工程を含む、方法である。一部の例では、該方法は、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）を培養する工程;出発化合物を該細胞培養物に添加する工程;および、該酵素を該細胞培養物から回収する工程を含む、酵素を調製する方法である。

発酵培地には適当な炭素基質が含有され得る。本開示の方法を行なうのに適した炭素の供給源には多種多様な炭素含有基質が包含され得る。好適な基質としては、非限定的に、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース）、オリゴ糖（例えば、ラクトース、スクロース、ラフィノース）、多糖（例えば、デンプン、セルロース）、またはその組合せが挙げられ得る。一部の場合では、再生可能フィードストック由来の未精製混合物が使用され得る（例えば、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽）。一部の場合では、炭素基質が1炭素基質（例えば、メタノール、二酸化炭素）または2炭素基質（例えば、エタノール）であり得る。他の場合では、他の炭素含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミンおよびアミノ酸が使用され得る。

遺伝子操作された宿主細胞を培養する任意の簡便な方法が、関心対象の酵素および/またはBIAの生成のために使用され得る。使用される具体的なプロトコルは、例えば、遺伝子操作された宿主細胞、異種コード配列、関心対象の酵素、関心対象のBIAなどに応じてさまざまであり得る。細胞は、任意の簡便な環境、例えば、該細胞が1種または複数種の機能性の異種酵素を発現できる環境に存在させ得る。いくつかの態様では、細胞は、酵素発現を誘導性の条件下で、インビボでの関心対象の酵素および/またはBIAの生成を可能にすることに利用可能な適切な基質を用いて培養される。いくつかの態様では、機能性の該酵素が、インビトロ条件下での関心対象の酵素および/またはBIAの生成のために遺伝子操作された宿主から抽出される。一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が多細胞宿主生物体に戻される。遺伝子操作された宿主細胞は任意の増殖期、例えば非限定的に静止期および対数増殖期などのものであり得る。また、培養自体は連続培養であってもよく、バッチ式培養であってもよい。

細胞は、適切な発酵培地中で14〜40℃の温度にて培養され得る。細胞を、任意の簡便な速度（例えば、200 rpm）で振盪しながら培養してもよい。細胞は適当なpHで培養され得る。この発酵に好適なpH範囲はpH 5〜9であり得る。発酵は、好気性、嫌気性または微好気性条件下で行なわれ得る。任意の適当な増殖培地が使用され得る。好適な増殖培地としては、非限定的に、一般的な市販の調製培地、例えば、合成規定（SD）最少培地または酵母エキスペプトンデキストロース（YEPD）富化培地が挙げられ得る。微生物に適切な任意の他の富化、規定または合成の増殖培地を使用してもよい。

細胞は、本質的に任意のサイズおよび形状の槽内で培養され得る。本開示の方法を行なうのに適した槽の例としては、非限定的に、マルチウェル振盪プレート、試験管、フラスコ（バッフル付きおよびバッフルなし）ならびにバイオリアクターが挙げられ得る。培養容量は、10マイクロリットルから10,000リットルより多くまでの範囲であり得る。

アルカロイドの生成に望ましい様式で代謝をモジュレートすることが公知である剤の、増殖培地に対する添加を含めてもよい。非限定的な一例では、異化代謝産物抑制をモジュレートするために環状アデノシン2'3'-一リン酸が増殖培地に添加され得る。

具体的な細胞型に対して任意の簡便な細胞培養条件が使用され得る。特定の態様では、1つまたは複数の改変を含む宿主細胞が、標準的な条件または容易に最適化される条件下で標準的な細胞培養培地と補給物を用いて培養される。一例として、標準的な増殖培地は、プラスミド維持のための選択圧が必要とされない場合、20 g/Lの酵母エキス、10 g/Lのペプトンおよび20 g/Lのデキストロース（YPD）を含有するものであり得る。プラスミドを含む宿主細胞は、1.7 g/Lの酵母窒素ベース、5 g/Lの硫酸アンモニウムおよび20 g/Lのデキストロースを含有しており、増殖と選択に必要とされる適切なアミノ酸を補給した合成の完全（SC）培地中で培養される。誘導性酵素発現に有用であり得る代替的な炭素源としては、非限定的に、スクロース、ラフィノースおよびガラクトースが挙げられる。細胞は、任意の簡便な温度（例えば、30℃）で任意の簡便な速度（例えば、200 rpm）にて振盪しながら、槽内、例えば試験管もしくはフラスコ内で1〜1000 mLの範囲の容量で、またはより大容量でラボラトリーにて培養される。

培養容量を、例えば工業用プロセスの一部として、より大型の発酵槽内での培養のためにスケールアップしてもよい。工業用発酵プロセスは、密閉系バッチ、フェッドバッチもしくは連続恒成分条件下で、または任意の適当な発酵様式で行なわれ得る。一部の場合では、細胞が基質上に全細胞触媒として固定化され、アルカロイド生成のための発酵条件に供され得る。

バッチ式発酵は閉鎖系であり、この場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵プロセス中は変更されない。所望の生物体を発酵の開始時に培地中に播種する。一部の例では、バッチ式発酵は、pHおよび酸素濃度などの要素を制御するために系に対してなされる（が炭素に対してはしない）変更を伴って行なわれる。この型の発酵系では、系のバイオマスおよび代謝産物の組成が、発酵過程で連続的に変化する。細胞は典型的には誘導期から、次いで対数期（高増殖速度）、次いで静止期（増殖速度が低下または停止）、最終的に死滅期（未処理で放置した場合）と進行する。追加の場合では、バッチ式発酵系は、所望の生物体の発酵のために追加の基質を添加するための特定の時点で開放され得る。特に一部の場合では、発酵系は流加反応器を含み得る。

連続発酵は開放系であり、この場合、規定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、加工処理のために等量の発酵培地がこの槽から連続的に除去される。連続発酵系は一般的に、定常状態の増殖条件を維持するために操作され、そのため、培地の除去による細胞減損が発酵中の増殖速度によって均衡されなければならない。連続発酵は一般的に、細胞が高い定細胞密度である条件で操作される。連続発酵により、目的生成物濃度および/または細胞増殖に影響する1つまたは複数の因子のモジュレーションが可能である。

液体培地としては、非限定的に、上記の付加的成分を有する富化または合成の規定培地が挙げられ得る。培地成分は水に溶解され、熱、圧力、濾過、放射線、化学薬品またはその任意の組合せによって滅菌され得る。いくつかの培地成分は、別個に調製され、滅菌され、次いで発酵槽内で合わされ得る。培養培地は、発酵全体を通して一定のpHが維持されることが補助されるように緩衝され得る。

プロセスパラメータ、例えば温度、溶存酸素、pH、撹拌、エアレーション速度および細胞密度が発酵過程でモニタリングまたは制御され得る。例えば、発酵プロセスの温度は、培養培地中に浸漬させた温度プローブによってモニタリングされ得る。培養温度は、ジャケット温度を調節することにより設定点に制御され得る。水が外部冷却機内で冷却され、次いでバイオリアクターのコントロールタワー内に流され、ジャケットに、槽内の設定点温度が維持されるのに必要とされる温度で循環され得る。

さらに、ガス流パラメータが発酵プロセス中にモニタリングされ得る。例えば、ガスはスパージャーから培地中に流され得る。本開示の方法に適したガスとしては、圧縮空気、酸素および窒素が挙げられ得る。ガス流は固定速度であってもよく、設定点の溶存酸素が維持されるように調節してもよい。

また、培養培地のpHもモニタリングされ得る。一例では、該pHが、槽内部の培養培地中に浸漬させたpHプローブによってモニタリングされ得る。pH制御を実施する場合、pHは、各溶液を培地に必要とされる速度で添加する酸ポンプおよび塩基ポンプによって調整され得る。pHを制御するために使用される酸溶液は硫酸または塩酸であり得る。pHを制御するために使用される塩基溶液は水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化アンモニウムであり得る。

さらに、培養培地中の溶存酸素が、培養培地中に浸漬させた溶存酸素プローブによってモニタリングされ得る。溶存酸素調節を実施する場合、酸素レベルは、撹拌速度を増減させることにより調整され得る。また、溶存酸素レベルは、ガス流速を増減させることによっても調整され得る。ガスは圧縮空気、酸素または窒素であり得る。

また、撹拌速度も発酵プロセス中にモニタリングされ得る。一例では、撹拌機のモーターでアジテータが駆動され得る。撹拌機の速度は発酵全体を通して一貫したrpmに設定してもよく、設定した溶存酸素レベルが維持されるように動的に調節してもよい。

さらに、濁度が発酵プロセス中にモニタリングされ得る。一例では、細胞密度が濁度プローブを用いて測定され得る。代替的に、細胞密度は、試料をバイオリアクターから採取し、これを分光測光器で解析することにより測定され得る。さらに、試料をバイオリアクターから、滅菌試料採取装置によって間隔をあけて取り出してもよい。試料は、宿主細胞によって生成されるアルカロイドについて解析され得る。また、試料は、他の代謝産物および糖類、培養培地成分の枯渇または細胞密度についても解析され得る。

別の例では、フィードストックパラメータが発酵プロセス中にモニタリングされ得る。特に、外部のポンプを用いて発酵に加えられ得る糖類および他の炭素源、栄養物ならびに補因子などのフィードストック。また、他の成分、例えば非限定的に、消泡剤、塩類、キレート剤、界面活性剤および有機液を発酵中に添加してもよい。

宿主細胞内での異種ポリヌクレオチドの発現を最適化するための任意の簡便なコドン最適化手法が、主題の宿主細胞および方法における使用のために適合され得、例えば、Gustafsson C., et al.（2004）Trends Biotechnol, 22, 346-353（これは参照によりその全体が組み入れられる）を参照のこと。

また、主題の方法に、出発化合物を該細胞培養物に添加する工程を含めてもよい。任意の簡便な添加方法が主題の方法における使用のために適合され得る。細胞培養物には、充分な量の関心対象の出発物質（例えば、本明細書に記載のようなもの）、例えばmM〜μMの量、例えば約1〜5 mMの出発化合物が補給され得る。出発物質の添加量、添加のタイミングおよび速度、添加する物質の形態などは、さまざまな要素に応じて異なり得ることは理解されよう。出発物質はそのままで添加してもよく、適当な溶媒（例えば、細胞培養培地、水または有機溶媒）に事前に溶解させてもよい。出発物質を濃縮形態（例えば、所望の濃度の10倍）で添加し、添加時の細胞培養培地の希薄化が最小限となるようにしてもよい。出発物質は1回または複数回のバッチ式で添加してもよく、長期間（例えば、数時間または数日間）にわたる連続添加によって添加してもよい。

生成物を発酵培地から単離するための方法
また、主題の方法に、関心対象の酵素および/またはBIAを細胞培養物から回収する工程を含めてもよい。分離および単離の任意の簡便な方法（例えば、クロマトグラフィー法または沈降法）が、関心対象の酵素および/またはBIAを細胞培養物から回収するための主題の方法における使用のために適合され得る。濾過法は、細胞培養物の可溶性画分を不溶性画分から分離するために使用され得る。一部の場合では、液体クロマトグラフィー法（例えば、逆相HPLC、サイズ排除、順相クロマトグラフィー）が、関心対象のBIAを細胞培養物の他の可溶性成分から分離するために使用され得る。一部の場合では、抽出法（例えば、液体抽出、pHに基づいた精製、固相抽出、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換など）が、関心対象の酵素および/またはBIAを細胞培養物の他の成分から分離するために使用され得る。

生成したアルカロイドは発酵培地から、当技術分野において公知の方法を用いて単離され得る。所望の生成物の最初の回収で発酵の直後（または一部の場合では発酵中に）、複数回の回収工程が行なわれ得る。このような工程により、アルカロイド（例えばBIA）が細胞、細胞デブリおよび老廃物から分離され得、他の栄養物、糖類および有機分子は、使用済み培養培地中に残存し得る。このプロセスは、BIA富化生成物を得るために使用され得る。

例では、ベンジルイソキノリンアルカロイド（BIA）生成物を有する生成物流が、遺伝子操作された酵母細胞と、栄養物および水を含むフィードストックをバッチ式反応器に供給することにより形成される。特に、遺伝子操作された酵母細胞を少なくとも約5分間の期間にわたりインキュベートすることにより、遺伝子操作された酵母細胞を発酵に供して、BIA生成物と細胞材料とを含む溶液を生成させ得る。遺伝子操作された酵母細胞が発酵に供されたら、BIA生成物を細胞材料から分離するために少なくとも1つの分離ユニットが使用され、該BIA生成物を含む生成物流が得られ得る。特に、該生成物流には、BIA生成物ならびにさらなる成分、例えば清澄化した酵母培養培地が含まれ得る。さらに、BIA生成物は、1種または複数種の関心対象のBIA、例えば1種または複数種のBIA化合物を含み得る。

いろいろな方法を用いて、関心対象の酵素および/またはBIAを含むバイオリアクター培地から細胞が除去され得る。一例では、細胞は経時的な沈殿によって除去され得る。この沈殿プロセスを冷やすことにより、または清澄剤、例えばシリカの添加によって加速させてもよい。次いで、使用済み培養培地が反応器の上面から吸い上げられ得るか、または細胞が反応器の底面からデカンテーションされ得る。代替的に、細胞は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって除去され得る。また、細胞は、例えば連続フロー遠心分離による遠心分離または連続抽出装置の使用によっても除去され得る。

いくらかの貴重な関心対象の酵素および/またはBIAが細胞内部に存在している場合、細胞は透過処理または溶解され得、細胞デブリが上記のいずれかの方法によって除去され得る。細胞を透過処理するために使用される剤としては、非限定的に、有機溶媒（例えば、DMSO）または塩（例えば、酢酸リチウム）が挙げられ得る。細胞を溶解させるための方法としては、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの添加、またはビーズミリングもしくは超音波処理による機械的破壊が挙げられ得る。

関心対象の酵素および/またはBIAは清澄化した使用済み培養培地から、水性の該培養培地と非混和性である有機液の添加による液液抽出によって抽出され得る。一例では、液液抽出の使用は、他の加工処理工程に加えて用いられ得る。適当な有機液の例としては、非限定的に、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、クロロホルム、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、オレイン酸メチル、トルエン、オレイルアルコール、酪酸エチルが挙げられる。有機液は水性培地の10％程度の少なさで添加してもよく、100％程度の多さで添加してもよい。有機液は水性培地の容量の10％程度の少なさでもよく、100％でもよく、200％でもよく、300％でもよく、400％でもよく、500％でもよく、600％でもよく、700％でもよく、800％でもよく、900％でもよく、1000％でもよく、1000％超でもよく、または本明細書に列挙されたパーセンテージの間にある1つのパーセンテージでもよい。

一部の場合では、有機液は発酵の開始時に添加され得るか、または発酵中の任意の時点で添加され得る。この抽出発酵プロセスにより、酵素および/またはBIAが該有機相に連続的に除去されることによって、宿主細胞からの関心対象の酵素および/またはBIAの収率が高まり得る。

アジテーションにより、該有機相が水性の該培養培地とエマルジョンを形成するようにしてもよい。2つの相がそれぞれの層に分離するのを促す方法としては、非限定的に、乳化破壊剤もしくは核生成剤の添加、またはpHの調整が挙げられ得る。また、エマルジョンを、例えば連続コニカルプレート遠心分離によって遠心分離し、2つの相に分離してもよい。

代替的に、該有機相は水性の該培養培地から、抽出後に物理的に除去され得るように単離してもよい。例えば、溶媒の膜内への封入であり得る。

例では、関心対象の酵素および/またはBIAは発酵培地から、吸着法を用いて抽出され得る。一例では、関心対象のBIAが、清澄化した使用済み培養培地から、例えばAmberlite（登録商標）XAD4などの樹脂またはBIAを吸着によって除去する別の剤の添加によって、抽出され得る。次いで、関心対象のBIAが該樹脂から有機溶媒を用いて放出され得る。好適な有機溶媒の例としては、非限定的に、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはアセトンが挙げられる。

また、関心対象のBIAを発酵培地から濾過を用いて抽出してもよい。高pHでは、関心対象のBIAは、バイオリアクター内で結晶様析出物を形成し得る。この析出物は、フィルター、膜または他の多孔質物質に通す濾過によって直接除去され得る。また、この析出物を遠心分離および/またはデカンテーションによって収集してもよい。

上記の抽出法は、インサイチュー（バイオリアクター内）またはエクスサイチュー（ex situ）（例えば、培地がバイオリアクターから流れ出て抽出剤と接触され、次いで再循環されて槽内に戻る外部ループ内）のいずれかで行なわれ得る。代替的に、抽出法は、発酵が終了した後に、バイオリアクター槽から取り出した清澄化した培地を用いて行なわれ得る。

アルカロイド富化溶液から生成物を精製するための方法
後続の精製工程は、関心対象のBIA生成物が富化された発酵後の溶液を、関心対象の個々の生成物種を高純度で回収するための当技術分野において公知の方法を用いて処理することを伴い得る。

一例では、有機相中に抽出された関心対象のBIAは水溶液に移され得る。一部の場合では、有機溶媒が熱および/または真空によって蒸発され得、得られた粉末が適当なpHの水溶液中に溶解され得る。さらなる一例では、関心対象のBIAが有機相から、水相中への関心対象のBIAの抽出を促進させる適当なpHの水溶液の添加によって抽出され得る。次いで、水相はデカンテーション、遠心分離または別の方法によって除去され得る。

BIA含有溶液は、金属類を除去するために、例えば適当なキレート剤で処理することによってさらに処理され得る。関心対象のBIA含有溶液は、他の不純物、例えばタンパク質およびDNAを除去するために沈降によってさらに処理され得る。一例では、関心対象のBIA含有溶液は適切な沈降剤で、例えば、エタノール、メタノール、アセトンまたはイソプロパノールで処理される。代替的な一例では、DNAおよびタンパク質は透析によって、または低分子のアルカロイドを混入生体高分子から分離する他のサイズ排除法によって除去され得る。

さらなる例では、関心対象のBIAを含有している溶液は、連続クロスフロー濾過によって当技術分野において公知の方法を用いて高純度に抽出され得る。

該溶液が関心対象のBIAの混合物を含有している場合、これは酸-塩基処理に供され、当技術分野において公知の方法を用いて個々の関心対象のBIA種が得られ得る。このプロセスでは、水溶液のpHが、個々のBIAが析出するように調整される。

高純度小規模調製では、BIAは液体クロマトグラフィーによる1回の工程で精製され得る。

液体クロマトグラフィー質量分析（LCMS）法:
1-ベンジルイソキノリンアルカロイド、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド、プロモルフィナンアルカロイド、モルフィナンアルカロイド、ナル-オピオイド、およびノル-オピオイドを含む関心対象のBIA化合物は液体クロマトグラフィーを用いて分離され、質量分析を用いて検出および定量され得る。化合物の実体は特性溶出時間、質量電荷比（m/z）および断片化パターン（MS/MS）によって確認され得る。定量は、化合物のピーク面積を既知の参照標準化合物の標準曲線と比較することによって行なわれ得る。さらに、関心対象のBIAは、代替的な方法、例えばGC-MS、UV-vis分光法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLCおよびキャピラリー電気泳動によって検出され得る。

purpaldアッセイ法
脱メチル化反応のハイスループットスクリーニングには、purpaldアッセイが使用され得る。例えば、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される脱メチル化により、ホルムアルデヒドが、一般化学反応式:［基質］＋2-オキソグルタレート＋O₂ ⇔［生成物］＋ホルムアルデヒド＋スクシネート＋CO₂に示す生成物として生成する。アルカリ性条件でのpurpald試薬はホルムアルデヒドの存在下で色変化を生じ、これが、1 nMという低濃度まで分光測光器で510 nmにて定量され得る。

酵母由来アルカロイドAPI 対植物由来API
清澄化した酵母培養培地（CYCM）中には複数種の不純物が含まれ得る。清澄化した酵母培養培地は真空および/または熱によって脱水され、アルカロイド富化粉末が得られ得る。この生成物は、ケシを栽培している国が輸出しAPI製造業者が購入する、けしがら濃縮物（concentrate of poppy straw）（CPS）またはアヘンと類似している。本発明の解釈上、CPSは、所望のアルカロイド生成物が最終的にさらに精製され得る任意の型の精製植物エキスの代表例である。表10および表11に、CYCMもしくはCPSのいずれかに特異的であり得るかまたは両方に存在し得る、この2種類の生成物中の不純物を明示している。一部のBIAは不純物として色素を有し得る一方、他のBIAはそれ自体が色素として分類され得る。したがって、このようなBIAは、不純物について非色素不純物に基づいて評価され得る。起源不明の生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、酵母系生産宿主に由来するのか植物系生産宿主に由来するのかを判定することができよう。

API等級の医薬品成分は高度に精製された分子である。そのため、APIの植物起源または酵母起源を示している可能性がある不純物（例えば、表10および表11に列記したもの）は、API段階の生成物には存在し得ない。実際、本発明の酵母株に由来するAPI生成物の多くは、従来の植物由来APIとおおむね区別不可能であり得る。しかしながら、一部の場合では、慣用的なアルカロイド化合物が化学合成アプローチを用いた化学修飾に供され得、これにより、かかる化学修飾を必要とする植物ベース生成物中の化学物質不純物が現れる場合があり得る。例えば、化学的誘導体化では多くの場合、化学合成プロセスに関連する一連の不純物が生じ得る。一部の特定の状況では、このような修飾が酵母系生産プラットフォーム内で生物学的に行なわれ、それにより、化学的誘導体化に付随する不純物の一部が酵母由来生成物中に存在することが回避され得る。特に、化学的誘導体化生成物のこのような不純物は、化学合成プロセスを用いて生成されたAPI生成物中には存在し得るが、酵母由来生成物を用いて生成されたAPI生成物中には非存在であり得る。代替的に、酵母由来生成物を化学的誘導生成物と混合した場合、生じる不純物は存在し得るが、化学的誘導生成物のみを含むAPIまたは主として化学的誘導生成物を含むAPIにおいて予測され得るものより少ない量であり得る。この例では、API生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、酵母系生産宿主に由来するのか従来の化学的誘導体化経路に由来するのかを判定することができよう。

化学的に誘導体化されたモルフィナンAPI中に存在し得るが生合成API中には存在し得ない不純物の非限定的な例としては、APIコデイン中のコデイン-O（6）-メチルエーテル不純物;APIオキシコドン中の8,14-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロコデイノン;およびAPIヒドロコドン中のテトラヒドロテバインが挙げられる。コデイン-O（6）-メチルエーテルはモルヒネの化学的過剰メチル化によって形成され得る。APIオキシコドン中の8,14-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロコデイノンはテバインの化学的過剰酸化によって形成され得る。さらに、APIヒドロコドン中のテトラヒドロテバインはテバインの化学的過剰還元によって形成され得る。

しかしながら、酵母由来化合物および植物由来化合物がどちらも化学合成アプローチによる化学修飾に供された場合、化学合成プロセスに付随する同じ不純物が生成物中に存在することが予測され得る。かかる状況では、出発物質（例えば、CYCMまたはCPS）は、上記のようにして解析され得る。

宿主細胞由来ナル-オピオイド対化学的誘導ナル-オピオイド
化学合成によって作製されるナル-オピオイド中には複数種の不純物が含まれ得る。このような不純物は、多くの異なる原因、例えば、未反応の出発物質、不完全な反応、副生成物の形成、中間体の残存、二量体化または分解によって生じ得る。未反応の出発物質の一例は、ナルトレキソンの調製において残存するオキシモルホンであり得る。不完全な反応により生じる不純物の一例は、テバインの不完全な3-O-脱メチル化により生じる3-O-メチルブプレノルフィンであり得る。化学修飾によりオフターゲット部位の官能基の付加または除去がもたらされ得る。例えば、ナルトレキソン合成において10-ヒドロキシナルトレキソンおよび10-ケトナルトレキソンが生じるC10の酸化、またはブプレノルフィン合成において6-O-デスメチルブプレノルフィンが得られる6-O-メチル基の除去。不純物は、反応中間体の残存、例えば、N-脱メチル化プロセス中に形成されるオキシモルホンN-オキシドなどのN-オキシドの残存により生じ得る。不純物の別の原因は二量体化である、2つのオピオイド分子、例えば、2つのブプレノルフィン分子（2,2'-ビスブプレノルフィン）、2つのナルトレキソン分子（2,2'-ビスナルトレキソン）または2つのナロキソン分子（2,2'-ビスナロキソン）のコンジュゲーションである。不純物は、出発物質、反応中間体または反応生成物の分解によっても生じ得る。化学合成において使用される極端な物理的条件は分解の存在をより起こりやすくする。分解により生じ得る不純物の一例は、ブプレノルフィン合成時の酸化条件によって生じるデヒドロブプレノルフィンである。

宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイドには、化学合成によって作製されるナル-オピオイドとは異なる不純物が含まれ得る。宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイド中に含まれ得る不純物は化学合成によって作製されるナル-オピオイド中より少ない。宿主細胞内で酵素触媒作用によって生成するナル-オピオイドには化学合成によって作製されるナル-オピオイドにみられる一部の特定の不純物がない場合があり得る。例において、酵素合成のカギとなる特徴としては、（1）酵素が特異的な基質と残基を高い忠実度で標的化する;（2）酵素が、該分子の安定性を障害しない穏やかな細胞内生理学的条件で反応を行なう;および（3）酵素が、反応を終了へと推進する効率的な触媒となるように遺伝子操作されていることが挙げられ得る。

表12に、化学的に作製したナル-オピオイドに特異的であり得るいくつかの不純物を明示している。したがって、ナル-オピオイドは、表12のいずれかの不純物の有無を調べるために不純物について評価され得る。起源不明の生成物をこのような不純物のサブセットについて解析することにより、当業者は、生成物が、化学合成に由来するのか酵素的合成に由来するのかを判定することができよう。

宿主細胞の遺伝子操作方法
また、関心対象の酵素および/またはBIAを生成する目的のための宿主細胞の遺伝子操作方法も含む。宿主細胞内へのDNAの挿入は任意の簡便な方法を用いて行なわれ得る。該方法は、異種コード配列を遺伝子操作された宿主細胞内に、該宿主細胞が酵素を機能的に発現し、関心対象の出発化合物を生成物である関心対象の酵素および/またはBIAに変換するように挿入するために使用される。

任意の簡便なプロモーターが、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法において使用され得る。異種コード配列の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいが、該プロモーターは遺伝子操作された宿主細胞内で活性であるものとする。異種コード配列は、その天然プロモーターによって発現されるものであってもよく、非天然プロモーターを使用してもよい。かかるプロモーターは、これが使用される宿主において低度から高度の強度であり得る。プロモーターは調節されていてもよく構成的であってもよい。特定の態様では、グルコース抑制型でないか、または培養培地中のグルコースの存在によって軽度にしか抑制されないプロモーターが使用される。関心対象のプロモーターとしては、非限定的に、解糖系遺伝子のプロモーター、例えば、枯草菌tsr遺伝子（フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター領域をコードしている）のプロモーターまたはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD、GAPDHもしくはTDH3）をコードしている出芽酵母遺伝子由来のプロモーター、パン酵母のADH1プロモーター、リン酸欠乏誘導型プロモーター、例えば、酵母のPHO5プロモーター、B.リケニフォルミス由来のアルカリホスファターゼプロモーター、酵母の誘導性プロモーター、例えば、Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、抑制性プロモーターMet25、tetO、および構成的プロモーター、例えば、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（GPD）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ADH）、翻訳-伸長因子-1-αプロモーター（TEF）、シトクロムc-オキシダーゼプロモーター（CYC1）、MRP7プロモーターなどが挙げられる。また、ホルモン、例えばグルココルチコイド、ステロイドおよび甲状腺ホルモンにより誘導性のプロモーターを含む自律複製型酵母発現ベクターも使用され得、非限定的に、グルコルチコイド応答エレメント（GRE）および甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）が挙げられ得る。これらおよび他の例は米国特許第7,045,290号に記載されており、これは参照により、これに引用された参考文献も含めて組み入れられる。構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGH）を含むさらなるベクターが使用され得る。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組合せ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBどおり）もまた、遺伝子発現を駆動させるために使用することができよう。例えば大腸菌の宿主細胞に対して任意の簡便な適切なプロモーターが選択され得る。プロモーターの選択を、転写物、したがって酵素レベルを最適化して産生を最大限にするとともにエネルギー資源を最小限にするために使用してもよい。

任意の簡便なベクターが、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法において使用され得る。関心対象のベクターとしては、酵母および他の細胞における使用のためのベクターが挙げられる。酵母ベクターの型は、4つの一般カテゴリー:組込み型ベクター（YIp）、自律複製型高コピー数ベクター（YEpまたは2μプラスミド）、自律複製型低コピー数ベクター（YCpまたはセントロメアプラスミド）および大型断片のクローニング用ベクター（YAC）に分けられ得る。ベクターDNAは原核生物細胞または真核生物細胞内に、任意の簡便な形質転換またはトランスフェクション手法によって導入される。別の供給源のDNA（例えば、PCR生成二本鎖DNA産物、または合成の二本鎖もしくは一本鎖のオリゴヌクレオチド）を、ゲノム内への組込みによる酵母の遺伝子操作のために使用してもよい。任意の単一の形質転換事象は、宿主細胞を遺伝子改変するための1つまたはいくつかの核酸（ベクター、二本鎖または一本鎖DNA 断片）を含み得る。図11は、簡便なベクターの例を示す。さらに表8は、図11に示された配列の一部分が由来しうるベースプラスミド配列の例を提供する。一部の態様では、本明細書に開示した態様の局面を統合する際に、表8のプラスミド配列が利用され得る。

有用性
例えば上記のもののような本発明の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな用途における利用が見出される。関心対象の用途としては、非限定的に:研究用途および治療用途が挙げられる。本発明の方法は、さまざまな異なる用途、例えば、酵素および/またはBIAの生成が関心対象となる任意の簡便な用途における利用が見出される。

主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな治療用途における利用が見出される。関心対象の治療用途としては、BIAを含む医薬製剤品の調製が関心対象である用途が挙げられる。本明細書に記載の遺伝子操作された宿主細胞は、関心対象のBIAと関心対象の酵素を生成する。レチクリンは、最終生成物、例えばオピオイド生成物を生成するための遺伝子操作作業を含むBIAの合成における関心対象の主要な分岐点中間体である。主題の宿主細胞は、関心対象のBIA（レチクリンおよびBIA最終生成物を含む）の生成における利用が見出され得る単純で廉価な出発物質から関心対象のBIAを生成するために使用され得る。そのため、主題の宿主細胞は、治療活性な関心対象のBIAの供給における利用が見出される。

一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞および方法は、化学合成では収量が少なく、大規模生産には実行可能な手段でない商業規模の量のBIAの生産における利用が見出される。一部の特定の場合では、宿主細胞および方法は、治療製剤品用の関心対象のBIAの迅速生産を可能にする例えば5,000〜200,000リットル容のバイオリアクター（発酵槽）を含み得る発酵施設内で使用される。かかる用途としては、発酵性炭素源、例えば、セルロース、デンプンおよび遊離糖からの関心対象のBIAの工業規模の生産が挙げられ得る。

主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、さまざまな研究用途における利用が見出される。主題の宿主細胞および方法は、さまざまな関心対象の酵素および/またはBIAの生合成経路に対するさまざまな酵素の効果を解析するために使用され得る。また、遺伝子操作された宿主細胞は、今のところまだわかっていない治療的機能における関心対象の生理活性についての試験における利用が見出される関心対象の酵素および/またはBIAを生成するように遺伝子操作され得る。一部の場合では、さまざまな酵素をコードしているさまざまな異種コード配列を含めるという宿主細胞の遺伝子操作により、関心対象の酵素および/またはBIAへの高収量生合成経路が解明されている。一部の特定の場合では、研究用途としては、次いで所望の生成物にさらに化学修飾もしくは誘導体化され得る関心対象の治療用分子用の、または関心対象の治療活性の増大についてスクリーニング用の関心対象の酵素および/またはBIAの生成が挙げられる。一部の例では、宿主細胞株は、かかる経路において関心対象である酵素活性についてスクリーニングするために使用され、これにより、このような細胞株内で生成したBIAの代謝産物の変換により酵素の発見がもたらされ得る。

主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、植物に特殊な代謝産物の生産プラットフォームとして使用され得る。主題の宿主細胞および方法は、薬物ライブラリーの開発ならびに植物酵素の発見のプラットフォームとして使用され得る。例えば、主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、興味対象の骨格分子、例えばガテガウメリン（guattegaumerine）を生成する酵母株を採用し、該化合物の構造をコンビナトリアル生合成または化学的手段によってさらに機能性にすることにより、天然産物ベースの薬物のライブラリーの開発における利用が見出され得る。このようにして薬物ライブラリーを作成することにより、潜在的薬物ヒット（あれば）が既に、大規模での培養および生産に適した生産宿主に付随している。別の例として、このような主題の遺伝子操作された宿主細胞および方法は、植物酵素の発見における利用が見出され得る。主題の宿主細胞により、新たな酵素活性を同定するために植物ESTライブラリーを発現させるための規定の代謝産物のクリーンなバックグラウンド（clean background）が提供される。主題の宿主細胞および方法により、酵母における植物酵素の機能性発現および活性増大のための発現方法および培養条件が提供される。

キットおよびシステム
本発明の局面は、本発明の方法において使用される1種または複数種の成分、例えば、本明細書に記載のような遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、異種コード配列、ベクター、培養培地などを含み得るキットおよびシステムをさらに含む。いくつかの態様では、主題のキットは、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、本明細書に記載のようなもの）と、以下のもの:出発化合物、異種コード配列および/または該配列を含むベクター、ベクター、増殖用フィードストック、発現系における使用に適した成分（例えば、細胞、クローニングベクター、マルチクローニングサイト（MCS）、双方向プロモーター、内部リボソーム進入部位（IRES）など）および培養培地から選択される1種または複数種の成分とを含む。

本明細書に記載の任意の成分、例えば、1つまたは複数の改変を含む宿主細胞、出発化合物、培養培地などがキット内に備えられ得る。異種コード配列、クローニングベクターおよび発現系の作製および使用における使用に適したさまざまな成分が、主題のキットにおいて利用が見出され得る。また、キットにチューブ、バッファーなど、および使用説明書を含めてもよい。キットの種々の試薬成分は、所望により、別々の容器内に存在させてもよく、該成分の一部または全部を単一の容器内で事前に合わせて試薬混合物にしておいてもよい。

また、関心対象の酵素および/またはBIAを生成するためのシステムであって、1つまたは複数の改変（例えば、本明細書に記載のようなもの）を含む遺伝子操作された宿主細胞、出発化合物、培養培地、発酵槽および発酵設備、例えば、宿主細胞の増殖条件を維持するのに適した装置、試料採取およびモニタリングの設備および成分などを含み得るシステムも提供する。酵母細胞の大規模発酵における使用に適したさまざまな要素が主題のシステムにおいて利用が見出され得る。

一部の場合では、システムは、遺伝子操作された宿主細胞の大規模発酵ならびに発酵させた宿主細胞によって生成される酵素および/またはBIA化合物のモニタリングおよび精製のための要素を含む。一部の特定の態様では、1種または複数種の出発化合物（例えば、本明細書に記載のようなもの）をシステムに、発酵槽内の遺伝子操作された宿主細胞によって関心対象の1種または複数種の所望のBIA生成物が生成される条件下で添加する。一部の場合では、宿主細胞が関心対象のBIA（例えば、本明細書に記載のようなもの）を生成させる。一部の特定の場合では、関心対象のBIA生成物がオピオイド生成物、例えばテバイン、コデイン、ネオピン、モルヒネ、ネオモルヒネ、ヒドロコドン、オキシコドン、ヒドロモルホン、ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイン、ジヒドロモルヒネおよびオキシモルホンである。一部の場合では、関心対象のBIA生成物がナル-オピオイド、例えばナルトレキソン、ナロキソン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロルフィン、ナロデイン、ナルデメジン、ナロキセゴール、6β-ナルトレキソール、ナルトルインドール、メチルナルトレキソン、メチルサミドルファン、アルビモパン、アキセロプラン、ベベンプラン、ジニコチネート、レバロルファン、サミドルファン、ブプレノルフィン、デゾシン、エプタゾシン、ブトルファノール、レボルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン、フェナゾシン、ノルビナルトルフィミンおよびジプレノルフィンである。一部の場合では、関心対象のBIA生成物がノル-オピオイド、例えばノルコデイン、ノルオキシコドン、ノルテバイン、ノルヒドロコドン、ノルジヒドロ-コデイン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイン、ノルコデイノン、ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン、ノルモルヒネ、ノルオキシモルホン、ノルオリパビン、ノルヒドロ-モルホン、ノルジヒドロ-モルヒネ、ノル-14-ヒドロキシ-モルヒネ、ノルモルヒノンおよびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノンである。一部の場合では、BIA生成物がビスベンジルイソキノリン生成物、例えばベルバムニン、ガテガウメリン、ダウリシンおよびリエンシニンである。

一部の場合では、システムは、主題の宿主細胞によって生成される1種または複数種の関心対象の酵素および/またはBIA化合物をモニタリングおよびまたは解析するためのプロセスを含む。例えば、本明細書に記載のようなLC-MS解析のシステム、クロマトグラフィーのシステム、または試料が解析されて標準と比較され得る任意の簡便なシステム、例えば、本明細書に記載のようなもの。発酵培地は、発酵前および発酵中の任意の簡便な時点で試料採取および解析によってモニタリングされ得る。出発化合物の関心対象の酵素および/またはBIA生成物への変換が完了すると、発酵は停止され得、BIA生成物の精製が行なわれ得る。そのため、一部の場合では、主題のシステムは、関心対象の酵素および/またはBIA生成物をそれが生成された宿主細胞培地から精製するのに適した、精製要素を含む。精製要素としては、発酵によって生成された関心対象の酵素および/またはBIA生成物を精製するために使用され得る任意の簡便な手段、例えば非限定的に、シリカクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HICクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体抽出およびpH抽出法が挙げられ得る。一部の場合では、主題のシステムにより、該システムに1種または複数種の出発化合物を投入した後に関心対象の酵素および/またはBIA発酵産物の生成および単離がもたらされる。

以下の実施例は、当業者に、本発明をどのようにして作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するために示し、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が行なわれる実験のすべて、または唯一の実験であることを表していることを意図するものでもない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確性が確保されるように努力したが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮されたい。特に記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

酵素リストの論考
宿主細胞は、関心対象のBIAおよび/または関心対象の酵素の生成をもたらす1つまたは複数の改変（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上またはさらにはそれ以上の改変）を含むように遺伝子操作され得る。表3に、遺伝子操作された宿主細胞において関心対象のBIAの生成および/または関心対象の酵素の産生をもたらすような1つまたは複数の改変に作用され得る例示的な遺伝子を列記する。

表3に示す遺伝子の改変は、増殖に必要とされる最低限の栄養物を含有している培地が供給された遺伝子操作された宿主細胞から関心対象のBIAを生成するために使用され得る。この最少培地には炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン類および塩類が含有され得る。例えば、表3に示す遺伝子の改変は、糖質が供給された遺伝子操作された宿主細胞から関心対象のBIAを生成するために使用され得る。さらに、表3に示す1つまたは複数の遺伝子の改変は、薬物生産のために遺伝子操作され得る宿主細胞の生合成プロセスを増大させるために使用され得る。

さらに、遺伝子操作された宿主細胞において関心対象のBIAの生成および/または関心対象の酵素の産生をもたらすためのこのような改変の使用は、遺伝子によって産生され得る酵素の単なる同定からは容易にわかることではない。特に、本明細書に記載のような宿主細胞、例えば酵母細胞内で再構築された合成経路は、単一の生物体において天然状態で一緒になって作用するものでないさまざまな酵素を含む。さらに、本明細書において論考した酵素のうちの一部のものは、その天然の状況ではBIAの生合成のために作用しない。さらに、本明細書に記載の酵素のうちの一部のものは、特定の宿主細胞、例えば酵母細胞において機能するように進化せず、一緒になって機能するように進化しない。このような場合、該酵素が、宿主細胞内、例えば酵母内の合成BIA経路の状況において、下流のBIA最終生成物を生成するために経路を通して十分なフラックスを有するのに十分な活性を示すであろうことは、自明ではないであろう。

例えば、植物酵素は多くの場合、異種微生物宿主、例えば酵母において機能的に発現させることが困難である。多くの場合、該酵素は、ミスフォールディングされ得る、宿主細胞内に正しく局在化され得ない、および/または不正確にプロセッシングされ得る。タンパク質の翻訳およびプロセッシングにおける酵母と植物間の違いにより、このような酵素が示す酵母宿主内における活性はかなり低いものから検出不可能なまでの程度となり得る。このような課題は一般的に、内膜に局在する酵素、例えばシトクロムP450について生じ、BIA経路内で強く示される。酵素活性が低い場合であっても、複雑なBIAを生成するように酵母を遺伝子操作することにはかなりの課題が提示され得、所望のBIA生成物の高レベルの蓄積を確保するために各工程で充分な活性が必要とされる。

さらに、一部の宿主細胞、例えば酵母には、BIA経路内の初期段階の前駆体（すなわち、チロシンからノルコクラウリンまでの中間体）の多くに対して作用し得る内因性酵素/経路が存在し、したがって、このような競合性の内因性経路を考慮すると、異種経路による充分なフラックスが存在して相当なBIA生成が達成され得るであろうことは容易に明らかでないかもしれない。例えば、酵母におけるErlich経路（Hazelwood, et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 2259-66; Larroy, et al. 2003. Chem. Biol. Interact. 143-144: 229-38; Larroy, et al. 2002. Eur. J. Biochem. 269: 5738-45）は、初期段階のBIA経路の中間体の多くを望ましくない生成物に変換し、フラックスを合成経路からそらすために作用する可能性がある主要な内因性経路である。

さらに、本明細書において論考し、表3に示した酵素の多くは、天然の植物宿主内では非常に特異的な調節ストラテジー下、例えば空間的調節下で機能を果たし得るが、これは、異種酵母宿主に移されると失われ得る。また、植物は、酵母細胞と非常に異なる、該酵素が機能を果たすように進化する生化学的環境、例えば、pH、レドックス状態、ならびに基質、共基質、補酵素および補因子利用能を提示する。天然宿主と異種酵母宿主間の生化学的環境および調節ストラテジーの違いを考慮すると、該酵素が酵母環境の状況下における場合で相当な活性を示すであろうことは自明でなく、さらに、該酵素が一緒になって、単純な前駆体、例えば糖を複雑なBIA化合物に指向するように動作するであろうことは自明でない。酵母宿主内で該酵素の活性が維持されることは特に重要であり、それは、該経路の多くが多くの反応工程（>10）を有しており、したがってこれらの工程が効率的でなければ所望の下流産物の蓄積が期待され得ないためである。

また、天然の植物宿主では、このような経路に付随する代謝産物が異なる細胞型および組織型にまたがって局在し得る。いくつかの例では、生合成に特殊化され得る細胞型および代謝産物の蓄積のために合成され得る細胞型が存在する。このような型の細胞の特殊化は、異種酵母宿主内で該経路を発現させた場合は失われ得、該細胞に対するこのような代謝産物の毒性の制御に重要な役割を果たし得る。したがって、酵母が、このような代謝産物を、このような化合物の毒性によって害されることなく生合成して蓄積させるように、成功裡に遺伝子操作され得るであろうことは自明でない。

一例として、天然の植物宿主では、酵素BBEが動的細胞内局在を有することが報告されている。特に、酵素BBEは、最初はER内から始まり、次いで液胞内に分取される（Bird and Facchini. 2001. Planta. 213: 888-97）。植物におけるBBEのER結合（Alcantara, et al. 2005. Plant Physiol. 138: 173-83）がBBE活性のための最適な塩基性pH（pH約8.8）を提供していることが示唆されている（Ziegler and Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69）。別の例として、サングイナリン生合成が植物細胞内の特殊な小胞内で起こるという証拠がある（Amann, et al. 1986. Planta. 167: 310-20）が、この小胞内には一部の中間体しか蓄積されない。これは、該中間体を他の酵素活性および/または毒性効果から隔離するために起こるのかもしれない。

別の例として、モルフィナン経路分岐内の生合成酵素がすべて、植物の維管束組織の一部である師部に局在する。師部内では、経路内酵素が2つの細胞型:すべての植物に一般的な篩要素、および特殊な二次代謝産物を作り出すある特定の植物にのみ存在する特殊な細胞型である乳管にさらに分けられ得る。上流酵素（すなわち、NCSからSalATまで）は主に篩要素内に存在し、下流酵素（すなわち、T6ODM、COR、CODM）はほとんどが乳管内に存在する（Onoyovwe, et al. 2013. Plant Cell. 25: 4110-22）。さらに、ノスカピン生合成経路の最終工程は乳管内で起こることが見出された（Chen and Facchini. 2014. Plant J. 77: 173-84）。この区分けは、中間体を単離または輸送し、最適なpHを提供し、補因子の供給を増強させることによる生合成の調節に非常に重要であると考えられるが、ケシの乳管の微小環境の性質はまだ究明中である（Ziegler and Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69）。さらに、該酵素のうちのいくつかは、植物の二次代謝に一般的な多酵素複合体または代謝チャネルとしての機能を果たし得ることが予測される（Kempe, et al. 2009. Phytochemistry. 70: 579-89; Allen, et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 1559-66）。異なる宿主に由来する生合成酵素を合わせた場合および/または生合成酵素を異種酵母細胞内で組換え発現させた場合、このような複合体またはチャネルが天然宿主内の場合のように形成されることは明白でない。さらなる一例において、オウレンでは、ベルベリンが根の組織内で生合成され、次いで、特殊なATP結合カセット輸送タンパク質の作用によって地下茎内に蓄積される（Shitan, et al. 2013. Phytochemistry. 91: 109-16）。ケシでは、モルフィナンアルカロイドがラテックス（乳管細胞の細胞質）中に蓄積される（Martin, et al. 1967. Biochemistry. 6: 2355-63）。

さらに、このような考慮事項がない場合であっても、本明細書に記載の経路内の工程のいくつかで、植物酵素がまだ特性評価されていないという場合もある。例えば、初期段階のベンジルイソキノリンアルカロイド骨格であるノルコクラウリンへのチロシンの変換はまだ特性評価されていない。したがって、本明細書に記載の経路内の工程のいくつかで、通常、天然状態ではBIAの生合成のために一緒に存在しない酵素活性を一緒にすること、または再構築経路に使用される新たな酵素活性をゲノム配列情報から同定することにより代替的な生合成スキームをもたらした。

例えば、チロシンのドパミンへの二工程変換は、天然では一緒に存在せず、この経路の状況で、または植物酵素とともに機能を果たすように進化しなかった少なくとも5種類の哺乳動物酵素と1種の細菌酵素を合わせることにより行なわれ得る。このような場合では、このような酵素を、これが天然状態ではそのために進化しなかった化合物の生合成のために使用すること、および異種微生物宿主およびこの経路の状況において有効に機能を果たし得るであろうことは自明とはなり得ない。

別の例として、近年まで、（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換を担う酵素は不明であった。融合型エピメラーゼ酵素が発見されたときでさえ、進化論的解析により、モルヒネ生成ポピーではエピメラーゼの反応のためのオキシダーゼとレダクターゼとの融合酵素が生じると示唆され、これはエピメラーゼ酵素が非融合型である非モルヒネ生成ポピーとは対照的であった。この解析に基づき、一部の学者は、オキシダーゼ部分とレダクターゼ部分の融合が（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換を効率的に触媒するのに必要であると考えた。本明細書において論考する遺伝子操作された分割型エピメラーゼを使用する新規な方法では、このエピマー化反応が酵母内でBIA合成経路の状況において行われ得、このエピマー化は、野生型エピメラーゼを用いて行われるエピマー化よりも高効率で行われ得る。

関心対象のBIAが生成および/または関心対象の酵素が産生するような改変の対象物である遺伝子の例を以下に論考する。さらに、該遺伝子を、関心対象のBIAおよび/または関心対象の酵素の産生に使用される経路を示す一連の図の状況において論考する。

［TLK1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素トランスケトラーゼの発現を改変し得る。トランスケトラーゼはTKL1遺伝子にコードされている。一例では、トランスケトラーゼは、図2に示すようなフルクトース-6-リン酸＋グリセルアルデヒド-3-リン酸 ⇔ キシロース-5-リン酸＋エリトロース-4-リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTKL1遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTKL1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTKL1遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TKL1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞において組込まれるように改変され得る。TKL1遺伝子は出芽酵母または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TKL1遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［ZWF1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼはZWF1遺伝子にコードされている。一例では、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、図2に示すようなグルコース-6-リン酸→6-ホスホグルコノラクトンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のZWF1遺伝子のコード領域が欠失するように改変され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりZWF1遺伝子の機能性が無効になるように改変され得る。

［ARO4］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸（DAHP）シンターゼの発現を改変し得る。DAHPシンターゼはARO4遺伝子にコードされている。一例では、DAHPシンターゼは、図2に示すようなエリトロース-4-リン酸＋ホスホエノールピルビン酸→DAHPの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞はARO4遺伝子を、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が組込まれるように改変し得る。特に、フィードバック阻害緩和変異（例えば、ARO4^FBR）は、天然型ARO4遺伝子の本来の遺伝子座に特異的変異として;別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入される追加コピーとして;またはエピゾーマルベクター、例えば2μmまたはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。変異ARO4^FBRの識別表示「FBR」は、フィードバック耐性の変異型および変異をいう。DAHPシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、例えば遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞である場合、天然酵母の転写調節下に存在し得る。代替的に、DAHPシンターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、遺伝子操作された宿主細胞に、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入され得る。一部の場合では、ARO4遺伝子は出芽酵母に由来するものであり得る。一部の場合では、ARO4遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。ARO4遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性変異、K229LまたはQ166Kが挙げられる。

［ARO7］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コリスミ酸ムターゼの発現を改変し得る。コリスミ酸ムターゼはARO7遺伝子にコードされている。一例では、コリスミ酸ムターゼは、図2に示すようなコリスメート→プレフェネートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞はARO7遺伝子を、1つまたは複数のフィードバック阻害緩和変異が組込まれるように改変し得る。特に、フィードバック阻害緩和変異（例えば、ARO7^FBR）は、天然型ARO7遺伝子の本来の遺伝子座に特異的変異として;別個の遺伝子座における組込み遺伝子として導入される追加コピーとして;またはエピゾーマルベクター、例えば2μmまたはセントロメアプラスミド上の追加コピーとして組込まれ得る。変異ARO7^FBRの識別表示「FBR」は、フィードバック耐性の変異型および変異をいう。コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、例えば遺伝子操作された宿主細胞が酵母細胞である場合、天然酵母の転写調節下に存在し得る。代替的に、コリスミ酸ムターゼ酵素のフィードバック阻害コピーは、遺伝子操作された宿主細胞に、合成プロモーターの制御下に配置することによるタンパク質発現の構成的または動的な遺伝子操作された調節を伴って導入され得る。一部の場合では、ARO7遺伝子は出芽酵母に由来するものであり得る。一部の場合では、ARO7遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。ARO7遺伝子に対する改変の例としては、フィードバック阻害耐性変異またはT226Iが挙げられる。

［ARO10］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの発現を改変し得る。フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼはARO10遺伝子にコードされている。一例では、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート→4-ヒドロキシフェニルアセテート（4HPA）の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO10遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO10遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO10遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、ARO10遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。ARO10遺伝子は出芽酵母または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、ARO10遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［ADH2〜7、SFA1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の発現を改変し得る。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アルコールデヒドロゲナーゼは、4HPA→チロソールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数のコード領域が欠失するように改変され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7およびSFA1遺伝子のうちの1つまたは複数の機能性が無効になるように改変され得る。

［ALD2〜6］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、アルデヒドオキシダーゼ酵素の発現を改変し得る。アルデヒドオキシダーゼ酵素は、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アルデヒドオキシダーゼは、4HPA→ヒドロキシフェニル酢酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数のコード領域が欠失するように改変され得る。代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、例えば不活性化変異を導入することによりALD2、ALD3、ALD4、ALD5およびALD6遺伝子のうちの1つまたは複数の機能性が無効になるように改変され得る。

［AAD4］、［AAD6］、［AAD10］］、［AAD14］、［AAD15］、［AAD16］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が、アリール-アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の発現を改変し得る。アリール-アルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、AAD4、AAD6、AAD10、AAD14、AAD15およびAAD16遺伝子のうちの1つまたは複数にコードされ得る。一例では、アリール-アルコールデヒドロゲナーゼは、芳香族アルデヒド＋NAD^＋→芳香族アルコール＋NADHの反応を触媒する。

［ARO9］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を改変し得る。芳香族アミノトランスフェラーゼはARO9遺伝子にコードされている。一例では、芳香族アミノトランスフェラーゼは、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート＋L-アラニン←→チロシン＋ピルベートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO9遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のARO9遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO9遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、ARO9遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。ARO9遺伝子は出芽酵母または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、ARO9遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［ARO8］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素芳香族アミノトランスフェラーゼの発現を改変し得る。芳香族アミノトランスフェラーゼはARO8遺伝子にコードされている。一例では、芳香族アミノトランスフェラーゼが、図2に示すようなヒドロキシフェニルピルベート＋グルタメート⇔チロシン＋アルファ-ケトグルテレートの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのARO8遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのARO8遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのARO8遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのARO8遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。ARO8遺伝子は出芽酵母または別の種に由来し得る。一部の例では、ARO8遺伝子が天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［TYR1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素プレフェン酸デヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。プレフェン酸デヒドロゲナーゼはTYR1遺伝子にコードされている。一例では、プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、図2に示すようなプレフェネート＋NADP^＋→4-ヒドロキシフェニルピルベート＋CO₂＋NADPHの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTYR1遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTYR1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYR1遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTYR1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。TYR1遺伝子は出芽酵母または別の種に由来し得る。一部の例では、TYR1遺伝子が天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［TYR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシナーゼの発現を改変し得る。チロシナーゼはTYR遺伝子にコードされている。一例では、チロシナーゼは、図2、12、および13に示すようなチロシン→L-DOPAの反応を触媒する。他の例では、チロシナーゼは、L-DOPA→ドパキノンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TYR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。TYR遺伝子は青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、ツクリタケ（Agaricus bisporus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TYR遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［TyrH］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシンヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。チロシンヒドロキシラーゼはTyrH遺伝子にコードされている。一例では、チロシンヒドロキシラーゼは、図2、12、および13に示すようなチロシン→L-DOPAの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTyrH遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTyrH遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTyrH遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TyrH遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。TyrH遺伝子はヒト、ドブネズミ、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TyrH遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［DODC］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素L-DOPAデカルボキシラーゼの発現を改変し得る。L-DOPAデカルボキシラーゼはDODC遺伝子にコードされている。一例では、L-DOPAデカルボキシラーゼは、図2、12、および13に示すようなL-DOPA→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDODC遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDODC遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDODC遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DODC遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。DODC遺伝子はシュードモナス・プチダ、ドブネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DODC遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［TYDC］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素チロシン/DOPAデカルボキシラーゼの発現を改変し得る。チロシン/DOPAデカルボキシラーゼはTYDC遺伝子にコードされている。一例では、チロシン/DOPAデカルボキシラーゼは、図2、12、および13に示すようなL-DOPA→ドパミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYDC遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTYDC遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTYDC遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TYDC遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。TYDC遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TYDC遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［MAO］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モノアミンオキシダーゼの発現を改変し得る。モノアミンオキシダーゼはMAO遺伝子にコードされている。一例では、モノアミンオキシダーゼは、図2および13に示すようなドパミン→3,4-DHPAの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMAO遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMAO遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのMAO遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、MAO遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、MAO遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。MAO遺伝子は大腸菌、ヒト、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、MAO遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。

［NCS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリンシンターゼの発現を改変し得る。ノルコクラウリンシンターゼはNCS遺伝子にコードされている。一例では、ノルコクラウリンシンターゼは、図12および13に示すような4HPA＋ドパミン→(S)-ノルコクラウリンの反応を触媒する。特に、図12は、本発明の態様による、ノルコクラウリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図12は、酵素TyrH,チロシンヒドロキシラーゼ;DODC,DOPAデカルボキシラーゼ;NCS,ノルコクラウリンシンターゼ（本明細書において論考したもの）;6OMT,6-O-メチルトランスフェラーゼ;CNMT,コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ;CYP80B1,シトクロムP450 80B1;CPR,シトクロムP450 NADPHレダクターゼ;4'OMT,3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ. L-DOPA,L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン;および4-HPA,4-ヒドロキシフェニルアセチルアルデヒドの使用を示す。図12に示した酵素のうち、4-HPAおよびL-チロシンは酵母内で天然に合成される。列挙された他のすべての代謝産物は酵母内で天然に生成されない。さらに、TyrHはL-チロシンのL-DOPAへの変換を触媒し得るが、本明細書に記載のように他の酵素もまた、この工程を行なうために使用され得る。例えば、チロシナーゼもまた、L-チロシンのL-DOPAへの変換を行なうために使用され得る。また、他の酵素、例えばシトクロムP450オキシダーゼもまた、L-チロシンのL-DOPAへの変換を行なうために使用され得る。かかる酵素は、関連BIA前駆体化合物、例えばL-DOPAおよびL-チロシンに対してオキシダーゼ活性を示し得る。

さらに、ノルコクラウリンシンターゼは、図13に示すような3,4-DHPA＋ドパミン→(S)-ノルラウダノソリンの反応を触媒する。特に、図13は、本発明の態様による、ノルラウダノソリンを経由するL-チロシンのレチクリンへの変換の生合成スキームを示す。図13は、酵素TyrH,チロシンヒドロキシラーゼ;DODC,DOPAデカルボキシラーゼ;maoA,モノアミンオキシダーゼ;NCS,ノルコクラウリンシンターゼ;6OMT,6-O-メチルトランスフェラーゼ;CNMT,コクラウリンN-メチルトランスフェラーゼ;4'OMT,3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン4'-O-メチルトランスフェラーゼ.L-DOPA,L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン;および3,4-DHPA,3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドの使用を示す。図13に示した酵素のうち、L-チロシンは酵母内で天然に合成される。図13に示された他の代謝産物は酵母内で天然に生成されない。

遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のNCS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のNCS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのNCS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、NCS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。さらに、ノルコクラウリンシンターゼはN-末端切断部を有し得る。一部の場合では、NCS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。NCS遺伝子はオウレン、ケシ、パパヴェール・ブラクテアタム（Papver bracteatum）、サリシタム・フラバム（Thalicitum flavum）、コリダリス・サキシコラ（Corydalis saxicola）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、NCS遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。

［6OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは6OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは、図12に示すようなノルコクラウリン→コクラウリンの反応を触媒する。他の例では、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼは、ノルラウダノソリン→3'ヒドロキシコクラウリンの反応、ならびに本明細書に詳述した他の反応、例えば図13に示したものを触媒する。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の6OMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の6OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーの6OMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、6OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。6OMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、6OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［CNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼはCNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼは、図12に示すようなコクラウリン→N-メチルコクラウリンの反応を触媒する。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼ酵素が、3'ヒドロキシコクラウリン→3'ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンの反応を触媒し得る。他の例では、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼが、本明細書に詳述した他の反応、例えば図13に示したものを触媒し得る。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCNMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCNMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCNMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CNMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CNMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［4'OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素4'-O-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。4'-O-メチルトランスフェラーゼは4'OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、4'-O-メチルトランスフェラーゼは、図12に示すような3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン→レチクリンの反応を触媒する。他の例では、4'-O-メチルトランスフェラーゼは、本明細書に詳述した他の反応、例えば図13に示したものを触媒する。さらに、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の4'OMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内の4'OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーの4'OMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、4'OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。4'OMT遺伝子はケシ、キバナカラマツソウ、オウレンまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、4'OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［CYP80B1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムP450 80B1の発現を改変し得る。シトクロムP450 80B1はCYP80B1遺伝子にコードされている。一例では、シトクロムP450 80B1は、図12に示すようなN-メチルコクラウリン→3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のシトクロムP450 80B1遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のシトクロムP450 80B1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのシトクロムP450 80B1遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、シトクロムP450 80B1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、CYP80B1遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。シトクロムP450 80B1遺伝子はケシ、ハナビシソウ（E. californica）、キバナカラマツソウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、P450 80B1遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。

［FOL2］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素GTPシクロヒドロラーゼの発現を改変し得る。GTPシクロヒドロラーゼはFOL2遺伝子にコードされている。一部の例では、GTPシクロヒドロラーゼは、図1に示すようなGTP→ジヒドロネオプテリン三リン酸の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のFOL2遺伝子の構成的過剰発現を含むように改変され得る。また、遺伝子操作された宿主細胞は天然の調節を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のFOL2遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのFOL2遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、FOL2遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。FOL2遺伝子は出芽酵母、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、FOL2遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［PTPS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素6-ピルボイルテトラヒドロビオプテリン（PTP）シンターゼの発現を改変し得る。ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼはPTPS遺伝子にコードされている。一部の例では、6-ピルボイルテトラヒドロビオプテリンシンターゼは、図1に示すようなジヒドロネオプテリン三リン酸→PTPの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPTPS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPTPS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPTPS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PTPS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、PTPS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。PTPS遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、PTPS遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。

［SepR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素セピアプテリンレダクターゼの発現を改変し得る。セピアプテリンレダクターゼはSepR遺伝子にコードされている。一部の例では、セピアプテリンレダクターゼは、図1に示すようなPTP→BH₄の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSepR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSepR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSepR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SepR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SepR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。SepR遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SepR遺伝子は天然に存在する遺伝子と72％類似しているものであり得る。

［PCD］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン（プテリン-4α-カルビノールアミン）デヒドラターゼの発現を改変し得る。4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼはPCD遺伝子にコードされている。一部の例では、4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンデヒドラターゼは、図1に示すような4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリン→H₂O＋キノノイドジヒドロプテリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPCD遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPCD遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPCD遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PCD遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、PCD遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。PCD遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、PCD遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。

［QDHPR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼの発現を改変し得る。キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼはQDHPR遺伝子にコードされている。一部の例では、キノノイドジヒドロプテリジンレダクターゼは、図1に示すようなキノノイドジヒドロプテリジン→BH₄の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のQDHPR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のQDHPR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのQDHPR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、QDHPR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、QDHPR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。QDHPR遺伝子はドブネズミ、ヒト、ハツカネズミまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、QDHPR遺伝子は天然に存在する遺伝子と75％類似しているものであり得る。

［DHFR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現を改変し得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼはDHFR遺伝子にコードされている。一部の例では、ジヒドロ葉酸レダクターゼは、図1に示すような7,8-ジヒドロビオプテリン（BH₂）→5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリン（BH₄）の反応を触媒する。この反応は、図12に示すようなチロシンのL-DOPAへの変換のための共基質としてBH₄の回収に有用であり得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDHFR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDHFR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDHFR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DHFR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、DHFR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。DHFR遺伝子はドブネズミ、ヒトまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DHFR遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。

［DRS-DRR］1-BIAのエピマー化に関して上記に論考したように、遺伝子操作された宿主細胞は、BIAエピメラーゼの発現を改変し得る。BIAエピメラーゼはDRS-DRR遺伝子にコードされている。また、一部の例では、DRS-DRRはCYP-CORとも称され得る。一部の例では、BIAエピメラーゼの遺伝子操作された分割型または遺伝子操作された融合型が、図14に示すような（S）-1-BIA→（R）-1-BIAの変換を触媒する。特に、図14は、本発明の態様によるL-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。図14は、酵素CPR,シトクロムP450レダクターゼ;DRS-DRR,デヒドロレチクリンシンターゼとデヒドロレチクリンレダクターゼ;SalSyn,サルタリジンシンターゼ;SalR,サルタリジンレダクターゼ;SalAT,サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ;T6ODM,テバイン6-O-デメチラーゼ;COR,コデイノンレダクターゼ;およびCODM,コデイン-O-デメチラーゼの使用を示す。

遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたDRS-DRR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRR遺伝子に遺伝子操作された融合エピメラーゼがコードされ得る。一部の場合では、遺伝子操作されたDRS-DRR遺伝子に遺伝子操作された分割型エピメラーゼがコードされ得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのDRS-DRR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDRS-DRR遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのDRS-DRR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。DRS-DRR遺伝子はハカマオニゲシ（Papaver bracteatum）、ケシ、アツミゲシ（Papaver setigerum）、クサノオウ（Chelidonium majus）または別の種に由来し得る。一部の例では、DRS-DRR遺伝子が天然に存在する遺伝子と77％類似しているものであり得る。

［CPR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素シトクロムP450レダクターゼの発現を改変し得る。シトクロムP450レダクターゼはCPR遺伝子にコードされている。一部の例では、シトクロムP450レダクターゼは、図14に示すような(R)-レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。さらに、シトクロムP450レダクターゼは、他の反応、例えば本出願の至る箇所の図に示したものを触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCPR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCPR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCPR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CPR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CPR遺伝子はハナビシソウ、ケシ、ヒト（H. sapiens）、出芽酵母、シロイヌナズナ（A. thaliana）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CPR遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［SalSyn］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンシンターゼの発現を改変し得る。サルタリジンシンターゼはSalSyn遺伝子にコードされている。一部の例では、サルタリジンシンターゼは、図14に示すような(R)-レチクリン→サルタリジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalSyn遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalSyn遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalSyn遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalSyn遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SalSyn遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。一部の例では、SalSynはN-末端が改変され得る。SalSyn遺伝子はケシ、ケシ属の種、クサノオウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalSyn遺伝子は天然に存在する遺伝子と78％類似しているものであり得る。

［SalR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素サルタリジンレダクターゼの発現を改変し得る。サルタリジンレダクターゼはSalR遺伝子にコードされている。一部の例では、サルタリジンレダクターゼは、図14に示すようなサルタリジノール→サルタリジンの反応を可逆的に触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SalR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。SalR遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、ケシ属の種、クサノオウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalR遺伝子は天然に存在する遺伝子と80〜100％類似しているものであり得る。

［SalAT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼはSalAT遺伝子にコードされている。一部の例では、アセチル-CoA:サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼは、図14に示すようなアセチル-CoA＋サルタリジノール→CoA＋7-O-アセチルサルタリジノールの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalAT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSalAT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSalAT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、SalAT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、SalAT遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。SalAT遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、オニゲシ（Papaver orientale）、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、SalAT遺伝子は天然に存在する遺伝子と77〜80％類似しているものであり得る。

［TS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素テバインシンターゼの発現を改変し得る。テバインシンターゼはTS遺伝子にコードされている。一部の例では、テバインシンターゼまたは遺伝子操作されたテバインシンターゼが、図14に示すような7-O-アセチルサルタリジノール→テバイン＋アセテートの反応を触媒する。一部の例では、7-O-アセチルサルタリジノール→テバイン＋アセテートの反応が自然に起こるが、テバインシンターゼがこの反応の一部分を触媒する。特に、図14は、本発明の態様によるL-チロシンのモルフィナンアルカロイドへの変換の生合成スキームを示す。図14は、酵素CPR,シトクロムP450レダクターゼ;DRS-DRR,デヒドロレチクリンシンターゼとデヒドロレチクリンレダクターゼ;SalSyn,サルタリジンシンターゼ;SalR,サルタリジンレダクターゼ;SalAT,サルタリジノール7-O-アセチルトランスフェラーゼ;TS,テバインシンターゼ;T6ODM,テバイン6-O-デメチラーゼ;COR,コデイノンレダクターゼ;およびCODM,コデイン-O-デメチラーゼの使用を示す。

遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTS遺伝子または遺伝子操作されたTS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。一部の場合では、遺伝子操作されたTS遺伝子に遺伝子操作された融合酵素がコードされ得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTS遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのTS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。一部の場合では、TS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。TS遺伝子はケシ、ハカマオニゲシ、オニゲシ（Papaver orientale）、ケシ属の種または別の種に由来し得る。一部の例では、TS遺伝子が天然に存在する遺伝子と75〜80％類似しているものであり得る。

［T6ODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テバイン6-O-デメチラーゼの発現を改変し得る。テバイン6-OデメチラーゼはT6ODM遺伝子にコードされている。一部の例では、テバイン6-O-デメチラーゼは、図14に示すようなテバイン→ネオピノンの反応を触媒する。ネオピノンが生成されたら、ネオピノンはコデイノンに変換され得る。ネオピノン→コデイノンの変換は自発的に起こり得る。代替的に、ネオピノン→コデイノンの変換は、触媒された反応の結果として起こり得る。他の例では、T6ODM酵素が、テバイン以外の基質のO-脱メチル化を触媒し得る。例えば、T6ODMはオリパビンをO-脱メチル化してモルヒノンを生成させ得る。代替的に、T6ODMは、1-ベンジルイソキノリン、プロトベルベリンまたはプロトピン類型のBIA、例えばそれぞれ、パパベリン、カナジンおよびアロクリプトピンのO-脱メチル化を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のT6ODM遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のT6ODM遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのT6ODM遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、T6ODM遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、T6ODM遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。T6ODM遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、T6ODM遺伝子は天然に存在する遺伝子と76.2％類似しているものであり得る。

［COR］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデイノンレダクターゼの発現を改変し得る。コデイノンレダクターゼはCOR遺伝子にコードされている。一部の例では、コデイノンレダクターゼは、図14に示すようなコデイノンのコデインへの反応を触媒する。一部の場合では、コデイノンレダクターゼは、ネオピノンのネオピンへの反応を触媒し得る。他の例では、CORは、他のモルフィナンの還元、例えば、ヒドロコドン→ジヒドロコデイン、14-ヒドロキシコデイノン→14-ヒドロキシコデイン、およびヒドロモルホン→ジヒドロモルヒネを触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCOR遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCOR遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCOR遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、COR遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、COR遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。付加的または代替的に、COR遺伝子は、ミトコンドリア、液胞、小胞体またはその組合せに対する標的化配列の付加を有するように改変され得る。COR遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と76〜78％類似しているものであり得る。一例では、COR遺伝子は天然に存在する遺伝子と76.8％、77.0％、77.3％または77.7％類似しているものであり得る。

［CODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素コデインO-デメチラーゼの発現を改変し得る。コデインO-デメチラーゼはCODM遺伝子にコードされている。一部の例では、コデインO-デメチラーゼは、図14に示すようなコデインのモルヒネへの反応を触媒する。コデインO-デメチラーゼはまた、ネオピンのネオモルヒネへの反応も触媒し得る。コデインO-デメチラーゼはまた、テバインのオリパビンへの反応も触媒し得る。他の例では、CODMが、1-ベンジルイソキノリン、アポルフィンおよびプロトベルベリン類型のBIA、例えばそれぞれ、レチクリン、イソコリジンおよびスコウレリンのO-脱メチル化を触媒し得る。他の例では、CODM酵素が、プロトピン内のメチレンジオキシブリッジ構造を切断するためのO,O-デメチレン化反応を触媒し得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCODM遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCODM遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCODM遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CODM遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、CODM遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。付加的または代替的に、CODM遺伝子は、ミトコンドリアに対する標的化配列の付加を有するように改変され得る。CODM遺伝子はケシ、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CODM遺伝子は天然に存在する遺伝子と75％類似しているものであり得る。一例では、CODM遺伝子が天然に存在する遺伝子と75.2％類似しているものであり得る。

［BBE］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ベルベリンブリッジ酵素の発現を改変し得る。ベルベリンブリッジ酵素はBBE遺伝子にコードされている。一部の例では、ベルベリンブリッジ酵素は、(S)-レチクリン→(S)-スコウレリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のBBE遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のBBE遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのBBE遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、BBE遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。BBE遺伝子はケシ、アザミゲシ、ハナビシソウ、ベルベリス・ストロニフェラ、サリクトラム・フラバム・グロウカム（Thalictrum flavum subsp. glaucum）、オウレン、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、BBE遺伝子は天然に存在する遺伝子と99％類似しているものであり得る。

［CYP2D6］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞がシトクロムP450,ファミリー2,サブファミリーD,ポリペプチド6の発現を改変し得る。この特定のシトクロムP450はCYP2D6遺伝子にコードされている。この特定のシトクロムP450酵素は、基質特異性が緩慢な（promiscuous）オキシダーゼであると特性評価され得る。一部の例では、この特定のシトクロムP450酵素が、数ある反応の中でも（R）-レチクリン＋NADPH＋H^＋＋O₂→サルタリジン＋NADP^＋＋2 H₂Oの反応を触媒し得る。

［S9OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼはS9OMT遺伝子にコードされている。一部の例では、S-アデノシル-L-メチオニン:(S)-スコウレリン9-O-メチルトランスフェラーゼは、S-アデノシル-L-メチオニン＋(S)-スコウレリン→S-アデノシル-L-ホモシステイン＋(S)-テトラヒドロコルンバミンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のS9OMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のS9OMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのS9OMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、S9OMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、S9OMT遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。S9OMT遺伝子はサリクトラム・フラバム・グロウカム、オウレン、トウオウレン、ケシ、カラマツソウ属の種、オウレン属の種、ケシ属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、S9OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。一例では、S9OMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と80％類似しているものであり得る。

［CAS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素(S)-カナジンシンターゼの発現を改変し得る。(S)-カナジンシンターゼはCAS遺伝子にコードされている。一部の例では、(S)-カナジンシンターゼは、(S)-テトラヒドロコルンバミン→(S)-カナジンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子を発現するように改変され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCAS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCAS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CAS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CAS遺伝子はサリクトラム・フラバム・グロウカム、オウレン、カラマツソウ属の種、オウレン属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CAS遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。

［STOX］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼの発現を改変し得る。(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼはSTOX遺伝子にコードされている。一部の例では、(S)-テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼは、(S)-テトラヒドロベルベリン＋2 O₂→ベルベリン＋2 H₂O₂の反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTOX遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTOX遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTOX遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STOX遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の例では、STOXはN-末端が改変され得る。一部の場合では、STOX遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。STOX遺伝子はベルベリス・ウィルソニエー、オウレン、メギ属の種、オウレン属の種または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STOX遺伝子は天然に存在する遺伝子と78％類似しているものであり得る。

［TNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼはTNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、カナジン→N-メチルカナジンの反応を触媒する。

他の例では、テトラヒドロプロトベルベリン-N-メチルトランスフェラーゼは、スチロピン→cis-N-メチルスチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTNMT遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のTNMT遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのTNMT遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、TNMT遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、TNMT遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。TNMT遺伝子はケシ、ハナビシソウ、ハカマオニゲシ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、TNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。一例では、TNMT遺伝子は天然に存在する遺伝子と81％類似しているものであり得る。

［CFS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ケイランチフォリンシンターゼの発現を改変し得る。ケイランチフォリンシンターゼはCFS遺伝子にコードされている。一例では、ケイランチフォリンシンターゼは、スコウレリン→ケイランチフォリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCFS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCFS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCFS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CFS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。CFS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシ（A. mexicana）または別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CFS遺伝子は天然に存在する遺伝子と77％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、CFS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。

一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素スチロピンシンターゼの発現を改変し得る。スチロピンシンターゼはSTS遺伝子にコードされている。一例では、スチロピンシンターゼは、ケイランチフォリン→スチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。STS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STS遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、STS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。

［STS］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素スチロピンシンターゼの発現を改変し得る。スチロピンシンターゼはSTS遺伝子にコードされている。一例では、スチロピンシンターゼは、数ある反応の中でもケイランチフォリン→スチロピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のSTS遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのSTS遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、STS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。STS遺伝子はケシ、ハナビシソウ、アザミゲシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、STS遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％、78％または79％類似しているものであり得る。さらに、STS遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。

［MSH］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼはMSH遺伝子にコードされている。一例では、cis-N-メチルスチロピン14-ヒドロキシラーゼは、cis-N-メチルスチロピン→プロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMSH遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のMSH遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのMSH遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、MSH遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。MSH遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、MSH遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。さらに、MSH遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。

［P6H］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素プロトピン-6-ヒドロキシラーゼの発現を改変し得る。プロトピン-6-ヒドロキシラーゼはP6H遺伝子にコードされている。一例では、プロトピン-6-ヒドロキシラーゼは、プロトピン→6-ヒドロキシプロトピンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のP6H遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のP6H遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのP6H遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CFS遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。P6H遺伝子はケシ、ハナビシソウまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、P6H遺伝子は天然に存在する遺伝子と79％類似しているものであり得る。さらに、P6H遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。

［DBOX］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼの発現を改変し得る。ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼはDBOX遺伝子にコードされている。一例では、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼは、ジヒドロサングイナリン→サングイナリンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDBOX遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のDBOX遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのDBOX遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、DBOX遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。DBOX遺伝子はケシまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、DBOX遺伝子は天然に存在する遺伝子と100％類似しているものであり得る。さらに、DBOX遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。

［morA］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒネデヒドロゲナーゼの発現を改変し得る。モルヒネデヒドロゲナーゼはmorA遺伝子にコードされている。一部の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、図15に示すようなモルヒネ→モルヒノンの反応を触媒する。他の例では、モルヒネデヒドロゲナーゼは、同じく図15に示すようなコデイノン→コデインの反応を触媒する。図15は、本発明の態様による、半合成オピオイド（opiod）の生成の生合成スキームを示す。特に、図15は、morA,モルヒネデヒドロゲナーゼ;およびmorB,モルヒネレダクターゼを組込むことによる酵母内でのテバインの拡張形質転換を示す。

遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorA遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorA遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのmorA遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、morA遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、morA遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。morA遺伝子はシュードモナス・プチダまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、morA遺伝子は天然に存在する遺伝子と73.7％類似しているものであり得る。

［morB］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は、酵素モルヒノンレダクターゼの発現を改変し得る。モルヒノンレダクターゼはmorB遺伝子にコードされている。一部の例では、モルヒノンレダクターゼは、図15に示すようなコデイノン→ヒドロコドンの反応を触媒する。他の例では、モルヒノンレダクターゼは、同じく図15に示すようなモルヒノン→ヒドロモルホンの反応を触媒する。他の例では、モルヒノンレダクターゼは、14-ヒドロキシコデイノン→オキシコドンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorB遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のmorB遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのmorB遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、morB遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、morB遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。morB遺伝子はシュードモナス・プチダまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、morB遺伝子は天然に存在する遺伝子と67.2％類似しているものであり得る。

［CYP80A1］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素ベルバムニン（berbamunine）シンターゼを発現し得る。ベルバムニンシンターゼはシトクロムP450酵素80A1（CYP80A1）の遺伝子にコードされている。一部の例では、CYP80A1は、図17に示すような(S)-N-メチルコクラウリン＋(R)-N-メチルコクラウリン→ベルバムニンの反応を触媒する。他の例では、CYP80A1は、図17に示すような(R)-N-メチルコクラウリン＋(R)-N-メチルコクラウリン→ガテガウメリンの反応を触媒する。他の例では、CYP80A1は、(R)-N-メチルコクラウリン＋(S)-コクラウリン→2'ノルベルバムニンの反応を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP80A1遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のCYP80A1遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのCYP80A1遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、CYP80A1遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、CYP80A1遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。CYP80A1遺伝子はベルベリス・ストロニフェラまたは別の種に由来するものであり得る。一部の例では、CYP80A1遺伝子は天然に存在する遺伝子と76％類似しているものであり得る。

［PODA］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞は酵素プロトピンO-デアルキラーゼを発現し得る。プロトピンO-デアルキラーゼは遺伝子PODAにコードされている。一部の例では、PODAは、プロトベルベリンおよびプロトピン、例えば、カナジン、スチロピン、ベルベリン、クリプトピン、アロクリプトピンおよびプロトピンのO,O-脱メチル化を触媒する。一部の例では、PODAは、BIA、例えばテトラヒドロパパベリン、テトラヒドロパルマチンおよびクリプトピンのO-脱メチル化を触媒する。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPODA遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内のPODA遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞は、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのPODA遺伝子が組込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、PODA遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が遺伝子操作された宿主細胞内に組込まれるように改変され得る。一部の場合では、PODA遺伝子が出芽酵母内での発現のためにコドン最適化され得る。PODA遺伝子はケシまたは他の種に由来するものであり得る。一部の例では、PODA遺伝子は天然に存在する遺伝子と70〜100％類似しているものであり得る。

［RNMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素レチクリンN-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。レチクリンN-メチルトランスフェラーゼはRNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、レチクリンN-メチルトランスフェラーゼが、数ある反応の中でもレチクリン→テンベタリン（tembetarine）などの反応を触媒し得る。

［P7OMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素パパベリン7-O-デメチラーゼの発現を改変し得る。パパベリン7-O-デメチラーゼはP70MT遺伝子にコードされている。一部の例では、パパベリン7-O-デメチラーゼが、数ある反応の中でもパパベリン→パコジン（pacodine）などの反応を触媒し得る。

［3ODM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素3-O-デメチラーゼの発現を改変し得る。3-O-デメチラーゼは3ODM遺伝子にコードされている。一部の例では、3-O-デメチラーゼが、数ある反応の中でもオキシコドン→オキシモルホン;ヒドロコドン→ヒドロモルホン;ジヒドロコデイン→ジヒドロモルヒネ;14-ヒドロキシコデイン→14-ヒドロキシモルヒネ;コデイノン→モルヒノン;および14-ヒドロキシコデイノン→14-ヒドロキシモルヒノンなどの反応を触媒し得る。

［NDM］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素N-デメチラーゼの発現を改変し得る。N-デメチラーゼはNDM遺伝子にコードされている。一部の例では、N-デメチラーゼが、数ある反応の中でもコデイン→ノルコデイン;モルヒネ→ノルモルヒネ;オキシコドン→ノルオキシコドン;オキシモルホン→ノルオキシモルホン;テバイン→ノルテバイン;オリパビン→ノルオリパビン;ヒドロコドン→ノルヒドロコドン;ヒドロモルホン→ノルヒドロモルホン;ジヒドロコデイン→ノルジヒドロコデイン;ジヒドロモルヒネ→ノルジヒドロモルヒネ;14-ヒドロキシコデイン→ノル-14-ヒドロキシコデイン;14-ヒドロキシモルヒネ→ノル-14-ヒドロキシモルヒネ;コデイノン→ノルコデイノン;モルヒノン→ノルモルヒノン;14-ヒドロキシコデイノン→ノル-14-ヒドロキシコデイノン;および14-ヒドロキシモルヒノン→ノル-14-ヒドロキシモルヒノンなどの反応を触媒し得る。

［NMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素N-メチルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。N-メチルトランスフェラーゼはNMT遺伝子にコードされている。一部の例では、N-メチルトランスフェラーゼが、ノルコデイン→コデイン;ノルモルヒネ→モルヒネ;ノルオキシコドン→オキシコドン;ノルオキシモルホン→ノルオキシモルホン;ノルテバイン→テバイン;ノルオリパビン→オリパビン;ノルヒドロコドン→ヒドロコドン;ノルヒドロモルホン→ヒドロモルホン;ノルジヒドロコデイン→ジヒドロコデイン;ノルジヒドロモルヒネ→ジヒドロモルヒネ;ノル-14-ヒドロキシコデイン→14-ヒドロキシコデイン;ノル-14-ヒドロキシモルヒネ→14-ヒドロキシモルヒネ;ノルコデイノン→コデイノン;ノルモルヒノン→モルヒノン;ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン→14-ヒドロキシコデイノン;ノル-14-ヒドロキシ-モルヒノン→14-ヒドロキシモルヒノンなどの反応を触媒し得る。

［NAT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素N-アリルトランスフェラーゼの発現を改変し得る。N-アリルトランスフェラーゼはNAT遺伝子にコードされている。一部の例では、N-アリルトランスフェラーゼが、数ある反応の中でもノルコデイン→N-アリル-ノルコデイン;ノルモルヒネ→N-アリル-ノルモルヒネ;ノルオキシコドン→N-アリル-ノルオキシコドン;ノルオキシモルホン→N-アリル-ノルノルオキシモルホン;ノルテバイン→N-アリル-ノルテバイン;ノルオリパビン→N-アリル-ノルオリパビン;ノルヒドロコドン→N-アリル-ノルヒドロコドン;ノルヒドロモルホン→N-アリル-ノルヒドロモルホン;ノルジヒドロコデイン→N-アリル-ノルジヒドロコデイン;ノルジヒドロモルヒネ→N-アリル-ノルジヒドロモルヒネ;ノル-14-ヒドロキシコデイン→N-アリル-ノル-14-ヒドロキシコデイン;ノル-14-ヒドロキシモルヒネ→N-アリル-ノル-14-ヒドロキシモルヒネ;ノルコデイノン→N-アリル-ノルコデイノン;ノルモルヒノン→N-アリル-ノルモルヒノン;ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン→N-アリル-ノル-14-ヒドロキシコデイノン;ノル-14-ヒドロキシ-モルヒノン→N-アリル-ノル-14-ヒドロキシモルヒノンなどの反応を触媒し得る。

［CPMT］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素N-シクロプロピルメチルトランセラーゼ（transerase）の発現を改変し得る。N-シクロプロピルメチルトランセラーゼはCPMT遺伝子にコードされている。一部の例では、N-シクロプロピルメチルトランスフェラーゼが、数ある反応の中でもノルコデイン→N（シクロプロピルメチル）ノルコデイン;ノルモルヒネ→N（シクロプロピルメチル）ノルモルヒネ;ノルオキシコドン→N（シクロプロピルメチル）ノルオキシコドン;ノルオキシモルホン→N（シクロプロピルメチル）ノルノルオキシモルホン;ノルテバイン→N（シクロプロピルメチル）ノルテバイン;ノルオリパビン→N（シクロプロピルメチル）ノルオリパビン;ノルヒドロコドン→N（シクロプロピルメチル）ノルヒドロコドン;ノルヒドロモルホン→N（シクロプロピルメチル）ノルヒドロモルホン;ノルジヒドロコデイン→N（シクロプロピルメチル）ノルジヒドロコデイン;ノルジヒドロモルヒネ→N（シクロプロピルメチル）ノルジヒドロモルヒネ;ノル-14-ヒドロキシコデイン→N（シクロプロピルメチル）ノル-14-ヒドロキシコデイン;ノル-14-ヒドロキシモルヒネ→N（シクロプロピルメチル）ノル-14-ヒドロキシモルヒネ;ノルコデイノン→N（シクロプロピルメチル）ノルコデイノン;ノルモルヒノン→N（シクロプロピルメチル）ノルモルヒノン;ノル-14-ヒドロキシ-コデイノン→N（シクロプロピルメチル）ノル-14-ヒドロキシコデイノン;およびノル-14-ヒドロキシ-モルヒノン→N（シクロプロピルメチル）ノル-14-ヒドロキシモルヒノンなどの反応を触媒し得る。

［BM3］一部の例では、遺伝子操作された宿主細胞が酵素BM3を発現し得る。BM3は、天然宿主内での脂肪酸への一酸素添加に関与している巨大菌シトクロムP450である。一部の場合では、BM3が、図9に示すようにオピオイドをN-脱メチル化してノル-オピオイドを生成させる。一部の場合では、宿主細胞が、BM3に加えて、図10に示すようなナル-オピオイドまたはノル-オピオイドの生成のための他の異種酵素を発現するように改変される。遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのBM3遺伝子の構成的発現を含むように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのBM3遺伝子の発現を合成的に調節するように改変され得る。一例では、遺伝子操作された宿主細胞が、1コピー、複数コピーまたはさらなるコピーのBM3遺伝子が組み込まれるように改変され得る。付加的または代替的に、遺伝子操作された宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞内でのBM3遺伝子の過剰発現のための強力なプロモーターエレメントの導入が組み込まれるように改変され得る。BM3は、可溶性であること、融合レダクターゼパートナータンパク質が付随していること、および新たな基質を受容するように容易に遺伝子操作され得ることなどの、生合成酵素としてのいくつかの利点を有する。さらに、表7は、BM3 N-デメチラーゼ変異体を示す。

前述の遺伝子の例は、宿主細胞内のいくつかの異なるプラットフォーム、例えばプラスミド（2μ、ARS/CEN）、YACまたはゲノムにより発現させることができる。また、前述の遺伝子配列の例は天然または所望の異種宿主（例えば、出芽酵母）での発現のためにコドン最適化されたもののいずれかであり得る。

以下の実施例は、本発明の種々の態様の実例を示す目的で示しており、本発明をいかなる様式でも限定することを意図するものではない。表示されている場合、発現構築物は、使用される厳密なターミネーター配列が明記されていない場合であっても適当なプロモーター、遺伝子およびターミネーターが組み込まれると理解されたい。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現時点で好ましい代表的な態様であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の趣旨に包含される、本実施例における変更および他の使用は当業者に思いつくであろう。

実施例1.別々に発現されるDRSとDRRの細胞内活性は融合型親酵素よりかなり高い.
ハカマオニゲシ由来のDRS-DRRのアミノ酸配列（Farrow et al.2015,GenBank:AKO60179.1）を出芽酵母内での発現のためにコドン最適化し（例えばSEQ.ID 16参照）（IDTのコドン最適化アルゴリズム）、プロテインエンジニアリングおよび酵素改善を可能にするためのいろいろなプロモーター強度を有するベクター内にクローニングした。得られたプラスミドpDW10およびpDW18（図11参照）は、それぞれ強発現のための出芽酵母（S.cerevisiae）TDH3プロモーターおよび弱発現のためのCYC1プロモーターの制御下のDRS-DRRを有し、これらを将来的な酵素の遺伝子操作の取り組み用のベースライン構築物として使用した。この実施例のスクリーニング株は、BIA経路内のDRS-DRRまでの酵素を発現するがDRS-DRRは含まない遺伝子操作された出芽酵母Cen.PK株YA106の派生株であった。LCMS法を用いた（S）-レチクリンと（R）-レチクリンのハイスループット区別における限界のため、ハカマオニゲシSalSynを高レベルで発現する株を構築し、DRS-DRR酵素の改善について、サルタリジンの生成量に基づいてスクリーニングした。SalSyn活性は、プラスミドベースのDRS-DRR活性よりかなり高いと経験論的に判断し、これにより、（S）-レチクリンの（R）-レチクリンへの変換の増大をサルタリジンの生成量によって検出することを可能にした。したがって、プロテインエンジニアリングによるDRS-DRR（またはDRS単独）に対する改善を、培養培地中のサルタルジンの相対濃度によって測定した。スクリーニング株の形質転換の際にプラスミドが染色体に組み込まれないことを確実にするため、TRP1遺伝子座をURA3の組込みによってノックアウトし、この実施例および後続の実施例で使用するレポーター株DW24を得た。

遺伝子操作されたDRS-DRR（または分離型のDRSおよびDRR）酵素を有する酵母株の増殖のため、レポーター株を発現プラスミドで、標準的な分子生物学の手法を用いて形質転換し、シングルコロニーの酵母を固相寒天培地プレートから、選択条件（例えば、トリプトファンなしの合成完全2％デキストロース）下で単離した。コロニーを液体培養培地中に播種し、30℃で2日間培養した。次いで培養物を同じ組成の新鮮培地中で、または一部の場合では8％のマルトデキストリンを含有している液体合成完全培地中で継代培養した。高分子マルトデキストリンから単糖を放出させるため、クロコウジカビ（A.niger）由来のアミログルコシダーゼ（Sigma）をおよそ3 U/Lの濃度で添加した。酵母株を30℃でさらに3日間または4日間培養し、培養物を遠心分離によって分離し、サルタリジン濃度を上清み中で直接、LC-MSによって測定した。

プラスミドおよび株

BIA経路内のいろいろな代謝産物の合成のためおそらく非常に特殊化された細胞型を有しているモルフィナンアルカロイド生成ポピー植物とは異なり（Onoyovwe et al.,2013）、出芽酵母が有する細胞型はただ1つであり、この経路による価値のある化合物の異種生成は、すべての酵素、補因子および細胞機構が同じ細胞内で一緒に働かなければならないことを要する。野生型融合酵素DRS-DRRにコードされた活性がどのようにして分離型酵素として異種系内で、例えば酵母内で機能するのかを調べるため、融合型酵素のシトクロムP450（DRS）ドメインとアルド-ケトレダクターゼ（DRR）ドメインを2つの分離型酵素に分割し、異なるプロモーター下で発現させた。pDW18を鋳型として使用し、DRS-DRRのデヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）ドメインとデヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）ドメインを別々に標準的な分子生物学の手法を用いてCYC1プロモーターおよびTEF1プロモーター下でクローニングし、プラスミドpDW21を得た。pDW21プラスミドおよび融合型親DRS-DRR酵素を有する対照プラスミド（pDW18）でレポーター株を別々に形質転換した。この株を培養し、サルタリジン生成を上清み中で直接、LC-MS解析によって測定した。図18は、個々の形質転換体において、pDW21を有する形質転換体により生成されたサルタリジンのレベル（グレーのバー）が対照pDW18を有する形質転換体によるものよりほぼ4倍高いことを示す。pDW21を有する株は、対照と比べて全レチクリン（S-とR-の両方）の小幅な減少およびかなり少ないデヒドロレチクリンをさらに示す。

実施例2.DRSとDRRを別々に発現している株では全BIAレベルが融合型親酵素と比べて上昇している.
詳細なLC-MS解析を行い、DRS-DRRに由来するDRS酵素とDRR酵素の独立した発現の複数のBIA経路中間体のレベルに対する効果を調べた。BIA中間体の検出のため、TDH3プロモーターの制御下のDRS-DRR由来分離型DRS酵素およびTEF1プロモーターの制御下の分離型DRR酵素を有するプラスミド（pJL29）を、pDW10プラスミドにより発現させた融合型親酵素との比較のために構築した。プロモーター強度に基づき、このプラスミドでは、分離型酵素と融合型酵素の間で同等発現の最も近い近似値が得られた。これらのプラスミドで実施例1に記載の出芽酵母レポーター株を別々に形質転換した。これらの株を実施例1に記載のようにして培養し、BIA代謝産物を上清み中で直接、LC-MS解析によって測定した。図19に示されるように、pJL29を有する酵母株では対照プラスミドpDW10を有する株と比べて、ほぼすべてのBIA経路中間体のレベルが上昇している。上流経路中間体、特にコクラウリンとN-メチル-コクラウリンが、分離型のDRS酵素およびDRR酵素を発現している株において、融合型DRS-DRR酵素を発現している株と比べて増加し、これは、DRSとDRRを別々に発現する細胞の方が経路全体において能力が高いことを示す。この実験のレチクリンレベルはほぼ同じであったが、実施例3は、この実験のレチクリンのほとんどがおそらくR-配置であったことを示す。S-レチクリンのR-レチクリンへの効率的な変換およびその後のサルタリジンへの変換により、上流酵素が、その活性の生成物阻害（例えば、S-レチクリンによる）の減少のため、よりよく機能することが可能になるということが考えられ得る。図18に示された結果と同様、分離型のDRS酵素とDRR酵素を発現している細胞では融合型の親DRS-DRR酵素を発現している細胞と比べて多くの量のサルタリジンが生成した。

実施例3.キラル分離-DRSとDRRを別々に発現している株は融合型親酵素よりかなり多くのR-レチクリンを生成する.
融合型親DRS-DRRまたは分離型のDRS酵素とDRR酵素のいずれかを発現している実施例1に記載のYA106の派生株の2種類のBIA経路酵母株を、S-レチクリンおよびR-レチクリンの生成能について解析した。レチクリンを酵母培地から、12.5 mLの酵母培養液をペレット化して上清み1 mLあたり30 mgのXAD-4樹脂を添加し、回転装置上で室温にて一晩インキュベートし、上清み1 mLあたり100μLのメタノールを用いて溶出させることによって濃縮した。試料を乾燥させ、100μLの水中に再懸濁させた。試料を逆相HPLC（Pursuit XRs-C18、50 mm×10 mm、5μm）により定組成15％メタノールを用いて分画した。

画分をプールし、乾燥させ、イソプロパノール中に再懸濁させた。試料をキラルカラム（Phenomenex Lux cellulose-1、150 mm×2 mm、3μm）で、定組成の72％N-ヘキサン、28％イソプロパノール、0.1％ジエチルアミンを0.3 mL/分の流速で用いて分離し、MS検出を、Agilent 6320 Ion Trap質量分析計を用いて実施した。レチクリンピークの保持時間を、基準となる（S）-レチクリンおよび（R）-レチクリンの標準品のものと比較した。図20に示されるように、分離型のDRS酵素とDRR酵素を発現した株は、全レチクリンの87％より多くを（R）-レチクリンとして生成したが、融合型親酵素を発現した株はおよそ50％の各立体異性体を生成した。

実施例4.DRSの構造モデルの構築および解析.
分離型のDRS酵素がどのようにしてフォールディングして機構的挙動を示すのかをよりよく理解するため、およびプロテインエンジニアリングの取り組みのためのフレームワークを構築するため、DRSの構造的相同性モデルを、無料で入手可能なSWISS-MODELアルゴリズム（https://swissmodel.expasy.org/）を用いて構築した。異なるCYP17酵素（PDB 4NKXおよび4R20）をベースにした2つの構造モデルを構築し、詳細に解析した。これらの2つの異なるCYPをベースにした構造モデルは互いにほぼ同一にマッチし、これらの型のシトクロムP450分子間の広い構造的相同性が示された。さらに、両モデルにはDRSの保存されたEXXRモチーフおよびC末端システイン残基（すべてのP450に共通）が親構造と同一の場所にマッピングされ、このような分子のコア構造が類似していることが示唆された。図22および23は、4NKXをベースにしたDRSの構造モデルを示す。残部のN末端ERアンカードメインを図の左下に示すとともに、酵素活性部位の近くに存在するヘム結合領域（4R20からモデル設計）のおよその場所も示す。図示したモデルの正面は、電子移動が起こるシトクロムP450レダクターゼ（CPR）の提案される一般的な結合領域であり、図22および23に示したモデルの裏側はミクロソーム膜に近位であることが提案される。DRSの相同性モデルにより、潜在的機能的役割を、確認された残基の位置およびアミノ酸変化に基づいていずれかのプロテインエンジニアリングインプルーブメントに帰属させることが可能になる。

実施例5.細胞内DRS活性はDRR活性と比べて律速的である.
DRS酵素とDRR酵素の別々の発現に関するさらなる実験を実施し、どの活性が異種細胞において制限的であるのかを調べた。DRSまたはDRRのいずれかのどの酵素活性が律速的であるのかをよりよく理解するため、異なるプロモーター強度下で両方の酵素を発現する一連のベクターを構築した。pDW21を親構築物として使用し、元のTEF1プロモーターより強いTDH3プロモーターをDRR発現の駆動のために挿入して使用し、プラスミドpJL32を得た。また、pDW21を親構築物として使用し、TDH3プロモーターをDRSの駆動のために挿入して使用し、プラスミドpJL29を得た。pJL29を親構築物として使用し、TEF1よりかなり弱いCYC1プロモーターをDRRの駆動のために挿入して使用し、プラスミドpJL35を得た。これらのプラスミドで実施例1に記載のレポーター酵母株を別々に形質転換した。これらの株を実施例1に記載のようにして培養し、BIA代謝産物を上清み中で直接、LC-MS解析によって測定した。図21は、DRS発現が低く（CYC1プロモーター）、DRR発現が高い（TDH3またはTEF1のいずれか）場合、およそ10μMのサルタリジンが酵母株から生成されることを示す。しかしながら、DRS発現が高い（TDH3プロモーター）場合、両方の構築物で酵母株から、DRSが低レベルで発現された株で観察されたもののほぼ倍のおよそ20μMのサルタリジンの生成がもたらされるため、DRR発現が低い（CYC1）か中間体レベルである（TEF1）かは重要でない可能性がある。この結果は、DRRと比べてDRSの細胞内活性が制限的であること、およびさらなるプロテインエンジニアリングの取り組みをDRS酵素に適用するとその活性がさらに改善され得ることを示す。

実施例6.改善されたDRS変異体の変異誘発および同定.
本発明者らは、DRSライブラリーをスクリーニングして改善されたDRS酵素変異体を同定するための変異誘発ベースの酵素遺伝子操作ストラテジーを実施した。pDW21内のDRSオープンリーディングフレームを、GeneMorph II（Agilent）ランダム変異誘発キットを製造業者が推奨するプロトコルに従って用いてエラープローンPCRに供した。次いでDRSの完全長の変異誘発PCR産物を、pDW21プラスミドを直接再増幅および再生させるためのプライマーとして使用するか、または、Gibson Assembly kit（NEB）を製造業者が推奨するプロトコルに従って用いて線状化pDW21と直接再結合させるかのいずれかとした。次いで、得られたプラスミドで大腸菌を形質転換し、精製プラスミドの変異誘発プールを精製し、続いて実施例1に記載の出芽酵母レポーター株を形質転換した。個々のコロニーを採取し、培養し、サルタリジンレベルを上清み中で直接、LC-MS解析によって測定した。およそ5,000個の個々の変異体をLC-MSにより、サルタリジン生成の増大についてスクリーニングした。

野生型の非変異誘発親DRSを発現している対照株（pDW21を有するDW24）との比較において、サルタリジン生成の改善を示したDRS変異体を発現している株を二次スクリーニングおよびさらなる試験用に選出した。生成されたサルタリジンを、レポーター株で発現させた6連の独立した親DRSによる平均サルタリジン濃度で割り算することにより、各変異体の相対的性能を求めた。親より1.2倍またはそれより高い変化倍数を示した25個の変異体でさらに続行した。次いで、改善された変異体のDNAシャッフリングおよびさらなるスクリーニングを使用し、活性に対してプラスの効果を有する変異体を、該効果を有しないものから単離した。DNAシャッフリングでは、NExT法（Mueller et al.2005）を、DNAを、エンドヌクレアーゼIV（NEB）を用いて消化し、Phusionポリメラーゼ（NEB）を再合成後のDNA増幅に使用したこと以外は記載のとおりに使用した。シャッフル変異体をpDW21骨格内にクローニングし、DW24内でのサルタリジン生成について上記のとおりに試験した。

DRSの親配列と比べて改善された活性を有するシャッフル変異体をシーケンシングし（Quintara Biosciences）、性能の改善に対して最も大きな寄与を示す変異体を特定した。表13に、性能の改善を示したすべてのシャッフル変異体を示す。表13に示した変異体はすべて、親配列と比べてDRSの活性増大をもたらす可能性があるが、複数の改善されたシャッフル変異体において、または複数のシャッフルプール間において同定された変異体がDRS性能の直接的な改善をもたらす可能性が非常に高いと判断された。このような条件を満たす6つの部位は16位、17位、69位、110位、155位および293位であった。

CYP17A1（PDB番号4NKX）ベースのDRSの構造的相同性モデル上にマッピングすると、16位、17位および69位はすべて、このクラスのP450酵素のミクロソーム膜とのテザリングを担うN末端ER局在ドメインに存在する。理論に拘束されないが、酵素機能には膜局在と向きが極めて重要であるため、これらの残基における変化は、DRSがどのようにERと相互作用して埋め込まれるかだけでなく、DRSの活性全体にも影響を及ぼすことが考えられ得る。110位は相同性モデルにおいて表面露出残基であり、P450活性のための必須のレドックス供与体であるシトクロムP450レダクターゼ（CPR）と相互作用することが提案される酵素の正面に存在する。この位置における変化は、DRSがどのようにCPRと相互作用するかに、例えば2つの酵素間の電子移動を助長することによってプラスの影響を及ぼし得る。155位もまた、DRSがどのようにCPRと相互作用するかに役割を果たし得る表面露出残基であり、この位置における変化は活性にプラスの影響を及ぼし得よう。293位は、分子の110位と反対側の面に存在する別の表面露出残基であり、基質または生成物の到達性が許容され得るであろう構造モデル内のチャネル付近に位置する。この位置の残基の変化は、基質がどのように結合するか、または生成物がどのように放出されるかに影響を及ぼし得よう。さらに、この酵素面はER膜表面に近位であり、ここの変化は酵素がどのようにミクロソームと連動するかに影響を与え得よう。

実施例7.分離型のDRS酵素とDRR酵素を形成するためにPbDRS-DRRが切断され得るアミノ酸位置.
図24に示すように、ヒナゲシ由来のPbDRS-DRR対デヒドロレチクリンシンターゼ（DRS）およびデヒドロレチクリンレダクターゼ（DRR）の一次アミノ酸配列のアラインメントを、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を用いて作成した。ヒナゲシ由来のDRRとのアラインメントに基づき、本発明者らは、PbDRS-DRRをDRS酵素およびDRR酵素に分離する切断点を特定した。ここにはM569の位置に保存メチオニン残基がみられる（Seq.ID 16）。この残基はSeq.ID 18の1位に対応する。残基D568とM569の間の黒矢印はPbDRS-DRRが切断された部位を表す。PbDRS-DRRベースの分離型DRS酵素はD568の位置で終結するように設計した。点線の矢印は、ヒナゲシ由来のDRSまたはDRRのいずれかに保存されていないか、または相同性でないPbDRS-DRR領域を示す。黒で囲んだK557から始まってD568で終わる配列のこれらの非保存残基の各々の後ろでの切断体を生成させ、DRSの各連続切断体の活性を、pDW21と同一の（TEF1プロモーターの制御下のDRRを有する）ベクター骨格においてアッセイした。このようなプラスミドで実施例1に記載のレポーター酵母株を別々に形質転換した。これらの株を実施例1に記載のようにして培養し、サルタリジンを上清み中で直接、LC-MS解析によって測定した。

実施例8.モルフィナンアルカロイドテバインの生成を改善するDRS変異体の同定.
DRS酵素内の30個の特有の残基において、酵母のエピメラーゼ活性を改善し、プロモルフィナンアルカロイドである高力価のサルタリジンをもたらす変異を同定した（実施例6参照）。このような変異のいくつかのDRS活性およびテバイン生成に対する影響を、選択したDRS内の点変異をプラスミド内にクローニングすることによって検証した。解析に選択した点変異はV16A、A17T、A50T、H69Q、V70I、M110IおよびR160Rであった（コドン置換）。これらのプラスミドでスクリーニング株yA511を形質転換した。yA511は、テバインまでの完全な生合成経路を有するが機能性DRS酵素は欠損しているように遺伝子操作されている。形質転換されたコロニーを前培養増殖メディーズ（medies）中に採取し、実施例1に記載のようにして一晩培養した。細胞を生産（production）培地中に戻し希釈した。2日間の生産増殖後、培養物の上清みを単離し、LC-MS/MS解析を用いて測定した。DRS変異型変異体を発現している細胞では培養培地中に、野生型（WT）DRSを発現している対照株と比較して最大1.4倍多いテバインが蓄積された（図25）。

実施例9:グルコースと単純窒素源から（S）-レチクリンを生成するように遺伝子操作されたプラットフォーム酵母株
BIAのカギとなる分岐点中間体（S）-レチクリンをL-チロシンから生成するプラットフォーム酵母株を構築した（図12）。具体的には、4種類の多遺伝子発現構築物を酵母株のゲノム内に組み込んだ。この4つの構築物の組成を図26に示す。各構築物は、酵母プロモーターにより発現される4つまたは5つの遺伝子で構成されている。遺伝子は各遺伝子座に、模式図上部のアノテーションに明記したとおりのプロモーター、遺伝子のオープンリーディングフレームおよびターミネーターを含む完全発現カセットとして位置している。模式図には、所与の遺伝子を表す矢印の方向によって各発現カセットの向きを示している。選択マーカーをアノテーションにおいてイタリック体で示し、模式図においてグレーの矢印で示す。各選択マーカーは、遺伝子座からの該マーカーの除去を可能にするloxP部位に隣接する。さらに、各構築物は、該マーカーがCreレコンビナーゼによって除去され得るようにloxP部位に隣接した選択マーカーを有する。

第1の組込み構築物には、ドブネズミ（Rattus norvegicus）由来の4つの異種遺伝子をYBR197C遺伝子座内にG418選択マーカー（KanMX）と一緒に組み込む。RnPTPS、RnSepR、RnPCDおよびRnQDHPRが、図1に示すような酵母の内因性葉酸誘導体（folate）合成経路によるテトラヒドロビオプテリン（BH₄）の合成および再生に必要とされる。各遺伝子は、酵母内での発現のためにコドン最適化される。

第2の組込み構築物には、4つの異種遺伝子をHIS3位座内にHIS5選択マーカーと一緒に組み込む。ドブネズミのチロシンヒドロキシラーゼ（RnTyrH）はチロシンをL-DOPAに、先の組込み構築物によって生成される共基質BH₄を用いて変換する。RnTyrH遺伝子は、野生型または活性の向上を付与する改善された変異型（例えば、W166Y、R37EおよびR38E）の任意のものであり得る。第2のドブネズミ遺伝子RnDHFRは、ジヒドロビオプテリン（BH₄の酸化生成物）をBH₄に還元する酵素をコードしており、このようにして、この共基質の利用能が高まる。また、第3の構築物には、L-DOPAをドパミンに変換する酵素であるシュードモナス・プチダ由来のPpDODCを含める。第4の酵素はオウレン（Coptis japonica）由来のCjNCSであり、これは4-HPAとドパミンを縮合させてノルコクラウリンを作製する。各遺伝子は、酵母内での発現のためにコドン最適化される。

第3の組込み構築物には、植物由来の5つの異種遺伝子とLEU2選択マーカーを遺伝子座YDR514C内に組み込む。Ps6OMT、Ps4’OMTおよびPsCNMTはケシ由来のメチルトランスフェラーゼであり、天然植物のヌクレオチド配列として発現される。第4のケシ遺伝子yPsCPRv2は、酵母用にコドン最適化され、ハナビシソウ由来のシトクロムP450、EcCYP80A1の活性を補助するレダクターゼをコードしている。この構築物にコードされた酵素は、先の組込み構築物によって生成されるノルコクラウリンからレチクリンを生成させるための2つのO-メチル化、N-メチル化およびヒドロキシル化を行う。各遺伝子は、酵母内での発現のためにコドン最適化される。

最後の組込み構築物には、さらなるコピーの出芽酵母内因性遺伝子ARO4^Q166K、ARO7 ^T226I、TYR1およびARO10をARO4遺伝子座内にハイグロマイシン耐性選択マーカーと一緒に組み込む。ARO4^Q166KおよびARO7 ^T226Iは、各々が野生型配列と比べて単一塩基対置換をコードしているARO4およびARO10のフィードバック耐性変異型である。TYR1およびARO10は天然酵母遺伝子と同一であるが、強力なプロモーターの後ろ（behind）で発現される。Aro4pおよびAro7pは、チロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成における酵素である。このような酵素からフィードバック阻害を取り除くと内因性チロシンの生合成の上方調節がもたらされる。Tyr1pの過剰発現によりチロシンの生合成が上方調節され、したがってチロシン生成が上方調節される。Aro10pの過剰発現により4-HPAの生成が増大する。

プラットフォーム酵母株は、この4つの発現カセットのうちの任意の数を有するように構築され得る。具体的には、プラットフォーム酵母株を、組込み構築物1〜4および組込み構築物1〜3を有するように構築した。チロシン過剰生成構築物（構築物4）を除いた後者の株では、レチクリンの生合成を補助するために、さらなるチロシンが培養培地中に供給され得る。下流のBIAの生成およびBIA生合成へのフラックスの増大を補助するためのさらなる遺伝子改変をプラットフォーム株に組み込んでもよい。

酵母株を、専用のアミノ酸類欠損溶液を含む合成完全培地中で30℃にて培養した。培地の上清み中のBIA代謝産物を、48時間および96時間の培養後にLC-MS/MS解析によって解析した。

実施例10:グルコースと単純窒素源からテバインを生成するように遺伝子操作されたプラットフォーム酵母株
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからのモルフィナンアルカロイドテバインの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例9に記載のプラットフォーム酵母株は、L-チロシンからモルフィナンアルカロイド生成物を生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図14）。

L-チロシンから（S）-レチクリンを生成させるプラットフォーム酵母株（実施例9の説明参照）を、生合成された（S）-レチクリンを最初のモルフィナンアルカロイドテバインに変換するための遺伝子操作された分割型エピメラーゼDRSとDRR、遺伝子操作されたサルタリジンシンターゼ、サルタリジンレダクターゼ、サルタリジノールアセチルトランスフェラーゼおよびテバインシンターゼが組み込まれるようにさらに遺伝子操作した（図14）。3つの発現カセット（P_TDH3-yEcCFS^1-26-yPbSS^33-504、P_TPI1-yPbSalR、P_TEF1-yPsSalAT）を、bleR選択マーカーを有する組込み構築物内にアセンブリングし、プラットフォーム酵母株の遺伝子座TRP1内に組み込んだ。さらに3つの発現カセット（P_TDH3-yPbDRS、P_TEF1-yPbDRR、P_PGK1-yPsTS）を、URA3選択マーカーを有する組込み構築物内にアセンブリングし、プラットフォーム酵母株の遺伝子座YPL250CΔ内に組み込んだ。この2つの構築物の組成を図27に示す。

組み込まれたカセットを有する酵母株を、専用の欠損溶液を含む合成完全培地中で30℃にて培養した。96時間の培養後、培地をBIA代謝産物についてLC-MS/MS解析によって解析した。

実施例11:遺伝子操作された酵母株によるグルコースと単純窒素源からのテバインの生成
酵母株を、実施例9および10に記載のようにして、五環式モルフィナンアルカロイドテバインが単糖（例えば、グルコース）および標準的な増殖培地中に存在する窒素源から直接生成されるように遺伝子操作した。具体的には、CEN.PK株の出芽酵母を、以下の異種酵素:TyrH、DODC、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、NCS、6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR、4OMT、DRS、DRR、SalSyn、SalR、SalATおよびTSが発現されるように酵母染色体内への組込みによって遺伝子操作した。この実施例では、SalSyn酵素は、そのリーダー配列がハナビシソウ（Eschscholzia californica）ケランチフォリン（chelanthifoline）シンターゼ（EcCFS）のN末端由来の83個のアミノ酸で置き換えられているように遺伝子操作される。この株に対して、BIA前駆体の蓄積を増大させるためのさらなる改変、例えば:ARO10の過剰発現、TYR1の過剰発現、フィードバック耐性ARO4（ARO4^Q166K）の発現およびフィードバック耐性ARO7（ARO7^T226I）の発現を行った。テバインシンターゼ活性（TS）、例えばSEQ ID NO.35（すなわち、TS1）、37（すなわち、TS2）をコードしているいろいろな変異体の酵素を有するか、最初の22個のアミノ酸のN末端切断体（すなわち、tTS1）を有するSEQ ID NO.35の変異体を有するか、テバインシンターゼ酵素（YA397）を有しない別個の遺伝子操作された酵母株を記載のようにして作製した。これらの酵素変異体の配列を表2に示す。

記載の酵母株を、2％のグルコースを含む2 mlの合成完全培地（酵母ニトロゲンベースおよびアミノ酸）中に播種し、30℃でおよそ4時間培養した。次いで、10 uLの各培養物を96ウェルプレート内の400 uLの新鮮培地に4連で移し、30℃でさらに48時間培養した。生産培地は、1×酵母ニトロゲンブロスおよびアミノ酸、20 mMのアスコルビン酸、300 mg/Lのチロシン、40 g/Lのマルトデキストリンおよび2単位/Lのアミラーゼを含有している。アミラーゼは、フェドバッチプロセスを模倣し、酵母が炭素源として使用できるようにグルコースを高分子マルトデキストリンから緩徐に放出させるために使用する。細胞を培地から遠心分離によって分離し、テバイン濃度を上清み中で直接、LC-MS/MS解析によって測定した。すべての遺伝子操作された酵母株が、増殖培地中に存在しているグルコースと単純窒素源からテバインを生成した（図29および30）。テバインシンターゼ活性を有する株は、記載の発酵条件下において、この活性を有しない株と比べて高いレベルのテバインを生成した。

実施例12:グルコースと単純窒素源から下流のモルフィナンアルカロイドを生成するように遺伝子操作された酵母株
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからの下流のモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例10に記載のプラットフォーム酵母株は、L-チロシンから下流のモルフィナンアルカロイド生成物を生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図14）。

L-チロシンからテバインを生成するプラットフォーム酵母株（実施例10の記載を参照のこと）を、生合成されたテバインを下流のモルフィナンアルカロイド、例えばモルヒネに変換するためのテバイン6-O-デメチラーゼ、コデイノンレダクターゼおよびコデイノン-O-デメチラーゼが組み込まれるようにさらに遺伝子操作した（図14）。3つの発現カセット（P_ADH1-T6ODM-T_ADH1、P_HXT7-COR-T_PGK1、P_TEF1-CODM-T_CYC1）をTRP1選択マーカーとともに直接アセンブリングし、テバインプラットフォーム酵母株のtrp1遺伝子座内に組み込んだ（Thodey et al.,2014）。

実施例13:グルコースと単純窒素源から半合成オピオイドを生成するように遺伝子操作された酵母株
酵母株は、初期段階の前駆体、例えばチロシンからの下流のモルフィナンアルカロイドの生成のために遺伝子操作され得る。一例として、実施例9および10に記載の酵母株は、L-チロシンから半合成オピオイド生成物を生成するようにさらに遺伝子操作され得る（図15）。

L-チロシンから下流のモルフィナンアルカロイドを生成する酵母株（実施例10の記載を参照のこと）を、生合成されたテバインを下流のモルフィナンアルカロイド、例えばモルヒネに変換するためのモルヒネデヒドロゲナーゼおよびモルヒノンレダクターゼが組み込まれるようにさらに遺伝子操作した（図15）。2つの発現カセット（P_GPD-morA-T_CYC1、P_PGK1-morB-T_PHO5）をKanMX選択マーカーとともに直接アセンブリングし、下流のモルフィナンアルカロイドを生成する酵母株のHO遺伝子座内に組み込んだ（Thodey et al.,2014）。

実施例14:グルコースと単純窒素源からO-脱メチル化オピオイド化合物を生成するように遺伝子操作された微生物株
モルフィナンアルカロイドに対してO-デメチラーゼ活性を示した表4に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（出芽酵母または大腸菌のいずれか）に組み込んだ（実施例10に記載のようにして）。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたL-チロシンが使用される。2分子のチロシンが改変され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに改変されて（S）-レチクリンを形成し、次いで、遺伝子操作された分割型エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、（R）-レチクリンが生じる。（R）-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに改変された後、テバインシンターゼによって触媒される酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図14参照）。表3に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。

図10は、本発明の態様による、微生物細胞内での生合成スキームを示す。細胞によって内因性的に生成された、および/または培養培地中に供給されたチロシンがオキシコドンに変換される（点線の矢印は多酵素工程を表す）。次いでオキシコドンは3-O-脱メチル化されてオキシモルホンとなり、N-脱メチル化されてノルオキシモルホンとなる。最後に、N-メチルトランスフェラーゼがSAMアナログからアリル炭素部分およびシクロプロピルメチル炭素部分を受容し、それぞれナロキソンおよびナルトレキソンを生成させる。

モルフィナンアルカロイド分子生成株におけるO-デメチラーゼ活性を検出するため、プラスミドベクターまたは染色体組込みカセットのいずれかにより候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ、細胞上清みを収集し、全オピオイドプロフィールを解析した（上記のとおり）。完全なBIA経路を有する株内でのオピオイド分子のO-脱メチル化をLC-MSによって検出した（上記のとおり）。具体的には、オキシコドンのオキシモルホンへの変換を検出した。生物触媒作用によるO-脱メチル化活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにオピオイド基質（図6参照）および酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。オピオイド分子のO-脱メチル化をLC-MSによって検出した。

実施例15:グルコースと単純窒素源からN-脱メチル化オピオイド化合物を生成するように遺伝子操作された微生物株
モルフィナンアルカロイドに対してN-デメチラーゼ活性を示した表5に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（出芽酵母または大腸菌のいずれか）に組み込んだ（実施例10に記載のようにして）。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたL-チロシンが使用される。2分子のチロシンが改変され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに改変されて（S）-レチクリンを形成し、次いで遺伝子操作された分割型エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、（R）-レチクリンが生じる。（R）-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに改変された後、テバインシンターゼによって触媒される酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図14参照）。表3に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。
モルフィナンアルカロイド分子生成株におけるN-デメチラーゼ活性を検出するため、プラスミドベクターまたは染色体組込みカセットのいずれかにより候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ、細胞上清みを収集し、全オピオイドプロフィールを解析した（上記のとおり）。完全なBIA経路を有する株内でのオピオイド分子のN-脱メチル化をLC-MSによって検出した（上記のとおり）。具体的には、オキシモルホンのノルオキシモルホンへの変換を検出した。生物触媒作用によるN-脱メチル化活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにオピオイド基質（図7参照）および酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。オピオイド分子のN-脱メチル化をLC-MSによって検出した。

実施例16:グルコースと単純窒素源からナル-オピオイド化合物を生成するように遺伝子操作された微生物株
モルフィナンアルカロイドに対してN-メチラーゼ活性を示した表6に列記した酵素を、モルフィナンアルカロイドをデノボで生合成する微生物株（出芽酵母または大腸菌のいずれか）に組み込んだ（実施例10に記載のようにして）。図10は、前駆体分子テバインから最終ナル-オピオイド化合物のナロキソンおよびナルトレキソンまでの完全な反応スキームの一例を示す。このような株は、完全なBIA経路によるノル-オピオイド化合物の生成を担う、実施例14および15ならびに表3の酵素をさらに発現する。また、N-メチラーゼ酵素を、生合成経路がない微生物株内（例えば、出芽酵母ではCen.PK2または大腸菌ではBL21のいずれか）で発現させ、外来的に供給したいくつかの異なる基質分子の生物触媒作用能を有する株を作製した。完全なBIA生合成経路では、宿主細胞によって生成された、および/または培養培地中に補給されたチロシンが使用される。2分子のチロシンが改変され、縮合して、ノルコクラウリンまたはノルラウダノソリンのいずれかであり得る第1のベンジルイソキノリン構造を形成する。このベンジルイソキノリンはさらに改変されて（S）-レチクリンを形成し、次いで遺伝子操作された分割型エピメラーゼ酵素の活性によって立体化学的に反転され、（R）-レチクリンが生じる。（R）-レチクリンは炭素-炭素間のカップリング反応を受けて、第1のプロモルフィナンであるサルタリジンを形成し、さらに改変された後、テバインシンターゼによって触媒される酸素-炭素間のカップリング反応を受け、第1のモルフィナンアルカロイド構造であるテバインが得られる（図14参照）。表3に、完全な経路内の酵素および活性を列記する。

ノル-オピオイドまでの完全なBIA経路（図10参照）を有する株におけるN-修飾活性を検出するため、候補酵素を発現している細胞を発酵によって増殖させ（上記のとおり）、SAMまたはSAMアナログ、例えば図8に列記したものとともにインキュベートした。完全なBIA経路を有する株内におけるノル-オピオイドまたは他のBIA分子の酵素的修飾を、上清み中でLC-MSによって検出した（上記のとおり）。生物触媒作用によるN-修飾活性を検出するため、株を選択培地中で培養し、次いでガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにSAMまたはSAMアナログおよび酵素機能に必要な他の補因子を外来的に供給した。具体的には、ノルオキシモルホンのナロキソンおよびナルトレキソンへの変換（図8に示すようにSAMアナログであるアリル-SAMまたはシクロプロパン-SAMを使用）を検出した。ノル-オピオイドまたは他のBIA分子の修飾をLC-MSによって検出した。完全なBIA経路を有していない株における生物触媒作用によるN-修飾活性を検出するため、記載の異種酵素を発現しているCen.PK2株を選択培地中で培養し、ガラスビーズでの破壊によって溶解させた。細胞ライセートにSAMまたはSAMアナログ、酵素機能に必要な補因子ならびにノル-オピオイド分子、例えば図8および表3に列記したものを外来的に供給した。このような化合物の修飾をLC-MSによって検出した。

（表３）酵素リスト

（表４）O-デメチラーゼ候補酵素

（表５）N-デメチラーゼ候補酵素

（表６）N-メチルトランスフェラーゼおよびN-修飾候補酵素

（表７）BM3 N-デメチラーゼの変異体

（表８）pA24、pA25およびpA26の配列

（表９）テーラリング酵素

（表１０）けしがら濃縮物および清澄化した酵母培養培地中に存在し得る不純物の比較.

（表１１）清澄化した酵母培養培地（CYCM）中に存在する相違する分子群。けしがら濃縮物（CPS）とは異なり、酵母宿主株は、他の類型のアルカロイドが存在しないように所定の類型のアルカロイド分子（すなわち、一株につき1つの生合成経路のみ）を生成するように遺伝子操作され得る。したがって、CYCM中には、単一の生合成経路内の分子、例えば、1つまたは2つのカラムにまたがる分子のサブセットが含まれ得るが、CPS中には多くのカラムにおける分子のサブセットが含まれ得る.

（表１２）化合物の化学合成調製物中に存在し得る不純物

（表１３）NeXTシャッフリングによるシーケンシング済DRS変異体.

添付の特許請求の範囲にかかわらず、本明細書に示す開示内容はまた、以下の項によっても規定される:
1.遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、
方法。
2.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、項1の方法。
3.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項1の方法。
4.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項1の方法。
5.前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項2の方法。
6.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含む、項2の方法。
7.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも85％相同な配列を含む、項2の方法。
8.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも90％相同な配列を含む、項2の方法。
9.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、項2の方法。
10.前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、項6の方法。
11.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、項2の方法。
12.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも85％相同な配列を含む、項2の方法。
13.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも90％相同な配列を含む、項2の方法。
14.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、項2の方法
15.遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で融合型エピメラーゼよりも少なくとも1％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、
方法。
16.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも3％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
17.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼより少なくとも5％多くの前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
18.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも10％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
19.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも15％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
20.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも20％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
21.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも25％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
22.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも30％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項15の方法。
23.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項15の方法。
24.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項23の方法。
25.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、項15の方法。
26.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含む、項25の方法。
27.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも85％相同な配列を含む、項25の方法。
28.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも90％相同な配列を含む、項25の方法。
29.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、項25の方法。
30.前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、項25の方法。
31.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、項25の方法。
32.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも85％相同な配列を含む、項25の方法。
33.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも90％相同な配列を含む、項25の方法。
34.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、項25の方法。
35.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を、同様の条件下での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換と比べて増大させる、遺伝子操作された分割型エピメラーゼ
を含む、遺伝子操作された宿主細胞。
36.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼでは、前記アルカロイド生成物の生成が、同様の条件下での融合型の親エピメラーゼを介するエピマー化と比べて増大する、項35の遺伝子操作された宿主細胞。
37.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼでは、前記アルカロイド生成物の生成が、野生型融合型エピメラーゼを介するエピマー化と比べて増大する、項35の遺伝子操作された宿主細胞。
38.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項35の遺伝子操作された宿主細胞。
39.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項35の遺伝子操作された宿主細胞。
40.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、項35の遺伝子操作された宿主細胞。
41.前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項40の遺伝子操作された宿主細胞。
42.前記オキシダーゼ成分が、
SEQ ID NO.17と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項40の遺伝子操作された宿主細胞。
43.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、項40の遺伝子操作された宿主細胞。
44.局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
45.オキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、項44の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
46.野生型融合型エピメラーゼと比較して高い活性を有する、項44の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
47.自身の活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項44の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
48.前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項45の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
49.前記オキシダーゼ成分が、
SEQ ID NO.17と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項45の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
50.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、項45の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
51.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を、同様の条件下での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換と比べて増大させる、遺伝子操作された分割型エピメラーゼ
を含む、遺伝子操作された宿主細胞。
52.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項51の遺伝子操作された宿主細胞。
53.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項51の遺伝子操作された宿主細胞。
54.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、項51の遺伝子操作された宿主細胞。
55.前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項54の遺伝子操作された宿主細胞。
56.前記オキシダーゼ成分が、
SEQ ID NO.17と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項54の遺伝子操作された宿主細胞。
57.局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
58.野生型融合型エピメラーゼと比較して高い活性を有する、項57の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
59.自身の活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項57の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
60.オキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、項57の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
61.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
62.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも85％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
63.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも90％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
64.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
65.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
66.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも85％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
67.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも90％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
68.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
69.前記オキシダーゼ成分が1つまたは複数の変異を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
70.前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、項60の遺伝子操作された分割型エピメラーゼ。
71.遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物を生成する方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼはオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含み、前記オキシダーゼ成分はSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含み、前記レダクターゼ成分はSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、
方法。
72.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項71の方法。
73.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項71の方法。
74.前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項71の方法。
75.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも85％相同な配列を含む、項71の方法。
76.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも90％相同な配列を含む、項71の方法。
77.前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、項71の方法。
78.前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、項71の方法。
79.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも85％相同な配列を含む、項71の方法。
80.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも90％相同な配列を含む、項71の方法。
81.前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、項71の方法。
82.前記融合型エピメラーゼが野生型エピメラーゼである、先の項のいずれかの方法。
83.前記融合型エピメラーゼが前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、先の項のいずれかの方法。
84.前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、先の項のいずれかの方法。
85.前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記レダクターゼ成分と同じ配列を有するレダクターゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、先の項のいずれかの方法。
86.前記融合型エピメラーゼが野生型エピメラーゼである、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
87.前記融合型エピメラーゼが前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
88.前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
89.前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記レダクターゼ成分と同じ配列を有するレダクターゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
90.オキシダーゼ成分がシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインを有する、先の項のいずれかの方法。
91.レダクターゼ成分がコデイノンレダクターゼ様ドメインを有する、先の項のいずれかの方法。
92.遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、アルカロイド生成物を生成する方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させる工程であって、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼは、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、
方法。
93.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項92の方法。
94.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項92の方法。
95.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、項92の方法。
96.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも80％相同な配列を含む、項92の方法。
97.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも85％相同な配列を含む、項92の方法。
98.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも90％相同な配列を含む、項92の方法。
99.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも95％相同な配列を含む、項92の方法。
100.遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、同様の条件での野生型融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも1％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、
方法。
101.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも3％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
102.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも5％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
103.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも10％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
104.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも15％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
105.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも20％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
106.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも25％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
107.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも30％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、項100の方法。
108.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項100の方法。
109.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項100の方法。
110.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項100の方法。
111.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、項100の方法。
112.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも80％相同な配列を含む、項100の方法。
113.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも85％相同な配列を含む、項100の方法。
114.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも90％相同な配列を含む、項100の方法。
115.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼがSEQ ID NO.16と少なくとも95％相同な配列を含む、項100の方法。
116.遺伝子操作された融合型エピメラーゼを含む遺伝子操作された宿主細胞であって、前記エピメラーゼは（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を増大させ、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼより多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、遺伝子操作された宿主細胞。
117.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項116の遺伝子操作された宿主細胞。
118.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項116の遺伝子操作された宿主細胞。
119.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項116の遺伝子操作された宿主細胞。
120.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項116の遺伝子操作された宿主細胞。
121.局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼ。
122.野生型融合型エピメラーゼと比較して高い活性を有する、項121の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
123.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項121の遺伝子操作された融合型エピメラーゼ。
124.1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、野生型配列と比べてSEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、項121の遺伝子操作された融合型エピメラーゼ。
125.SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項121の遺伝子操作された融合型エピメラーゼ。
126.ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を有する生成物流を形成するための方法であって、
（a）遺伝子操作された宿主細胞と、栄養物および水を含むフィードストックとをバッチ式反応器に供給する工程であって、該遺伝子操作された宿主細胞は、少なくとも1種の遺伝子操作されたエピメラーゼをコードしている少なくとも1つの異種コード配列を含み、該遺伝子操作されたエピメラーゼは先の項のいずれかの遺伝子操作された分割型エピメラーゼまたは遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、工程;
（b）前記バッチ式反応器内で、前記遺伝子操作された宿主細胞を少なくとも約5分間インキュベートすることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞を発酵に供して、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物と細胞材料を含む溶液を生成させる工程;および
（c）前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を前記細胞材料から分離するために少なくとも1つの分離ユニットを用いて、前記ベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を含む前記生成物流を得る工程
を含む、方法。
127.バッチ式反応器の少なくとも1つのプロセスパラメータが、得られるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物の組成が変更されるように修正可能である、項126の方法。
128.修正可能である該少なくとも1つのプロセスパラメータが、溶存酸素、pH、撹拌速度、エアレーション速度および細胞密度のうちの少なくとも1つを含む、項126の方法。
129.先の項のいずれかにより生成されるベンジルイソキノリンアルカロイド生成物を含む医療用製剤品。
130.がん治療特性を有する、項129の医療用製剤品。
131.鎮痛特性を有する、項129の医療用製剤品。
132.抗マラリア特性を有する、項129の医療用製剤品。
133.鎮咳特性を有する、項129の医療用製剤品。
134.オピオイド過剰摂取処置特性を有する、項129の医療用製剤品。
135.抗依存症特性を有する、項129の医療用製剤品。
136.前記生成物が前記遺伝子操作された宿主細胞内でさらなる処理を受けてナル-オピオイド生成物が生成される、先の項のいずれかの方法。
137.前記生成物が前記遺伝子操作された宿主細胞内でさらなる処理を受けてノル-オピオイド生成物が生成される、先の項のいずれかの方法。
138.前記生成物が前記遺伝子操作された宿主細胞内でさらなる処理を受けてビスベンジルイソキノリンアルカロイド生成物が生成される、先の項のいずれかの方法。
139.前記生成物をナル-オピオイド生成物に変換するように遺伝子操作されている、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
140.前記生成物をノル-オピオイド生成物に変換するように遺伝子操作されている、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
141.前記生成物をビスベンジルイソキノリンアルカロイド生成物に変換するように遺伝子操作されている、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
142.前記生成物をプロモルフィナンアルカロイド生成物に変換するように遺伝子操作されている、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
143.前記生成物をモルフィナンアルカロイド生成物に変換するように遺伝子操作されている、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
144.遺伝子操作された融合型エピメラーゼがオキシダーゼドメインとレダクターゼドメインを含む、先の項のいずれかの方法。
145.オキシダーゼドメインがシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインである、項144の方法。
146.レダクターゼドメインがコデイノンレダクターゼ様ドメインである、項144の方法。
147.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが（S）-レチクリンである、先の項のいずれかの方法。
148.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが（R）-レチクリンである、先の項のいずれかの方法。
149.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを4環式のプロモルフィナンアルカロイドに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
150.4環式のプロモルフィナンアルカロイドがサルタリジンである、項75の方法。
151.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを5環式のモルフィナンアルカロイドに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
152.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをビスベンジルイソキノリンアルカロイドに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
153.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをナル-オピオイドに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
154.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをノル-オピオイドに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
155.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをプロモルフィナンに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
156.（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドをモルフィナンに変換する工程
をさらに含む、先の項のいずれかの方法。
157.遺伝子操作された宿主細胞内に存在する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された微生物細胞内で生成される、先の項のいずれかの方法。
158.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞内で、L-チロシンから始まる代謝経路によって生成される、先の項のいずれかの方法。
159.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが、遺伝子操作された宿主細胞内で、糖質と窒素源から始まる代謝経路によって生成される、先の項のいずれかの方法。
160.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが:（S）-ノルレチクリン;（S）-レチクリン;（S）-テトラヒドロパパベリン;（S）-ノルコクラウリン;（S）-コクラウリン;（S）-N-メチルコクラウリン;（S）-3’-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン;（S）-ノルイソオリエンタリン;（S）-オリエンタリン;（S）-イソオリエンタリン;（S）-ノルプロトシノメニン;（S）-プロトシノメニン;（S）-ノルラウダノソリン;（S）-ラウダノソリン;（S）-4’-O-メチルラウダノソリン;（S）-6-O-メチルノルラウダノソリン;および（S）-4’-O-メチルノルラウダノソリンからなる群より選択される、先の項のいずれかの方法。
161.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが式I:

の化合物であり、
式中:
R¹、R²、R³およびR⁴は独立して水素またはメチルであり;
R⁵は水素、ヒドロキシまたはメトキシである、
先の項のいずれか1つの方法。
162.前記遺伝子操作された宿主細胞が遺伝子操作された非植物細胞である、上記の項のいずれか1つの方法。
163.前記遺伝子操作された宿主細胞が遺伝子操作された酵母細胞である、上記の項のいずれか1つの方法。
164.前記遺伝子操作された宿主細胞が遺伝子操作された細菌細胞である、上記の項のいずれか1つの方法。
165.遺伝子操作された融合型エピメラーゼがオキシダーゼドメインとレダクターゼドメインを含む、先の項のいずれかの遺伝子操作された宿主細胞。
166.オキシダーゼ成分がシトクロムP450オキシダーゼ様ドメインを有する、項165の遺伝子操作された宿主細胞。
167.レダクターゼ成分がコデイノンレダクターゼ様ドメインを有する、項165の遺伝子操作された宿主細胞。
168.遺伝子操作された非植物細胞である、上記の項のいずれか1つの遺伝子操作された宿主細胞。
169.遺伝子操作された酵母細胞である、上記の項のいずれか1つの遺伝子操作された宿主細胞。
170.遺伝子操作された細菌細胞である、上記の項のいずれか1つの遺伝子操作された宿主細胞。
171.遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作されたエピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作されたエピメラーゼと接触させることにより、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、
方法。
172.前記遺伝子操作されたエピメラーゼが、遺伝子操作された分割型エピメラーゼである、項171の方法。
173.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼでは、野生型融合型エピメラーゼを介するエピマー化と比べて前記前記アルカロイド生成物の生成が増大する、項172の方法。
174.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項172の方法。
175.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項172の方法。
176.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが1つまたは複数の変異を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内の位置に相当する位置に存在する、項172の方法。
177.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項172の方法。
178.前記遺伝子操作されたエピメラーゼが、遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、項171の方法。
179.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項178の方法。
180.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項178の方法。
181.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが1つまたは複数の変異を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内の位置に相当する位置に存在する、項178の方法。
182.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項178の方法。
183.前記遺伝子操作された宿主細胞が遺伝子操作された非植物細胞である、上記の項171〜182のいずれか1つの方法。
184.（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を増大させる遺伝子操作されたエピメラーゼを含む遺伝子操作された宿主細胞。
185.前記遺伝子操作されたエピメラーゼが、遺伝子操作された分割型エピメラーゼである、項184の遺伝子操作された宿主細胞。
186.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼでは、前記アルカロイド生成物の生成が野生型融合型エピメラーゼを介するエピマー化と比べて増大する、項185の遺伝子操作された宿主細胞。
187.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項185の遺伝子操作された宿主細胞。
188.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項185の遺伝子操作された宿主細胞。
189.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが1つまたは複数の変異を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内の位置に相当する位置に存在する、項185の遺伝子操作された宿主細胞。
190.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項185の遺伝子操作された宿主細胞。
191.前記遺伝子操作されたエピメラーゼが、遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、項184の遺伝子操作された宿主細胞。
192前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項191の遺伝子操作された宿主細胞。
193.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、項191の遺伝子操作された宿主細胞。
194.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが1つまたは複数の変異を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内の位置に相当する位置に存在する、項191の遺伝子操作された宿主細胞。
195.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項191の遺伝子操作された宿主細胞。
196.前記遺伝子操作された宿主細胞が遺伝子操作された非植物細胞である、項184〜195のいずれか1つの遺伝子操作された宿主細胞。
197.局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む遺伝子操作されたエピメラーゼ。
198.遺伝子操作された分割型エピメラーゼである、項197の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
199.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが野生型融合型エピメラーゼと比較して高い活性を有する、項197の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
200.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、項197の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
201.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが1つまたは複数の変異を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.16内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内の位置に相当する位置に存在する、項197の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
202.前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項197の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
203.局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである遺伝子操作されたエピメラーゼ。
204.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、SEQ ID NO.16の対応する位置に1つまたは複数の変異を含み、前記1つまたは複数の変異が、16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応する、項203の遺伝子操作されたエピメラーゼ。
205.前記遺伝子操作された融合型エピメラーゼが、
SEQ ID NO.16と少なくとも80％相同であり、かつ
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.16内のアミノ酸位置に相当するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列にコードされている
配列を含む、項203の遺伝子操作されたエピメラーゼ。

本発明の好ましい態様を本明細書において図示および記載してきたが、当業者にはかかる態様は一例とした示したものにすぎないことが明らかであろう。ここに、当業者には、本発明から逸脱することなく数多くの変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する種々の代替例が本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、およびこの特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにその均等物が特許請求の範囲に包含されることを意図する。

Claims

遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、
方法。
前記融合型エピメラーゼが野生型エピメラーゼである、請求項1記載の方法。
前記融合型エピメラーゼが前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、請求項1記載の方法。
前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、請求項1記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、請求項1記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項1記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、請求項1記載の方法。
前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、請求項7記載の方法。
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含む、請求項7記載の方法。
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、請求項7記載の方法。
前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、請求項7記載の方法。
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、請求項7記載の方法。
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、請求項7記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で前記融合型エピメラーゼよりも少なくとも1％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、請求項1記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも3％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、請求項1記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも5％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、請求項1記載の方法。
遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物を生成する方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼはオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含み、前記オキシダーゼ成分はSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含み、前記レダクターゼ成分はSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、
方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、請求項17記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項17記載の方法。
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、請求項17記載の方法。
前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、請求項20記載の方法。
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも85％相同な配列を含む、請求項20記載の方法。
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも90％相同な配列を含む、請求項20記載の方法。
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、請求項20記載の方法。
前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列
にコードされた配列を含む、請求項20記載の方法。
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも85％相同な配列を含む、請求項20記載の方法。
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも90％相同な配列を含む、請求項20記載の方法。
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、請求項20記載の方法。
前記オキシダーゼ成分をコードしている第1の核酸が第1の翻訳開始部位を有し、前記レダクターゼ成分をコードしている第2の核酸が第2の翻訳開始部位を有する、請求項7または20記載の方法。
前記第1の核酸が前記第2の核酸と分離されている、請求項29記載の方法。
前記第1の核酸が前記第2の核酸と同じ核酸である、請求項29記載の方法。
前記オキシダーゼ成分が第1のメッセンジャーRNAにコードされており、前記レダクターゼ成分が第2のメッセンジャーRNAにコードされている、請求項7または20記載の方法。
前記オキシダーゼ成分が第1の分子を含み、前記レダクターゼ成分が第2の分子を含み、ここで、前記第1の分子は前記第2の分子と分離されている、請求項7または20記載の方法。
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を、同様の条件下での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換と比べて増大させる、遺伝子操作された分割型エピメラーゼ
を含む、遺伝子操作された宿主細胞。
前記融合型エピメラーゼが野生型エピメラーゼである、請求項34記載の遺伝子操作された宿主細胞。
前記融合型エピメラーゼが前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、請求項34記載の遺伝子操作された宿主細胞。
前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、請求項34記載の遺伝子操作された宿主細胞。