CN114302951A

CN114302951A - 提高吗啡喃生物碱和衍生物的产量的方法

Info

Publication number: CN114302951A
Application number: CN202080039446.9A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂娜·斯默克; 凯瑟琳·托德利; 克里斯蒂·霍金斯; X·李; 艾米·考泽娜
Original assignee: Antheia Inc
Current assignee: Antheia Inc
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2022-04-08
Also published as: CA3134602A1; WO2020198373A1; EP3947633A1; EP3947633A4; US20220162656A1

Abstract

提供了用于在工程化非植物细胞内产生可待因酮的方法和系统。所述方法包括在所述工程化非植物细胞内产生蒂巴因产物。所述方法还包括在所述工程化非植物细胞内，使所述蒂巴因产物与具有蒂巴因6‑O‑脱甲基酶活性的酶接触，从而产生尼奥品酮产物。另外，所述方法包括在所述工程化非植物细胞内，使所述尼奥品酮产物与尼奥品酮异构酶接触，从而产生可待因酮产物。

Description

提高吗啡喃生物碱和衍生物的产量的方法

交叉参考

本申请要求2019年3月26日提交的美国临时申请第62/824,252号的优先权，所述申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

本申请涉及：美国专利申请第14/211,611号，目前公开为US 2014-0273109，所述申请于2014年3月14日提交并且代理人案号为STAN-1018WO；PCT申请第PCT/US2014/027833号，目前公开为WO 2014/143744，所述申请于2014年3月14日提交并且代理人案号为STAN-1018WO；美国专利申请第15/031,618号，所述申请于2016年4月22日提交并且代理人案号为STAN-1078；申请第PCT/US2014/063738号，目前公开为WO 2015/066642，所述申请于2014年11月3日提交并且代理人案号为STAN-1078WO；美国临时专利申请第62/080,610号，其于2014年11月17日提交并且代理人案号为STAN-1169PRV；美国临时专利申请第62/107,238号，其于2015年1月23日提交并且代理人案号为STAN-1169PRV2；申请第PCT/US2015/060891号，所述申请于2015年11月16日提交并且代理人案号为STAN-1169WO；美国临时专利申请第62/156,701号，其于2015年5月4日提交并且代理人案号为STAN-1221PRV；申请第PCT/US2016/030808号，其于2016年5月4日提交并且代理人案号为STAN-1221WO；申请第PCT/US2016/031506号，所述申请于2016年5月9日提交；申请第PCT/US2017/057237号，所述申请于2017年10月18日提交；申请第62/541,038号，所述申请于2017年8月3日提交；申请第PCT/US2018/045222号，所述申请于2018年8月3日提交；申请第16/149,025号，所述申请于2018年10月1日提交；美国临时专利申请第62/628,264号，其于2018年2月8日提交；以及申请第PCT/US2019/017357号，所述申请于2019年2月8日提交；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文中。

发明内容

本公开提供用于在工程化宿主细胞中产生多种苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。本公开进一步提供在工程化宿主细胞中产生的多种生物碱的组合物。另外，本公开提供用于在工程化宿主细胞中产生一种或多种Bet v 1折叠蛋白的方法。另外，本公开提供用于在工程化宿主细胞中产生尼奥品酮(neopinone)异构酶的方法。在特定情况下，本公开提供通过在工程化宿主细胞中将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱，产生多种生物碱产物的方法。在进一步特定情况下，本公开提供通过将尼奥品酮转化为可待因酮来产生多种生物碱产物的方法。

在一些实施例中，本公开提供通过在工程化宿主细胞中经由工程化差向异构酶将(S)-1-苄基异喹啉生物碱差向异构为(R)-1-苄基异喹啉生物碱来增加多种生物碱产物产量的方法。在其它实施例中，本公开提供与通过经由野生型差向异构酶将(S)-牛心果碱(reticuline)差向异构为(R)-牛心果碱产生多种生物碱产物相比，通过经由包含编码氧化酶和还原酶的两种独立酶的工程化差向异构酶将(S)-牛心果碱差向异构为(R)-牛心果碱来增加多种生物碱产物的产量的方法。

尽管工程化分裂差向异构酶可由来源于亲本或野生型差向异构酶的独立氧化酶和还原酶构成，但工程化差向异构酶也可包含来源于独立亲本或野生型差向异构酶的独立氧化酶和还原酶。具有氧化酶和还原酶组分的亲本差向异构酶的实例包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16，如表1中列出。

在一些实施例中，本公开提供通过在工程化宿主细胞中经由蒂巴因合酶将原吗啡喃(promorphinan)生物碱转化为吗啡喃生物碱来增加多种生物碱产物产量的方法。在其它实施例中，本公开提供通过经由蒂巴因合酶将沙罗泰里啶醇(salutaridinol)-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因来增加多种生物碱产物产量的方法。亲本蒂巴因合酶的实例包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36和37，如表2中列出。

在一些实施例中，本公开提供通过在工程化宿主细胞中经由工程化蒂巴因合酶将原吗啡喃生物碱转化为吗啡喃生物碱来增加多种生物碱产物产量的方法。在其它实施例中，本公开提供通过经由工程化蒂巴因合酶将沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因来增加多种生物碱产物产量的方法。

在一些实施例中，工程化蒂巴因合酶为融合酶。在其它实施例中，蒂巴因合酶与乙酰基转移酶融合。在其它实施例中，蒂巴因合酶在乙酰基转移酶内被编码。在其它实施例中，蒂巴因合酶与还原酶融合。

在一些实施例中，本公开提供通过在工程化宿主细胞中经由尼奥品酮异构酶将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱，增加多种生物碱产物产量的方法。在其它实施例中，经由包含多种酶并且以简单起始物质(如糖和/或L-酪氨酸)的起始的异源生物合成途径，在工程化细胞中产生在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱。在其它实施例中，本公开提供通过经由尼奥品酮异构酶将尼奥品酮转化为可待因酮来增加多种生物碱产物产量的方法。亲本尼奥品酮异构酶的实例包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85和86，如表3中列出。

在一些实施例中，本公开提供通过在工程化宿主细胞中经由工程化尼奥品酮异构酶将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱，增加多种生物碱产物产量的方法。在其它实施例中，本公开提供通过经由工程化尼奥品酮异构酶将尼奥品酮转化为可待因酮来增加多种生物碱产物产量的方法。

在一些实施例中，工程化尼奥品酮异构酶为融合酶。在其它实施例中，尼奥品酮异构酶与作用于吗啡喃生物碱支架的O-脱甲基酶融合。在其它实施例中，尼奥品酮异构酶在O-脱甲基酶内被编码。在其它实施例中，尼奥品酮异构酶与还原酶融合。在其它实施例中，尼奥品酮异构酶在还原酶内被编码。

在一些实例中，工程化非植物细胞包含多个编码序列，其各自编码选自表5中列出的酶的组的酶。在一些实例中，异源编码序列可以可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可处于经由尼奥品酮异构酶活性或工程化尼奥品酮异构酶活性产生特定苄基异喹啉生物碱产物的相同途径内。

在一些实施例中，本公开提供一种将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的方法，其包括使前体吗啡喃生物碱与至少一种酶接触，其中使前体吗啡喃生物碱与至少一种酶接触将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱。在一些情况下，至少一种酶通过培养具有用于编码至少一种酶的编码序列的工程化非植物细胞来产生。在一些情况下，所述至少一种酶包含尼奥品酮异构酶。在一些情况下，尼奥品酮异构酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85和86。在一些情况下，尼奥品酮异构酶为Bet v1折叠蛋白。

在一些情况下，所述方法进一步包括用多种异源酶来工程化非植物细胞，以从简单起始物质(如糖和/或L-酪氨酸)产生前体吗啡喃生物碱。在一些情况下，所述方法进一步包括用至少一种酶来工程化非植物细胞，所述酶将在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱转化为下游衍生物。在一些情况下，所述方法进一步包括从细胞培养物中回收在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱或其衍生物。

通过引用并入

本说明书中提到的所有公开、专利以及专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每个单独的公开、专利或专利申请特定地并且单独地指示以引用的方式并入一般。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。将参考以下详细描述和附图来获得对本发明特征和优势的更好理解，以下详细描述阐述利用本发明原理的说明性实施例，在附图中：

图1说明根据本发明的一些实施例，将葡萄糖转化为4-HPAA、多巴胺、3,4-DHPAA以及将1-苄基异喹啉生物碱转化为牛心果碱的生物合成方案。

图2说明根据本发明的一些实施例，酪氨酸羟化酶活性以及与酪氨酸3-单加氧酶活性相关的四氢生物蝶呤的合成、再循环和补救途径的实例。

图3说明根据本发明的一些实施例，经由去甲乌药碱(norcoclaurine)和去甲劳丹碱(norlaudanosoline)将L-酪氨酸转化为牛心果碱的生物合成方案。

图4说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为吗啡喃生物碱，包括天然和半合成阿片的生物合成方案。

图5说明根据本发明的一些实施例，用于产生天然阿片，包括可待因和吗啡的异构体的生物合成方案。

图6说明根据本发明的一些实施例，用于产生去甲阿片和纳阿片(nal-opioid)的生物合成方案。

图7说明根据本发明的一些实施例，用于产生诺斯卡品(noscapine)和相关途径代谢物的生物合成方案。

图8说明根据本发明的一些实施例，用于产生血根碱和相关途径代谢物的生物合成方案。

图9说明根据本发明的一些实施例，用于产生小檗碱和相关途径代谢物的生物合成方案。

图10说明根据本发明的一些实施例，用于产生bisBIA和相关途径代谢物的生物合成方案。

图11说明根据本发明的一些实施例，具有阿片6-O-脱甲基酶活性的酶。

图12说明根据本发明的一些实施例，具有阿片3-O-脱甲基酶活性的酶。

图13说明根据本发明的一些实施例，具有阿片N-脱甲基酶活性的酶。

图14说明根据本发明的一些实施例，具有阿片14-羟化酶活性的酶。

图15说明根据本发明的一些实施例，具有阿片醇氧化还原酶活性的酶。

图16说明根据本发明的一些实施例，具有阿片还原酶活性的酶。

图17说明根据本发明的一些实施例，具有阿片异构酶活性的酶。

图18说明根据本发明的一些实施例，具有N-甲基转移酶活性的酶。

图19说明根据本发明的一些实施例，用于从L-酪氨酸产生牛心果碱的酵母平台菌株。

图20说明根据本发明的一些实施例，用于从L-酪氨酸产生蒂巴因和氢可酮的酵母菌株。

图21说明根据本发明的一些实施例，由工程化酵母菌株从糖和L-酪氨酸产生吗啡喃生物碱可待因。

图22说明根据本发明的一些实施例，由工程化酵母菌株从糖和L-酪氨酸产生吗啡。

图23说明根据本发明的一些实施例，由工程化酵母菌株从糖和L-酪氨酸产生氢可酮。

图24说明根据本发明的一些实施例，BM3变异体的功能性表达。

具体实施方式

本公开提供用于在工程化宿主细胞中产生多种苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。本公开进一步提供在工程化宿主细胞中产生的多种生物碱的组合物。另外，本公开提供用于在宿主细胞中产生尼奥品酮异构酶的方法，所述宿主细胞用多种异源酶工程化以从简单起始物质，如糖和/或L-酪氨酸产生前体吗啡喃生物碱。另外，本公开提供用于在宿主细胞中产生工程化尼奥品酮异构酶的方法，所述宿主细胞用多种异源酶工程化以从简单起始物质产生前体吗啡喃生物碱。在特定情况下，本公开提供通过在工程化宿主细胞中增加前体吗啡喃生物碱向产物吗啡喃生物碱异构体的转化来产生吗啡喃、纳阿片和去甲阿片生物碱产物的方法。在进一步特定情况下，本公开提供通过在宿主细胞中增加前体吗啡喃生物碱向产物吗啡喃生物碱异构体的转化来产生吗啡喃、纳阿片和去甲阿片生物碱产物的方法，所述宿主细胞用一种或多种酶工程化以将产物吗啡喃生物碱异构体转化为下游生物碱产物。在进一步特定情况下，本公开提供通过增加前体吗啡喃生物碱向产物吗啡喃生物碱异构体的转化来产生多种生物碱产物的方法。

所关注的苄基异喹啉生物碱(BIA)

提供了产生所关注的BIA的宿主细胞。在一些实例中，宿主细胞的工程化菌株，如本发明的工程化菌株提供产生跨若干结构类别的所关注的苄基异喹啉生物碱和其修饰的平台，所述类别包括但不限于前体BIA、苄基异喹啉、原吗啡喃、吗啡喃、原小檗碱、原阿片碱、苯并菲啶、开环小檗碱、苯酞异喹啉、阿朴啡、双苄基异喹啉、纳阿片、去甲阿片和其它。这些类别中的每一者意图包括可产生所述类别的成员的工程化宿主细胞生物合成途径的任何适宜成员的生物合成前体、中间体和其代谢物。对于这些结构类别中的每一者，下文给出化合物的非限制性实例。在一些情况下，给定实例的结构本身可或可不表征为苄基异喹啉生物碱。本发明化学实体意图包括所有可能的异构体，包括单一对映异构体、外消旋混合物、光学纯形式、非对映异构体的混合物和中间体混合物。

苄基异喹啉生物碱前体可包括但不限于去甲乌药碱(NC)和去甲劳丹碱(NL)，以及NC和NL前体，如酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛(4-HPAA)、4-羟基苯丙酮酸(4-HPPA)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPAA)和多巴胺。在一些实施例中，一种或多种BIA前体为3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPAA)和多巴胺。在某些情况下，一种或多种BIA前体为4-羟基苯乙醛(4-HPAA)和多巴胺。特定来说，NL和NC可分别经由皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)缩合反应从前体分子合成，其中反应可自发发生或可通过任何适宜的酶催化。

苄基异喹啉可包括但不限于去甲乌药碱、去甲劳丹碱、乌药碱、3'-羟基乌药碱、4'-O-甲基去甲劳丹碱、4'-O-甲基-劳丹碱、N-甲基去甲乌药碱、劳丹碱、N-甲基乌药碱、3'-羟基-N-甲基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、罂粟碱、劳丹宁(laudanine)、劳丹素(laudanosine)、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱和东罂粟灵(orientaline)。

原吗啡喃可包括但不限于沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇和沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。

吗啡喃可包括但不限于蒂巴因、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱、尼奥品酮、尼奥品、尼奥吗啡、氢可酮、二氢可待因、14-羟基可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡、美托酮、丁丙诺啡、福尔可定、异可待因和羟吗啡酮。

原小檗碱可包括但不限于斯氏紫堇碱(scoulerine)、华紫堇碱(cheilanthifoline)、人血草碱(stylopine)、南丁宁碱(nandinine)、药根碱(jatrorrhizine)、光千金藤定碱(stepholidine)、木瓣树胺(discretamine)、顺-N-甲基人血草碱、四氢非洲防己碱(tetrahydrocolumbamine)、巴马亭(palmatine)、四氢巴马亭、非洲防己碱、坎那定(canadine)、N-甲基坎那定、1-羟基坎那定、小檗碱、N-甲基-蛇果黄堇碱(ophiocarpine)、1,13-二羟基-N-甲基坎那定和1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基坎那定。

原阿片碱可包括但不限于原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱(allocryptopine)、隐品碱、蓟罂粟胺(muramine)和黄唐松草碱(thalictricine)。

苯并菲啶可包括但不限于二氢血根碱、血根碱、二氢切里鲁宾(dihydrocheilirubine)、切里鲁宾、二氢马卡平(dihydromarcapine)、马卡平和白屈菜红碱。

开环小檗碱可包括但不限于4′-O-去甲基马克兰特醛(desmethylmacrantaldehyde)、4′-O-去甲基罂粟奥辛(desmethylpapaveroxine)、4′-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛。

苯酞异喹啉可包括但不限于罂粟壳碱半缩醛(narcotolinehemiacetal)、那可汀半缩醛(narcotinehemiacetal)、罂粟壳碱、诺斯卡品、藤荷包牡丹定碱(adlumidine)、藤荷苞牡丹明(adlumine)、(+)或(-)-荷包牡丹碱(bicuculline)、咖喏定(capnoidine)、紫堇明(carlumine)、对叶延胡索碱(corledine)、紫堇米定碱(corlumidine)、夏无碱(decumbenine)、5′-O-去甲基那可汀、(+)或(-)-α或β-白毛莨碱(hydrastine)，和细果角茴香碱(hypecoumine)。

阿朴啡可包括但不限于木兰花碱(magnoflorine)、紫堇块茎碱(corytuberine)、阿朴吗啡(apomorphine)、波尔定碱(boldine)、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱和加奥芬(glaufine)。

双苄基异喹啉可包括但不限于大叶小檗碱(berbamunine)、蝙蝠葛新林碱(guattegaumerine)、山豆根碱(dauricine)和莲心碱(liensinine)。

纳阿片可包括但不限于纳曲酮、纳洛酮、纳美芬、纳洛芬、纳洛芬、纳洛地因(nalodeine)、纳地美定(naldemedine)、纳洛昔醇(naloxegol)、6β-纳曲醇、纳曲吲哚、甲基纳曲酮、甲基沙米多芬(methylsamidorphan)、爱维莫潘(alvimopan)、阿西洛仑(axelopran)、倍福普兰(bevenpran)、二烟酸酯、左洛啡烷(levallorphan)、沙米多芬、丁丙诺啡、地佐辛、依他佐辛、布托啡诺、左啡诺、纳布啡、喷他佐辛、非那佐辛、去甲丙纳托非敏(norbinaltorphimine)和二丙诺啡。

去甲鸦片可包括但不限于去甲可待因、去甲羟考酮、去甲蒂巴因、去甲氢可酮、去甲二氢-可待因、去甲-14-羟基-可待因、去甲可待因酮、去甲-14-羟基-可待因酮、去甲吗啡、去甲羟吗啡酮、去甲东罂粟碱、去甲氢-吗啡酮、去甲二氢-吗啡、去甲-14-羟基-吗啡、去甲吗啡酮和去甲-14-羟基-吗啡酮。

可由本发明的工程化菌株产生的其它化合物可包括但不限于丽春花定碱(rhoeadine)、杷碱(pavine)、异杷碱和枯拉灵(cularine)。

在某些实施例中，本发明的工程化菌株可提供用于产生与四氢生物蝶呤合成相关的化合物的平台，所述化合物包括但不限于三磷酸二氢新蝶呤、6-丙酮酰基四氢蝶呤、5,6,7,8-四氢生物蝶呤、7,8-二氢生物蝶呤、四氢生物蝶呤4a-甲醇胺、醌型二氢生物蝶呤和生物蝶呤。

宿主细胞

可在本发明宿主细胞和方法中利用任何适宜细胞。在一些情况下，宿主细胞为非植物细胞。在一些情况下，宿主细胞可表征为微生物细胞。在某些情况下，宿主细胞为昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。可利用任何适宜类型的宿主细胞来产生本发明的产生BIA的细胞，参见例如US2008/0176754、US2014/0273109、PCT/US2014/063738、PCT/US2016/030808、PCT/US2015/060891、PCT/US2016/031506和PCT/US2017/057237，其公开内容以全文引用的方式并入。所关注的宿主细胞包括但不限于细菌细胞，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、链霉菌属(Streptomyces)、鱼腥藻属(Anabaena)、节杆菌属(Arthrobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、盐单胞菌属(Halomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、考克氏菌属(Kocuria)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucononstoc)、巨球菌属(Macrococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基细胞菌属(Methylocella)、甲基球菌属(Methylococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、微囊藻属(Microcystis)、穆尔氏菌属(Moorella)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形杆菌属(Proteus)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、四体球菌属(Tetragenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、发酵单胞菌属(Zymomonas)和鼠寒沙门氏菌(Salmonella typhimuium)细胞，昆虫细胞如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞，以及酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。在一些实例中，宿主细胞为酵母细胞或大肠杆菌细胞。在一些情况下，宿主细胞为酵母细胞。在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生所关注的BIA，如(R)-1-苄基异喹啉生物碱的酵母菌株。在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生所关注的酶的酵母菌株。在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生工程化差向异构酶的酵母菌株。在一些实施例中，工程化差向异构酶可为工程化分裂差向异构酶。在一些实施例中，工程化差向异构酶可为工程化融合差向异构酶。在一些实施例中，差向异构酶活性可由独立氧化酶和还原酶编码。另外，在一些实施例中，相对于亲本差向异构酶，工程化差向异构酶可能能够更有效地将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在一些实施例中，亲本差向异构酶可为野生型差向异构酶。在一些实施例中，亲本差向异构酶可基本上类似于野生型差向异构酶。在一些情况下，基本上类似于野生型差向异构酶的亲本差向异构酶的氨基酸序列与野生型差向异构酶的氨基酸序列的相似度可为至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。在一些实施例中，工程化差向异构酶可分离成更小的酶，所述更小的酶展现相对于其对应的亲本差向异构酶，更有效地将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的氧化酶和还原酶活性。

在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生蒂巴因合酶的酵母菌株。相对于自发反应，蒂巴因合酶可能能够更有效地将沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因。在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生工程化蒂巴因合酶的酵母菌株。在一些实施例中，工程化蒂巴因合酶可为工程化融合酶。另外，相对于亲本蒂巴因合酶，工程化蒂巴因合酶可能能够更有效地将沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因。在一些实施例中，亲本蒂巴因合酶可为野生型蒂巴因合酶。在一些实施例中，亲本蒂巴因合酶可基本上类似于野生型蒂巴因合酶。在一些情况下，基本上类似于野生型蒂巴因合酶的亲本蒂巴因合酶的氨基酸序列与野生型蒂巴因合酶的氨基酸序列的相似度可为至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。工程化蒂巴因合酶可工程化为与另一种酶的融合酶，以相对于亲本蒂巴因合酶，更有效地将沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因。

在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生尼奥品酮异构酶的酵母菌株。相对于自发反应，尼奥品酮异构酶可能能够更有效地将尼奥品酮转化为可待因酮。在一些情况下，宿主细胞来自经工程化以产生工程化尼奥品酮异构酶的酵母菌株。在一些实施例中，工程化尼奥品酮异构酶可为工程化融合酶。另外，相对于亲本尼奥品酮异构酶，工程化尼奥品酮异构酶可能能够更有效地将尼奥品酮转化为可待因酮。在一些实施例中，亲本尼奥品酮异构酶可为野生型尼奥品酮异构酶。在一些实施例中，亲本尼奥品酮异构酶可基本上类似于野生型尼奥品酮异构酶。在一些情况下，基本上类似于野生型尼奥品酮异构酶的亲本尼奥品酮异构酶的氨基酸序列与野生型尼奥品酮异构酶的氨基酸序列的相似度可为至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高。工程化尼奥品酮异构酶可工程化为与另一种酶的融合酶，以相对于亲本尼奥品酮异构酶，更有效地将尼奥品酮转化为可待因酮。

Smolke等人的US2008/0176754、US2014/0273109、PCTUS2014/063738、PCT/US2016/030808、PCT/US2015/060891、PCT/US2016/031506、PCT/US2017/057237和美国临时申请第62/627,264号中所描述的宿主细胞中的任一者可适用于本发明细胞和方法。在某些实施例中，酵母细胞可为物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae/S.cerevisiae)。在某些实施例中，酵母细胞可为物种粟酒裂殖酵母。在某些实施例中，酵母细胞可为物种巴斯德毕赤酵母。酵母作为宿主细胞受关注，因为细胞色素P450蛋白能够正确折叠到内质网膜中，使得所述蛋白的活性得到维持。在一些实例中，细胞色素P450蛋白参与一些所关注的生物合成途径。在其它实例中，细胞色素P450蛋白参与所关注的BIA的产生。在其它实例中，细胞色素P450蛋白参与所关注的酶的产生。

用于本发明的所关注的酵母菌株包括但不限于CEN.PK(基因型：MATa/α ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2)、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、∑1278B、AB972、SK1和FL100。在某些情况下，酵母菌株为以下中的任一者：S288C(MATα；SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1flo8-1 hap1)、BY4741(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)、BY4742(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0)、BY4743(MATa/MATα；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0)和WAT11或W(R)，W303-B菌株的衍生物(MATa；ade2-1；his3-11,-15；leu2-3,-112；ura3-1；canR；cyr+)，其分别表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)NADPH-P450还原酶ATR1和酵母NADPH-P450还原酶CPR1。在另一实施例中，酵母细胞为W303α(MATα；his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)。其它所关注的酵母菌株的身份和基因型可在EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)找到。

在一些情况下，宿主细胞为真菌细胞。在某些实施例中，真菌细胞可为曲霉属物种，并且菌株包括黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC 1015、ATCC 9029、CBS 513.88)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(ATCC 56747、RIB40)、土曲霉(Aspergillus terreus)(NIH2624、ATCC 20542)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(FGSC A4)。

在某些实施例中，异源编码序列可经密码子优化以便在曲霉属物种中表达并且由适当启动子表达。在某些实施例中，启动子可选自磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)、MbfA启动子、细胞色素c氧化酶亚基启动子(CoxA)、SrpB启动子、TvdA启动子、苹果酸脱氢酶启动子(MdhA)、β-甘露糖苷酶启动子(ManB)。在某些实施例中，终止子可选自葡糖淀粉酶终止子(GlaA)或TrpC终止子。在某些实施例中，由启动子、异源编码序列和终止子组成的表达盒可由质粒表达或整合于宿主的基因组中。在某些实施例中，可用抗生素选择(如潮霉素)或氮源利用(如使用乙酰胺作为唯一氮源)，进行维持质粒或整合盒的细胞选择。在某些实施例中，可使用已建立的转化方法(如原生质体转化、乙酸锂或电穿孔)将DNA构建体引入宿主细胞。在某些实施例中，细胞可在液体ME或固体MEA(3％麦芽提取物、0.5％蛋白胨和±1.5％琼脂)或在沃格尔基本培养基(Vogel's minimal medium)中在具有或不具有选择的情况下培养。

在一些情况下，宿主细胞为细菌细胞。细菌细胞可选自任何细菌属。细菌细胞可来自的属的实例包括鱼腥藻属、节杆菌属、醋杆菌属、醋酸杆菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、短状杆菌属、短杆菌属、肉食杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、葡糖醋杆菌属、葡糖杆菌属、哈夫尼菌属、盐单胞菌属、克雷伯氏菌属、考克氏菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、巨球菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基细胞菌属、甲基球菌属、微杆菌属、微球菌属、微囊藻属、穆尔氏菌属、酒球菌属、片球菌属、原绿球藻属、丙酸杆菌属、变形杆菌属、假交替单胞菌属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、红细菌属、红球菌属、红假单胞菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、聚球藻属、集胞藻属、四体球菌属、魏斯氏菌属和发酵单胞菌属。可与本公开的方法一起使用的细菌物种的实例包括烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、阿氏节杆菌(Arthrobacterarilaitensis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、酪发酵短状杆菌(Brachybacterium tyrofermentans)、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)、广布肉食杆菌(Carnobacterium divergens)、微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、欧洲葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter europaeus)、约翰娜葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter johannae)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)、酸面乳杆菌(Lactobacillus acidifarinae)、詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、山梨乳杆菌(Lactobacillusyamanashiensis)、柠檬色明串珠菌(Leuconostoc citreum)、溶酪巨球菌(Macrococcuscaseolyticus)、叶片微杆菌(Microbacterium foliorum)、里拉微球菌(Micrococcuslylae)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、速生嗜冷杆菌(Psychrobacter celer)、调料葡萄球菌(Staphylococcus condimenti)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、嗜盐四体球菌(Tetragenococcus halophilus)、食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、韩国魏斯氏菌(Weissella koreensis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、两歧/短/长双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum/breve/longum)、铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonas citrea)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、扬氏/乙酸/丙酮丁醇/拜氏/丁酸梭菌(Clostridium ljungdahlii/aceticum/acetobutylicum/beijerinckii/butyricum)和热纤维/热乙酸穆尔氏菌(Moorella themocellum/thermoacetica)。

在某些实施例中，细菌细胞可为大肠杆菌菌株。在某些实施例中，大肠杆菌菌株可选自BL21、DH5α、XL1-Blue、HB101、BL21和K12。在某些实施例中，异源编码序列可经密码子优化以便在大肠杆菌中表达并且由适当启动子表达。在某些实施例中，启动子可选自T7启动子、tac启动子、trc启动子、四环素诱导型启动子(tet)、lac操纵子启动子(lac)、lacO1启动子。在某些实施例中，由启动子、异源编码序列和终止子组成的表达盒可由质粒表达或整合于基因组中。在某些实施例中，质粒选自pUC19或pBAD。在某些实施例中，维持质粒或整合盒的细胞选择可用抗生素选择，如卡那霉素、氯霉素、链霉素、壮观霉素、庆大霉素、红霉素或氨苄青霉素进行。在某些实施例中，可使用已建立的转化方法，如缀合、热休克化学转化或电穿孔将DNA构建体引入宿主细胞。在某些实施例中，细胞可在液体卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani；LB)培养基中在约37℃下在具有或不具有抗生素的情况下培养。

在某些实施例中，细菌细胞可为枯草芽孢杆菌菌株。在某些实施例中，枯草芽孢杆菌菌株可选自1779、GP25、RO-NN-1、168、BSn5、BEST195、1A382和62178。在某些实施例中，异源编码序列可经密码子优化以便在芽孢杆菌属物种中表达并且由适当启动子表达。在某些实施例中，启动子可选自grac启动子、p43启动子或trnQ启动子。在某些实施例中，由启动子、异源编码序列和终止子组成的表达盒可由质粒表达或整合于基因组中。在某些实施例中，质粒选自pHP13 pE194、pC194、pHT01或pHT43。在某些实施例中，可以用整合载体(如pDG364或pDG1730)将表达盒整合到基因组中。在某些实施例中，维持质粒或整合盒的细胞选择可用抗生素选择，如红霉素、卡那霉素、四环素和壮观霉素进行。在某些实施例中，可使用已建立的转化方法，如自然感受态、热休克或化学转化将DNA构建体引入宿主细胞。在某些实施例中，细胞可在液体卢里亚-贝尔塔尼(LB)培养基中在37℃下或在M9培养基加葡萄糖和色氨酸中培养。

对宿主细胞的基因修饰

宿主细胞可经工程化以包括提供所关注的BIA的产生的一种或多种修饰(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多修饰)。另外或可替代地，宿主细胞可经工程化以包括提供所关注的酶的产生的一种或多种修饰(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多修饰)。在一些情况下，修饰为基因修饰，如基因或其片段的突变、添加或缺失，或基因或其片段的转录调控。如本文所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序，氨基酸残基或核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变可作为对原始基因座处天然基因的定向突变并入。在一些情况下，突变可作为被作为单独基因座处基因整合引入的基因的额外拷贝并入，或作为游离型载体(如2μ或着丝粒质粒)上的额外拷贝并入。在某些情况下，酶的底物抑制拷贝受天然细胞转录调控。在一些情况下，酶的底物抑制拷贝通过将其置于合成启动子的控制下，用蛋白质表达的工程化组成型或动态调控引入。在一些实例中，一种或多种修饰的对象可为天然基因。在一些实例中，一种或多种修饰的对象可为非天然基因。在一些实例中，非天然基因可插入到宿主细胞中。在其它实例中，非天然基因可在插入到宿主细胞中之前通过一种或多种修饰改变。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种所关注的BIA。过度产生意指相对于对照细胞(例如未修饰的细胞)，细胞具有提高或增加的所关注的BIA分子的产量。提高或增加的产量意指在对照不具有所关注的BIA产量时，产生一定量的所关注的BIA，以及在对照具有一定的所关注的BIA产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种(S)-1-苄基异喹啉生物碱。在一些情况下，工程化宿主细胞可在对照不具有(S)-1-苄基异喹啉生物碱产量时，产生一定量的所关注的(S)-1-苄基异喹啉生物碱，以及在对照具有一定的所关注的(S)-1-苄基异喹啉生物碱产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

工程化宿主细胞可进一步过度产生一种或多种(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在一些情况下，工程化宿主细胞可在对照不具有(R)-1-苄基异喹啉生物碱产量时，产生一定量的所关注的(R)-1-苄基异喹啉生物碱，以及在对照具有一定的所关注的(R)-1-苄基异喹啉生物碱产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。工程化宿主细胞可进一步过度产生一种或多种1-苄基异喹啉生物碱。

工程化宿主细胞可进一步过度产生一种或多种吗啡喃生物碱。在一些情况下，工程化宿主细胞可在对照不具有吗啡喃生物碱产量时，产生一定量的所关注的吗啡喃生物碱，以及在对照具有一定的所关注的吗啡喃生物碱产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。在一些情况下，吗啡喃生物碱由工程化宿主细胞内工程化差向异构酶催化的差向异构反应的1-苄基异喹啉生物碱产物或其衍生物形成。工程化差向异构酶可包含起作用以产生差向异构酶反应的两种独立酶。工程化宿主细胞可进一步过度产生原吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱中的一者或多者。

在一些情况下，相对于具有工程化融合差向异构酶的宿主细胞，具有工程化分裂差向异构酶的工程化宿主细胞能够产生增加量的(R)-牛心果碱。在一些情况下，相对于缺乏对工程化差向异构酶的氧化酶部分的一种或多种修饰(例如，如本文所描述)的对照宿主细胞，具有对工程化差向异构酶的氧化酶部分的修饰的工程化宿主细胞能够产生增加量的(R)-牛心果碱。在某些情况下，相对于对照宿主细胞，(R)-牛心果碱的增加量为约10％或更多，如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、约2倍或更多、约5倍或更多或甚至约10倍或更多。在一些情况下，(R)-牛心果碱为由工程化宿主细胞内至少一种工程化差向异构酶催化的差向异构反应的产物。在这些情况下，(S)-牛心果碱可为差向异构反应的底物。

在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所描述)的对照宿主细胞，工程化宿主细胞能够产生增加量的蒂巴因。在一些情况下，相对于缺乏蒂巴因合酶的宿主细胞，具有蒂巴因合酶的工程化宿主细胞能够产生增加量的蒂巴因。在一些情况下，相对于具有亲本蒂巴因合酶(例如，如本文所描述)的宿主细胞，具有工程化蒂巴因合酶的工程化宿主细胞能够产生增加量的蒂巴因。在某些情况下，相对于对照宿主细胞，蒂巴因的增加量为约10％或更多，如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、约2倍或更多、约5倍或更多或甚至约10倍或更多。在一些情况下，蒂巴因为工程化宿主细胞内蒂巴因合酶反应的产物。在一些情况下，蒂巴因为由工程化宿主细胞内至少一种工程化蒂巴因合酶催化的蒂巴因合酶反应的产物。在这些情况下，沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯可为蒂巴因合酶反应的底物。

在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所描述)的对照宿主细胞，工程化宿主细胞能够产生增加量的可待因酮，或生物合成途径中可待因酮下游的吗啡喃生物碱产物。在一些情况下，相对于缺乏尼奥品酮异构酶的宿主细胞，具有尼奥品酮异构酶的工程化宿主细胞能够产生增加量的可待因酮，或生物合成途径中可待因酮下游的吗啡喃生物碱产物。在一些情况下，相对于具有亲本尼奥品酮异构酶(例如，如本文所描述)的宿主细胞，具有工程化尼奥品酮异构酶的工程化宿主细胞能够产生增加量的可待因酮，或生物合成途径中可待因酮下游的吗啡喃生物碱产物。在某些情况下，相对于对照宿主细胞，可待因酮，或生物合成途径中可待因酮下游的吗啡喃生物碱产物的增加量为约10％或更多，如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、约2倍或更多、约5倍或更多或甚至约10倍或更多。在一些情况下，可待因酮为工程化宿主细胞内尼奥品酮异构酶反应的产物。在一些情况下，可待因酮为由工程化宿主细胞内至少一种工程化尼奥品酮异构酶催化的尼奥品酮异构酶反应的产物。在这些情况下，尼奥品酮可为尼奥品酮异构酶反应的底物。

另外，工程化宿主细胞可过度产生一种或多种所关注的酶。过度产生意指相对于对照细胞(例如未修饰的细胞)，细胞具有提高或增加的所关注的酶的产量。提高或增加的产量意指在对照不具有产量时，产生一定量的所关注的酶，以及在对照具有一定的所关注的酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种工程化DRS-DRR酶。在一些情况下，在对照不具有DRS-DRR酶产量或对照与工程化宿主细胞相比具有相同水平的野生型差向异构酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的工程化DRS-DRR差向异构酶，以及在对照具有一定的DRS-DRR酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。在一些情况下，工程化DRS-DRR差向异构酶可为工程化分裂差向异构酶。在一些情况下，工程化DRS-DRR差向异构酶可为工程化融合差向异构酶。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种蒂巴因合酶。在一些情况下，在对照不具有蒂巴因合酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的蒂巴因合酶，以及在对照具有一定的蒂巴因合酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种工程化蒂巴因合酶。在一些情况下，在对照不具有蒂巴因合酶产量或对照与工程化宿主细胞相比具有相同水平的野生型蒂巴因合酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的工程化蒂巴因合酶，以及在对照具有一定的蒂巴因合酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。在一些情况下，工程化蒂巴因合酶可为工程化融合酶。

工程化宿主细胞可进一步过度产生一种或多种衍生自蒂巴因合酶的酶。在一些情况下，在对照不具有衍生自蒂巴因合酶的酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的衍生自蒂巴因合酶的酶，以及在对照具有一定的衍生自蒂巴因合酶的酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种尼奥品酮异构酶。在一些情况下，在对照不具有尼奥品酮异构酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的尼奥品酮异构酶，以及在对照具有一定的尼奥品酮异构酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

工程化宿主细胞可过度产生一种或多种工程化尼奥品酮异构酶。在一些情况下，在对照不具有尼奥品酮异构酶产量或对照与工程化宿主细胞相比具有相同水平的野生型尼奥品酮异构酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的工程化尼奥品酮异构酶，并且在对照具有一定的尼奥品酮异构酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。在一些情况下，工程化尼奥品酮异构酶可为工程化融合酶。

工程化宿主细胞可进一步过度产生一种或多种衍生自尼奥品酮异构酶的酶。在一些情况下，在对照不具有衍生自尼奥品酮异构酶的酶产量时，工程化宿主细胞可产生一定量的衍生自尼奥品酮异构酶的酶，以及在对照具有一定的衍生自尼奥品酮异构酶的酶产量的情况下，增加约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多，如5倍或更多，包括10倍或更多。

另外，工程化宿主细胞可过度产生一种或多种双苄基异喹啉生物碱(bisBIA)。特定来说，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所描述)，包括与携带工程化差向异构酶相关的修饰的对照宿主细胞，工程化宿主细胞能够产生增加量的双苄基异喹啉生物碱(bisBIA)。在某些情况下，相对于对照宿主细胞，bisBIA的增加量为约10％或更多，如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、约2倍或更多、约5倍或更多或甚至约10倍或更多。在一些情况下，bisBIA由至少一种BIA单体形成，所述BIA单体为由工程化宿主细胞内工程化差向异构酶催化的差向异构反应的产物或其衍生物。工程化差向异构酶可包含起作用以产生差向异构酶反应的两种独立酶。工程化宿主细胞可进一步过度产生以下中的一者或多者：千金藤碱(cepharanthine)、防己诺林碱(fangchinoline)、莲心碱、甲基莲心碱(neferine)、筒箭毒碱(tubocurarine)、山豆根碱、汉防己碱(tetrandrine)、箭毒碱(curine)、大叶小檗碱、蝙蝠葛新林碱、2'-去甲大叶小檗碱和小檗胺。

在一些情况下，一种或多种(如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)修饰可选自：定位突变；细胞色素P450还原酶相互作用突变；可接近性突变；活性增强突变；工程化融合差向异构酶修饰；工程化蒂巴因合酶修饰；工程化尼奥品酮异构酶修饰；和工程化分裂差向异构酶修饰。包括一种或多种修饰的细胞可称为工程化细胞。

底物抑制减轻突变

在一些情况下，工程化宿主细胞为在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种底物抑制减轻突变(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多)的细胞。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是天然的(例如存在于未修饰的细胞中)。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是非天然的。如本文所用，术语“底物抑制减轻突变”是指减轻细胞的底物抑制控制机制的突变。

减轻底物抑制的突变相对于对照细胞减少对所关注的细胞中受调控酶的抑制，并且提供提高水平的受调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，减轻对受调控酶的抑制意指抑制的IC₅₀增加2倍或更多，如3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多或甚至更多。提高水平意指一种水平，其为对照细胞中受调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多，如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多或200％或更多，如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多或甚至更多的工程化宿主细胞中的受调控化合物或其下游产物。

可靶向工程化宿主细胞中针对所关注的BIA或其前体水平的调控的多种底物抑制控制机制和生物合成酶，以进行底物抑制减轻。工程化宿主细胞可在一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种底物抑制减轻突变。一种或多种突变可位于任何适宜生物合成酶基因中，其中生物合成酶受调控控制。在一些实施例中，一种或多种生物合成酶基因编码一种或多种酪氨酸羟化酶。在某些情况下，一种或多种底物抑制减轻突变存在于生物合成酶基因中，所述基因为TyrH。在一些实施例中，工程化宿主细胞可在一种或多种生物合成酶基因，如表5中所描述的那些基因之一中包括一种或多种底物抑制减轻突变。

在某些实施例中，一种或多种底物抑制减轻突变存在于TyrH基因中。TyrH基因编码酪氨酸羟化酶，其为将酪氨酸转化为L-DOPA的酶。然而，TyrH受其底物酪氨酸抑制。哺乳动物酪氨酸羟化酶活性，如人或大鼠中所见，可通过减轻底物抑制的对TyrH基因的突变来提高。特定来说，来自酪氨酸的底物抑制可通过TyrH基因中的点突变W166Y减轻。TyrH基因中的点突变W166Y还可提高酪氨酸羟化酶的辅助底物BH₄的结合，以催化酪氨酸向L-DOPA的反应。TyrH的突变体在酵母菌株中表达以从糖产生BIA(如美国临时专利申请第61/899,496号中所描述的那些)时，可显著提高BIA的产量。

可利用任何适宜数量和类型的突变来减轻底物抑制控制机制。在某些实施例中，本发明的工程化宿主细胞可在工程化宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基因中包括1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种底物抑制减轻突变，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种底物抑制减轻突变。

辅因子回收促进机制

在一些情况下，工程化宿主细胞为在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种辅因子回收促进机制(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多)的细胞。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是天然的(例如存在于未修饰的细胞中)。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是非天然的。如本文所用，术语“辅因子回收促进机制”是指促进细胞的辅因子回收控制机制的机制。

可靶向工程化宿主细胞中针对所关注的BIA或其前体水平的调控的多种辅因子回收控制机制和生物合成酶，以进行辅因子回收促进。工程化宿主细胞可在一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种辅因子回收促进机制。在一些实例中，工程化宿主细胞可包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的异源编码序列。当DHFR表达时，其可将7,8-二氢生物蝶呤(BH₂)转化为四氢生物蝶呤(BH₄)，从而回收BH₄作为TyrH辅助底物。在一些实例中，工程化宿主细胞可在一种或多种生物合成酶基因，如表5中所描述的那些基因之一中包括一种或多种辅因子回收促进机制。

可利用任何适宜数量和类型的机制来促进辅因子回收控制机制。在某些实施例中，本发明的工程化宿主细胞可在工程化宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基因中包括1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种辅因子回收促进机制，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种辅因子回收促进机制。

产物抑制减轻突变

在一些情况下，工程化宿主细胞为在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种产物抑制减轻突变(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多)的细胞。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是天然的(例如存在于未修饰的细胞中)。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是非天然的。如本文所用，术语“产物抑制减轻突变”是指减轻工程化宿主细胞的短期和/或长期产物抑制控制机制的突变。短期产物抑制为在辅助底物结合位点处存在竞争性结合的细胞的控制机制。长期产物抑制为存在远离所需途径的化合物的不可逆结合的细胞的控制机制。

减轻产物抑制的突变相对于对照细胞减少对所关注的细胞中受调控酶的抑制，并且提供提高水平的受调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，减轻对受调控酶的抑制意指抑制的IC₅₀增加2倍或更多，如3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多或甚至更多。提高水平意指一种水平，其为对照细胞中受调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多，如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多或200％或更多，如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多或甚至更多的工程化宿主细胞中的受调控化合物或其下游产物。

可靶向工程化宿主细胞中针对所关注的BIA水平的调控的多种产物抑制控制机制和生物合成酶，以进行产物抑制减轻。工程化宿主细胞可在一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种产物抑制减轻突变。突变可位于任何适宜生物合成酶基因中，其中生物合成酶受调控控制。在一些实施例中，一种或多种生物合成酶基因编码一种或多种酪氨酸羟化酶。在某些情况下，一种或多种产物抑制减轻突变存在于生物合成酶基因中，所述基因为TyrH。在一些实施例中，工程化宿主细胞在一种或多种生物合成酶基因，如表5中所描述的那些基因之一中包括一种或多种产物抑制减轻突变。

在某些实施例中，一种或多种产物抑制减轻突变存在于TyrH基因中。TyrH基因编码酪氨酸羟化酶，其为将酪氨酸转化为L-DOPA的酶。TyrH需要四氢生物蝶呤(BH₄)作为辅助底物来催化羟基化反应。一些微生物菌株，如酿酒酵母不天然产生BH₄，但可经工程化以通过如图2中说明的四酶合成和再循环途径产生此底物。图2说明根据本发明的一些实施例的四氢生物蝶呤的合成、再循环和补救途径的实例。图2提供酶PTPS，丙酮酰基四氢蝶呤合酶；SepR，墨蝶呤还原酶；PCD，蝶呤4a-甲醇胺脱水酶；QDHPR，二氢蝶啶还原酶；和DHFR，二氢叶酸还原酶的用途。在图2中说明的酶中，酵母合成内源性GTP环化水解酶I。GTP和二氢新蝶呤三磷酸在酵母中天然合成。另外，图2中的其它代谢物并非在酵母中天然产生。

TyrH受其产物L-DOPA以及其它儿茶酚胺，尤其多巴胺抑制。哺乳动物酪氨酸羟化酶活性，如来自人或大鼠，可通过减轻底物抑制的突变来提高。举例来说，短期产物抑制，如辅助底物结合位点处的竞争性结合，可通过TyrH基因上的点突变W166Y减轻。特定来说，TyrH基因上的点突变W166Y可提高辅助底物的结合。另外，可通过TyrH基因上的点突变S40D来提高减轻辅助底物结合位点处的竞争性结合的短期产物抑制。还可通过TyrH基因上的R37E、R38E联合突变来提高短期产物抑制。特定来说，R37E、R38E突变可一起特异性提高在多巴胺存在下的酪氨酸羟化酶活性。

另外，可通过TyrH基因上的点突变减轻来长期产物抑制。长期产物抑制减轻可包括儿茶酚胺与活性位点中铁的不可逆结合，使得存在更少儿茶酚胺来充当酪氨酸羟化酶活性的产物抑制剂。可分别通过TyrH基因中的突变E332D和Y371F来减轻长期产物抑制。

可进行突变组合(如一次进行两种或三种或更多种突变)以减轻多种类型的底物和产物抑制来进一步提高TyrH活性。TyrH的突变体在酵母菌株中表达以从糖产生BIA(如美国临时专利申请第61/899,496号中所描述的那些)时，可显著提高BIA的产量。

可利用任何适宜数量和类型的突变来减轻产物抑制控制机制。在某些实施例中，本发明的工程化宿主细胞可在工程化宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基因中包括1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种产物抑制减轻突变，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种产物抑制减轻突变。

反馈抑制减轻突变

在一些情况下，工程化宿主细胞为在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一种或多种反馈抑制减轻突变(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多)的细胞。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是天然的(例如存在于未修饰的细胞中)。另外或可替代地，在一些实例中，一种或多种生物合成酶对于细胞来说是非天然的。如本文所用，术语“反馈抑制减轻突变”是指减轻工程化宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制为细胞的一种控制机制，其中受调控化合物的合成途径中的酶在所述化合物积累到某一水平时受抑制，从而平衡细胞中所述化合物的量。相对于对照细胞，减轻反馈抑制的突变减少工程化宿主细胞中对受调控酶的抑制。以此方式，工程化宿主细胞提供提高水平的受调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，减轻对受调控酶的抑制意指抑制的IC₅₀增加2倍或更多，如3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多或甚至更多。提高水平意指一种水平，其为对照细胞中受调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多，如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多或200％或更多，如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多或甚至更多的宿主细胞中的受调控化合物或其下游产物。

可在宿主细胞中靶向针对所关注的BIA水平的调控的多种反馈抑制控制机制和生物合成酶，以进行减轻。宿主细胞可在一种或多种对于细胞来说是天然的生物合成酶基因中包括一种或多种反馈抑制减轻突变。一种或多种突变可位于任何适宜生物合成酶基因中，其中生物合成酶受调控控制。在一些实施例中，一种或多种生物合成酶基因可编码一种或多种选自3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸变位酶的酶。在一些实施例中，一种或多种生物合成酶基因编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因可编码分支酸变位酶。在某些情况下，一种或多种反馈抑制减轻突变可存在于选自ARO4和ARO7的生物合成酶基因中。在某些情况下，一种或多种反馈抑制减轻突变可存在于生物合成酶基因中，所述基因为ARO4。在某些情况下，一种或多种反馈抑制减轻突变存在于生物合成酶基因中，所述基因为ARO7。在一些实施例中，工程化宿主细胞可在一种或多种生物合成酶基因，如表5中所描述的那些基因之一中包括一种或多种反馈抑制减轻突变。

可利用任何适宜数量和类型的突变来减轻反馈抑制控制机制。如本文所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序，氨基酸残基或核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变可作为对原始基因座处天然基因的定向突变并入。在一些情况下，突变可作为被作为单独基因座处基因整合引入的基因的额外拷贝并入，或作为游离型载体，如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。在某些情况下，酶的反馈抑制拷贝受天然细胞转录调控。在一些情况下，酶的反馈抑制拷贝通过将其置于合成启动子的控制下，用蛋白质表达的工程化组成型或动态调控引入。

在某些实施例中，一种或多种反馈抑制减轻突变可存在于ARO4基因中。所关注的ARO4突变可包括但不限于用亮氨酸取代位置229处的赖氨酸残基、用赖氨酸残基取代位置166处的谷氨酰胺残基或如Hartmann M等人((2003)《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci U S A)》100(3):862-867)或Fukuda等人((1992)《发酵与生物工程杂志(JFerment Bioeng)》74(2):117-119)所描述的突变。在一些情况下，用于赋予反馈抑制的突变可选自酶突变体的诱变文库。此类选择的实例可包括在具有过量酪氨酸的培养基中挽救o-氟-D,L-苯丙氨酸的生长或aro3突变酵母菌株的生长，如Fukuda等人((1990)《产生大量β-苯乙醇和乙酸β-苯乙酯的啤酒酵母的育种(Breeding of Brewing Yeast Producing aLarge Amount of Beta-Phenylethyl Alcohol and Beta-Phenylethyl Acetate)》.《农业和生物化学(东京)(Agr Biol Chem Tokyo)》54(1):269-271)所描述。

在某些实施例中，本发明的工程化宿主细胞可在工程化宿主细胞内的一种或多种生物合成酶基因中包括1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或甚至15种或更多种反馈抑制减轻突变，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种反馈抑制减轻突变。

转录调节修饰

宿主细胞可包括细胞的一种或多种生物合成酶基因的一种或多种转录调节修饰(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多)。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是天然的。在一些实例中，一种或多种生物合成酶基因对于细胞来说是非天然的。可靶向细胞的任何适宜生物合成酶基因以进行转录调节。转录调节意指相对于对照细胞(例如未修饰的细胞)，修饰的细胞中所关注基因的表达经调节，例如提高或降低、增强或抑制。在一些情况下，所关注基因的转录调节包括提高或增强表达。提高或增强表达意指与对照，即未修饰的相同细胞中的表达相比，所关注基因的表达水平提高2倍或更多，如提高5倍或更多，并且有时提高25倍、50倍或100倍或更多，并且在某些实施例中提高300倍或更多或更高(例如通过使用任何适宜的基因表达分析)。可替代地，在所关注基因在细胞中的表达如此低以至于其不可检测的情况下，如果表达提高到可容易检测的水平，则所关注基因的表达水平视为提高。在某些情况下，所关注基因的转录调节包括降低或抑制表达。降低或抑制表达意指与对照相比，所关注基因的表达水平降低2倍或更多，如降低5倍或更多，并且有时降低25倍、50倍或100倍或更多，并且在某些实施例中降低300倍或更多或更高。在一些情况下，表达降低到不可检测的水平。可适用于在本发明宿主细胞中使用的所关注的宿主细胞过程的修饰描述于Smolke等人的美国公开第20140273109(14/211,611)号中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

任何适宜的生物合成酶基因可经转录调节，并且包括但不限于图1中所描述那些生物合成酶。特定来说，图1说明根据本发明的一些实施例，用于将葡萄糖转化为4-HPAA、多巴胺和3,4-DHPAA的生物合成方案。图1中所描述的酶的实例包括ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9和ARO8。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因可选自ARO10、ARO9、ARO8和TYR1。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因可为ARO10。在某些情况下，一种或多种生物合成酶基因可为ARO9。在一些实施例中，一种或多种生物合成酶基因可为TYR1。在一些实施例中，宿主细胞包括对一种或多种基因，如表5中所描述的那些基因之一的一种或多种转录调节修饰。

在一些实施例中，转录调节修饰可包括用强启动子取代一种或多种生物合成酶基因的天然启动子，或表达处于强启动子的控制下的一种或多种基因的额外拷贝。驱动所关注基因表达的启动子可为组成型启动子或诱导型启动子，其条件是启动子可在宿主细胞中具有活性。所关注基因可由其天然启动子表达。另外或可替代地，所关注基因可由非天然启动子表达。尽管不是必需的，但此类启动子在使用其的宿主中可具有中至高强度。启动子可受调控或为组成型。在一些实施例中，可使用不受葡萄糖抑制，或仅受培养基中葡萄糖的存在轻度抑制的启动子。存在大量合适的启动子，其实例包括糖酵解基因的启动子，如枯草芽孢杆菌tsr基因(编码果糖二磷酸醛缩酶)的启动子或来自酵母酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶)(Bitter G.A.,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》152:673 684(1987))。其它所关注的强启动子包括但不限于面包酵母的ADHI启动子(Ruohonen L.等人,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》39:193 203(1995))，磷酸饥饿诱导启动子，如酵母的PHO5启动子(Hinnen,A.等人,在《酵母基因工程(Yeast Genetic Engineering)》中,Barr,P.J.等人编,Butterworths(1989)，来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等人,《普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)》137:1127 1133(1991))，GPD1和TEF1。所关注的酵母启动子包括但不限于诱导型启动子，如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、可抑制启动子Met25、tetO，以及组成型启动子，如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延伸因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。在一些情况下，强启动子为GPD1。在某些情况下，强启动子为TEF1。还已知含有受激素(如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体，并且其包括但不限于糖皮质激素反应性元件(GRE)和甲状腺激素反应性元件(TRE)，参见例如美国专利第7,045,290号中所描述的那些启动子。可使用含有组成型或诱导型启动子，如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。另外，任何适宜启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库(Eukaryotic Promoter DataBase)EPDB)也可用于驱动所关注基因的表达。应理解，可选择对宿主细胞，例如大肠杆菌具有特异性的任何适宜启动子。在一些情况下，启动子选择可用于优化转录，并且因此优化酶水平，以使产量最大化同时使能量资源最小化。

失活突变

工程化宿主细胞可包括一种或多种对细胞的酶或蛋白质的失活突变(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多)。包含一种或多种失活突变可修改工程化宿主细胞的合成途径的通量，以提高所关注的BIA或产生其的所需酶或前体的水平。在一些实例中，一种或多种失活突变针对对于细胞来说是天然的酶。另外或可替代地，一种或多种失活突变针对对于细胞来说是非天然的酶。如本文所用，“失活突变”意指针对细胞的基因或调控DNA序列的一种或多种突变，其中突变使由所关注基因表达的蛋白质的生物活性失活。在一些情况下，基因对于细胞来说是天然的。在一些情况下，基因编码酶，所述酶失活并且是由宿主细胞产生的所关注的BIA的合成途径的一部分或与所述合成途径连接。在一些情况下，失活突变位于控制所关注基因的调控DNA序列中。在某些情况下，失活突变针对基因的启动子。可利用任何适宜突变(例如，如本文所描述)使所关注的基因或调控DNA序列失活。“失活的”或“失活”意指相对于由非突变对照基因表达的对照蛋白质，由突变基因表达的蛋白质的生物活性降低10％或更多，如降低20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多或99％或更多。在一些情况下，蛋白质为酶并且失活突变降低酶的活性。

在一些实例中，工程化宿主细胞包括对于细胞来说是天然的酶或蛋白质中的失活突变。可靶向任何适宜酶进行失活。所关注的酶可包括但不限于表5中所描述的那些酶，其在工程化宿主细胞的合成途径中的作用倾向于降低所关注的BIA的水平。在一些情况下，酶具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ZWF1。在一些情况下，酶具有醇脱氢酶活性。在一些实施例中，包括失活突变的酶选自ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ADH2。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ADH3。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ADH4。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ADH5。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ADH6。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ADH7。在一些情况下，酶具有醛氧化还原酶活性。在某些实施例中，包括失活突变的酶选自ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ALD2。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ALD3。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ALD4。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ALD5。在某些实施例中，包括失活突变的酶为ALD6。在一些情况下，酶具有醛还原酶活性。在一些实施例中，包括失活突变的酶为ARI1。在一些情况下，酶具有芳基-醇脱氢酶活性。在一些实施例中，包括失活突变的酶选自AAD4、AAD6、AAD10、AAD14、AAD15、AAD16。在某些实施例中，包括失活突变的酶为AAD4。在某些实施例中，包括失活突变的酶为AAD6。在某些实施例中，包括失活突变的酶为AAD10。在某些实施例中，包括失活突变的酶为AAD14。在某些实施例中，包括失活突变的酶为AAD15。在某些实施例中，包括失活突变的酶为AAD16。在一些实例中，工程化宿主细胞包括对于细胞来说是天然的转录调控因子中的失活突变。所关注的转录调控因子可包括但不限于表5中所描述的那些蛋白质。在一些情况下，蛋白质具有作为磷脂生物合成基因的转录调控因子的活性。在一些实施例中，包括失活突变的转录调控因子为OPI1。在一些实施例中，宿主细胞包括对表5中所描述的一种或多种基因的一种或多种失活突变。

差向异构修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述(S)-1-苄基异喹啉生物碱向(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化。这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱是将底物转化为广泛范围的生物碱中的关键步骤。在一些实例中，将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱包括经由工程化差向异构酶的差向异构反应。在一些情况下，底物生物碱的差向异构可通过将(S)-底物氧化为对应的席夫碱(Schiff base)或亚胺中间体，随后将此中间体立体特异性还原为(R)-产物来进行，如图1中所提供且如方案1中大体表示。如方案1中所提供，R₁、R₂、R₃和R₄可为H或CH₃。R₅可为H、OH或OCH₃。

方案1

在一些实例中，将(S)-底物转化为(R)-产物可涉及至少一种氧化反应和至少一种还原反应。在一些情况下，氧化反应任选地后接还原反应。在一些情况下，氧化反应和还原反应中的至少一者在酶存在下进行。在一些情况下，氧化反应和还原反应中的至少一者由工程化差向异构酶催化。在一些情况下，氧化反应和还原反应均在工程化融合差向异构酶存在下进行。在一些情况下，氧化反应和还原反应均在分别具有单独表达的氧化酶组分和还原酶组分的工程化分裂差向异构酶存在下进行。在一些情况下，工程化差向异构酶适用于催化氧化反应和还原反应。氧化反应和还原反应可由相同工程化差向异构酶催化。

在本文所描述的一些方法、工艺和系统中，氧化反应可在作为工程化差向异构酶的一部分的酶存在下进行。在一些实例中，工程化差向异构酶可具有氧化酶组分。在一些情况下，氧化酶组分可为工程化融合差向异构酶的组分。在一些情况下，氧化酶组分可独立地表达为工程化分裂差向异构酶的一部分。氧化酶可使用(S)-1-苄基异喹啉作为底物。氧化酶可将(S)-底物转化为对应亚胺或席夫碱衍生物。氧化酶可称为1,2-脱氢牛心果碱合酶(DRS)。本公开中适合于氧化(S)-1-苄基异喹啉生物碱的酶的非限制性实例包括细胞色素P450氧化酶、2-酮戊二酸依赖性氧化酶和黄素蛋白氧化酶。举例来说，(S)-四氢原小檗碱氧化酶(STOX，E.C 1.3.3.8)可将(S)-去甲牛心果碱和其它(S)-1-苄基异喹啉生物碱氧化为1,2-脱氢去甲牛心果碱和其它对应1,2-脱氢产物。在一些实例中，包含前述实例中的任一者的氧化酶结构域的蛋白质可进行氧化。在一些实例中，氧化酶可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的氧化反应，如本文所描述。在一些情况下，氧化酶可具有一种或多种提高活性的组分。

在一些实例中，还原反应可在氧化反应之后。还原反应可由作为工程化差向异构酶的一部分的酶进行。在一些实例中，还原酶可使用衍生自1-苄基异喹啉的亚胺或席夫碱作为底物。还原酶可将亚胺或席夫碱衍生物转化为(R)-1-苄基异喹啉。还原酶可称为1,2-脱氢牛心果碱还原酶(DRR)。适合于还原衍生自(S)-1-苄基异喹啉生物碱的亚胺或席夫碱的酶的非限制性实例包括醛酮还原酶(例如可待因酮还原酶样酶(EC 1.1.1.247))和短链脱氢酶(例如沙罗泰里啶还原酶样酶(EC 1.1.1.248))。在一些实例中，包含前述实例中的任一者的还原酶结构域的蛋白质可进行还原。在另一实施例中，还原为立体特异性的。在一些实例中，还原酶可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的还原反应，如本文所描述。

可进行将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构反应的酶的实例包括具有氧化酶结构域和还原酶结构域的差向异构酶。特定来说，差向异构酶可具有细胞色素P450氧化酶82Y2样结构域。另外，差向异构酶可具有可待因酮还原酶样结构域。具有细胞色素P450氧化酶82Y2样结构域并且还具有可待因酮还原酶样结构域的差向异构酶可称为DRS-DRR酶。特定来说，DRS-DRR酶可为作为融合差向异构酶的融合酶。此外，当DRS-DRR酶通过至少一种提高活性的修饰来修饰时，融合酶可为工程化融合差向异构酶。

可用于进行(S)-1-苄基异喹啉生物碱向(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化的DRS-DRR酶的氨基酸序列的实例阐述于表1中。用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构酶的氨基酸序列可与表1中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类差向异构酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

同源差向异构酶的氨基酸残基可根据SEQ ID NO.16的编号方案提及，并且此编号系统在整个本公开中使用以提及与SEQ ID NO.16同源的差向异构酶的特定氨基酸残基。与SEQ ID NO.16同源的差向异构酶可与SEQ ID NO.16具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性。在一些情况下，同源差向异构酶中提及为位置50的氨基酸可能不是同源差向异构酶中的第50个氨基酸，但将为在同源差向异构酶与SEQ ID NO.16的蛋白质比对中对应于SEQ ID NO.16中位置50处的氨基酸的氨基酸。在一些情况下，同源酶可根据一级序列、二级结构或三级结构与SEQ ID NO.16比对。

可提供工程化宿主细胞，其产生将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的工程化差向异构酶，其中差向异构酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，并且具有一种或多种增强活性的修饰。工程化宿主细胞内产生的差向异构酶可经回收和纯化以便形成生物催化剂。在一些情况下，差向异构酶可分裂成一种或多种酶。另外，可从工程化宿主细胞中回收通过分裂差向异构酶产生的一种或多种酶。由分裂差向异构酶产生的这一种或多种酶也可用于催化(S)-1-苄基异喹啉生物碱向(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化。另外，与利用融合差向异构酶在细胞内产生苄基异喹啉生物碱产物相比时，使用工程化分裂差向异构酶可用于增加细胞内苄基异喹啉生物碱产物的产生。

在其它情况下，从产生差向异构酶的工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的工艺。所述工艺可包括使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与足以将所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的量的差向异构酶接触。在一些实例中，可使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在其它实例中，可使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱。

可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一种或多种酶可在体外接触(S)-1-苄基异喹啉生物碱。另外或可替代地，可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一种或多种酶可在体内接触(S)-1-苄基异喹啉生物碱。另外，可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一种或多种酶可提供给在内部具有(S)-1-苄基异喹啉生物碱的细胞，或可在工程化宿主细胞内产生。

在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化宿主细胞，其中将(S)-底物差向异构为(R)-产物可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，产生的生物碱为(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在再其它实施例中，产生的生物碱衍生自(R)-1-苄基异喹啉生物碱，包括例如4-环原吗啡喃和5-环吗啡喃生物碱。在另一实施例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱为工程化宿主细胞的产物的中间体。在再其它实施例中，生物碱产物选自下组：1-苄基异喹啉、吗啡喃、原吗啡喃、去甲阿片、纳阿片或双苄基异喹啉生物碱。

在一些实例中，(S)-底物为选自下组的(S)-1-苄基异喹啉生物碱：(S)-去甲牛心果碱、(S)-牛心果碱、(S)-四氢罂粟碱、(S)-去甲乌药碱、(S)-乌药碱、(S)-N-甲基乌药碱、(S)-3'-羟基-N-甲基乌药碱、(S)-去甲异东罂粟灵、(S)-东罂粟灵、(S)-异东罂粟灵、(S)-去甲原青藤碱、(S)-原青藤碱、(S)-去甲劳丹碱、(S)-劳丹碱、(S)-4'-O-甲基劳丹碱、(S)-6-O-甲基去甲劳丹碱、(S)-4'-O-甲基去甲劳丹碱。

在一些实例中，(S)-底物为式I化合物：

或其盐，其中：

R¹、R²、R³和R⁴独立地选自氢和甲基；并且

R⁵选自氢、羟基和甲氧基。

在一些其它实例中，R¹、R²、R³、R⁴和R⁵中的至少一者为氢。

在再其它实例中，(S)-底物为式II化合物：

或其盐，其中：

R³选自氢和C₁-C₄烷基；

R⁶和R⁷在每次出现时独立地选自羟基、氟、氯、溴、甲醛、C₁-C₄酰基、C₁-C₄烷基和C₁-C₄烷氧基；

n为0、1、2、3或4；并且

n'为0、1、2、3、4或5。

当键穿过环绘制时，这意味着取代可在非特定环原子或位置处发生。举例来说，在以上展示的式II中，6元环中的任何-CH-的氢可被R⁷置换以形成-CR⁷-。

在一些实例中，R⁶和R⁷独立地为甲基或甲氧基。在一些其它实例中，n和n'独立地为1或2。在再其它实施例中，R³为氢或甲基。

在一些实例中，所述方法提供从(S)-牛心果碱产生生物碱产物的工程化宿主细胞。将(S)-牛心果碱差向异构为(R)-牛心果碱可构成从前体产生多种生物碱产物中的关键步骤。在一些实例中，前体为L-酪氨酸或糖(例如葡萄糖)。多种生物碱产物可包括但不限于1-苄基异喹啉、吗啡喃、原吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱。

任何合适的碳源可用作差向异构化1-苄基异喹啉生物碱的前体。合适的前体可包括但不限于单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉籽糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合。在一些实例中，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽、生物质水解物)。在再其它实施例中，碳前体可为一碳化合物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如乙醇)。在又其它实施例中，可利用其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸(例如L-酪氨酸)。在一些实例中，1-苄基异喹啉生物碱可直接添加到本发明的工程化宿主细胞中，包括例如去甲劳丹碱、劳丹碱、去甲牛心果碱和牛心果碱。在再其它实施例中，1-苄基异喹啉生物碱可以单一对映异构体(例如(S)-1-苄基异喹啉生物碱)或对映异构体的混合物，包括例如外消旋混合物的形式添加到工程化宿主细胞中。

在一些实例中，所述方法使用工程化差向异构酶提供1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物的立体中心的差向异构。在另一实施例中，所述方法包括使1-苄基异喹啉生物碱与工程化差向异构酶接触。工程化差向异构酶可将1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物的立体中心的立体化学反转为相反立体化学。在一些实例中，工程化差向异构酶将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在此利用工程化差向异构酶将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一些实例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱选自下组：(S)-去甲牛心果碱、(S)-牛心果碱、(S)-四氢罂粟碱、(S)-去甲乌药碱、(S)-乌药碱、(S)-N-甲基乌药碱、(S)-3'-羟基-N-甲基乌药碱、(S)-去甲异东罂粟灵、(S)-东罂粟灵、(S)-异东罂粟灵、(S)-去甲原青藤碱、(S)-原青藤碱、(S)-去甲劳丹碱、(S)-劳丹碱、(S)-4'-O-甲基劳丹碱、(S)-6-O-甲基去甲劳丹碱和(S)-4'-O-甲基去甲劳丹碱。

在再其它实施例中，使用工程化差向异构酶差向异构化的1-苄基异喹啉生物碱可包含两个或更多个立体中心，其中两个或更多个立体中心中的仅一者被反转以产生底物的非对映异构体(例如(S,R)-1-苄基异喹啉生物碱转化为(R,R)-1-苄基异喹啉生物碱)。在与至少一种酶接触时1-苄基异喹啉生物碱的仅一个立体中心被反转的一些实例中，产物称为1-苄基异喹啉生物碱的差向异构体。

在一些实例中，1-苄基异喹啉生物碱以单一立体异构体形式呈现给酶。在一些其它实例中，1-苄基异喹啉生物碱以立体异构体的混合物形式呈现给酶。在再其它实施例中，立体异构体的混合物可为外消旋混合物。在一些其它实例中，立体异构体的混合物可为一种立体异构体相比于另一立体异构体富集的。

在一些实例中，回收1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收1-苄基异喹啉生物碱。在再其它实施例中，与呈现给酶的1-苄基异喹啉生物碱的原始混合物相比，回收的1-苄基异喹啉生物碱为一种立体异构体对映异构富集的。在再其它实施例中，回收的1-苄基异喹啉生物碱的对映体过量为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％。

在一些实例中，回收原吗啡喃或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收原吗啡喃。在再其它实施例中，回收的原吗啡喃的对映体过量为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％。

在一些实例中，回收吗啡喃或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收吗啡喃。在再其它实施例中，回收的吗啡喃的对映体过量为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％。

在一些实例中，回收双苄基异喹啉或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收双苄基异喹啉。在再其它实施例中，与呈现给酶的双苄基异喹啉的原始混合物相比，回收的双苄基异喹啉为一种立体异构体对映异构富集的。在再其它实施例中，回收的双苄基异喹啉的对映体过量为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％。

在一些实例中，回收纳阿片或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收纳阿片。在再其它实施例中，回收的纳阿片的对映体过量为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％。

在一些实例中，回收去甲阿片或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收去甲阿片。在再其它实施例中，回收的去甲阿片的对映体过量为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％。

“异构体”是具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是只有原子在空间中的排列方式不同的异构体。“对映异构体”是一对立体异构体，互为不可重叠的镜像。一对对映异构体的1:1混合物是“外消旋”混合物。“非对映异构体(diastereoisomer/diastereomer)”是具有至少两个不对称原子但不互为镜像的立体异构体。如本文所用，术语“差向异构体”是指具有相同化学式但特定位置处的光学构型不同的化合物。举例来说，化合物的(R,S)和(S,S)立体异构体彼此为差向异构体。在一些实例中，将1-苄基异喹啉生物碱转化为其差向异构体(例如表-1-苄基异喹啉生物碱)。绝对立体化学根据卡恩-英格尔-普雷洛格(Cahn-Ingold-Prelog)R-S系统指定。当化合物为纯对映异构体时，每个手性碳处的立体化学可由R或S指定。绝对构型未知的解析化合物可取决于其旋转钠D线的波长的平面偏振光的方向(右旋或左旋)而指定为(+)或(-)。本文所描述的某些化合物含有一个或多个不对称中心，并且可由此产生对映异构体、非对映异构体和可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的其它立体异构形式。

表1.DRS-DRR酶、分裂DRS和DRR酶的示例氨基酸序列以及其它核苷酸序列

产生吗啡喃生物碱的修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述原吗啡喃生物碱向吗啡喃生物碱的转化。所述方法、工艺和系统中的一些描述四环支架向五环支架的转化(图4)。所述方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，描述从四环前体或原吗啡喃生物碱产生五环蒂巴因或吗啡喃生物碱。在一些实例中，将原吗啡喃生物碱转化为蒂巴因是将底物转化为广泛范围的苄基异喹啉生物碱中的关键步骤。

在一些实例中，四环前体可为沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇或沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。四环前体可通过C-4与C-5之间的氧化物桥的闭合而转化为五环蒂巴因。在一些实例中，四环前体沙罗泰里啶可通过C-7处逐步羟基化和O-乙酰化制备用于闭环。可通过消除乙酸酯离去基团来激活闭环。在一些实例中，自发发生产生蒂巴因的烯丙基消除和氧化物环闭合。在其它实例中，通过如pH或溶剂等因素来促进产生五环蒂巴因的闭环反应。在其它实例中，通过与蛋白质或酶接触来促进产生蒂巴因的闭环反应。这些转化步骤如图4中所提供且如方案2中大体表示。R₁、R₂和R₃可为H或CH₃。R₄可为CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂或其它适当烷基。在一些情况下，R₁、R₂、R₃和R₄可为如图4中所提供的CH₃。

方案2

在一些实例中，制备四环前体的第一酶为沙罗泰里啶还原酶(SalR)。在一些情况下，SalR在C-7位置处羟化底物沙罗泰里啶(参见式III)。此反应的产物可为一种或多种沙罗泰里啶醇差向异构体。在一些实例中，产物为(7S)-沙罗泰里啶醇。在一些实例中，沙罗泰里啶还原酶可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的还原反应，如本文所描述。

在一些实例中，制备四环前体的第二酶为沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶(SalAT)。在一些情况下，SalAT将乙酰基从乙酰辅酶A转移到沙罗泰里啶醇的7-OH(参见式IV)。在其它情况下，SalAT可利用新颖辅因子，如正丙酰辅酶A并且将丙酰基转移到沙罗泰里啶醇的7-OH。在一些实例中，SalAT的产物为(7S)-沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。在一些实例中，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的乙酰基转移反应，如本文所描述。

在一些实例中，蒂巴因的四环前体为(7S)-沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。在一些实例中，(7S)-沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯不稳定，并且自发地消除C-7处的乙酸酯并且闭合C-4与C-5之间的氧化物桥以形成蒂巴因(参见式V)。在一些实例中，乙酸酯离去基团的消除速率由pH促进。在一些实例中，烯丙基消除和氧化物桥闭合由具有蒂巴因合酶活性的酶或蒂巴因合酶催化。在一些实例中，此酶为Bet v 1折叠蛋白。在一些实例中，此酶为工程化蒂巴因合酶、工程化SalAT、指导(dirigent，DIR)蛋白或查耳酮异构酶(CHI)。在一些实例中，编码蒂巴因合酶活性的酶可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的闭环反应，如本文所描述。

在一些实例中，沙罗泰里啶还原酶可为SalR或SalR样酶，其来自生物合成蒂巴因的毛茛目(Ranunculales)植物，例如罂粟(Papaver somniferum)。在其它实例中，具有沙罗泰里啶还原酶活性的酶可来自哺乳动物或生物合成内源性吗啡的任何其它脊椎动物或无脊椎动物。

在一些实例中，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶可为SalAT或SalAT样酶，其来自生物合成蒂巴因的毛茛目植物，例如罂粟(P.somniferum)。在其它实例中，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶活性的酶可来自哺乳动物或生物合成内源性吗啡的任何其它脊椎动物或无脊椎动物。

在一些实例中，蒂巴因合酶(TS)可为Bet v 1折叠蛋白，其来自生物合成蒂巴因的毛茛目植物，例如罂粟。在一些实例中，Bet v 1蛋白以N末端至C末端的顺序包括以下结构域：β链、一个或两个α螺旋、六个β链和一个或两个α螺旋。蛋白质被组织成使得其具有Bet v1折叠和接受大型、大体积、疏水性分子，如吗啡喃生物碱的活性位点。此蛋白可为任何植物Bet v 1蛋白、病程相关10蛋白(PR-10)、主要乳胶蛋白(MLP)、水果或花粉过敏原、植物激素结合蛋白(例如与细胞分裂素或油菜素类固醇结合)、植物聚酮环化酶样蛋白或具有Bet v1折叠的去甲乌药碱合酶(NCS)相关蛋白。Bet v 1折叠蛋白的其它非植物实例为聚酮环化酶、Hsp90 ATP酶激活因子同源物1(AHA1)蛋白、SMU440样蛋白(例如来自变形链球菌(Streptococcus mutans))、PA1206相关蛋白(例如来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、CalC卡奇霉素抗性蛋白(例如来自棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora))和来自一氧化碳代谢食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)的CoxG蛋白。来自Bet v 1相关家族的其它实例包括START脂质转移蛋白、磷脂酰肌醇转移蛋白和环羟化酶。

在一些实例中，蒂巴因合酶可为指导蛋白，其来自生物合成蒂巴因的毛茛目植物，例如罂粟。在其它实例中，酶可为来自植物的任何指导蛋白。

在一些实例中，蒂巴因合酶可为查耳酮异构酶蛋白，其来自生物合成蒂巴因的毛茛目植物，例如罂粟。在其它实例中，酶可为来自植物的任何查耳酮异构酶蛋白。

在一些实例中，蒂巴因合酶可为SalAT样酶，其来自生物合成蒂巴因的毛茛目植物，例如罂粟。在其它实例中，酶可为来自植物的任何SalAT样蛋白。

在一些实例中，具有蒂巴因合酶活性的酶可来自哺乳动物或生物合成内源性吗啡的任何其它脊椎动物或无脊椎动物。

在一些实例中，以上酶与其它辅助蛋白的组合可用以将各种四环前体转化为蒂巴因。在一些实例中，这些酶催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的反应，如本文所描述。

蒂巴因合酶活性的氨基酸序列的实例阐述于表2中。用于蒂巴因的四环前体的蒂巴因合酶的氨基酸序列可与表2中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类蒂巴因合酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

可提供工程化宿主细胞，所述细胞产生沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶和蒂巴因合酶，其将四环前体转化为蒂巴因，其中蒂巴因合酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36和37。在一些情况下，蒂巴因合酶可与其它酶形成融合蛋白。工程化宿主细胞内产生的酶可经回收和纯化以便形成生物催化剂。所述一种或多种酶还可用于催化四环原吗啡喃前体向蒂巴因的转化。

在其它实例中，蒂巴因合酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60和61。

在其它情况下，从工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可用于将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因的工艺。所述工艺可包括使四环原吗啡喃前体与足以将所述四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因的量的回收的酶接触。在一些实例中，可使四环原吗啡喃前体与足量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因。在其它实例中，可使四环原吗啡喃前体与足量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因。

在一些实例中，实施工艺条件以支持工程化宿主细胞中蒂巴因的形成。在一些情况下，工程化宿主细胞在pH 3.3下生长，并且一旦达到高细胞密度，则将pH调节到pH 8.0以支持在较高pH下继续产生蒂巴因。在一些情况下，工程化宿主细胞产生其它酶以将糖和其它简单前体，如酪氨酸转化为蒂巴因。在一些情况下，SalAT酶已经工程化以在pH 8.0下展现较高活性并且由晚期启动子表达。

在一些实例中，将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因的一种或多种酶定位于细胞区室。在一些实例中，SalR、SalAT和蒂巴因合酶(TS)可经修饰，使得其编码将其定位于工程化宿主细胞的内质网膜的靶向序列。特定来说，在某些情况下，宿主细胞可经工程化以通过将TS和/或SalR和/或SalAT定位于酵母细胞中的细胞器，使从牛心果碱或其前体产生沙罗泰里啶醇或蒂巴因或蒂巴因作为前体的产物的产量增加。TS和/或SalR和/或SalAT可定位于酵母内质网，以便缩短TS和/或SalR和/或SalAT与CYP2D2或CYP2D6或SalSyn或催化牛心果碱向沙罗泰里啶的转化的工程化细胞色素P450酶的空间距离。增加的产量意指在对照不具有所关注的化合物产量时产生一定量的所关注的化合物，以及在对照具有一定的所关注的化合物产量的情况下，增加10％或更多，如50％或更多，包括2倍或更多，例如5倍或更多，如10倍或更多。

在其它实例中，SalAT和TS可共定位于单一蛋白质融合体。在一些实例中，融合体通过若干方法之一在SalAT与TS之间产生，所述方法包括直接融合、共定位于酵母细胞器或通过酶共定位工具，如亮氨酸拉链、利用接头结构域的蛋白质支架或利用适体的RNA支架。共定位蒂巴因合成酶可促进酶的活性位点之间的底物通道，并且限制不稳定中间体，如沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯的扩散。

在一些实例中，工程化沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶(SalAT)酶用于将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因。在一些实例中，SalAT酶经工程化以组合两种功能：(1)将酰基从乙酰辅酶A转移到沙罗泰里啶醇的7-OH，和(2)随后消除乙酰基并且闭合碳C4与C5之间的氧化物桥以形成蒂巴因。

在一些实例中，具有沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶活性的酶与具有Bet v 1折叠的肽融合。在一些实例中，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶与Bet v 1折叠蛋白可以N末端至C末端、C末端至N末端、N末端至N末端或C末端至C末端的任何顺序融合。在一些实例中，两个蛋白质序列可直接融合或通过肽接头区融合。

在一些实例中，具有沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶活性的酶与具有Bet v 1折叠的肽通过环状变换融合。在一些情况下，将SalAT的N末端和C末端融合，并且随后将Bet v1序列随机插入此序列内。在一些情况下，针对蒂巴因产生筛选所得融合蛋白文库。在其它情况下，首先针对在不存在Bet v 1情况下的活性筛选环状变换SalAT文库。在其它情况下，将SalAT的N末端和C末端融合，并且将酶消化且克隆平端。在其它情况下，针对沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶活性筛选此环状变换SalAT的文库。在其它情况下，来自环状变换SalAT文库的活性变异体随后用于设计与具有Bet v 1折叠的肽的蛋白质融合体。

可用于将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因的一种或多种酶可在体外接触四环原吗啡喃前体。另外或可替代地，可用于将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因的一种或多种酶可在体内接触四环原吗啡喃前体。另外，可用于将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因的一种或多种酶可提供给在内部具有四环原吗啡喃前体的细胞，或可在工程化宿主细胞内产生。

在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化宿主细胞，其中将四环原吗啡喃前体转化为蒂巴因可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，生物碱产物为蒂巴因。在再其它实施例中，生物碱产物衍生自蒂巴因，包括例如下游吗啡喃生物碱。在另一实施例中，四环原吗啡喃前体为工程化宿主细胞的产物的中间体。在再其它实施例中，生物碱产物选自下组：吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱。

在一些实例中，还原反应的底物为式III化合物：

或其盐，其中：

R₁、R₂和R₃独立地选自氢和甲基。

在一些其它实例中，R₁、R₂和R₃为甲基，并且还原反应由沙罗泰里啶还原酶催化。

在一些实例中，碳链转移反应的底物为式IV化合物：

或其盐，其中：

R₁、R₂和R₃独立地选自氢和甲基。

在一些其它实例中，R₁、R₂和R₃为甲基，并且碳链转移反应由沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶催化。

在一些实例中，蒂巴因合酶的底物为式V化合物：

或其盐，其中：

R¹、R²和R³独立地选自氢和甲基；并且

R₄选自甲基、乙基、丙基和其它适当烷基。

在一些其它实例中，R₁、R₂、R₃和R₄为甲基，并且闭环反应由蒂巴因合酶催化。在一些实例中，蒂巴因合酶为Bet v 1蛋白。

在一些实例中，所述方法提供从沙罗泰里啶产生生物碱产物的工程化宿主细胞。将沙罗泰里啶转化为蒂巴因可构成从前体产生多种生物碱产物中的关键步骤。在一些实例中，前体为L-酪氨酸或糖(例如葡萄糖)。多种生物碱产物可包括但不限于吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱。

任何合适的碳源可用作五环吗啡喃生物碱的前体。合适的前体可包括但不限于单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉籽糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合。在一些实例中，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽、生物质水解物)。在再其它实施例中，碳前体可为一碳化合物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如乙醇)。在又其它实施例中，可利用其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸(例如L-酪氨酸)。在一些实例中，1-苄基异喹啉生物碱可直接添加到本发明的工程化宿主细胞中，包括例如去甲劳丹碱、劳丹碱、去甲牛心果碱和牛心果碱。

在一些实例中，回收苄基异喹啉生物碱产物或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收苄基异喹啉生物碱产物。在一些实例中，苄基异喹啉生物碱产物为吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱。

表2.产生吗啡喃生物碱的酶的示例氨基酸序列。

吗啡喃生物碱异构化修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述吗啡喃生物碱异构体的产生。所述方法、工艺和系统中的一些描述将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱(图4)。所述方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱是将前体转化为广泛范围的苄基异喹啉生物碱中的重要步骤。

在一些实例中，在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱的产生发生在工程化宿主细胞内，所述细胞包含多种用于将简单起始物质转化为前体吗啡喃生物碱的异源酶。在一些实例中，简单起始物质为糖和/或L-酪氨酸。

在一些实例中，异构体前体吗啡喃生物碱可为尼奥品酮、尼奥品、尼奥吗啡或尼奥吗啡酮。前体吗啡喃生物碱可通过碳C-14与C-8和碳C-8与C-7之间的碳-碳双键的重排转化为所需异构体。在一些情况下，通过异构化形成的产物的实例可为可待因酮、可待因、吗啡或吗啡酮。在一些实例中，产生所需异构体的重排自发发生。在其它实例中，通过如pH和溶剂等因素促进产生所需异构体的重排。在其它实例中，通过与蛋白质或酶接触使碳-碳双键转位。异构化转化步骤提供于图4中且如方案3中大体表示。R₁、R₂、R₃和R₄可为O、OH、H、CH₃或其它适当烷基。

方案3

在一些实例中，产生异构体前体吗啡喃生物碱的第一酶为蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)。在一些情况下，T6ODM使底物蒂巴因在C-6位置处O-去甲基化。在一些实例中，此反应的产物为尼奥品酮。在一些实例中，T6ODM可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的O-去甲基化反应，如本文所描述。

在一些实例中，异构体前体吗啡喃生物碱为尼奥品酮。在一些实例中，尼奥品酮经历异构化成为可待因酮。在一些实例中，尼奥品酮至可待因酮的分配可在水溶液中达到平衡，使得尼奥品酮和可待因酮以稳态浓度存在。在一些实例中，尼奥品酮向可待因酮的转化速率由pH促进。在一些实例中，尼奥品酮向可待因酮的重排由具有尼奥品酮异构酶活性的酶催化。在一些实例中，此酶为Bet v 1折叠蛋白。在一些实例中，此酶为尼奥品酮异构酶(NPI)。在一些实例中，此酶为N末端序列截短的工程化蛋白质。在一些实例中，NPI可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的异构化反应，如本文所描述。

在一些实例中，作用于可待因酮的酶为可待因酮还原酶(COR)。在一些情况下，COR使可待因酮的位置C-6处的酮还原以形成羟基。在一些实例中，此反应的产物为可待因。在一些实例中，COR选自多种基因复制和选择性剪接同工型，以在与编码尼奥品酮异构酶活性的蛋白质配对时展现最高活性。在一些实例中，COR可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的还原反应，如本文所描述。

在一些实例中，作用于可待因酮的酶为吗啡酮还原酶(morB)。在一些情况下，morB使可待因酮的C-7与C-8之间的碳-碳双键饱和。在一些实例中，此反应的产物为氢可酮。在一些实例中，morB可催化宿主细胞，如工程化宿主细胞内的还原反应，如本文所描述。

在一些实例中，蒂巴因6-O-脱甲基酶可为T6ODM或T6ODM样酶，其来自生物合成吗啡的毛茛目植物，例如罂粟。在一些实例中，T6ODM可为T6ODM样酶，其来自生物合成苄基异喹啉生物碱的植物，例如大红罂粟、虞美人、野罂粟(P.nudicaule)和鬼罂粟(P.orientale)。在一些实例中，植物酶为2-酮戊二酸/Fe(II)依赖性双加氧酶，其使用2-酮戊二酸和氧并且在使蒂巴因去甲基化以产生尼奥品酮时产生琥珀酸和二氧化碳。在一些实例中，T6ODM还可使东罂粟碱去甲基化以产生尼奥吗啡酮。

在其它实例中，具有蒂巴因6-O-脱甲基酶活性的酶可来自哺乳动物或生物合成内源性吗啡喃生物碱的另一脊椎动物或无脊椎动物。

在一些实例中，尼奥品酮异构酶(NPI)可为Bet v 1折叠蛋白，其来自生物合成吗啡的毛茛目植物，例如罂粟。在一些实例中，NPI可为NPI样酶，其来自生物合成苄基异喹啉生物碱的植物，例如大红罂粟、虞美人、野罂粟和鬼罂粟。在一些实例中，Bet v 1蛋白以N末端至C末端的顺序包括以下结构域：β链、一个或两个α螺旋、六个β链和一个或两个α螺旋。在一些实例中，在酶的N末端处进行截短以去除第一结构域的全部或部分。在一些实例中，酶可具有如本文所论述并且如实例6和7中所描述的一种或多种提高活性的组分。在一些实例中，蛋白质被组织成使得其具有Bet v 1折叠和接受大型、大体积、疏水性分子，如吗啡喃生物碱的活性位点。在一些实例中，蛋白质可为任何植物Bet v 1蛋白、病程相关10蛋白(PR-10)、主要乳胶蛋白(MLP)、水果或花粉过敏原、植物激素结合蛋白(例如与细胞分裂素或油菜素类固醇结合)、植物聚酮环化酶样蛋白或具有Bet v 1折叠的去甲乌药碱合酶(NCS)相关蛋白。在一些实例中，Bet v 1折叠蛋白的功能为催化也可自发发生的反应。

在其它实例中，具有尼奥品酮异构酶活性的酶可来自哺乳动物或生物合成内源性吗啡喃生物碱的另一脊椎动物或无脊椎动物。

在一些实例中，可待因酮还原酶可为COR或COR样酶，其来自生物合成吗啡的毛茛目植物，例如罂粟。在一些实例中，COR可为COR样酶，其来自生物合成苄基异喹啉生物碱的植物，例如大红罂粟、虞美人、野罂粟和鬼罂粟。在一些实例中，植物酶为在可待因酮向可待因的可逆还原中使用NADPH作为辅因子的氧化还原酶。在一些实例中，COR酶为特定基因复制或剪接变异体，其经选择以具有所选动力学参数，例如对一个或多个反应的更高活性速率(K_cat)、对一种或多种底物的提高的结合亲和力(K_M)、相比于尼奥品酮对底物可待因酮增强的特异性或增强的热稳定性。在一些实例中，COR酶可用以还原其它吗啡喃生物碱底物，例如尼奥品酮、吗啡酮、尼奥吗啡酮、氢可酮、氢吗啡酮、羟考酮、羟吗啡酮、14-羟基可待因酮或14-羟基吗啡酮。在一些实例中，COR活性的产物为尼奥品、吗啡、尼奥吗啡、二氢可待因、二氢吗啡、羟考醇、羟吗啡醇、14-羟基可待因或14-羟基吗啡。

在一些实例中，吗啡酮还原酶可为morB或来自假单胞菌属细菌的morB样酶。在一些实例中，吗啡酮还原酶可为来自革兰氏阴性细菌的烯烃还原酶。在一些实例中，细菌酶为使用NADH和FMN作为辅因子以使可待因酮的C-7与C-8之间的碳-碳双键饱和的a/β筒黄素蛋白。在一些实例中，morB酶具有所选动力学参数，例如对一个或多个反应的更高活性速率(K_cat)、对一种或多种底物的提高的底物结合亲和力(K_M)、对一种底物增强的特异性或增强的热稳定性。morB酶还可还原其它吗啡喃底物，例如吗啡酮、尼奥吗啡酮、可待因、吗啡、尼奥品、尼奥吗啡、14-羟基可待因酮或14-羟基吗啡酮。morB活性的产物的实例为氢吗啡酮、二氢可待因、二氢吗啡、羟考酮或羟吗啡酮。

在其它实例中，以上酶与其它辅助蛋白的组合可在所选吗啡喃生物碱异构体的产生中起作用。在一些实例中，这些酶催化本文所描述的宿主细胞，如工程化宿主细胞内的反应。

尼奥品酮异构酶活性的氨基酸序列的实例阐述于表3中。用于将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的尼奥品酮异构酶的氨基酸序列可与表3中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类尼奥品酮异构酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

可提供工程化宿主细胞，所述细胞产生蒂巴因6-O-脱甲基酶、尼奥品酮异构酶和可待因酮还原酶，其通过碳C-14与C-8和碳C-8与C-7之间的碳-碳双键的重排将前体吗啡喃生物碱异构体转化为所需产物吗啡喃生物碱异构体，其中尼奥品酮异构酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:82、83、84、85和86。在一些情况下，尼奥品酮异构酶可与一种或多种途径酶物理相互作用。在一些情况下，物理相互作用可改变一种或多种途径酶的活性。在一些情况下，尼奥品酮异构酶可与一种或多种其它酶形成融合蛋白。工程化宿主细胞内产生的酶可经回收和纯化以便形成生物催化剂。所述一种或多种酶也可用于催化在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱向在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的转化。

在其它实例中，尼奥品酮异构酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85和86。

可待因酮还原酶活性的氨基酸序列的实例阐述于表4中。用于将吗啡喃生物碱的C-6位置处的酮还原为所述位置处的羟基的可待因酮还原酶的氨基酸序列可与表4中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类可待因酮还原酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

可提供工程化宿主细胞，所述细胞产生蒂巴因6-O-脱甲基酶、尼奥品酮异构酶和可待因酮还原酶，其通过碳C-14与C-8和碳C-8与C-7之间的碳-碳双键的重排和C-6位置处酮向羟基的还原将前体吗啡喃生物碱异构体转化为所需产物吗啡喃生物碱异构体，其中可待因酮还原酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95和96。在一些情况下，可待因酮还原酶可与其它酶相互作用或与其它酶形成融合蛋白。工程化宿主细胞内产生的酶可经回收和纯化以便形成生物催化剂。所述一种或多种酶也可用于催化在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱向在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的转化。

在其它情况下，从工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可用于将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的工艺。所述工艺可包括使前体吗啡喃生物碱异构体与足以将所述前体吗啡喃生物碱异构体转化为所需吗啡喃生物碱异构体产物的量的回收的酶接触。在一些实例中，可使前体吗啡喃生物碱异构体与足量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述前体吗啡喃生物碱异构体转化为所需产物吗啡喃生物碱异构体。在其它实例中，可使前体吗啡喃生物碱异构体与足量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述前体吗啡喃生物碱异构体转化为所需产物吗啡喃生物碱异构体。

在一些实例中，实施工艺条件以支持工程化宿主细胞中所需产物吗啡喃生物碱异构体的形成。在一些情况下，工程化宿主细胞在pH 3.3下生长，并且一旦达到高细胞密度，则将pH调节到pH 6-6.5以支持在较高pH下继续产生所需产物吗啡喃生物碱异构体。在一些情况下，工程化宿主细胞产生其它酶以将糖和其它简单起始物质，如酪氨酸转化为所需产物吗啡喃生物碱异构体。

在一些实例中，将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的酶中的一者或多者可定位于细胞区室。在一些实例中，T6ODM、COR或morB和NPI可经修饰，使得其编码将其定位于工程化宿主细胞的内质网膜的靶向序列。特定来说，在某些情况下，宿主细胞可经工程化以通过将NPI和/或T6ODM和/或COR和/或morB定位于酵母细胞中的细胞器，增加产物吗啡喃生物碱异构体或其前体的产量。NPI和/或T6ODM和/或COR和/或morB可定位于酵母内质网以便缩短这些酶之间的空间距离。增加的产量意指在对照不具有所关注的化合物产量时产生一定量的所关注的化合物，以及在对照具有一定的所关注的化合物产量的情况下，增加10％或更多，如50％或更多，包括2倍或更多，例如5倍或更多，如10倍或更多。

在其它实例中，T6ODM和NPI可共定位于单一蛋白质融合体。在其它实例中，COR或morB和NPI可共定位于单一蛋白质融合体。在一些实例中，融合体在蛋白质之间，通过若干方法之一产生，包括直接融合、共定位于酵母细胞器或通过酶共定位工具，如亮氨酸拉链、利用接头结构域的蛋白质支架或利用适体的RNA支架。共定位尼奥品酮异构酶可促进酶的活性位点之间的底物通道，并且限制不稳定中间体，如尼奥品酮和可待因酮的扩散。

在一些实例中，工程化T6ODM酶用于吗啡喃生物碱异构体之间的转化。在一些实例中，T6ODM酶经工程化以组合两种功能：(1)蒂巴因C-6位置处的O-去甲基化，和(2)碳C-14与C-8和碳C-8与C-7之间的碳-碳双键的重排。

在一些实例中，具有蒂巴因6-O-脱甲基酶活性的酶与具有Bet v 1折叠的肽融合。在一些实例中，蒂巴因6-O-脱甲基酶与Bet v 1折叠蛋白可以N末端至C末端、C末端至N末端、N末端至N末端或C末端至C末端的任何顺序融合。在一些实例中，两个蛋白质序列可直接融合或通过肽接头区融合。

在一些实例中，具有蒂巴因6-O-脱甲基酶活性的酶与具有Bet v 1折叠的肽通过环状变换融合。在一些情况下，T6ODM的N末端和C末端融合，并且随后将Bet v 1序列随机插入此序列内。在一些情况下，针对所需吗啡喃生物碱异构体产物的产生筛选所得融合蛋白文库。在其它情况下，首先针对在不存在Bet v 1情况下的活性筛选环状变换T6ODM文库。在其它情况下，将T6ODM的N末端和C末端融合，并且将酶消化且克隆平端。在其它情况下，针对蒂巴因6-O-脱甲基酶活性筛选此环状变换T6ODM的文库。在其它情况下，来自环状变换T6ODM文库的活性变异体随后用于设计与具有Bet v 1折叠的肽的蛋白质融合体。

在一些实例中，工程化COR或morB酶用于吗啡喃生物碱异构体之间的转化。在一些实例中，COR或morB酶经工程化以组合两种功能：(1)碳C-14与C-8和碳C-8与C-7之间的碳-碳双键的重排，和(2)吗啡喃生物碱异构体产物的还原。

在一些实例中，具有阿片还原酶活性的酶与具有Bet v 1折叠的肽融合。在一些实例中，COR或morB酶与Bet v 1折叠蛋白可以N末端至C末端、C末端至N末端、N末端至N末端或C末端至C末端的任何顺序融合。在一些实例中，两个蛋白质序列可直接融合或通过肽接头区融合。

在一些实例中，具有阿片还原酶活性的酶与具有Bet v 1折叠的肽通过环状变换融合。在一些情况下，COR或morB的N末端和C末端融合，并且随后将Bet v 1序列随机插入此序列内。在一些情况下，针对所需吗啡喃生物碱异构体产物的产生筛选所得融合蛋白文库。在其它情况下，首先针对在不存在Bet v 1情况下的活性筛选环状变换COR或morB文库。在其它情况下，将COR或morB的N末端和C末端融合，并且将酶消化且克隆平端。在其它情况下，针对阿片还原酶活性筛选此环状变换COR或morB的文库。在其它情况下，来自环状变换COR或morB文库的活性变异体随后用于设计与具有Bet v 1折叠的肽的蛋白质融合体。

可用于将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的一种或多种酶可在体外接触前体吗啡喃生物碱异构体。另外或替代地，可用于将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的一种或多种酶可在体内接触前体吗啡喃生物碱异构体。另外，可用于将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱的一种或多种酶可提供给在内部具有前体吗啡喃生物碱异构体的细胞，或可在工程化宿主细胞内产生。

在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化宿主细胞，其中将在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱转化为在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的产物吗啡喃生物碱可构成生物碱产物产生中的重要步骤。在一些实例中，生物碱产物为可待因酮。在再其它实施例中，生物碱产物衍生自可待因酮，包括例如下游吗啡喃生物碱。在另一实施例中，在碳C-14与C-8之间具有碳-碳双键的前体吗啡喃生物碱为工程化宿主细胞的产物的中间体。在再其它实施例中，生物碱产物选自下组：吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱。

在一些实例中，O-去甲基化反应的底物为式VI化合物：

或其盐，其中：

R₁和R₂独立地选自氢和甲基。

在一些其它实例中，R₁和R₂为甲基，并且O-去甲基化反应由蒂巴因6-O-脱甲基酶催化。6-O-去甲基化反应的其它实例提供于图11中。

在一些实例中，异构化反应的底物为式VII化合物：

或其盐，其中：

R₁和R₃独立地选自氢和甲基，并且R₂独立地选自羟基和氧。

在一些其它实例中，R₁和R₃为甲基且R₂为氧，并且异构化反应由尼奥品酮异构酶催化。异构化反应的其它实例提供于图17中。

在一些实例中，还原反应的底物为式VIII化合物：

或其盐，其中：

R₁和R₃独立地选自氢和甲基；并且R₂独立地选自羟基和氧。

在一些其它实例中，R₁和R₃为甲基且R₂为氧，并且还原反应由可待因酮还原酶催化。在一些其它实例中，还原反应由吗啡酮还原酶催化。还原反应的其它实例提供于图15和16中。

在一些实例中，所述方法提供从尼奥品酮产生吗啡喃生物碱产物的工程化宿主细胞。将尼奥品酮转化为可待因酮可构成从简单起始物质产生多种吗啡喃生物碱产物中的重要步骤。在一些实例中，简单起始物质为L-酪氨酸或糖(例如葡萄糖)。多种生物碱产物可包括但不限于吗啡喃、去甲阿片或纳阿片生物碱。

在一些实例中，工程化宿主细胞通过补料分批发酵工艺生长，其中简单起始物质随时间进料并且在工程化宿主细胞中随时间推移连续转化为前体吗啡喃生物碱，从而提供前体吗啡喃生物碱的恒定来源。在一些实例中，前体吗啡喃生物碱的连续来源随时间推移连续异构化为产物吗啡喃生物碱异构体，且随后通过工程化宿主细胞中一种或多种作用于吗啡喃生物碱异构体的酶转化为下游生物碱产物，从而提供产物异构体向下游生物碱产物的恒定拉动。在一些实例中，动态系统工艺(例如前体吗啡喃生物碱的连续供应和产物吗啡喃生物碱异构体向下游生物碱产物的连续转化)是通过增强的可逆异构化反应实现所需生物碱产物产量增加的有益组分。

在一些情况下，尼奥品酮异构酶与展现特定动力学特性的COR变异体的配对是实现工程化宿主细胞中所需生物碱产物产量增加的有益组分。在一些情况下，尼奥品酮异构酶与展现特定动力学特性的morB变异体的配对是实现工程化宿主细胞中所需生物碱产物产量增加的有益组分。

任何合适的碳源可用作吗啡喃生物碱的起始物质。合适的前体可包括但不限于简单起始物质，如单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉籽糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合。在一些实例中，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽、生物质水解物)。在再其它实施例中，碳前体可为一碳化合物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如乙醇)。在又其它实施例中，可利用其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸(例如L-酪氨酸)。

表3.吗啡喃生物碱异构化酶的示例氨基酸序列。

表4.吗啡喃生物碱还原酶的示例氨基酸序列。

产生BisBIA的修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述与利用对应融合酶产生双苄基异喹啉生物碱(bisBIA)相比时，通过利用衍生自亲本差向异构酶的两种独立差向异构酶增加bisBIA的产生。在一些实例中，对应融合酶包含具有与两种独立差向异构酶对应的氧化酶和还原酶区的融合差向异构酶。在一些实例中，两种独立差向异构酶可包含氧化酶和还原酶。BisBIA为可通过两个BIA单体之间的偶联反应形成的二聚分子。在一些实例中，bisBIA可通过碳-氧偶联反应形成。在其它实例中，bisBIA可通过碳-碳偶联反应形成。在一些实例中，bisBIA二聚分子为包含两个相同BIA单体的同二聚体。在一些实例中，工程化宿主细胞可产生一种BIA单体。在这些实例中，BIA单体可在与一种或多种偶联酶接触时形成同二聚体。在其它实例中，bisBIA二聚分子为包含两个不同BIA单体的异二聚体。举例来说，bisBIA可为包含互为对映异构体的BIA单体的异二聚体。在一些实例中，工程化宿主细胞可产生两种或更多种BIA单体。在这些实例中，BIA单体可在与一种或多种偶联酶接触时形成同二聚体和异二聚体。

描述bisBIA的产生的这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，工程化宿主细胞可经工程化以产生BIA单体，所述BIA单体又可用作形成bisBIA的构建块分子。可用于形成bisBIA的BIA单体的实例包括乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、去甲劳丹碱、6-O-甲基-去甲劳丹碱、3′-羟基-N-甲基乌药碱、3′-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁、劳丹素和罂粟碱。特定来说，工程化宿主细胞可通过表达包括O-甲基转移酶、N-甲基转移酶和3′-羟化酶的异源酶，从去甲乌药碱或去甲劳丹碱合成BIA单体。O-甲基转移酶的实例可包括去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)。O-甲基转移酶的其它实例可包括儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)。N-甲基转移酶的其它实例可包括乌药碱N-甲基转移酶(CNMT)。3'羟化酶的实例可包括N-甲基乌药碱3'-羟化酶(CYP80B1)。

工程化宿主细胞可产生各种BIA单体的(S)或(R)对映异构体。另外或可替代地，工程化宿主细胞可产生两种对映异构体的混合物。(S)和(R)对映异构体的比率可通过合成BIA单体的一种或多种酶的底物和产物特异性来确定。可替代地，存在的每种对映异构体的量可通过工程化差向异构酶的两种独立氧化酶和还原酶的表达和接合来修改，所述工程化差向异构酶进行一种立体异构体向另一立体异构体的差向异构。在一些情况下，存在的每种对映异构体的量可通过工程化融合差向异构酶的表达和接合来修改，所述工程化融合差向异构酶进行一种立体异构体向另一立体异构体的差向异构。

这些BIA单体可融合成二聚bisBIA支架。特定来说，BIA单体可利用由工程化宿主细胞产生的一种或多种酶融合成二聚bisBIA支架。另外或可替代地，可利用从工程化宿主细胞外部的来源提供给BIA单体的一种或多种酶，将BIA单体融合成二聚bisBIA支架。一种或多种酶可用于形成碳-氧和/或碳-碳偶联反应，以在一个、两个或三个位置处融合两个BIA单体。在一些实例中，两个BIA单体可通过醚桥连接。在一些实例中，直接碳-碳键可用于连接两个BIA单体。在一些实例中，通过融合两个BIA单体形成的bisBIA可包含一个二苯醚键。在一些实例中，两个BIA单体可融合以形成包含两个二苯醚键的bisBIA。在一些实例中，由两个BIA单体形成的bisBIA可包含三个二苯醚键。在一些实例中，bisBIA可包含一个二苯醚键和一个苄基苯基醚键。在一些情况下，bisBIA可包含一个苄基苯基醚键和两个二苯醚键。

在一些实例中，可使BIA单体与足量的一种或多种酶接触，所述酶可用于形成偶联反应以融合两个BIA单体，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述BIA单体转化为bisBIA。可用于将BIA单体二聚合成bisBIA的一种或多种酶可在体外接触BIA单体。另外或可替代地，可用于将BIA单体二聚合成bisBIA的一种或多种酶可在体内接触BIA单体。另外，一种或多种bisBIA二聚合酶可在产生BIA单体的宿主细胞中表达。可替代地，可将BIA单体提供给表达bisBIA二聚合酶的工程化宿主细胞。可替代地，可将一种或多种bisBIA二聚合酶提供给内部具有BIA单体的细胞。

在一些实例中，双苄基异喹啉生物碱为式Va-Vu中的任一者的化合物：

或其盐，其中：

R^1a、R^1b、R^2a和R^2b独立地选自氢和C₁-C₄烷基；

R^3a、R^3b、R^6a、R^6b、R^8a和R^8b独立地选自氢、羟基、氟、氯、溴、甲醛、C₁-C₄酰基、C₁-C₄烷基和C₁-C₄烷氧基；

R^4a和R^5a独立地选自氢和C₁-C₄烷基，或R^4a和R^5a一起形成亚甲基桥；

R^4b和R^5b独立地选自氢和C₁-C₄烷基，或R^4b和R^5b一起形成亚甲基桥；并且

R^7a、R^7b和R^9a独立地选自氢和C₁-C₄烷基。

在一些实例中，R^1a和R^1b各自为氢；R^2a和R^2b各自为甲基；R^3a和R^3b各自为氢；R^4a和R^5a独立地为氢或甲基；R^4b和R^5b独立地为氢或甲基，或R^4b和R^5b一起形成亚甲基桥；R^6a、R^6b、R^8a和R^8b各自为氢；并且R^7a、R^7b和R^9a独立地为氢或甲基。

如上文所说明，式Va、Vb和Vd的bisBIA化合物通过使用碳-氧偶联反应融合两个BIA单体形成。另外，式Vc、Vf和Vh的bisBIA化合物通过使用碳-氧偶联反应和碳-碳偶联反应两者融合两个BIA单体形成。此外，式Ve、Vg、Vi、Vj、Vk、Vl、Vm、Vo、Vp和Vq的bisBIA化合物通过使用两个碳-氧偶联反应融合两个BIA单体形成。式Vn的bisBIA化合物通过两个碳-氧偶联反应和一个碳-碳偶联反应融合两个BIA单体形成。另外，式Vr的bisBIA化合物通过使用三个碳-氧偶联反应融合两个BIA单体形成。

可用于形成偶联反应的一种或多种酶可包括已知细胞色素P450，如匍匐小檗(Berberis stolonifera)CYP80A1或来自天然合成这些化合物的其它植物的类似细胞色素P450酶。可替代地，偶联反应可由并非细胞色素P450的酶进行。可用于形成偶联反应的一种或多种酶可经工程化以接受非天然底物。因此，可用于形成偶联反应的一种或多种酶可用于产生非天然bisBIA分子。在一些实例中，一种或多种酶可将天然BIA单体与非天然BIA单体融合以产生非天然bisBIA分子。在其它实例中，一种或多种酶可融合两个非天然BIA单体以产生非天然bisBIA分子。酶工程化策略可用于鉴别可用于形成融合BIA单体以产生bisBIA的偶联反应的一种或多种酶。在一些实例中，酶工程化策略可包括定点诱变、随机诱变和筛选、DNA改组和筛选。

一旦形成bisBIA，则bisBIA可进一步衍生或修饰。bisBIA可利用由工程化宿主细胞产生的一种或多种酶衍生或修饰。特定来说，可通过使bisBIA与由工程化宿主细胞产生的一种或多种酶接触来衍生或修饰bisBIA。另外或可替代地，可通过使bisBIA与从工程化宿主细胞外部的来源提供给bisBIA的一种或多种酶接触来衍生或修饰bisBIA。可用于衍生或修饰bisBIA的一种或多种酶可用于进行定制反应。定制反应的实例包括氧化、还原、O-甲基化、N-甲基化、O-去甲基化、乙酰化、亚甲二氧基桥形成和O,O-去亚甲基化。bisBIA可使用一种或多种定制反应衍生或修饰。

定制反应的实例提供于表5和11中。在一些实例中，定制酶可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的碳-碳偶联反应。可用于催化碳-碳偶联反应定制酶的实例包括来自罂粟、花菱草(Eschscholzia californica)、日本黄连(Coptis japonica)、匍匐小檗、黄唐松草或另一物种的小檗碱桥酶(BBE)；来自罂粟或另一物种的沙罗泰里啶合酶(SalSyn)；以及来自日本黄连或另一物种的紫堇块茎碱合酶(CorSyn)。可由裁剪酶催化的反应的非限制性实例显示于方案4中，其中R^a、R^b、R^c和R^d独立地选自氢、羟基、氟、氯、溴、甲醛、C₁-C₄酰基、C₁-C₄烷基和C₁-C₄烷氧基。在一些实例中，R^a、R^b和其所连接的碳原子任选地形成碳环或杂环。在一些实例中，R^c、R^d和其所连接的碳原子任选地形成碳环或杂环。

方案4

在一些实例中，定制酶可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的氧化反应。可用于催化氧化反应的定制酶的实例包括来自日本黄连、蓟罂粟(Argemone mexicana)、金花小檗(Berberis wilsonae)或另一物种的四氢原小檗碱氧化酶(STOX)；来自罂粟或另一物种的二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)；来自罂粟或另一物种的甲基人血草碱羟化酶(MSH)；以及来自罂粟、花菱草或另一物种的原阿片碱6-羟化酶(P6H)。

定制酶也可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的亚甲二氧基桥形成反应。可用于催化亚甲二氧基桥形成反应的定制酶的实例包括来自罂粟、花菱草、蓟罂粟或另一物种的人血草碱合酶(StySyn)；来自罂粟、花菱草、蓟罂粟或另一物种的华紫堇碱合酶(CheSyn)；以及来自黄唐松草、黄连(Coptis chinensis)或另一物种的坎那定合酶(CAS)。

在其它实例中，定制酶可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的O-甲基化反应。可用于催化O-甲基化反应的定制酶的实例包括来自罂粟、黄唐松草、日本黄连、大红罂粟或另一物种的去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)；来自罂粟、黄唐松草、日本黄连、黄连或另一物种的3'羟基-N-甲基乌药碱4'-O-甲基转移酶(4'OMT)；来自罂粟、花菱草或另一物种的牛心果碱7-O-甲基转移酶(7OMT)；以及来自罂粟、黄唐松草、日本黄连、黄连或另一物种的斯氏紫堇碱9-O-甲基转移酶(9OMT)。

另外，定制酶可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的N-甲基化反应。可用于催化N-甲基化反应的定制酶的实例包括来自罂粟、黄唐松草、日本黄连或另一物种的乌药碱N-甲基转移酶(CNMT)；来自罂粟、花菱草、大红罂粟或另一物种的四氢原小檗碱N-甲基转移酶(TNMT)。

另外，定制酶可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的O-去甲基化反应。可用于催化O-去甲基化反应的定制酶的实例包括来自罂粟或另一物种的蒂巴因脱甲基酶(T6ODM)；以及来自罂粟或另一物种的可待因脱甲基酶(CODM)。

定制酶也可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的还原反应。可用于催化还原反应的定制酶的实例包括来自罂粟、大红罂粟或另一物种的沙罗泰里啶还原酶(SalR)；来自罂粟或另一物种的可待因酮还原酶(COR)；以及来自花菱草或另一物种的血根碱还原酶(SanR)。在其它实例中，定制酶可用于催化对bisBIA或其衍生物进行的乙酰化反应。可用于催化乙酰化反应的定制酶的实例包括来自罂粟或另一物种的沙罗泰里啶乙酰基转移酶(SalAT)。

O-去甲基化修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述通过去除O-连接的甲基，将第一苄基异喹啉生物碱转化为第二苄基异喹啉生物碱。这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，将第一苄基异喹啉生物碱转化为第二苄基异喹啉生物碱是将底物转化为去甲阿片或纳阿片中的关键步骤。在一些实例中，第一生物碱向第二生物碱的转化包括脱甲基酶反应。

图12说明根据本发明的一些实施例，具有阿片3-O-脱甲基酶(ODM)活性的酶。具体来说，酶可作用于吗啡喃生物碱结构以从与碳3结合的氧去除甲基。

ODM酶的氨基酸序列的实例阐述于表6中。用于将第一生物碱转化为第二生物碱的ODM的氨基酸序列可与表6中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类差向异构酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

可提供工程化宿主细胞，其产生将第一生物碱转化为第二生物碱的ODM，其中ODM包含表6中列出的给定氨基酸序列。可提供工程化宿主细胞，其产生一种或多种ODM酶。工程化宿主细胞内产生的ODM可经回收和纯化以便形成生物催化剂。所述工艺可包括使第一生物碱与足以将所述第一生物碱转化为第二生物碱的量的ODM接触。在一些实例中，可使第一生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述第一生物碱转化为第二生物碱。在其它实例中，可使第一生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述第一生物碱转化为第二生物碱。

可用于将第一生物碱转化为第二生物碱的一种或多种酶可在体外接触第一生物碱。另外或替代地，可用于将第一生物碱转化为第二生物碱的一种或多种酶可在体内接触第一生物碱。在一些实例中，可用于将第一生物碱转化为第二生物碱的一种或多种酶可提供给内部具有第一生物碱的细胞。在一些实例中，可用于将第一生物碱转化为第二生物碱的一种或多种酶可在工程化宿主细胞内产生。

在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化宿主细胞，其中将底物O-去甲基化为产物可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，产生的生物碱为去甲阿片或纳阿片。在再其它实施例中，产生的生物碱衍生自去甲阿片或纳阿片。在另一实施例中，第一生物碱为工程化宿主细胞的产物的中间体。在再其它实施例中，生物碱产物选自下组：吗啡、羟吗啡、东罂粟碱、氢吗啡酮、二氢吗啡、14-羟基吗啡、吗啡酮和14-羟基吗啡酮。

在一些实例中，底物生物碱为选自下组的阿片：可待因、羟考酮、蒂巴因、氢可酮、二氢可待因、14-羟基可待因、可待因酮和14-羟基可待因酮。

N-去甲基化修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述通过去除N-连接的甲基将第一生物碱转化为第二生物碱。这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，将第一生物碱转化为第二生物碱是将底物转化为去甲阿片或纳阿片中的关键步骤。在一些实例中，第一生物碱向第二生物碱的转化包括脱甲基酶反应。

图13说明根据本发明的一些实施例，具有阿片N-脱甲基酶活性的酶。具体来说，酶可作用于吗啡喃生物碱结构以从氮去除甲基。

可用于进行第一生物碱向第二生物碱的转化的N-脱甲基酶(NDM)的氨基酸序列的实例提供于表7中。用于将第一生物碱转化为第二生物碱的NDM的氨基酸序列可与表7中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类差向异构酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

可提供工程化宿主细胞，其产生将第一生物碱转化为第二生物碱的NDM，其中NDM包含表7中列出的氨基酸序列。可提供工程化宿主细胞，其产生一种或多种NDM酶。工程化宿主细胞内产生的NDM可经回收和纯化以便形成生物催化剂。所述工艺可包括使第一生物碱与足以将所述第一生物碱转化为第二生物碱的量的NDM接触。在一些实例中，可使第一生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述第一生物碱转化为第二生物碱。在其它实例中，可使第一生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述第一生物碱转化为第二生物碱。

在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化宿主细胞，其中将底物N-去甲基化为产物可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，产生的生物碱为去甲阿片或纳阿片。在再其它实施例中，产生的生物碱衍生自去甲阿片或纳阿片。在另一实施例中，第一生物碱为工程化宿主细胞的产物的中间体。在再其它实施例中，生物碱产物选自下组：去甲可待因、去甲羟考酮、去甲蒂巴因、去甲氢可酮、去甲二氢-可待因、去甲-14-羟基-可待因、去甲可待因酮、去甲-14-羟基-可待因酮、去甲吗啡、去甲羟吗啡酮、去甲东罂粟碱、去甲氢-吗啡酮、去甲二氢-吗啡、去甲-14-羟基-吗啡、去甲吗啡酮和去甲-14-羟基-吗啡酮。

在一些实例中，底物生物碱为选自下组的阿片：可待因、羟考酮、蒂巴因、氢可酮、二氢可待因、14-羟基可待因、可待因酮、14-羟基可待因酮、吗啡、羟吗啡酮、东罂粟碱、氢吗啡酮、二氢吗啡、14-羟基-吗啡、吗啡酮和14-羟基-吗啡酮。

N-甲基转移酶修饰

本文所提供的一些方法、工艺和系统描述通过添加N-连接的侧链基团将第一生物碱转化为第二生物碱。本文所提供的一些方法、工艺和系统描述通过将侧链基团从辅助底物转移到第一生物碱来将第一生物碱转化为第二生物碱。这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化宿主细胞。在一些实例中，将第一生物碱转化为第二生物碱是将底物转化为纳阿片中的关键步骤。在一些实例中，第一生物碱向第二生物碱的转化包括甲基转移酶反应。

图18说明根据本发明的一些实施例，具有N-甲基转移酶(NMT)活性的酶。具体来说，酶可作用于吗啡喃生物碱结构以将甲基或其它碳部分添加到氮。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)可充当官能团(甲基、烯丙基、环丙基甲基或其它)的供体。

NMT酶的氨基酸序列的实例阐述于表8中。用于将第一生物碱转化为第二生物碱的NMT的氨基酸序列可与表8中列出的给定氨基酸序列具有50％或更高同一性。举例来说，此类差向异构酶的氨基酸序列可包含一种氨基酸序列，其与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性。另外，在某些实施例中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有与特定氨基酸序列至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上含有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可相同，但DNA序列经改变，以便例如优化宿主生物体的密码子使用。

可提供工程化宿主细胞，其产生将第一生物碱转化为第二生物碱的NMT，其中NMT包含如表8中所提供的氨基酸序列。可提供工程化宿主细胞，其产生一种或多种NMT酶。工程化宿主细胞内产生的NMT可经回收和纯化以便形成生物催化剂。所述工艺可包括使第一生物碱与足以将所述第一生物碱转化为第二生物碱的量的NMT接触。在一些实例中，可使第一生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述第一生物碱转化为第二生物碱。在其它实例中，可使第一生物碱与足量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述第一生物碱转化为第二生物碱。

在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化宿主细胞，其中底物到产物的N-甲基转移酶为可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，产生的生物碱为纳阿片。在再其它实施例中，产生的生物碱衍生自去甲阿片或纳阿片。在另一实施例中，第一生物碱为工程化宿主细胞的产物的中间体。在再其它实施例中，生物碱产物选自下组：纳洛酮、纳曲酮和纳美芬。

在一些实例中，底物生物碱为选自下组的阿片：去甲可待因、去甲羟考酮、去甲蒂巴因、去甲氢可酮、去甲二氢-可待因、去甲-14-羟基-可待因、去甲可待因酮、去甲-14-羟基-可待因酮、去甲吗啡、去甲羟吗啡酮、去甲东罂粟碱、去甲氢-吗啡酮、去甲二氢-吗啡、去甲-14-羟基-吗啡、去甲吗啡酮和去甲-14-羟基-吗啡酮。在一些实例中，辅助底物为S-腺苷甲硫氨酸、烯丙基-S-腺苷甲硫氨酸或环丙基甲基-S-腺苷甲硫氨酸。

异源编码序列

在一些情况下，工程化宿主细胞携带一个或多个异源编码序列(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)，其编码使得工程化宿主细胞能够产生所需所关注的酶和/或所关注的BIA(例如，如本文所描述)的活性。如本文所用，术语“异源编码序列”用于指示编码或最终编码通常不存在于宿主生物体中并且可在适当条件下在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等效氨基酸序列，例如酶的任何多核苷酸。因此，“异源编码序列”包括通常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，使得细胞表达通常不存在于细胞中的编码序列的额外拷贝。异源编码序列可为RNA或其任何类型，例如mRNA，DNA或其任何类型，例如cDNA，或RNA/DNA的杂交体。所关注的编码序列包括但不限于全长转录单元，其包括如编码序列、内含子、启动子区、3'-UTR和增强子区等特征。

在一些实例中，工程化宿主细胞可包含多个异源编码序列，其各自编码酶，如表5中列出的酶。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多个酶可彼此不同。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多个酶中的一些可彼此不同，并且由多个异源编码序列编码的多个酶中的一些可为重复拷贝。

在一些实例中，异源编码序列可以可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可处于产生特定苄基异喹啉生物碱产物和/或差向异构酶产物的相同途径内。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列可沿产生特定苄基异喹啉生物碱产物和/或差向异构酶产物的途径直接依序。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列可在由多个异源编码序列编码的酶中的一者或多者之间具有一种或多种天然酶。在一些实例中，异源编码序列可在由多个异源编码序列编码的酶中的一者或多者之间具有一种或多种异源酶。在一些实例中，异源编码序列可在由多个异源编码序列编码的酶中的一者或多者之间具有一种或多种非天然酶。

工程化宿主细胞还可经修饰以具有一种或多种基因改变以适应异源编码序列。天然宿主基因组的改变包括但不限于修饰基因组以降低或消除可干扰所需途径的特定蛋白质的表达。此类天然蛋白质的存在可将所述途径的中间体或最终产物之一快速转化为代谢物或在所需途径中不可用的其它化合物。因此，如果天然酶的活性降低或完全不存在，则产生的中间体将更容易可用于并入到所需产物中。

异源编码序列包括但不限于编码通常负责植物中所关注的BIA产生的酶的序列，酶为野生型或等效序列。在一些情况下，异源序列编码的酶可为1-苄基异喹啉生物碱途径中的任何酶，并且可来自任何适宜来源。可基于所需产物选择由用于特定合成途径的异源编码序列编码的酶的选择和数量。在某些实施例中，本发明的宿主细胞可包括1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或甚至15个或更多个异源编码序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个异源编码序列。

如本文所用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分(即肽或酶的cDNA或mRNA序列)，以及全长转录单元的编码部分(即包括内含子和外显子的基因)，以及“密码子优化”序列、截短序列或其它形式的改变的序列，所述序列编码酶或编码其等效氨基酸序列，其条件是等效氨基酸序列产生功能蛋白。此类等效氨基酸序列可具有一个或多个氨基酸的缺失，其中缺失为N末端、C末端或内部。设想截短形式，只要其具有本文中所指示的催化能力即可。还设想两种或更多种酶的融合以促进代谢物在途径中的转移，其条件是催化活性得到维持。

可通过建模和/或筛选来鉴别可操作片段、突变体或截短形式。在一些情况下，这通过以下实现：以逐步方式缺失蛋白质的例如N末端、C末端或内部区，接着分析与原始序列相比，所得衍生物对于所需反应的活性。如果所讨论的衍生物以此能力操作，则其视为适当构成酶的等效衍生物。

在一些实例中，一些异源蛋白质在重组宿主中表达时可能显示其不正确加工的情况。举例而言，微生物生产宿主中表达的植物蛋白，如细胞色素P450酶可能具有不正确加工的情况。特定来说，当在酵母中异源表达时，沙罗泰里啶合酶可经历N-连接的糖基化。在植物中可能未观察到此N-连接的糖基化，其可指示新生SalSyn转录物的N末端分选不正确，从而降低异源微生物宿主中酶的活性。在此类实例中，针对校正新生转录物的N末端分选以便去除N-连接的糖基化模式的蛋白质工程可引起重组生产宿主中沙罗泰里啶合酶的活性提高。

本发明的方面还涉及编码等效于各种酶的天然氨基酸序列的氨基酸序列的异源编码序列。“等效”的氨基酸序列定义为一种氨基酸序列，其与特定氨基酸序列不相同，而是含有当用于所需目的时，与特定氨基酸序列的相似活性相比，基本上不影响蛋白质的生物活性的至少一些氨基酸变化(缺失、取代、倒位、插入等)。在差向异构酶的实例中，生物活性是指其催化活性。等效序列还意图包括已经工程化和/或进化以具有不同于原始氨基酸序列的特性的那些序列。所关注的可变特性包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解度、定位等。

在一些情况下，每种类型的酶的表达通过额外基因拷贝(即，多个拷贝)提高，其增加中间体积累和/或所关注的BIA产生。本发明的一些实施例包括通过同时表达单一或多个酶的多种物种变异体来增加宿主细胞中所关注的BIA产生。在一些情况下，单一或多个酶的额外基因拷贝包括于宿主细胞中。可利用任何适宜方法，包括宿主细胞中酶的异源编码序列的多个拷贝。

在一些实例中，工程化宿主细胞包括酶的异源编码序列的多个拷贝，如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或甚至10个或更多个拷贝。在某些实施例中，工程化宿主细胞包括一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个等的多个拷贝。在一些情况下，酶的异源编码序列的多个拷贝衍生自与宿主细胞相比，两种或更多种不同来源生物体。举例来说，工程化宿主细胞可包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中拷贝中的每一者衍生自不同来源生物体。因此，基于由异源编码序列编码的所关注的酶的物种间差异，每个拷贝可包括显式序列中的一些变化。

在某些实施例中，工程化宿主细胞包括一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个等的多个拷贝。在一些情况下，酶的异源编码序列的多个拷贝衍生自与宿主细胞相比，两种或更多种不同来源生物体。举例来说，工程化宿主细胞可包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中拷贝中的每一者衍生自不同来源生物体。因此，基于由异源编码序列编码的所关注的酶的物种间差异，每个拷贝可包括显式序列中的一些变化。

可对工程化宿主细胞培养基进行取样并且监测其所关注的BIA产生。可使用任何适宜方法观察和测量所关注的BIA。所关注的方法包括但不限于LC-MS方法(例如，如本文所描述)，其中与已知量的标准化合物相比来分析所关注的样品。另外，存在可观察和/或测量所关注的BIA的其它方式。观察和/或测量BIA的替代方式的实例包括GC-MS、UV-vis光谱、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC、毛细管电泳等。可以例如通过m/z和MS/MS裂解规律、MRM跃迁确认身份，并且可通过参考已知量的化合物标准品的对应LC-MS分析，经由已知滞留时间的LC迹线峰和/或EIC MS峰分析实现化合物的定量或测量。在一些情况下，可使用质谱法经由多反应监测来确认身份。

另外，可对工程化宿主细胞的培养物进行取样并且监测其所关注的酶，如尼奥品酮异构酶的产生。可使用任何适宜方法观察和测量所关注的酶。所关注的方法包括酶活性分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、一氧化碳光谱和蛋白质印迹分析。

方法

培养用于BIA产生的宿主细胞的方法

如上文所概述，本发明的一些方面包括制备所关注的苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。另外，本发明的一些方面包括制备所关注的酶的方法。因此，本发明的一些方面包括在一种或多种宿主细胞修饰(例如，如本文所描述)功能性表达的条件下培养工程化宿主细胞，使得细胞将所关注的起始化合物转化为所关注的产物酶和/或BIA。还提供了包括在适合于蛋白质产生的条件下培养工程化宿主细胞，使得一个或多个异源编码序列功能性表达并且将所关注的起始化合物转化为所关注的产物酶或BIA的方法。在一些实例中，所述方法为制备苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法，其包括培养工程化宿主细胞(例如，如本文所描述)；将起始化合物添加到细胞培养物中；以及从细胞培养物中回收BIA。在一些实例中，所述方法为制备酶的方法，其包括培养工程化宿主细胞(例如，如本文所描述)；将起始化合物添加到细胞培养物中；以及从细胞培养物中回收酶。

发酵培养基可含有合适的碳底物。适合于进行本公开的方法的碳源可涵盖广泛多种含碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉籽糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合。在一些情况下，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽)。在一些情况下，碳底物可为一碳底物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳底物(例如乙醇)。在其它情况下，可利用其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸。

可采用培养工程化宿主细胞的任何适宜方法来产生所关注的酶和/或BIA。所采用的特定方案可改变，例如取决于工程化宿主细胞、异源编码序列、所关注的酶、所关注的BIA等。工程化宿主细胞可存在于任何适宜环境中，如工程化宿主细胞能够表达一种或多种功能性异源酶的环境。在一些实施例中，工程化宿主细胞在有助于酶表达的条件下，并且在可用于允许体内产生所关注的酶和/或BIA的适当底物下培养。在一些实施例中，从工程化宿主提取功能性酶以便在体外条件下产生所关注的酶和/或BIA。在一些情况下，将工程化宿主细胞放回多细胞宿主生物体中。工程化宿主细胞处于任何生长期，包括但不限于静止期和对数生长期等。另外，培养物本身可为连续培养物或其可为分批培养物。

细胞可在适当发酵培养基中在14-40℃之间的温度下生长。细胞可在任何适宜速度(例如200rpm)的摇动下生长。细胞可在合适的pH下生长。适用于发酵的pH范围可在pH 5-9之间。发酵可在好氧、厌氧或微好氧条件下进行。可使用任何合适的生长培养基。合适的生长培养基可包括但不限于常见商业制备培养基，如合成已知成分(synthetic defined，SD)基本培养基或酵母提取物蛋白胨右旋糖(yeast extract peptone dextrose，YEPD)富集培养基。可使用适合于微生物的任何其它富集、已知成分或合成生长培养基。

可在基本上任何大小和形状的容器中培养细胞。适合于进行本公开的方法的容器的实例可包括但不限于多孔摇板、试管、烧瓶(具有档板和不具有档板)和生物反应器。培养的体积可在10微升至大于10,000升的范围内。

可包括将已知以产生生物碱所需的方式调节代谢的试剂添加到生长培养基中。在非限制性实例中，可将环腺苷2′3′-单磷酸添加到生长培养基中以调节分解代谢物抑制。

可利用针对特定细胞类型的任何适宜细胞培养条件。在某些实施例中，包括一种或多种修饰的宿主细胞在标准或容易优化的条件下用标准细胞培养基和补充剂培养。作为一个实例，当不需要质粒维持的选择压力时，标准生长培养基可含有20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和20g/L右旋糖(YPD)。含有质粒的宿主细胞在合成完全(syntheticcomplete，SC)培养基中生长，所述培养基含有1.7g/L酵母氮源基础、5g/L硫酸铵和20g/L右旋糖，补充有生长和选择所需的适当氨基酸。适用于诱导型酶表达的替代碳源包括但不限于蔗糖、棉籽糖和半乳糖。在实验室中，细胞在容器中，例如体积在1-1000mL的范围内或更大的试管或烧瓶中在任何适宜温度(例如30℃)下，在任何适宜速率(例如200rpm)的摇动下生长。

培养体积可按比例扩大以便在较大发酵容器中生长，例如作为工业工艺的一部分。工业发酵工艺可在封闭分批、补料分批或连续恒化器条件或任何合适的发酵模式下进行。在一些情况下，工程化宿主细胞可作为全细胞催化剂固定于底物上并且经历生物碱产生的发酵条件。

分批发酵为封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵工艺期间不改变。在发酵开始时将所需生物体接种到培养基中。在一些情况下，在对系统作出改变的情况下运作分批发酵，以控制如pH和氧浓度(而非碳)等因素。在此类型的发酵系统中，系统的生物质和代谢物组成在发酵过程中连续改变。细胞典型地前进通过停滞期，随后到对数期(高生长速率)，随后到静止期(生长速率降低或停止)，并且最终到死亡期(如果未加处理)。在其它情况中，可在某些时间打开分批发酵系统以添加用于发酵所需生物体的额外底物。特定来说，在一些情况下，发酵系统可包括补料分批反应器。

连续发酵为开放系统，其中将已知成分发酵培养基连续添加到生物反应器中，并且从容器中连续取出等量的发酵培养基以进行加工。一般操作连续发酵系统以维持稳态生长条件，使得归因于取出的培养基的细胞损失必须由发酵中的生长速率平衡。连续发酵一般在细胞处于恒定高细胞密度下的条件下操作。连续发酵允许调节影响目标产物浓度和/或细胞生长的一种或多种因素。

液体培养基可包括但不限于具有上文所描述的添加剂组分的富集或合成已知成分培养基。培养基组分可溶解于水中并且通过加热、压力、过滤、辐射、化学品或其任何组合灭菌。若干培养基组分可分别制备和灭菌，且随后在发酵容器中组合。培养基可经缓冲以帮助在整个发酵过程中维持恒定pH。

可在发酵过程中监测或控制包括温度、溶解氧、pH、搅拌、通气速率和细胞密度的工艺参数。举例来说，可通过浸入培养基中的温度探针监测发酵工艺的温度。可通过调节夹套温度将培养温度控制在设定点。水可在外部冷却器中冷却，且随后流动到生物反应器控制塔中，并且以维持容器中设定点温度所需的温度循环到夹套。

另外，可在发酵工艺中监测气流参数。举例来说，气体可通过分布器流动到培养基中。适合于本公开的方法的气体可包括压缩空气、氧气和氮气。气流可处于固定速率或经调节以维持溶解氧设定点。

还可监测培养基的pH。在一些实例中，可通过浸入容器内的培养基中的pH探针监测pH。如果pH控制有效，则可通过将每种溶液以所需速率添加到培养基中的酸和碱泵调节pH。用于控制pH的酸溶液可为硫酸或盐酸。用于控制pH的碱溶液可为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵。

此外，可通过浸入培养基中的溶解氧探针监测培养基中的溶解氧。如果溶解氧调节有效，则可通过提高或降低搅拌速度来调节氧水平。还可通过提高或降低气体流动速率来调节溶解氧水平。气体可为压缩空气、氧气或氮气。

还可在发酵工艺中监测搅拌速度。在一些实例中，搅拌机马达可驱动搅拌器。搅拌机速度可在整个发酵过程中设定为一致的rpm，或可动态调节以维持设定的溶解氧水平。

另外，可在发酵工艺中监测浊度。在一些实例中，可使用浊度探针测量细胞密度。可替代地，可通过从生物反应器中取得样品并且将其在分光光度计中分析来测量细胞密度。此外，可通过无菌取样装置以时间间隔从生物反应器中取出样品。可针对宿主细胞产生的生物碱分析样品。还可针对其它代谢物和糖、培养基组分耗乏或细胞密度分析样品。

在另一实例中，可在发酵工艺期间监测原料参数。特定来说，可使用外部泵将包括糖和其它碳源、营养物和辅因子的原料添加到发酵中。还可在发酵期间添加其它组分，包括但不限于消泡剂、盐、螯合剂、表面活性剂和有机液体。

用于优化宿主细胞中异源多核苷酸表达的任何适宜密码子优化技术可适用于本发明宿主细胞和方法，参见例如Gustafsson,C.等人(2004)《生物技术趋势(TrendsBiotechnol)》,22,346-353，其以全文引用的方式并入。

本发明方法还可包括将起始化合物添加到细胞培养物中。任何适宜的添加方法可适用于本发明方法。细胞培养物可补充有足量的所关注的起始物质(例如，如本文所描述)，例如mM至μM量，如约1-5mM之间的起始化合物。应理解，添加的起始物质的量、添加的时间选择和速率、添加的物质的形式等可根据多种因素而改变。起始物质可纯净添加或预溶解于合适溶剂(例如细胞培养基、水或有机溶剂)中。起始物质可以浓缩形式(例如超过所需浓度10倍)添加以使添加后细胞培养基的稀释最小化。起始物质可以一个或多个批次添加，或在长时间段(例如数小时或数天)内连续添加。

用于从发酵培养基中分离产物的方法

本发明方法还可包括从细胞培养物中回收所关注的酶和/或BIA。任何适宜的分离(separation/isolation)方法(例如色谱方法或沉淀方法)可适用于本发明方法以从细胞培养物中回收所关注的酶和/或BIA。过滤方法可用于将细胞培养物的可溶性级分与不溶性级分分离。在一些情况下，液相色谱方法(例如反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱)可用于将所关注的BIA与细胞培养物的其它可溶性组分分离。在一些情况下，萃取方法(例如液体萃取、基于pH的纯化、固相萃取、亲和色谱、离子交换等)可用于将所关注的酶和/或BIA与细胞培养物的其它组分分离。

可使用所属领域中已知的方法从发酵培养基中分离产生的生物碱。可紧接在发酵之后(或在一些情况下，在发酵期间)进行多个回收步骤，以便进行所需产物的初始回收。通过这些步骤，生物碱(例如BIA)可与工程化宿主细胞、细胞碎片和废料分离，并且其它营养物、糖和有机分子可保留在废培养基中。此工艺可用于产生BIA富集的产物。

在一个实例中，通过将工程化酵母细胞和包括营养物和水的原料提供到分批反应器，形成具有苄基异喹啉生物碱(BIA)产物的产物流。特定来说，可通过将工程化酵母细胞培育至少约5分钟的时间段来使工程化酵母细胞经历发酵，以产生包含BIA产物和细胞物质的溶液。一旦工程化酵母细胞已经历发酵，则可使用至少一个分离单元将BIA产物与细胞物质分离以提供包含BIA产物的产物流。特定来说，产物流可包括BIA产物以及额外组分，如澄清酵母培养基。另外，BIA产物可包含一种或多种所关注的BIA，如一种或多种BIA化合物。

可使用不同方法从生物反应器培养基中取出包括所关注的酶和/或BIA的细胞。在一些实例中，可通过随时间沉降取出细胞。此沉降过程可通过冷却或通过添加澄清剂，如二氧化硅来加速。随后可从反应器的顶部虹吸废培养基，或可从反应器的底部倾析细胞。可替代地，可通过过滤器、膜或且其它多孔材料过滤来取出细胞。细胞还可通过离心取出，例如通过连续流离心或通过使用连续提取器。

如果一些有价值的所关注的酶和/或BIA存在于工程化宿主细胞内部，则可使工程化宿主细胞透化或裂解并且可通过上文所描述的方法中的任一者去除细胞碎片。用于透化工程化宿主细胞的试剂可包括但不限于有机溶剂(例如DMSO)或盐(例如乙酸锂)。裂解工程化宿主细胞的方法可包括添加表面活性剂，如十二烷基硫酸钠，或通过珠磨或超声处理进行机械破坏。

可通过添加与水性培养基不混溶的有机液体，通过液-液萃取来从澄清废培养基中萃取所关注的酶和/或BIA。在一些实例中，除其它加工步骤之外，还可使用液-液萃取。合适有机液体的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯、甲基异丁基酮、油酸甲酯、甲苯、油烯醇、丁酸乙酯。有机液体可添加到水性培养基的少到10％或高达100％。有机液体可为水性培养基的体积的少到10％，可为100％，可为200％，可为300％，可为400％，可为500％，可为600％，可为700％，可为800％，可为900％，可为1000％，可为大于1000％，或可为本文所列的那些之间的百分比。

在一些情况下，可在发酵开始时或在发酵期间的任何时间添加有机液体。此萃取发酵工艺可通过连续取出酶和/或BIA到有机相中来增加来自宿主细胞的所关注的酶和/或BIA的产量。

搅拌可使有机相与水性培养基形成乳液。促进两相分离成不同层的方法可包括但不限于添加破乳剂或成核剂，或调节pH。还可离心乳液以分离两相，例如通过连续锥形板离心。

可替代地，可从水性培养基中分离有机相，使得其可在萃取之后物理取出。举例来说，溶剂可囊封于膜中。

在一些实例中，可使用吸附方法从发酵培养基中萃取所关注的酶和/或BIA。在一些实例中，可通过添加树脂，如

XAD4或通过吸附取出BIA的另一试剂从澄清废培养基中萃取所关注的BIA。随后可使用有机溶剂从树脂中释放所关注的BIA。合适的有机溶剂的实例包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮。

还可使用过滤从发酵培养基中萃取所关注的BIA。在高pH下，所关注的BIA可在生物反应器中形成结晶性样沉淀物。此沉淀物可通过过滤器、膜或且其它多孔材料过滤直接取出。沉淀物还可通过离心和/或倾析收集。

上文所描述的萃取方法可原位(在生物反应器中)或非原位(例如在外部回路中，培养基通过其流出生物反应器并且接触萃取剂，随后再循环回到容器中)进行。可替代地，可在发酵终止之后使用从生物反应器容器中取出的澄清培养基进行萃取方法。

用于从生物碱富集的溶液纯化产物的方法

后续纯化步骤可涉及使用所属领域中已知的方法处理富集有所关注的BIA产物的发酵后溶液，以将所关注的个别产物物种回收到高纯度。

在一个实例中，萃取在有机相中的所关注的BIA可转移到水溶液中。在一些情况下，可通过加热和/或真空蒸发有机溶剂，并且可将所得粉末溶解于合适pH的水溶液中。在另一实例中，可通过在促进所关注的BIA萃取到水相中的合适pH下添加水溶液，从有机相萃取所关注的BIA。随后可通过倾析、离心或另一方法取出水相。

可进一步处理含BIA溶液以去除金属，例如通过用合适的螯合剂处理。可通过沉淀进一步处理含所关注的BIA的溶液以去除其它杂质，如蛋白质和DNA。在一个实例中，用适当沉淀剂，如乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇处理含所关注的BIA的溶液。在一个替代实例中，可通过透析或通过将较小生物碱与污染性生物大分子分离的其它尺寸排阻方法来去除DNA和蛋白质。

在其它实例中，可使用所属领域中已知的方法通过连续错流过滤将含有所关注的BIA的溶液萃取到高纯度。

如果溶液含有所关注的BIA的混合物，则可使用所属领域中已知的方法对其进行酸碱处理以产生所关注的个别BIA物种。在此工艺中，调节水溶液的pH以使个别BIA沉淀。

对于高纯度、小规模制备，可通过液相色谱在单步中纯化BIA。

液相色谱质谱(LCMS)法

所关注的BIA化合物，包括1-苄基异喹啉生物碱、双苄基异喹啉生物碱、原吗啡喃生物碱、吗啡喃生物碱、纳阿片和去甲阿片可使用液相色谱分离，并且使用质谱检测和定量。化合物身份可通过特征洗脱时间、质荷比(m/z)和裂解规律(MS/MS)来确认。定量可通过将化合物峰面积与已知参考标准化合物的标准曲线进行比较来进行。另外，所关注的BIA可通过替代方法检测，如GC-MS、UV-vis光谱、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC和毛细管电泳。

Purpald分析方法

对于去甲基化反应的高通量筛选，可使用purpald分析。举例来说，由2-酮戊二酸依赖性双加氧酶催化的去甲基化产生甲醛a作为产物，如以下通用化学方程式中所示：

碱性条件下的Purpald试剂在甲醛存在下经历颜色变化，其可用分光光度计在510nm下定量到低至1nM的浓度。

酵母衍生的生物碱API与植物衍生的API

澄清酵母培养基(CYCM)可含有多种杂质。澄清酵母培养基可通过真空和/或加热脱水以产生富含生物碱的粉末。此产品类似于罂粟秆浓缩物(CPS)或鸦片，其从种植罂粟的国家出口并且由API制造商购买。出于本发明的目的，CPS为任何类型的纯化植物提取物的代表性实例，所需生物碱产品最终可从其中进一步纯化。表12和13突出显示这两种产品中可为CYCM或CPS所特有，或可存在于两者中的杂质。虽然一些BIA可具有色素作为杂质，但其它BIA自身可分类为色素。因此，可基于非色素杂质来评定这些BIA的杂质。通过针对这些杂质的子集分析未知来源的产品，所属领域的技术人员可确定所述产品源自酵母还是植物生产宿主。

API级药物成分为高度纯化的分子。因此，在产品的API阶段可能不存在可指示API的植物或酵母来源的杂质(如表12和13中列出的那些)。实际上，衍生自本发明的一些实施例的酵母菌株的许多API产品可能与传统植物衍生的API在很大程度上不可区分。然而，在一些情况下，常规生物碱化合物可使用化学合成方法经历化学修饰，其可在需要此类化学修饰的植物类产品中显示为化学杂质。举例来说，化学衍生化通常产生与化学合成工艺相关的一组杂质。在某些情况下，可在酵母生产平台中以生物方式进行这些修饰，从而避免与化学衍生相关的一些杂质存在于酵母衍生的产品中。特定来说，来自化学衍生产品的这些杂质可能存在于使用化学合成工艺产生的API产品中，但可能不存在于使用酵母衍生的产品产生的API产品中。可替代地，如果将酵母衍生的产品与化学衍生的产品混合，则所得杂质可能存在，但存在量小于仅含有或主要含有化学衍生的产品的API中的预期量。在此实例中，通过针对这些杂质的子集分析API产品，所属领域的技术人员可确定产品源自酵母生产宿主还是传统化学衍生化途径。

可存在于化学衍生吗啡喃API中但不存在于生物合成API中的杂质的非限制性实例包括API可待因中的可待因-O(6)-甲基醚杂质；API羟考酮中的8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮；以及API氢可酮中的四氢蒂巴因。可待因-O(6)-甲基醚可通过吗啡的化学过度甲基化形成。API羟考酮中的8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮可通过蒂巴因的化学过度氧化形成。另外，API氢可酮中的四氢蒂巴因可通过蒂巴因的化学过度还原形成。

然而，在酵母衍生的化合物和植物衍生的化合物都经历通过化学合成方法的化学修饰的情况下，可预期产品中存在与化学合成工艺相关的相同杂质。在此情况下，可如上文所描述分析起始物质(例如CYCM或CPS)。

宿主细胞衍生的纳阿片与化学衍生的纳阿片

通过化学合成产生的纳阿片可含有多种杂质。这些杂质可由许多不同原因产生，例如未反应的起始物质、不完全反应、副产物形成、中间体存留、二聚合或降解。未反应的起始物质的一个实例可为纳曲酮制剂中剩余的羟吗啡酮。由不完全反应产生的杂质的一个实例可为由蒂巴因的不完全3-O-去甲基化产生的3-O-甲基丁丙诺啡。化学修饰可引起在脱靶位点处添加或去除官能团。举例来说，在纳曲酮合成期间，氧化C10产生10-羟基纳曲酮和10-酮纳曲酮，或在丁丙诺啡合成期间去除6-O-甲基得到6-O-去甲基丁丙诺啡。杂质可由反应中间体的存留产生，例如在N-去甲基化工艺期间形成的N-氧化物，如羟吗啡酮N-氧化物的存留。杂质的另一来源为二聚合，即两个阿片分子的缀合，例如两个丁丙诺啡分子(2,2′-双丁丙诺啡)、两个纳曲酮分子(2,2′-双纳曲酮)或两个纳洛酮分子(2,2′-双纳洛酮)。杂质可由起始物质、反应中间体或反应产物的降解产生。化学合成中使用的极端物理条件可使降解更有可能存在。可由降解产生的杂质的一个实例为在丁丙诺啡合成期间由氧化条件产生的脱氢丁丙诺啡。

在宿主细胞中由酶催化产生的纳阿片可含有与通过化学合成产生的纳阿片不同的杂质。在宿主细胞中由酶催化产生的纳阿片可含有比与通过化学合成产生的纳阿片更少的杂质。在宿主细胞中由酶催化产生的纳阿片可缺乏通过化学合成产生的纳阿片中发现的某些杂质。在一些实例中，酶合成的关键特征可包括(1)酶以高保真度靶向特定底物和残基；(2)酶在细胞内不损害分子稳定性的温和生理条件下进行反应；以及(3)酶工程化为驱动反应完成的高效催化剂。

表14突出显示可为化学产生的纳阿片所特有的一些杂质。因此，可评定纳阿片的杂质以确定是否存在来自表14的任何杂质。通过针对这些杂质的子集分析未知来源的产品，所属领域的技术人员可确定所述产品源自化学还是酶促合成。

工程化宿主细胞的方法

还包括出于产生所关注的酶和/或BIA的目的工程化宿主细胞的方法。可使用任何适宜方法实现将DNA插入到宿主细胞中。所述方法用于将异源编码序列插入到工程化宿主细胞中，使得宿主细胞功能性表达酶并且将所关注的起始化合物转化为所关注的产物酶和/或BIA。

可在本发明工程化宿主细胞和方法中利用任何适宜启动子。驱动异源编码序列表达的启动子可为组成型启动子或诱导型启动子，其条件是启动子在工程化宿主细胞中具有活性。异源编码序列可由其天然启动子表达，或可使用非天然启动子。此类启动子在使用其的宿主中可为低至高强度。启动子可受调控或为组成型。在某些实施例中，使用不受葡萄糖抑制，或仅受培养基中葡萄糖的存在轻度抑制的启动子。所关注的启动子包括但不限于糖酵解基因的启动子，如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶基因的启动子区)或编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的酵母酿酒酵母基因的启动子(GPD、GAPDH或TDH3)，面包酵母的ADH1启动子，磷酸饥饿诱导启动子，如酵母的PHO5启动子，来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子，酵母诱导型启动子，如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、可抑制启动子Met25、tetO，以及组成型启动子，如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延伸因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。还可使用含有可由激素，如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素诱导的启动子的自主复制酵母表达载体，并且其包括但不限于糖皮质激素反应性元件(GRE)和甲状腺激素反应性元件(TRE)。这些和其它实例描述于美国专利第7,045,290号中，其以引用的方式并入，包括其中引用的参考文献。可使用含有组成型或诱导型启动子，如α因子、醇氧化酶和PGH的其它载体。另外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因表达。可针对宿主细胞，例如大肠杆菌选择任何适宜的适当启动子。人们还可使用启动子选择来优化转录物，并且因此优化酶水平，以使产量最大化同时使能量资源最小化。

可在本发明工程化宿主细胞和方法中利用任何适宜载体。所关注的载体包括用于酵母和其它细胞的载体。酵母载体的类型可分为4种一般类别：整合载体(YIp)、自主复制高拷贝数载体(YEp或2μ质粒)、自主复制低拷贝数载体(YCp或着丝粒质粒)以及用于克隆大片段的载体(YAC)。经由任何适宜的转化或转染技术将载体DNA引入到原核或真核细胞中。另一来源的DNA(例如PCR产生的双链DNA产物，或合成双链或单链寡核苷酸)可用于通过整合到基因组中来工程化酵母。任何单一转化事件可包括一种或若干种核酸(载体、双链或单链DNA片段)以对宿主细胞进行基因修饰。表10说明适宜载体的实例。

效用

本发明的工程化宿主细胞和方法，例如如上文所描述，用于多种应用。所关注的应用包括但不限于：研究应用和治疗应用。本发明的方法用于多种不同应用，包括酶和/或BIA的产生受关注的任何适宜应用。

本发明工程化宿主细胞和方法用于多种治疗应用。所关注的治疗应用包括制备包括BIA的药物产品受关注的那些应用。本文所描述的工程化宿主细胞产生所关注的BIA和所关注的酶。牛心果碱是包括产生如阿片产品的最终产品的工程化努力的BIA合成中所关注的主要分支点中间体。本发明宿主细胞可用于从简单且廉价的起始物质产生所关注的BIA，所述起始物质可用于产生所关注的BIA，包括牛心果碱和BIA最终产品。因此，本发明宿主细胞用于供应所关注的治疗活性BIA。

在一些情况下，工程化宿主细胞和方法用于产生商业规模量的其BIA，其中这些化合物的化学合成产率低并且不是大规模生产的可行手段。在某些情况下，宿主细胞和方法在发酵设施中利用，所述发酵设施将包括5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵罐)，从而允许快速产生其所关注的BIA用于治疗产品。此类应用可包括从可发酵碳源，如纤维素、淀粉和游离糖工业规模产生所关注的BIA。

本发明工程化宿主细胞和方法用于多种研究应用。本发明工程化宿主细胞和方法可用于分析多种酶对多种所关注的酶和/或BIA的生物合成途径的影响。另外，工程化宿主细胞可经工程化以产生所关注的酶和/或BIA，其用于测试尚未证实的治疗功能中所关注的生物活性。在一些情况下，工程化宿主细胞以包括编码多种酶的多种异源编码序列阐明朝向所关注的酶和/或BIA的高产率生物合成途径。在某些情况下，研究应用包括产生所关注的酶和/或BIA用于所关注的治疗分子，所述治疗分子随后可进一步化学修饰或衍生为所需产品，或用于筛选提高的所关注的治疗活性。在一些情况下，宿主细胞菌株用于筛选此类途径中所关注的酶活性，其可引起经由这些菌株中产生的BIA代谢物的转化发现酶。

本发明工程化宿主细胞和方法可用作植物特化代谢物的生产平台。本发明工程化宿主细胞和方法可用作药物库开发以及植物酶发现的平台。举例来说，本发明工程化宿主细胞和方法可用于通过获取产生引起关注的支架分子，如蝙蝠葛新林碱的酵母菌株，并且通过组合生物合成或通过化学手段进一步官能化化合物结构，开发基于天然产品的药物库。通过以此方式产生药物库，任何潜在药物命中已与适合于大规模培养和生产的生产宿主相关联。作为另一实例，这些本发明工程化宿主细胞和方法可用于植物酶发现。本发明宿主细胞提供确定的代谢物的清洁背景来表达植物EST文库以鉴别新酶活性。本发明宿主细胞和方法为酵母中植物酶的功能性表达和提高的活性提供了表达方法和培养条件。

试剂盒和系统

本发明的方面进一步包括试剂盒和系统，其中试剂盒和系统可包括本发明的方法中采用的一种或多种组分，例如工程化宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等，如本文所描述。在一些实施例中，本发明试剂盒包括工程化宿主细胞(例如，如本文所描述)和一种或多种选自以下的组分：起始化合物、异源编码序列和/或包括其的载体、载体、生长原料、适用于表达系统的组分(例如细胞、克隆载体、多克隆位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)等)以及培养基。

本文所描述的组分中的任一者可提供于试剂盒中，例如包括一种或多种修饰的宿主细胞、起始化合物、培养基等。适用于制备和使用异源编码序列、克隆载体和表达系统的多种组分可用于本发明试剂盒。试剂盒还可包括试管、缓冲剂等，以及使用说明书。视需要，试剂盒的各种试剂组分可存在于独立容器中，或其中的一些或全部可预组合成单一容器中的试剂混合物。

还提供了用于产生所关注的酶和/或BIA的系统，其中所述系统可包括包含一种或多种修饰(例如，如本文所描述)的工程化宿主细胞、起始化合物、培养基、发酵罐和发酵设备(例如适合于维持宿主细胞的生长条件的装置)、取样和监测设备和组件等。适用于酵母细胞大规模发酵的多种组分可用于本发明系统。

在一些情况下，系统包括用于工程化宿主细胞大规模发酵的组分，以及由发酵宿主细胞产生的酶和/或BIA化合物的监测和纯化。在某些实施例中，在发酵罐中的工程化宿主细胞产生一种或多种所需所关注的BIA产物的条件下，将一种或多种起始化合物(例如，如本文所描述)添加到系统中。在一些情况下，宿主细胞产生所关注的BIA(例如，如本文所描述)。在某些情况下，所关注的BIA产物为阿片产品，如蒂巴因、可待因、尼奥品、吗啡、尼奥吗啡、氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因、二氢吗啡和羟吗啡酮。在一些情况下，所关注的BIA产物为纳阿片，如纳曲酮、纳洛酮、纳美芬、纳洛芬、纳洛芬、纳洛地因、纳地美定、纳洛昔醇、6β-纳曲醇、纳曲吲哚、甲基纳曲酮、甲基沙米多芬、爱维莫潘、阿西洛仑、倍福普兰、二烟酸酯、左洛啡烷、沙米多芬、丁丙诺啡、地佐辛、依他佐辛、布托啡诺、左啡诺、纳布啡、喷他佐辛、非那佐辛、去甲丙纳托非敏和二丙诺啡。在一些情况下，所关注的BIA产物为去甲阿片，如去甲可待因、去甲羟考酮、去甲蒂巴因、去甲氢可酮、去甲二氢-可待因、去甲-14-羟基-可待因、去甲可待因酮、去甲-14-羟基-可待因酮、去甲吗啡、去甲羟吗啡酮、去甲东罂粟碱、去甲氢-吗啡酮、去甲二氢-吗啡、去甲-14-羟基-吗啡、去甲吗啡酮和去甲-14-羟基-吗啡酮。在一些情况下，BIA产物为双苄基异喹啉产物，如大叶小檗碱、蝙蝠葛新林碱、山豆根碱和莲心碱。

在一些情况下，系统包括用于监测和或分析由本发明宿主细胞产生的一种或多种所关注的酶和/或BIA化合物的工艺。举例来说，如本文所描述的LC-MS分析系统、色谱系统或可分析样品并且将其与标准品(例如，如本文所描述)进行比较的任何适宜系统。可在发酵之前和发酵期间的任何适宜时间通过取样和分析监测发酵培养基。当起始化合物向所关注的酶和/或BIA产物的转化完成时，可停止发酵并且可进行BIA产物的纯化。因此，在一些情况下，本发明系统包括适合于将所关注的酶和/或BIA产物从宿主细胞培养基中纯化的纯化组分，所述酶和/或BIA产物产生到所述宿主细胞培养基中。纯化组分可包括可用于纯化通过发酵产生的所关注的酶和/或BIA产物的任何适宜工艺，包括但不限于硅胶色谱、反相色谱、离子交换色谱、HIC色谱、尺寸排阻色谱、液体萃取和pH萃取方法。在一些情况下，在将一种或多种起始化合物输入到系统之后，本发明系统提供所关注的酶和/或BIA发酵产物的产生和分离。

提出以下实例以便向所属领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是以摄氏度计，且压力是大气压或接近大气压。

酶列表的讨论

宿主细胞可经工程化以包括提供所关注的BIA和/或所关注的酶的产生的一种或多种修饰(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多修饰)。表5提供示例性基因的列表，所述基因可通过一种或多种修饰而作用，以便提供工程化宿主细胞中所关注的BIA和/或所关注的酶的产生。

如表5中所提供的基因修饰可用于从工程化宿主细胞产生所关注的BIA，所述工程化宿主细胞供应有含有生长所需的最小营养物的培养基。此基本培养基可含有碳源、氮源、氨基酸、维生素和盐。举例来说，如表5中所提供的基因修饰可用于从馈入糖的工程化宿主细胞产生所关注的BIA。另外，如表5中所提供的一种或多种基因的修饰可用于增强可工程化用于药物生产的宿主细胞的生物合成过程。

另外，仅仅根据可由基因产生的酶的鉴别，并不显而易见这些修饰提供工程化宿主细胞中所关注的BIA和/或所关注的酶的产生的用途。特定来说，已在如本文所描述的宿主细胞，如酵母细胞中重建的合成途径包含在自然界中在单一生物体内不一起作用的多种酶。另外，本文所论述的酶中的一些在其天然情形下不作用于BIA生物合成。此外，本文所描述的酶中的一些未进化为在特定宿主细胞，如酵母细胞中起作用，并且未进化为一起起作用。在这些情况下，不会显而易见的是，酶将在宿主细胞，如酵母中的合成BIA途径情形下展现足够的活性，以具有通过所述途径的足够通量以产生下游BIA最终产物。

举例来说，植物酶通常难以在异源微生物宿主，如酵母中功能性表达。在许多情况下，酶可能错误折叠、未正确定位于宿主细胞内和/或不正确地加工。酵母与植物之间蛋白质翻译和加工的差异可导致这些酶在酵母宿主中展现显著降低至不可检测的活性。对于在BIA途径中有很强代表性的内膜定位酶，如细胞色素P450，通常会出现这些挑战。即使是降低的酶活性也可对工程化酵母产生复杂BIA造成很大挑战，这需要在每一步骤具有足够的活性以确保所需BIA产物的高水平积累。

另外，一些宿主细胞，如酵母中存在内源性酶/途径，其可作用于BIA途径中的许多早期前体(即，酪氨酸到去甲乌药碱的中间体)，且因此鉴于这些竞争性内源性途径，可能无法显而易见将存在通过异源途径实现大量BIA产生的足够通量。举例来说，酵母中的艾利希途径(Erlich pathway)(Hazelwood等人2008.《应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)》74:2259-66；Larroy等人2003.《化学生物学相互作用(Chem.Biol.Interact.)》143-144:229-38；Larroy等人2002.《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)》269:5738-45)是作用于将早期BIA途径的许多中间体转化为非所需产物并且从合成途径分流通量的主要内源性途径。

此外，如本文所论述并且如表5中所提供的许多酶可在天然植物宿主中极特定的调控策略，包括空间调控下起作用，所述调控策略可在转移到异源酵母宿主后损失。另外，植物呈现与酵母细胞非常不同的生物化学环境，酶在其下进化以起作用，所述生物化学环境包括pH、氧化还原状态和底物、辅助底物、辅酶和辅因子可用性。鉴于天然宿主与异源酵母宿主之间生物化学环境和调控策略中的差异，不会显而易见的是，酶在酵母环境的情形下时将展现很大活性，并且另外不会显而易见的是，其将一起作用以将简单前体，如糖导向复杂BIA化合物。维持酵母宿主中酶的活性尤其重要，因为许多途径具有许多反应步骤(>10)，因此如果这些步骤不有效，则不会期望所需下游产物的积累。

另外，在天然植物宿主中，这些途径中的相关代谢物可跨不同细胞和组织类型定位。在若干实例中，存在可特化用于生物合成的细胞类型和可合成用于代谢物积累的细胞类型。此类型细胞特化当在异源酵母宿主内表达途径时可损失，并且可能在控制这些代谢物对细胞的毒性中发挥重要作用。因此，不会显而易见的是，酵母可成功地工程化以生物合成且积累这些代谢物，而不受这些化合物的毒性损害。

作为一个实例，在天然植物宿主中，据报道酶BBE具有动态亚细胞定位。特定来说，酶BBE最初在ER中开始且随后分选到液泡(Bird和Facchini.2001.《植物学(Planta.)》213:888-97)。已提出植物中BBE的ER关联(Alcantara等人2005.《植物生理学(PlantPhysiol.)》138:173-83)为BBE活性提供最优碱性pH(pH约8.8)(Ziegler和Facchini.2008.《植物生物学年度评论(Annu.Rev.Plant Biol.)》59:735-69)。作为另一实例，有证据表明血根碱生物合成发生在植物细胞内的特化囊泡中(Amann等人1986.《植物学》167:310-20)，但中间体中仅有一些在囊泡中积累。这可能发生以便将其与其它酶活性和/或毒性作用隔离开。

作为另一实例，吗啡喃途径分支中的生物合成酶均定位于韧皮部，这是植物维管组织的一部分。在韧皮部中，途径酶可进一步在两种细胞类型之间划分：所有植物共有的筛分子，和作为仅存在于制造特化次级代谢物的某些植物中的特化细胞类型的乳汁管。上游酶(即，从NCS到SalAT)主要在筛分子中，并且下游酶(即，T6ODM、COR、CODM)大部分在乳汁管中(Onoyovwe等人2013.《植物细胞(Plant Cell.)》25:4110-22)。另外，发现诺斯卡品生物合成途径中的最终步骤发生在乳汁管中(Chen和Facchini.2014.《植物杂志(Plant J.)》77:173-84)。此区室化被认为对通过分离或运输中间体、提供最优pH、增强辅因子供应来调控生物合成非常重要，尽管罂粟乳汁管微环境的性质仍在研究中(Ziegler和Facchini.2008.《植物生物学年度评论》59:735-69)。此外，预测若干酶可充当植物次级代谢中常见的多酶复合物或代谢通道(Kempe等人2009.《植物化学(Phytochemistry.)》70:579-89；Allen等人2004.《自然·生物技术(Nat.Biotechnol.)》22:1559-66)。当生物合成酶从不同宿主组合和/或在异源酵母细胞中重组表达时，不清楚这些复合物或通道将与其在天然宿主中一样形成。在另一实例中，在日本黄连中，小檗碱在根组织中生物合成且随后经由特化ATP结合盒转运蛋白的作用在根茎内积累(Shitan等人2013.《植物化学》91:109-16)。在鸦片罂粟中，吗啡喃生物碱在乳胶(乳汁管细胞的细胞质)内积累(Martin等人1967.《生物化学(Biochemistry.)》6:2355-63)。

此外，即使没有这些考虑因素，本文所描述的途径的若干步骤的植物酶尚未被表征也是这种情况。举例来说，酪氨酸向早期苄基异喹啉生物碱支架去甲乌药碱的转化尚未被表征。因此，对于本文所描述的途径的若干步骤，通过将在自然界中通常不一起发生的酶活性放在一起以进行BIA的生物合成，或从基因组序列信息鉴别新酶活性以用于重建的途径来产生替代生物合成方案。

举例而言，酪氨酸向多巴胺的两步转化可通过将至少5种哺乳动物酶与1种细菌酶组合来实现，所述酶不天然共同存在且未进化以在此途径情形下或与植物酶一起发挥作用。在这些情况下，可能不显而易见的是利用这些酶来生物合成其在自然界中未进化以针对的化合物，以及其将在异源微生物宿主和此途径的情形下有效发挥作用。

作为另一实例，直到近几年，负责将(S)-牛心果碱转化为(R)-牛心果碱的酶才为人所知。即使当发现融合差向异构酶时，进化分析表明产生吗啡的罂粟在氧化酶与还原酶之间进化出融合酶用于差向异构酶反应，这与不产生吗啡的罂粟(其中差向异构酶为非融合的)形成对比。基于此分析，一些学者认为氧化酶和还原酶部分的融合为有效催化(S)-牛心果碱向(R)-牛心果碱的转化所必需。使用如本文所论述的工程化分裂差向异构酶的新颖方法可在酵母中且在合成BIA途径的情形下进行此差向异构反应，并且可比用野生型差向异构酶进行差向异构更高效地进行此差向异构。

下文论述作为修饰的目标以便产生所关注的BIA和/或所关注的酶的基因的实例。另外，在说明用于产生所关注的BIA和/或所关注的酶的途径的一系列图的上下文中论述基因。

[TKL1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶转酮醇酶的表达。转酮醇酶由TKL1基因编码。在一些实例中，转酮醇酶催化果糖-6-磷酸+甘油醛-3-磷酸

木酮糖-5-磷酸+赤藓糖-4-磷酸的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括TKL1基因在工程化宿主细胞中的组成型过度表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TKL1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TKL1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TKL1基因的强启动子元件的引入。TKL1基因可衍生自酿酒酵母或另一物种。

[ZWF1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶由ZWF1基因编码。在一些实例中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸→6-磷酸葡糖酸内酯的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以缺失工程化宿主细胞中ZWF1基因的编码区。可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以停用ZWF1基因的功能，如通过引入失活突变。

[ARO4]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶的表达。DAHP合酶由ARO4基因编码。在一些实例中，DAHP合酶催化赤藓糖-4-磷酸+磷酸烯醇丙酮酸→DAHP的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可修饰ARO4基因以并入一种或多种反馈抑制减轻突变。特定来说，反馈抑制减轻突变(例如ARO4^FBR)可作为原始基因座处天然ARO4基因的定向突变；作为被作为单独基因座处的基因整合引入的额外拷贝；或作为游离型载体，如2-μm或着丝粒质粒上的额外拷贝而并入。突变ARO4^FBR中的标识符“FBR”是指抗反馈突变体和突变。DAHP合酶的反馈抑制拷贝可处于天然酵母转录调控下，如当工程化宿主细胞为酵母细胞时。可替代地，DAHP合酶的反馈抑制拷贝可通过将其置于合成启动子的控制下而引入到工程化宿主细胞中，其中工程化组成型或动态调控蛋白质表达。在一些情况下，ARO4基因可衍生自酿酒酵母。ARO4基因的修饰的实例包括抗反馈抑制突变、K229L或Q166K。

[ARO7]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶分支酸变位酶的表达。分支酸变位酶由ARO7基因编码。在一些实例中，分支酸变位酶催化分支酸→预苯酸的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可修饰ARO7基因以并入一种或多种反馈抑制减轻突变。特定来说，反馈抑制减轻突变(例如ARO7^FBR)可作为原始基因座处天然ARO7基因的定向突变；作为被作为单独基因座处的基因整合引入的额外拷贝；或作为游离型载体，如2-μm或着丝粒质粒上的额外拷贝而并入。突变ARO7^FBR中的标识符“FBR”是指抗反馈突变体和突变。分支酸变位酶的反馈抑制拷贝可处于天然酵母转录调控下，如当工程化宿主细胞为酵母细胞时。可替代地，分支酸变位酶的反馈抑制拷贝可通过将其置于合成启动子的控制下而引入到工程化宿主细胞中，其中工程化组成型或动态调控蛋白质表达。在一些情况下，ARO7基因可衍生自酿酒酵母。ARO7基因的修饰的实例包括抗反馈抑制突变或T226I。

[ARO10]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶苯丙酮酸脱羧酶的表达。苯丙酮酸脱羧酶由ARO10基因编码。在一些实例中，苯丙酮酸脱羧酶催化羟基苯丙酮酸→4-羟基苯乙酸(4HPAA)的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括ARO10基因在工程化宿主细胞中的组成型过度表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控ARO10基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入ARO10基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达ARO10基因的强启动子元件的引入。ARO10基因可衍生自酿酒酵母或另一物种。

[ADH2-7,SFA1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰醇脱氢酶的表达。醇脱氢酶可由ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1基因中的一者或多者编码。在一些实例中，醇脱氢酶催化4HPA→酪醇的反应。工程化宿主细胞可经修饰以缺失工程化宿主细胞中ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1基因中的一者或多者的编码区。可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以停用ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1基因中的一者或多者的功能，如通过引入失活突变。

[ALD2-6]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰醛氧化酶的表达。醛氧化酶可由ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因中的一者或多者编码。在一些实例中，醛氧化酶催化4HPA→羟基苯乙酸的反应。工程化宿主细胞可经修饰以缺失工程化宿主细胞中ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因中的一者或多者的编码区。可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以停用ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因中的一者或多者的功能，如通过引入失活突变。

[AAD4],[AAD6],[AAD10]],[AAD14],[AAD15],[AAD16]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰芳基-醇脱氢酶的表达。芳基-醇脱氢酶可由AAD4、AAD6、AAD10、AAD14、AAD15和AAD16基因中的一者或多者编码。在一些实例中，芳基-醇脱氢酶催化芳香醛+NAD⁺→芳香醇+NADH的反应。

[ARI1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰醛还原酶的表达。醛还原酶可由ARI1基因编码。在一些实例中，醛还原酶催化芳香醛底物的还原。在一些实例中，醛还原酶催化脂肪醛底物的还原。在一些实例中，醛还原酶ARI1的底物为4-羟基苯乙醛(4-HPAA)。工程化宿主细胞可经修饰以缺失ARI的编码区。可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以在功能上停用ARI1，如通过引入失活突变。

[OPI]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰磷脂生物合成基因的转录调控因子的表达。转录调控因子可由OPI1基因编码。在一些实例中，转录调控因子抑制磷脂生物合成基因。工程化宿主细胞可经修饰以缺失OPI1的编码区。可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以在功能上停用OPI1，如通过引入失活突变。

[ARO9]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶芳香族氨基转移酶的表达。芳香族氨基转移酶由ARO9基因编码。在一些实例中，芳香族氨基转移酶催化羟基苯丙酮酸+L-丙氨酸

酪氨酸+丙酮酸的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括ARO9基因在工程化宿主细胞中的组成型过度表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控ARO9基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入ARO9基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达ARO9基因的强启动子元件的引入。ARO9基因可衍生自酿酒酵母或另一物种。

[ARO8]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶芳香族氨基转移酶的表达。芳香族氨基转移酶由ARO8基因编码。在一些实例中，芳香族氨基转移酶催化羟基苯丙酮酸+谷氨酸

酪氨酸+α-酮戊二酸的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括ARO8基因在工程化宿主细胞中的组成型过度表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控ARO8基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入ARO8基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达ARO8基因的强启动子元件的引入。ARO8基因可衍生自酿酒酵母或另一物种。

[TYR1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶预苯酸脱氢酶的表达。预苯酸脱氢酶由TYR1基因编码。在一些实例中，预苯酸脱氢酶催化预苯酸+NADP⁺→4-羟基苯丙酮酸+CO₂+NADPH的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括TYR1基因在工程化宿主细胞中的组成型过度表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TYR1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TYR1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TYR1基因的强启动子元件的引入。TYR1基因可衍生自酿酒酵母或另一物种。

[TYR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶酪氨酸酶的表达。酪氨酸酶由TYR基因编码。在一些实例中，酪氨酸酶催化酪氨酸→L-DOPA的反应，如图1和2中所提及。在其它实例中，酪氨酸酶催化L-DOPA→多巴醌的反应。工程化宿主细胞可经修饰以包括TYR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TYR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TYR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TYR基因的强启动子元件的引入。TYR基因可衍生自青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或另一物种。

[TyrH]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶酪氨酸羟化酶的表达。酪氨酸羟化酶由TyrH基因编码。在一些实例中，酪氨酸羟化酶催化酪氨酸→L-DOPA的反应，如图1和2中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括TyrH基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TyrH基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TyrH基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TyrH基因的强启动子元件的引入。TyrH基因可衍生自智人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小家鼠(Mus musculus)或另一物种。

[DODC]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶L-DOPA脱羧酶的表达。L-DOPA脱羧酶由DODC基因编码。在一些实例中，L-DOPA脱羧酶催化L-DOPA→多巴胺的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括DODC基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控DODC基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入DODC基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达DODC基因的强启动子元件的引入。DODC基因可衍生自恶臭假单胞菌、褐家鼠或另一物种。

[TYDC]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶酪氨酸/DOPA脱羧酶的表达。酪氨酸/DOPA脱羧酶由TYDC基因编码。在一些实例中，酪氨酸/DOPA脱羧酶催化L-DOPA→多巴胺的反应，如图3中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括TYDC基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TYDC基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TYDC基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TYDC基因的强启动子元件的引入。TYDC基因可衍生自罂粟或另一物种。

[MAO]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶单胺氧化酶的表达。单胺氧化酶由MAO基因编码。在一些实例中，单胺氧化酶催化多巴胺→3,4-DHPA的反应，如图1和3中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括MAO基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控MAO基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入MAO基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达MAO基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，MAO基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。MAO基因可衍生自大肠杆菌、智人、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)或另一物种。

[NCS]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶去甲乌药碱合酶的表达。去甲乌药碱合酶由NCS基因编码。在一些实例中，去甲乌药碱合酶催化4HPA+多巴胺→(S)-去甲乌药碱的反应，如图1和3中所提及。特定来说，图1说明根据本发明的一些实施例，经由去甲乌药碱将L-酪氨酸转化为牛心果碱的生物合成方案。图1提供以下的用途：酶TyrH，酪氨酸羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；NCS，去甲乌药碱合酶，如本文所论述；6OMT，6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；CYP80B1，细胞色素P450 80B1；CPR，细胞色素P450 NADPH还原酶；4'OMT，3'羟基-N-甲基乌药碱4'-O-甲基转移酶；L-DOPA，L-3,4-二羟基丙苯氨酸；以及4-HPAA，4-羟基苯乙醛。在图1中说明的酶中，4-HPAA和L-酪氨酸在酵母中天然合成。所有其它列出的代谢物不在酵母中天然产生。另外，尽管TyrH可催化L-酪氨酸向L-DOPA的转化，但其它酶也可用于进行此步骤，如说明书中所描述。举例来说，酪氨酸酶也可用于进行L-酪氨酸向L-DOPA的转化。另外，其它酶，如细胞色素P450氧化酶也可用于进行L-酪氨酸向L-DOPA的转化。此类酶可展现对相关BIA前体化合物，包括L-DOPA和L-酪氨酸的氧化酶活性。

另外，去甲乌药碱合酶催化3,4-DHPAA+多巴胺→(S)-去甲劳丹碱的反应，如图1和3中所提及。特定来说，图3说明根据本发明的一些实施例，经由和去甲劳丹碱将L-酪氨酸转化为牛心果碱的生物合成方案。图3提供以下的用途：酶TyrH，酪氨酸羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；maoA，单胺氧化酶；NCS，去甲乌药碱合酶；6OMT，6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；4'OMT，3'羟基-N-甲基乌药碱4'-O-甲基转移酶；L-DOPA，L-3,4-二羟基丙苯氨酸；以及3,4-DHPAA，3,4-二羟基苯乙醛。在图3中说明的酶中，L-酪氨酸在酵母中天然合成。

工程化宿主细胞可经修饰以包括NCS基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控NCS基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入NCS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达NCS基因的强启动子元件的引入。另外，去甲乌药碱合酶可具有N末端截短。在一些情况下，NCS基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。NCS基因可衍生自日本黄连、罂粟、大红罂粟、黄唐松草、石生黄堇(Corydalis saxicola)或另一物种。

[6OMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶去甲乌药碱6-O-甲基转移酶的表达。去甲乌药碱6-O-甲基转移酶由6OMT基因编码。在一些实例中，去甲乌药碱6-O-甲基转移酶催化去甲乌药碱→乌药碱的反应，如图1中所提及。在其它实例中，去甲乌药碱6-O-甲基转移酶催化去甲劳丹碱→3'-羟基乌药碱的反应，以及本文中详述的其它反应，如图3中所提供的那些。另外，工程化宿主细胞可经修饰以包括6OMT基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控6OMT基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入6OMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达6OMT基因的强启动子元件的引入。6OMT基因可衍生自罂粟、黄唐松草、日本黄连或另一物种。

[CNMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶乌药碱-N-甲基转移酶的表达。乌药碱-N-甲基转移酶由CNMT基因编码。在一些实例中，乌药碱-N-甲基转移酶催化乌药碱→N-甲基乌药碱的反应，如图1中所提及。在其它实例中，乌药碱-N-甲基转移酶可催化3'-羟基乌药碱→3'羟基-N-甲基乌药碱的反应。在其它实例中，乌药碱-N-甲基转移酶可催化本文中详述的其它反应，如图3中所提供的那些。另外，工程化宿主细胞可经修饰以包括CNMT基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CNMT基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CNMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CNMT基因的强启动子元件的引入。CNMT基因可衍生自罂粟、黄唐松草、日本黄连或另一物种。

[4'OMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶4'-O-甲基转移酶的表达。4'-O-甲基转移酶由4'OMT基因编码。在一些实例中，4'-O-甲基转移酶催化3'-羟基-N-甲基乌药碱→牛心果碱的反应，如图1中所提及。在其它实例中，4′-O-甲基转移酶催化本文中详述的其它反应，如图3中所提供的那些。另外，工程化宿主细胞可经修饰以包括4'OMT基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控4′OMT基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入4′OMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达4′OMT基因的强启动子元件的引入。4′OMT基因可衍生自罂粟、黄唐松草、日本黄连或另一物种。

[CYP80B1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶细胞色素P450 80B1的表达。细胞色素P450 80B1由CYP80B1基因编码。在一些实例中，细胞色素P450 80B1催化N-甲基乌药碱→3'-羟基-N-甲基乌药碱的反应，如图1中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括细胞色素P450 80B1基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控细胞色素P450 80B1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入细胞色素P450 80B1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达细胞色素P450 80B1基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP80B1基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。细胞色素P450 80B1基因可衍生自罂粟、花菱草、黄唐松草或另一物种。

[FOL2]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶GTP环化水解酶的表达。GTP环化水解酶由FOL2基因编码。在一些实例中，GTP环化水解酶催化GTP→二氢新蝶呤三磷酸的反应，如图2中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括FOL2基因在工程化宿主细胞中的组成型过度表达。工程化宿主细胞还可经修饰以包括天然调控。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控FOL2基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入FOL2基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达FOL2基因的强启动子元件的引入。FOL2基因可衍生自酿酒酵母、智人、小家鼠或另一物种。

[PTPS]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶6-丙酮酰基四氢生物蝶呤(PTP)合酶的表达。丙酮酰基四氢生物蝶呤合酶由PTPS基因编码。在一些实例中，6-丙酮酰基四氢生物蝶呤合酶催化二氢新蝶呤三磷酸→PTP的反应，如图2中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括PTPS基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控PTPS基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入PTPS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达PTPS基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，PTPS基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。PTPS基因可衍生自褐家鼠、智人、小家鼠或另一物种。

[SepR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶墨蝶呤还原酶的表达。墨蝶呤还原酶由SepR基因编码。在一些实例中，墨蝶呤还原酶催化PTP→BH₄的反应，如图2中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括SepR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控SepR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入SepR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达SepR基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，SepR基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。SepR基因可衍生自褐家鼠、智人、小家鼠或另一物种。

[PCD]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶4a-羟基四氢生物蝶呤(蝶呤-4α-甲醇胺)脱水酶的表达。4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶由PCD基因编码。在一些实例中，4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶催化4a-羟基四氢生物蝶呤→H₂O+醌型二氢蝶啶的反应，如图2中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括PCD基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控PCD基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入PCD基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达PCD基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，PCD基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。PCD基因可衍生自褐家鼠、智人、小家鼠或另一物种。

[QDHPR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶醌型二氢蝶啶还原酶的表达。醌型二氢蝶啶还原酶由QDHPR基因编码。在一些实例中，醌型二氢蝶啶还原酶催化醌型二氢蝶啶→BH₄的反应，如图2中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括QDHPR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控QDHPR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入QDHPR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达QDHPR基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，QDHPR基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。QDHPR基因可衍生自褐家鼠、智人、小家鼠或另一物种。

[DHFR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶二氢叶酸还原酶的表达。二氢叶酸还原酶由DHFR基因编码。在一些实例中，二氢叶酸还原酶催化7,8-二氢生物蝶呤(BH₂)→5,6,7,8-四氢生物蝶呤(BH₄)的反应，如图2中所提及。此反应可适用于回收BH₄作为将酪氨酸转化为L-DOPA的辅助底物，如图2中所说明。工程化宿主细胞可经修饰以包括DHFR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控DHFR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入DHFR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达DHFR基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，DHFR基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。DHFR基因可衍生自褐家鼠、智人或另一物种。

[DRS-DRR]如上文关于差向异构化1-BIA所论述，工程化宿主细胞可修饰BIA差向异构酶的表达。BIA差向异构酶由DRS-DRR基因编码。在一些实例中，DRS-DRR也可称为CYP-COR。在一些实例中，BIA差向异构酶的工程化分裂形式或工程化融合形式催化(S)-1-BIA→(R)-1-BIA的转化，如图4中所提及。特定来说，图4说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为吗啡喃生物碱的生物合成方案。图4提供以下的用途：酶CPR，细胞色素P450还原酶；DRS-DRR，脱氢牛心果碱合酶和脱氢牛心果碱还原酶；SalSyn，沙罗泰里啶合酶；SalR，沙罗泰里啶还原酶；SalAT，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶；T6ODM，蒂巴因6-O-脱甲基酶；COR，可待因酮还原酶；以及CODM，可待因-O-脱甲基酶。

工程化宿主细胞可经修饰以包括工程化DRS-DRR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。在一些情况下，工程化DRS-DRR基因可编码工程化融合差向异构酶。在一些实施例中，工程化DRS-DRR基因可编码工程化分裂差向异构酶。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控DRS-DRR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入DRS-DRR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达DRS-DRR基因的强启动子元件的引入。DRS-DRR基因可衍生自大红罂粟、罂粟、刚毛罂粟、白屈菜或另一物种。

[CPR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶细胞色素P450还原酶的表达。细胞色素P450还原酶由CPR基因编码。在一些实例中，细胞色素P450还原酶催化(R)-牛心果碱→沙罗泰里啶的反应，如图4中所提及。另外，细胞色素P450还原酶催化其它反应，如在整个本申请中的图中所描述的那些。工程化宿主细胞可经修饰以包括CPR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CPR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CPR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CPR基因的强启动子元件的引入。CPR基因可衍生自花菱草、罂粟、智人、酿酒酵母、拟南芥或另一物种。

[SalSyn]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶沙罗泰里啶合酶的表达。沙罗泰里啶合酶由SalSyn基因编码。在一些实例中，沙罗泰里啶合酶催化(R)-牛心果碱→沙罗泰里啶的反应，如图4中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括SalSyn基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控SalSyn基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入SalSyn基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达SalSyn基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，SalSyn基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。在一些实例中，SalSyn可在N末端处经修饰。SalSyn基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、白屈菜或另一物种。

[SalR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶沙罗泰里啶还原酶的表达。沙罗泰里啶还原酶由SalR基因编码。在一些实例中，沙罗泰里啶还原酶可逆催化沙罗泰里啶醇→沙罗泰里啶的反应，如图4中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括SalR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控SalR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入SalR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达SalR基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，SalR基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。SalR基因可衍生自罂粟、大红罂粟、罂粟属物种、白屈菜或另一物种。

[SalAT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶乙酰辅酶A:沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶的表达。乙酰辅酶A:沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶由SalAT基因编码。在一些实例中，乙酰辅酶A:沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶催化乙酰辅酶A+沙罗泰里啶醇→辅酶A+7-O-乙酰基沙罗泰里啶醇的反应，如图4中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括SalAT基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控SalAT基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入SalAT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达SalAT基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，SalAT基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。SalAT基因可衍生自罂粟、大红罂粟、鬼罂粟、罂粟属物种或另一物种。

[TS]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶蒂巴因合酶的表达。蒂巴因合酶由TS基因编码。在一些实例中，蒂巴因合酶或工程化蒂巴因合酶催化7-O-乙酰基沙罗泰里啶醇→蒂巴因+乙酸的反应，如图4中所提及。在一些实例中，7-O-乙酰基沙罗泰里啶醇→蒂巴因+乙酸的反应自发发生，但蒂巴因合酶催化此反应的某一部分。特定来说，图4说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为吗啡喃生物碱的生物合成方案。图4提供以下的用途：酶CPR，细胞色素P450还原酶；DRS-DRR，脱氢牛心果碱合酶和脱氢牛心果碱还原酶；SalSyn，沙罗泰里啶合酶；SalR，沙罗泰里啶还原酶；SalAT，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶；TS，蒂巴因合酶；T6ODM，蒂巴因6-O-脱甲基酶；COR，可待因酮还原酶；以及CODM，可待因-O-脱甲基酶。

工程化宿主细胞可经修饰以包括TS基因或工程化TS基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。在一些情况下，工程化TS基因可编码工程化融合酶。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TS基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TS基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，TS基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。TS基因可衍生自罂粟、大红罂粟、鬼罂粟、罂粟属物种或另一物种。

[T6ODM]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶蒂巴因6-O-脱甲基酶的表达。蒂巴因6-O-脱甲基酶由T6ODM基因编码。在一些实例中，蒂巴因6-O-脱甲基酶催化蒂巴因→尼奥品酮的反应，如图4中所提及。一旦已产生尼奥品酮，则可将尼奥品酮转化为可待因酮。尼奥品酮→可待因酮的转化可自发发生。可替代地，尼奥品酮→可待因酮的转化可由于催化反应而发生。在其它实例中，T6ODM酶可催化除蒂巴因以外的底物的O-去甲基化。举例来说，T6ODM可使东罂粟碱O-去甲基化以产生吗啡酮。可替代地，T6ODM可催化1-苄基异喹啉、原小檗碱或原阿片碱类别(分别如罂粟碱、坎那定和别隐品碱)内的BIA的O-去甲基化。工程化宿主细胞可经修饰以包括T6ODM基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控T6ODM基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入T6ODM基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达T6ODM基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，T6ODM基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。T6ODM基因可衍生自罂粟或另一物种。

[NPI]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶尼奥品酮异构酶的表达。尼奥品酮异构酶由NPI基因编码。在一些实例中，尼奥品酮异构酶或工程化尼奥品酮异构酶催化尼奥品酮→可待因酮的反应，如图4中所提及。在一些实例中，尼奥品酮→可待因酮的反应自发发生，但尼奥品酮异构酶催化此反应的某一部分。特定来说，图4说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为吗啡喃生物碱的生物合成方案。图4提供以下的用途：酶CPR，细胞色素P450还原酶；DRS-DRR，脱氢牛心果碱合酶和脱氢牛心果碱还原酶；SalSyn，沙罗泰里啶合酶；SalR，沙罗泰里啶还原酶；SalAT，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰基转移酶；TS，蒂巴因合酶；T6ODM，蒂巴因6-O-脱甲基酶；NPI，尼奥品酮异构酶；COR，可待因酮还原酶；以及CODM，可待因-O-脱甲基酶。

工程化宿主细胞可经修饰以包括NPI基因或工程化NPI基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。在一些情况下，工程化NPI基因可编码工程化融合酶。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控NPI基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入NPI基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达NPI基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，NPI基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。NPI基因可衍生自罂粟、大红罂粟、鬼罂粟、罂粟属物种或另一物种。

[COR]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶可待因酮还原酶的表达。可待因酮还原酶由COR基因编码。在一些实例中，可待因酮还原酶催化可待因酮向可待因的反应，如图4中所提及。在一些情况下，可待因酮还原酶可催化尼奥品酮向尼奥品的反应。在其它实例中，COR可催化其它吗啡喃的还原，包括氢可酮→二氢可待因、14-羟基可待因酮→14-羟基可待因和氢吗啡酮→二氢吗啡。工程化宿主细胞可经修饰以包括COR基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控COR基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入COR基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达COR基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，COR基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。另外或可替代地，COR基因可添加针对线粒体、液泡、内质网或其组合的靶向序列进行修饰。COR基因可衍生自罂粟或另一物种。

[CODM]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶可待因O-脱甲基酶的表达。可待因O-脱甲基酶由CODM基因编码。在一些实例中，可待因O-脱甲基酶催化可待因向吗啡的反应，如图4中所提及。可待因O-脱甲基酶还可催化尼奥品向尼奥吗啡的反应。可待因O-脱甲基酶还可催化蒂巴因向东罂粟碱的反应。在其它实例中，CODM可催化1-苄基异喹啉、阿朴啡和原小檗碱类别(分别如牛心果碱、异紫堇定(isocorydine)和斯氏紫堇碱)内的BIA的O-去甲基化。在其它实例中，CODM酶可催化O,O-去亚甲基化反应以裂解原阿片碱中的亚甲二氧基桥结构。工程化宿主细胞可经修饰以包括CODM基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CODM基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CODM基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CODM基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CODM基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。另外或可替代地，CODM基因可添加针对线粒体的靶向序列进行修饰。CODM基因可衍生自罂粟、罂粟属物种或另一物种。

[BBE]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶小檗碱桥酶的表达。小檗碱桥酶由BBE基因编码。在一些实例中，小檗碱桥酶催化(S)-牛心果碱→(S)-斯氏紫堇碱的反应，如图9中所提及。图9说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为原小檗碱生物碱的生物合成方案。特定来说，图9提供以下的用途：酶BBE，小檗碱桥酶；S9OMT，斯氏紫堇碱9-O-甲基转移酶；CAS，坎那定合酶；CPR，细胞色素P450还原酶；以及STOX，四氢原小檗碱氧化酶。工程化宿主细胞可经修饰以包括BBE基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控BBE基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入BBE基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达BBE基因的强启动子元件的引入。BBE基因可衍生自罂粟、蓟罂粟、花菱草、匍匐小檗、黄花唐松草(Thalictrumflavum subsp.glaucum)、日本黄连、罂粟属物种或另一物种。

[CYP2D6]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰细胞色素P450家族2亚家族D多肽6的表达。此特定细胞色素P450由CYP2D6基因编码。此特定细胞色素P450酶可表征为混杂氧化酶。在一些实例中，此特定细胞色素P450酶可催化(R)-牛心果碱+NADPH+H⁺+O₂→沙罗泰里啶+NADP⁺+2H₂O的反应，以及其它反应。

[S9OMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-斯氏紫堇碱9-O-甲基转移酶的表达。S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-斯氏紫堇碱9-O-甲基转移酶由S9OMT基因编码。在一些实例中，S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-斯氏紫堇碱9-O-甲基转移酶催化S-腺苷-L-甲硫氨酸+(S)-斯氏紫堇碱→S-腺苷-L-高半胱氨酸+(S)-四氢非洲防己碱的反应，如图9中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括S9OMT基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控S9OMT基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入S9OMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达S9OMT基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，S9OMT基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。S9OMT基因可衍生自黄花唐松草、日本黄连、黄连、罂粟、唐松草属物种、黄连属物种、罂粟属物种或另一物种。在一些实例中，S9OMT基因可与天然存在的基因100％相似。

[CAS]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶(S)-坎那定合酶的表达。(S)-坎那定合酶由CAS基因编码。在一些实例中，(S)-坎那定合酶催化(S)-四氢非洲防己碱→(S)-坎那定的反应，如图9中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以在工程化宿主细胞中表达CAS基因。工程化宿主细胞可经修饰以包括CAS基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CAS基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CAS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CAS基因的强启动子元件的引入。CAS基因可衍生自黄花唐松草、日本黄连、唐松草属物种、黄连属物种或另一物种。

[STOX]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶(S)-四氢原小檗碱氧化酶的表达。(S)-四氢原小檗碱氧化酶由STOX基因编码。在一些实例中，(S)-四氢原小檗碱氧化酶催化(S)-四氢小檗碱+2 O₂→小檗碱+2 H₂O₂的反应，如图9中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括STOX基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控STOX基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入STOX基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达STOX基因的强启动子元件的引入。在一些实例中，STOX可在N末端处经修饰。在一些情况下，STOX基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。STOX基因可衍生自金花小檗、日本黄连、小檗属物种、黄连属物种或另一物种。

[TNMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶四氢原小檗碱-N-甲基转移酶的表达。四氢原小檗碱-N-甲基转移酶由TNMT基因编码。在一些实例中，四氢原小檗碱-N-甲基转移酶催化坎那定→N-甲基坎那定的反应，如图7中所提及。图7说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为诺斯卡品、诺斯卡品类(noscapinoid)和苯酞异喹啉的生物合成方案。特定来说，图7提供以下的用途：酶BBE，小檗碱桥酶；S9OMT，斯氏紫堇碱9-O-甲基转移酶；CAS，坎那定合酶；CPR，细胞色素P450还原酶；TNMT，四氢原小檗碱顺-N-甲基转移酶；CYP82Y1，N-甲基坎那定1-羟化酶；CYP82X2，1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶；AT1，1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O-乙酰基转移酶；CYP82X1，4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶；CXE1，那可汀半缩醛合酶；NOS(或SDR1)，诺斯卡品合酶；MT2，罂粟壳碱-4'-O-甲基转移酶1；MT3，罂粟壳碱-4'-O-甲基转移酶2；以及6OMT，6-O-甲基转移酶。

在其它实例中，四氢原小檗碱-N-甲基转移酶催化人血草碱→顺-N-甲基人血草碱的反应，如图8中所提及。图8说明根据本发明的一些实施例，将L-酪氨酸转化为血根碱和苯并菲啶生物碱的生物合成方案。特定来说，图8提供以下的用途：酶BBE，小檗碱桥酶；CFS，华紫堇碱合酶；STS，人血草碱合酶；TNMT，四氢小檗碱N-甲基转移酶；MSH，顺-N-甲基人血草碱14-羟化酶；P6H，原阿片碱6-羟化酶；以及DBOX，二氢苯并菲啶氧化酶。工程化宿主细胞可经修饰以包括TNMT基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控TNMT基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入TNMT基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达TNMT基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，TNMT基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。TNMT基因可衍生自罂粟、花菱草、大红罂粟、蓟罂粟或另一物种。

[CYP82Y1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶N-甲基坎那定1-羟化酶的表达。N-甲基坎那定1-羟化酶由CYP82Y1基因编码。在一些实例中，N-甲基坎那定1-羟化酶催化N-甲基坎那定→1-羟基-N-甲基坎那定的反应，如图7中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括CYP82Y1基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CYP82Y1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CYP82Y1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CYP82Y1基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP82Y1基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82Y1可在N末端处经修饰。CYP82Y1基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、对叶车前(Plantago arenaria)、异叶萝芙木(Rauwolfia heterophylla)、北美荷包藤(Adlumiafungosa)、金印草(Hydrastis canadensis)、异叶罂粟(Stylomecon heterophylla)、角茴香属(Hypecoum)或另一物种。

[CYP82X2]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶的表达。1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶由CYP82X2基因编码。在一些实例中，1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶催化1-羟基-N-甲基坎那定→1-羟基-N-甲基蛇果黄堇碱(即1,13-二羟基-N-甲基坎那定)的反应，如图7中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括CYP82X2基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CYP82X2基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CYP82X2基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CYP82X2基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP82X2基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82X2可在N末端处经修饰。CYP82X2基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、对叶车前、异叶萝芙木、北美荷包藤、金印草、异叶罂粟、扭果紫金龙(Dactylicapnos torulosa)、黄花海罂粟(Glauciumflavum)、月桂小檗(Berberis laurina)、欧洲小檗(B.Vulgaris)、紫堇属物种、烟堇属(Fumaria)物种、紫金龙属物种或另一物种。在一些实例中，CYP82X2基因可经历N末端工程化。在一些实例中，N末端工程化可包括N末端截短。

[CYP82X1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶的表达。4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶由CYP82X1基因编码。在一些实例中，4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶催化1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那定→4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛的反应，如图7中所提及。另外，CYP82X1催化1-羟基-N-甲基坎那定→4'-O-去甲基马克兰特醛的反应。工程化宿主细胞可经修饰以包括CYP82X1基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CYP82X1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CYP82X1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CYP82X1基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP82X1基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82X1可在N末端处经修饰。CYP82X1基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、对叶车前、异叶萝芙木、北美荷包藤、金印草、异叶罂粟、角茴香属或另一物种。在其它实例中，CYP82X1基因可经历N末端工程化。在一些实例中，N末端工程化可包括N末端截短。

[CFS]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶华紫堇碱合酶的表达。华紫堇碱合酶由CFS基因编码。在一些实例中，华紫堇碱合酶催化斯氏紫堇碱→华紫堇碱的反应，如图8中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括CFS基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CFS基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CFS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CFS基因的强启动子元件的引入。CFS基因可衍生自罂粟、花菱草、蓟罂粟或另一物种。

[STS]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶人血草碱合酶的表达。人血草碱合酶由STS基因编码。在一些实例中，人血草碱合酶催化华紫堇碱→人血草碱的反应以及其它反应，如图8中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括STS基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控STS基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入STS基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达STS基因的强启动子元件的引入。STS基因可衍生自罂粟、花菱草、蓟罂粟或另一物种。

[MSH]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶顺-N-甲基人血草碱14-羟化酶的表达。顺-N-甲基人血草碱14-羟化酶由MSH基因编码。在一些实例中，顺-N-甲基人血草碱14-羟化酶催化顺-N-甲基人血草碱→原阿片碱的反应，如图8中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括MSH基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控MSH基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入MSH基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达MSH基因的强启动子元件的引入。MSH基因可衍生自罂粟或另一物种。

[P6H]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶原阿片碱-6-羟化酶的表达。原阿片碱-6-羟化酶由P6H基因编码。在一些实例中，原阿片碱-6-羟化酶催化原阿片碱→6-羟基原阿片碱的反应，如图8中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括P6H基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控P6H基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入P6H基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CFS基因的强启动子元件的引入。P6H基因可衍生自罂粟、花菱草或另一物种。

[DBOX]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶二氢苯并菲啶氧化酶的表达。二氢苯并菲啶氧化酶由DBOX基因编码。在一些实例中，二氢苯并菲啶氧化酶催化二氢血根碱→血根碱的反应，如图8中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括DBOX基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控DBOX基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入DBOX基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达DBOX基因的强启动子元件的引入。DBOX基因可衍生自罂粟或另一物种。

[AT1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰基转移酶的表达。1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰基转移酶由AT1基因编码。在一些实例中，1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰基转移酶催化1,13-二羟基-N-甲基坎那定→1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那定的反应，如图7中所提及。图7说明根据本发明的一些实施例，将坎那定转化为诺斯卡品的生物合成方案。工程化宿主细胞可经修饰以包括AT1基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控AT1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入AT1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达AT1基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，AT1基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。AT1基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、对叶车前、异叶萝芙木、北美荷包藤、金印草、异叶罂粟、细果角茴香(Hypecoum leptocarpum)、扭果紫金龙、黄花海罂粟、月桂小檗、欧洲小檗、紫堇属物种、烟堇属物种、紫金龙属物种或另一物种。

[CXE1或CXE2]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶那可汀半缩醛合酶的表达。那可汀半缩醛合酶由CXE1基因编码。由CXE2基因编码的酶也可充当那可汀半缩醛合酶。在一些实例中，那可汀半缩醛合酶催化4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛→罂粟壳碱半缩醛和3-O-乙酰基罂粟奥辛→那可汀半缩醛的反应，如图7中所提及。工程化宿主细胞可经修饰以包括CXE1或CXE2基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CXE1或CXE2基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CXE1或CXE2基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CXE1或CXE2基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CXE1或CXE2基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。CXE1或CXE2基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、对叶车前、异叶萝芙木、北美荷包藤、金印草、异叶罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、黄花海罂粟、月桂小檗、欧洲小檗、紫堇属物种、烟堇属物种、紫金龙属物种或另一物种。

[SDR1]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶诺斯卡品合酶的表达。诺斯卡品合酶由SDR1基因编码。在一些实例中，诺斯卡品合酶催化罂粟壳碱半缩醛→罂粟壳碱的反应，如图7中所提及。另外，诺斯卡品合酶催化那可汀半缩醛→诺斯卡品的反应。工程化宿主细胞可经修饰以包括SDR1基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控SDR1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入SDR1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达SDR1基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，SDR1基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。SDR1基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、对叶车前、异叶萝芙木、北美荷包藤、金印草、异叶罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、黄花海罂粟、月桂小檗、欧洲小檗、紫堇属物种、烟堇属物种、紫金龙属物种或另一物种。

[MT2和MT3]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶罂粟壳碱4'-O-甲基化酶的表达。罂粟壳碱4'-O-甲基化酶是通过由MT2和MT3基因编码的O-甲基转移酶单体形成的异二聚体。在一些实例中，罂粟壳碱4'-O-甲基化酶催化罂粟壳碱→诺斯卡品的反应，如图7中所提及。另外，罂粟壳碱4'-O-甲基化酶催化罂粟壳碱半缩醛→那可汀半缩醛和4'-O-去甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛→3-O-乙酰基罂粟奥辛的反应。工程化宿主细胞可经修饰以包括MT2和MT3基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控MT2和MT3基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入MT2和MT3基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达MT2和MT3基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，MT2和MT3基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。MT2和MT3基因可衍生自罂粟、罂粟属物种、小花烟堇(Fumaria parviflora)、对叶车前、异叶萝芙木或另一物种。

[morA]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶吗啡脱氢酶的表达。吗啡脱氢酶由morA基因编码。在一些实例中，吗啡脱氢酶催化吗啡→吗啡酮的反应，如图4中所提及。在其它实例中，吗啡脱氢酶催化可待因酮→可待因的反应，也如图4中所提及。图4说明根据本发明的一些实施例，用于产生半合成阿片类的生物合成方案。特定来说，图4说明通过并入morA，吗啡脱氢酶；和morB，吗啡还原酶，酵母中蒂巴因的扩展转化。

工程化宿主细胞可经修饰以包括morA基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控morA基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入morA基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达morA基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，morA基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。morA基因可衍生自恶臭假单胞菌或另一物种。

[morB]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶吗啡酮还原酶的表达。吗啡酮还原酶由morB基因编码。在一些实例中，吗啡酮还原酶催化可待因酮→氢可酮的反应，如图4中所提及。在其它实例中，吗啡酮还原酶催化吗啡酮→氢吗啡酮的反应，也如图4中所提及。在其它实例中，吗啡酮还原酶催化14-羟基可待因酮→羟考酮的反应。工程化宿主细胞可经修饰以包括morB基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控morB基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入morB基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达morB基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，morB基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。morB基因可衍生自恶臭假单胞菌或另一物种。

[CYP80A1]在一些实例中，工程化宿主细胞可表达酶大叶小檗碱合酶。大叶小檗碱合酶由细胞色素P450酶80A1(CYP80A1)的基因编码。在一些实例中，CYP80A1催化(S)-N-甲基乌药碱+(R)-N-甲基乌药碱→大叶小檗碱的反应，如图10中所提及。在其它实例中，CYP80A1催化(R)-N-甲基乌药碱+(R)-N-甲基乌药碱→蝙蝠葛新林碱的反应，如图10中所提及。在其它实例中，CYP80A1催化(R)-N-甲基乌药碱+(S)-乌药碱→2'去甲大叶小檗碱的反应。工程化宿主细胞可经修饰以包括CYP80A1基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控CYP80A1基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入CYP80A1基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达CYP80A1基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP80A1基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。CYP80A1基因可衍生自匍匐小檗或另一物种。

[PODA]在一些实例中，工程化宿主细胞可表达酶原阿片碱O-脱烷基酶。原阿片碱O-脱烷基酶由基因PODA编码。在一些实例中，PODA催化原小檗碱和原阿片碱，如坎那定、人血草碱、小檗碱、隐品碱、别隐品碱和原阿片碱的O,O-去甲基化。在一些实例中，PODA催化BIA，包括四氢罂粟碱、四氢巴马亭和隐品碱的O-去甲基化。工程化宿主细胞可经修饰以包括PODA基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控PODA基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入PODA基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达PODA基因的强启动子元件的引入。在一些情况下，PODA基因可经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。PODA基因可衍生自罂粟或其它物种。

[RNMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶牛心果碱N-甲基转移酶的表达。牛心果碱N-甲基转移酶由RNMT基因编码。在一些实例中，牛心果碱N-甲基转移酶可催化如牛心果碱→藤泊它碱(tembetarine)的反应以及其它反应。

[P7OMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶罂粟碱7-O-脱甲基酶的表达。罂粟碱7-O-脱甲基酶由P70MT基因编码。在一些实例中，罂粟碱7-O-脱甲基酶可催化如罂粟碱→帕可定(pacodine)的反应以及其它反应。

[3ODM]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶3-O-脱甲基酶的表达。3-O-脱甲基酶由3ODM基因编码。在一些实例中，3-O-脱甲基酶可催化如羟考酮→羟吗啡酮；氢可酮→氢吗啡酮；二氢可待因→二氢吗啡；14-羟基可待因→14-羟基吗啡；可待因酮→吗啡酮；和14-羟基可待因酮→14-羟基吗啡酮的反应，以及其它反应。

[NDM]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶N-脱甲基酶的表达。N-脱甲基酶由NDM基因编码。在一些实例中，N-脱甲基酶可催化如可待因→去甲可待因；吗啡→去甲吗啡；羟考酮→去甲羟考酮；羟吗啡酮→去甲羟吗啡酮；蒂巴因→去甲蒂巴因；东罂粟碱→去甲东罂粟碱；氢可酮→去甲氢可酮；氢吗啡酮→去甲氢吗啡酮；二氢可待因→去甲二氢可待因；二氢吗啡→去甲二氢吗啡；14-羟基可待因→去甲-14-羟基可待因；14-羟基吗啡→去甲-14-羟基吗啡；可待因酮→去甲可待因酮；吗啡酮→去甲吗啡酮；14-羟基可待因酮→去甲-14-羟基可待因酮；和14-羟基吗啡酮→去甲-14-羟基吗啡酮的反应，以及其它反应。

[NMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶N-甲基转移酶的表达。N-甲基转移酶由NMT基因编码。在一些实例中，N-甲基转移酶可催化如去甲可待因→可待因；去甲吗啡→吗啡；去甲羟考酮→羟考酮；去甲羟吗啡酮→去甲羟吗啡酮；去甲蒂巴因→蒂巴因；去甲东罂粟碱→东罂粟碱；去甲氢可酮→氢可酮；去甲氢吗啡酮→氢吗啡酮；去甲二氢可待因→二氢可待因；去甲二氢吗啡→二氢吗啡；去甲-14-羟基可待因→14-羟基可待因；去甲-14-羟基吗啡→14-羟基吗啡；去甲可待因酮→可待因酮；去甲吗啡酮→吗啡酮；去甲-14-羟基-可待因酮→14-羟基可待因酮；去甲-14-羟基-吗啡酮→14-羟基吗啡酮的反应。

[NAT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶N-烯丙基转移酶的表达。N-烯丙基转移酶由NAT基因编码。在一些实例中，N-烯丙基转移酶可催化如去甲可待因→N-烯丙基-去甲可待因；去甲吗啡→N-烯丙基-去甲吗啡；去甲羟考酮→N-烯丙基-去甲羟考酮；去甲羟吗啡酮→N-烯丙基-去甲羟吗啡酮；去甲蒂巴因→N-烯丙基-去甲蒂巴因；去甲东罂粟碱→N-烯丙基-去甲东罂粟碱；去甲氢可酮→N-烯丙基-去甲氢可酮；去甲氢吗啡酮→N-烯丙基-去甲氢吗啡酮；去甲二氢可待因→N-烯丙基-去甲二氢可待因；去甲二氢吗啡→N-烯丙基-去甲二氢吗啡；去甲-14-羟基可待因→N-烯丙基-去甲-14-羟基可待因；去甲-14-羟基吗啡→N-烯丙基-去甲-14-羟基吗啡；去甲可待因酮→N-烯丙基-去甲可待因酮；去甲吗啡酮→N-烯丙基-去甲吗啡酮；去甲-14-羟基-可待因酮→N-烯丙基-去甲-14-羟基可待因酮；去甲-14-羟基-吗啡酮→N-烯丙基-去甲-14-羟基吗啡酮的反应，以及其它反应。

[CPMT]在一些实例中，工程化宿主细胞可修饰酶N-环丙基甲基转移酶的表达。N-环丙基甲基转移酶由CPMT基因编码。在一些实例中，N-环丙基甲基转移酶可催化如去甲可待因→N(环丙基甲基)去甲可待因；去甲吗啡→N(环丙基甲基)去甲吗啡；去甲羟考酮→N(环丙基甲基)去甲羟考酮；去甲羟吗啡酮→N(环丙基甲基)去甲羟吗啡酮；去甲蒂巴因→N(环丙基甲基)去甲蒂巴因；去甲东罂粟碱→N(环丙基甲基)去甲东罂粟碱；去甲氢可酮→N(环丙基甲基)去甲氢可酮；去甲氢吗啡酮→N(环丙基甲基)去甲氢吗啡酮；去甲二氢可待因→N(环丙基甲基)去甲二氢可待因；去甲二氢吗啡→N(环丙基甲基)去甲二氢吗啡；去甲-14-羟基可待因→N(环丙基甲基)去甲-14-羟基可待因；去甲-14-羟基吗啡→N(环丙基甲基)去甲-14-羟基吗啡；去甲可待因酮→N(环丙基甲基)去甲可待因酮；去甲吗啡酮→N(环丙基甲基)去甲吗啡酮；去甲-14-羟基-可待因酮→N(环丙基甲基)去甲-14-羟基可待因酮；和去甲-14-羟基-吗啡酮→N(环丙基甲基)去甲-14-羟基吗啡酮的反应，以及其它反应。

[BM3]在一些实例中，工程化宿主细胞可表达酶BM3。BM3为在其天然宿主中参与脂肪酸单加氧的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞色素P450。在一些情况下，BM3使阿片N-去甲基化以产生去甲阿片。在一些情况下，宿主细胞经修饰以表达BM3外加用于产生纳阿片或去甲阿片的其它异源酶。工程化宿主细胞可经修饰以包括BM3基因在工程化宿主细胞中的组成型表达。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以合成调控BM3基因在工程化宿主细胞中的表达。在一些实例中，工程化宿主细胞可经修饰以并入BM3基因的一个或多个拷贝或额外拷贝。另外或可替代地，工程化宿主细胞可经修饰以并入用于在工程化宿主细胞内过度表达BM3基因的强启动子元件的引入。BM3作为生物合成酶具有若干优点，包括其可溶、带有融合还原酶伴侣蛋白以及可容易工程化以接受新底物。另外，表9说明BM3N-去甲基酶的变异体。

前述基因的实例可由宿主细胞中的多种不同平台，包括质粒(2μ、ARS/CEN)、YAC或基因组表达。另外，前述基因序列的实例可为天然的或经密码子优化以便在所需异源宿主(例如酿酒酵母)中表达。

实例

给出以下实例是为了说明本发明的一些不同实施例，并不意味着以任何方式限制本发明。在指示时，表达构建体理解为并入有合适的启动子、基因和终止子，即使未指定所使用的精确终止子序列。本发明实例以及本文所描述的方法是目前优选实施例的代表，是示例性的并且不打算限制本发明的范围。所属领域的技术人员将想到其中的改变和其它用途，所述改变和其它用途涵盖在由权利要求书的范围限定的本发明的主旨内。

实例1：用于吗啡喃生物碱产生的酶的生物信息学鉴别

用来自每个假设酶类别的代表性变异体的氨基酸序列查询OneKP(Matasci N等人2014.《1,000种植物(1KP)项目的数据访问(Data access for the 1,000Plants(1KP)project)》.Gigascience 3:17)和植物转录组数据库。特定来说，检索包括产生所关注的苄基异喹啉生物碱的许多植物物种的罂粟属。使用10^-50的e值截止值将来自这些植物的候选序列的列表缩小到代表性序列。对于一些候选者，完整序列不存在于组装好的转录组中。在这些情况下，使用原始测序读段完成序列。

实例2：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生(S)-牛心果碱的平台酵母菌株

构建从L-酪氨酸产生重要分支点BIA中间体(S)-牛心果碱的平台酵母菌株(图19)。具体来说，将四种多基因表达构建体整合于酵母菌株的基因组中。四种构建体的组成在图19中指示。每种构建体包含由酵母启动子表达的4或5种基因。基因以完整表达盒的形式定位在每个基因座处，所述完整表达盒包含启动子、基因开放阅读框和终止子，如示意图上方的标注中所指定。示意图显示按表示给定基因的箭头的方向，每个表达盒的定向。可选标记在标注中为斜体并且在示意图中由灰色箭头表示。每个选择标记侧接loxP位点以允许从基因座中去除所述标记。另外，每种构建体都具有侧接loxP位点的可选标记，使得其可通过Cre重组酶去除。

在第一整合构建体中，来自褐家鼠的四种异源基因与G418选择标记(KanMX)一起整合于YBR197C基因座中。RnPTPS、RnSepR、RnPCD和RnQDHPR是从如图2中所指示的酵母内源性叶酸合成途径合成和再生四氢生物蝶呤(BH₄)所必需的。每种基因经密码子优化以便在酵母中表达。

在第二整合构建体中，四种异源基因与HIS5选择标记一起整合于HIS3基因座中。褐家鼠酪氨酸羟化酶(RnTyrH)使用由前一整合构建体产生的辅助底物BH₄将酪氨酸转化为L-DOPA。RnTyrH基因可为野生型或赋予增强的活性的改良突变体(例如W166Y、R37E和R38E)中的任一者。第二褐家鼠基因RnDHFR编码将二氢生物蝶呤(BH₄的氧化产物)还原为BH₄的酶，以此方式提高此辅助底物的可用性。第三构建体中还包括来自恶臭假单胞菌的PpDODC，一种将L-DOPA转化为多巴胺的酶。第四酶为来自日本黄连的CjNCS，其将4-HPA与多巴胺缩合以制备去甲乌药碱。每种基因经密码子优化以便在酵母中表达。

在第三整合构建体中，将来自植物的五种异源基因和LEU2选择标记整合于基因座YDR514C中。Ps6OMT、Ps4'OMT和PsCNMT为来自罂粟的甲基转移酶并且以天然植物核苷酸序列的形式表达。第四罂粟基因yPsCPRv2针对酵母经密码子优化，并且编码支持来自花菱草的细胞色素P450 EcCYP80A1的活性的还原酶。此构建体中编码的酶进行两个O-甲基化、一个N-甲基化和一个羟基化以从由前一整合构建体产生的去甲乌药碱产生牛心果碱。每种基因经密码子优化以便在酵母中表达。

在最后一个整合构建体中，将酿酒酵母内源基因ARO4^Q166K、ARO7^T226I、TYR1和ARO10的额外拷贝与潮霉素抗性选择标记一起整合于ARO4基因座中。ARO4^Q166K和ARO7^T226I为ARO4和ARO7的抗反馈突变体，其各自编码相对于野生型序列的单个碱基对取代。TYR1和ARO10与天然酵母基因相同，但在强启动子后表达。Aro4p和Aro7p为包括酪氨酸的芳香族氨基酸生物合成中的酶。从这些酶中去除反馈抑制引起内源性酪氨酸生物合成的上调。Tyr1p的过度表达上调酪氨酸生物合成且因此上调酪氨酸的产生。Aro10p的过度表达增加4-HPA的产生。

可用任何数目的四种表达盒构建平台酵母菌株。具体来说，用整合构建体1-4和整合构建体1-3构建平台酵母菌株。在排除酪氨酸过度产生的构建体(构建体4)的后一菌株中，可在培养基中供应额外酪氨酸以支持牛心果碱的生物合成。可将额外基因修饰并入到平台菌株中以支持下游BIA的产生和增加BIA生物合成的通量。

使酵母菌株在具有适当氨基酸缺陷溶液(amino acid drop out solution)的合成完全培养基中在28℃下生长。在48和96小时生长之后，通过LC-MS/MS分析对培养基上清液中的BIA代谢物进行分析。

实例3：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生蒂巴因的平台酵母菌株

酵母菌株可经工程化以便从早期前体，如酪氨酸产生吗啡喃生物碱蒂巴因。作为实例，实例2中所描述的平台酵母菌株可进一步工程化以从L-酪氨酸产生吗啡喃生物碱产物(图20)。

从L-酪氨酸产生(S)-牛心果碱的平台酵母菌株(参见实例2中的描述)进一步工程化以并入工程化分裂差向异构酶DRS-DRR、工程化沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇乙酰基转移酶和蒂巴因合酶，以将生物合成的(S)-牛心果碱转化为第一吗啡喃生物碱蒂巴因(图4)。三种表达盒(P_TDH3-yEcCFS^1-26-yPbSS^33-504、P_TPI1-yPbSalR、P_TEF1-yPsSalAT)与URA3选择性标记组装成整合构建体并且整合于平台酵母菌株中的基因座TRP1中。另外三种表达盒(P_TDH3-yPbDRS、P_TEF1-yPbDRR、P_PGK1-yPsTS)与bleR选择性标记组装成整合构建体并且整合于平台酵母菌株中的基因座YPL250CΔ中。两种构建体的组成在图20中指示。

使携带整合盒的酵母菌株在具有适当缺陷溶液的合成完全培养基中在28℃下生长。在96小时生长之后，通过LC-MS/MS分析对培养基的BIA代谢物进行分析。

实例4：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生下游吗啡喃生物碱的酵母菌株

酵母菌株可经工程化以便从早期前体，如酪氨酸产生下游吗啡喃生物碱。作为实例，实例3中所描述的平台酵母菌株可进一步工程化以从L-酪氨酸产生下游吗啡喃生物碱产物(图4)。

从L-酪氨酸产生蒂巴因的平台酵母菌株(参见实例3中的描述)进一步工程化以并入蒂巴因6-O-脱甲基酶、尼奥品酮异构酶、可待因酮还原酶和可待因酮-O-脱甲基酶，以将生物合成的蒂巴因转化为下游吗啡喃生物碱，包括吗啡(图20)。四种表达盒(P_GPD-T6ODM、P_PGK1-COR、P_ADH1-CODM、P_TPI1-yPsNPI)与KanMX选择性标记直接组装并且整合于蒂巴因平台酵母菌株中的HOΔ基因座中，以创建产生吗啡的酵母菌株(Thodey等人,2014)。三种表达盒(P_GPD-T6ODM、P_PGK1-COR、P_TPI1-yPsNPI)与KanMX选择性标记直接组装并且整合于蒂巴因平台酵母菌株中的HOΔ基因座中，以创建产生可待因的酵母菌株。

实例5：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生半合成阿片的酵母菌株

酵母菌株可经工程化以便从早期前体，如酪氨酸产生下游半合成吗啡喃生物碱。作为实例，实例3和4中所描述的酵母菌株可进一步工程化以从L-酪氨酸产生半合成阿片产物(图4)。

从L-酪氨酸产生蒂巴因的酵母菌株(参见实例3和4中的描述)进一步工程化以并入蒂巴因6-O-脱甲基酶、尼奥品酮异构酶和吗啡酮还原酶，以将生物合成的蒂巴因转化为半合成吗啡喃生物碱氢可酮(图20)。三种表达盒(P_GPD-T6ODM、P_PGK1-morB、P_TPI1-yPsNPI)与KanMX选择性标记直接组装并且整合于蒂巴因平台酵母菌株中的HOΔ基因座中，以创建产生氢可酮的酵母菌株(Thodey等人,2014)。

实例6：经由工程化酵母菌株从葡萄糖和简单氮源产生下游吗啡喃生物碱

酵母菌株如实例2、3和4中所描述工程化，以直接从标准生长培养基中存在的简单糖(例如葡萄糖)和氮源产生下游吗啡喃生物碱可待因和吗啡。具体来说，酿酒酵母CEN.PK菌株经工程化以经由整合到酵母染色体中来表达以下异源酶：TyrH、DODC、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、NCS、6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR、4OMT、DRS、DRR、SalSyn、SalR、SalAT、TS、T6ODM、COR(变异体1.3，SEQ ID NO.87)。此酵母菌株的一种形式还经工程化以经由整合到酵母染色体中来表达CODM。在此实例中，SalSyn酶经工程化以使其前导序列被来自花菱草华紫堇碱合酶(EcCFS)的N末端的83个氨基酸置换。对菌株进行额外修饰以增加BIA前体积累，包括：过度表达ARO10、过度表达TYR1、表达抗反馈ARO4(ARO4^Q166K)和表达抗反馈ARO7(ARO7^T226I)。如所描述制备独立工程化酵母菌株，其携带编码尼奥品酮异构酶活性(NPI)的酶的不同变异体，包括SEQ ID NO.83，此为SEQ ID NO.82的变异体，具有N末端前18个氨基酸截短(即NPI(截短))，以及不携带尼奥品酮异构酶(产生可待因的菌株：YA1033；产生吗啡的菌株：YA1022)。酶变异体的序列在表3中提供。

将所描述的酵母菌株接种到2ml具有2％葡萄糖的合成完全培养基(酵母氮源基础和氨基酸)中，并且在28℃下生长大约4小时。随后，将10μL的每种培养物一式4份转移到96孔板中的400μL新鲜培养基中，并且在28℃下再生长48小时。生产培养基含有1×酵母氮肉汤和氨基酸、20mM抗坏血酸、300mg/L酪氨酸、40g/L麦芽糊精和2单位/L淀粉酶。淀粉酶用于模拟分批补料工艺并且从麦芽糊精聚合物中逐渐释放葡萄糖，使得酵母可将其用作碳源。通过离心将细胞与培养基分离，并且通过LC-MS/MS分析直接在上清液中测量蒂巴因浓度。

工程化的产生可待因的酵母菌株从生长培养基中存在的葡萄糖和简单氮源产生蒂巴因、可待因和其它苄基异喹啉生物碱(图21)。工程化的产生吗啡的酵母菌株从生长培养基中存在的葡萄糖和简单氮源产生蒂巴因、可待因、吗啡和其它苄基异喹啉生物碱(图22)。在所有情况下，在所描述的发酵条件下，携带尼奥品酮异构酶活性的菌株相对于未携带此活性的菌株，产生更高水平的在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的吗啡喃生物碱异构体产物(即可待因和吗啡)。

实例7：经由工程化酵母菌株从葡萄糖和简单氮源产生下游半合成阿片

酵母菌株如实例2、3、4和5中所描述工程化，以直接从标准生长培养基中存在的简单糖(例如葡萄糖)和氮源产生下游半合成阿片氢可酮。具体来说，酿酒酵母CEN.PK菌株经工程化以经由整合到酵母染色体中来表达以下异源酶：TyrH、DODC、PTPS、SepR、PCD、QDHPR、NCS、6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR、4OMT、DRS、DRR、SalSyn、SalR、SalAT、TS、T6ODM、morB。在此实例中，SalSyn酶经工程化以使其前导序列被来自花菱草华紫堇碱合酶(EcCFS)的N末端的83个氨基酸置换。对菌株进行额外修饰以增加BIA前体积累，包括：过度表达ARO10、过度表达TYR1、表达抗反馈ARO4(ARO4^Q166K)和表达抗反馈ARO7(ARO7^T226I)。如所描述制备独立工程化酵母菌株，其携带编码尼奥品酮异构酶活性(NPI)的酶的不同变异体，包括SEQ ID NO.82(即NPI(全长))和SEQ ID NO.83，此为SEQ ID NO.82的变异体，具有N末端前18个氨基酸截短(即NPI(截短))，以及不携带尼奥品酮异构酶(YA1046)。酶变异体的序列在表3中提供。

工程化的产生氢可酮的酵母菌株从生长培养基中存在的葡萄糖和简单氮源产生蒂巴因、氢可酮和其它苄基异喹啉生物碱(图23)。在所有情况下，在所描述的发酵条件下，携带尼奥品酮异构酶活性的菌株相对于未携带此活性的菌株，产生更高水平的在碳C-8与C-7之间具有碳-碳双键的吗啡喃生物碱异构体产物(即氢可酮)。

实例8：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生O-去甲基化阿片化合物的微生物菌株

将表6中列出的对吗啡喃生物碱显示O-脱甲基酶活性的酶并入微生物菌株(酿酒酵母或大肠杆菌)，其从头生物合成吗啡喃生物碱(如实例3、4和5中所描述)。完整BIA生物合成途径使用由宿主细胞产生和/或培养基中补充的L-酪氨酸。两个酪氨酸分子经修饰且缩合以形成第一苄基异喹啉结构，其可为去甲乌药碱或去甲劳丹碱。苄基异喹啉进一步修饰以形成(S)-牛心果碱，且随后通过差向异构酶的活性立体化学反转，得到(R)-牛心果碱。(R)-牛心果碱经历碳-碳偶联反应以形成第一原吗啡喃沙罗泰里啶，并且进一步修饰，随后经历由蒂巴因合酶催化的氧-碳偶联反应以达成第一吗啡喃生物碱结构蒂巴因(参见图4)。表5列出完整途径中的酶和活性。

图6说明根据本发明的一些实施例，微生物细胞中的生物合成方案。将由细胞内源性产生和/或培养基中供应的酪氨酸转化为羟考酮(虚线箭头表示多个酶促步骤)。随后使羟考酮3-O-去甲基化为羟吗啡酮，并且N-去甲基化为去甲羟吗啡酮。最后，N-甲基转移酶从SAM类似物接受烯丙基和环丙基甲基碳部分以分别产生纳洛酮和纳曲酮。

为了检测产生吗啡喃生物碱分子的菌株中的O-脱甲基酶活性，通过发酵来繁殖由质粒载体或染色体整合盒表达候选酶的细胞，并且收集细胞上清液以分析总阿片概况(如上文所描述)。通过LC-MS检测到携带完整BIA途径的菌株中阿片分子的O-去甲基化(如上文所描述)。具体来说，检测到羟考酮向羟吗啡酮的转化。为了经由生物催化检测O-去甲基化活性，将菌株在选择性培养基中培养且随后通过玻璃珠破坏裂解。细胞裂解物外源供应有阿片底物(参见图11和12)和酶功能所需的其它辅因子。通过LC-MS检测到阿片分子的O-去甲基化。

实例9：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生N-去甲基化阿片化合物的微生物菌株

将表7中列出的对吗啡喃生物碱显示N-脱甲基酶活性的酶并入微生物菌株(酿酒酵母或大肠杆菌)，其从头生物合成吗啡喃生物碱(如实例3、4和5中所描述)。完整BIA生物合成途径使用由宿主细胞产生和/或培养基中补充的L-酪氨酸。两个酪氨酸分子经修饰且缩合以形成第一苄基异喹啉结构，其可为去甲乌药碱或去甲劳丹碱。苄基异喹啉进一步修饰以形成(S)-牛心果碱，且随后通过差向异构酶的活性立体化学反转，得到(R)-牛心果碱。(R)-牛心果碱经历碳-碳偶联反应以形成第一原吗啡喃沙罗泰里啶，并且进一步修饰，随后经历由蒂巴因合酶催化的氧-碳偶联反应以达成第一吗啡喃生物碱结构蒂巴因(参见图4)。表5列出完整途径中的酶和活性。

为了检测产生吗啡喃生物碱分子的菌株中的N-脱甲基酶活性，通过发酵来繁殖由质粒载体或染色体整合盒表达候选酶的细胞，并且收集细胞上清液以分析总阿片概况(如上文所描述)。通过LC-MS检测到携带完整BIA途径的菌株中阿片分子的N-去甲基化(如上文所描述)。具体来说，检测到羟吗啡酮向去甲羟吗啡酮的转化。为了经由生物催化检测N-去甲基化活性，将菌株在选择性培养基中培养且随后通过玻璃珠破坏裂解。细胞裂解物外源供应有阿片底物(参见图13和24)和酶功能所需的其它辅因子。通过LC-MS检测到阿片分子的N-去甲基化。

实例10：经工程化以从葡萄糖和简单氮源产生纳阿片化合物的微生物菌株

将表8中列出的对吗啡喃生物碱显示N-甲基化酶活性的酶并入微生物菌株(酿酒酵母或大肠杆菌)，其从头生物合成吗啡喃生物碱(如实例3、4和5中所描述)。图6显示从前体分子蒂巴因到最终纳阿片化合物纳洛酮和纳曲酮的完整反应方案的实例。这些菌株另外表达来自实例8和9以及表5的酶，其负责从完整BIA途径产生去甲阿片化合物。还在缺乏生物合成途径的微生物菌株(例如对于酿酒酵母，Cen.PK2，或对于大肠杆菌，BL21)中表达N-甲基化酶，以产生能够生物催化若干不同外源供应的底物分子的菌株。完整BIA生物合成途径使用由宿主细胞产生和/或培养基中补充的酪氨酸。两个酪氨酸分子经修饰且缩合以形成第一苄基异喹啉结构，其可为去甲乌药碱或去甲劳丹碱。苄基异喹啉进一步修饰以形成(S)-牛心果碱，且随后通过差向异构酶的活性立体化学反转，得到(R)-牛心果碱。(R)-牛心果碱经历碳-碳偶联反应以形成第一原吗啡喃沙罗泰里啶，并且进一步修饰，随后经历由蒂巴因合酶催化的氧-碳偶联反应以达成第一吗啡喃生物碱结构蒂巴因(参见图4)。表5列出完整途径中的酶和活性。

为了检测具有到去甲阿片的完整BIA途径(参见图6)的菌株中的N-修饰活性，表达候选酶的细胞通过发酵(如上文所描述)来繁殖并且与SAM或SAM类似物，如图18中列出的那些一起培育。通过LC-MS在上清液中检测到携带完整BIA途径的菌株中去甲阿片或其它BIA分子的酶促修饰(如上文所描述)。为了经由生物催化检测N-修饰活性，将菌株在选择性培养基中培养且随后通过玻璃珠破坏裂解。细胞裂解物外源供应有SAM或SAM类似物和酶功能所需的其它辅因子。具体来说，检测到去甲羟吗啡酮向纳洛酮和纳曲酮的转化(使用SAM类似物烯丙基-SAM或环丙烷-SAM，如图18中所示)。通过LC-MS检测到去甲阿片或其它BIA分子的修饰。为了在不具有完整BIA途径的菌株中通过生物催化检测N-修饰活性，使表达所描述的异源酶的Cen.PK2菌株在选择性培养基中生长并且通过玻璃珠破坏裂解。细胞裂解物外源供应有SAM或SAM类似物、酶功能所需的辅因子和去甲阿片分子，如图18和表5中列出的那些。通过LC-MS检测到这些化合物的修饰。

表5.酶列表

表6.O-脱甲基酶候选酶

表7.N-脱甲基酶候选酶

表8.N-甲基转移酶和N-修饰候选酶

表9.BM3 N-脱甲基酶的变异体

表10.pA24、pA25和pA26序列

表11.定制酶(Tailoring enzyme)

表12.罂粟秆浓缩物和澄清酵母培养基中可能存在的杂质的比较。

表13.澄清酵母培养基(CYCM)中存在的不同分子组。不同于罂粟秆浓缩物(CPS)，酵母宿主菌株可经工程化以产生预定类别的生物碱分子(即每种菌株仅一种生物合成途径)，使得不存在其它类别的生物碱。因此，CYCM可含有单一生物合成途径内的分子，包括跨越一列或两列的分子的子集，而CPS可含有跨越许多列的分子的子集。

表14.化合物的化学合成制剂中可能存在的杂质

虽然已经在本文中显示和描述了本发明的优选实施例，但所属领域的技术人员应清楚，此类实施例仅是作为实例而提供的。所属领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下意识到大量变型、变化以及取代。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。意图是所附权利要求书限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

Claims

1.一种在工程化非植物细胞内产生可待因酮的方法，所述方法包括：

在所述工程化非植物细胞内产生蒂巴因产物；

在所述工程化非植物细胞内，使所述蒂巴因产物与具有蒂巴因6-O-脱甲基酶活性的酶接触，从而产生尼奥品酮产物；以及

在所述工程化非植物细胞内，使所述尼奥品酮产物与尼奥品酮异构酶接触，从而产生可待因酮产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述尼奥品酮异构酶是工程化尼奥品酮异构酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在所述工程化非植物细胞内，使所述可待因酮产物与具有吗啡酮还原酶活性的酶接触，从而产生氢可酮产物。

4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在所述工程化非植物细胞内，使所述可待因酮产物与具有可待因酮还原酶活性的酶接触，从而产生可待因产物。

5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在所述工程化非植物细胞内，使所述可待因酮产物与具有吗啡脱氢酶活性的酶接触，从而产生可待因产物。

6.一种在工程化非植物细胞内使尼奥品酮异构化的方法，所述方法包括：

使尼奥品酮产物与尼奥品酮异构酶接触，

其中使所述尼奥品酮产物与所述尼奥品酮异构酶接触将所述尼奥品酮产物异构化为可待因酮产物，并且

其中所述尼奥品酮异构酶通过培养具有至少一个编码序列的工程化非植物细胞产生，所述编码序列被编码在所述工程化非植物细胞内的染色体内，用于编码所述尼奥品酮异构酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述尼奥品酮异构酶是工程化尼奥品酮异构酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括：

9.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括：

10.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括：

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中选自由所述蒂巴因产物和所述尼奥品酮产物组成的组的产物中的至少一者在所述工程化非植物细胞内由简单起始材料产生。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述简单起始材料包含糖。

13.根据权利要求1或权利要求6所述的方法，其进一步包括：

使所述可待因酮产物或其衍生物与一种或多种选自下组的酶接触：吗啡酮还原酶、吗啡脱氢酶、可待因酮还原酶、N-脱甲基酶、N-甲基转移酶和尼奥品酮异构酶，

从而产生至少一种选自下组的产物：尼奥品酮、14-羟基可待因酮、羟考酮、羟吗啡酮、去甲羟吗啡酮、去甲羟吗啡醇、丁丙诺啡、纳洛酮、纳曲酮和纳布啡。

14.根据权利要求3或权利要求8所述的方法，其进一步包括：

使所述氢可酮产物或其衍生物与一种或多种选自下组的酶接触：吗啡脱氢酶、可待因酮还原酶和可待因O-脱甲基酶，

从而产生至少一种选自下组的产物：氢吗啡酮和二氢可待因。

15.根据权利要求4或权利要求5或权利要求9或权利要求10所述的方法，其进一步包括：

使所述可待因产物或其衍生物与一种或多种选自下组的酶接触：吗啡脱氢酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶和尼奥品酮异构酶，

从而产生至少一种选自下组的产物：可待因酮、尼奥品酮、尼奥品、尼奥吗啡、吗啡、尼奥吗啡酮和吗啡酮。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞是工程化真菌细胞或工程化细菌细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述工程化非植物细胞是工程化真菌细胞。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述工程化非植物细胞是工程化细菌细胞。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述简单起始材料包含酪氨酸。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蒂巴因产物通过从酪氨酸到所述蒂巴因产物的代谢途径产生。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述尼奥品酮产物通过从酪氨酸到所述尼奥品酮产物的代谢途径产生。