CN116855429B - 一株节杆菌和一种复合修复菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株节杆菌和一种复合修复菌剂及其制备方法与应用，属于微生物菌剂技术领域。本发明以节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1‑3三株菌株制备的复合修复菌剂，可以协同提高石油烃的降解效率，而且具有植物促生作用，更适合植物‑微生物联合修复石油有机物污染土壤，且能适应盐碱环境中石油烃的降解。因此，本发明的复合修复菌剂应用范围广，市场前景广阔。

Description

一株节杆菌和一种复合修复菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一株节杆菌和一种复合修复菌剂及其制备方法与应用，属于微生物菌剂技术领域。
背景技术
石油有机物污染是指在石油开采、运输、装卸、加工和使用过程中，由于泄漏和排放石油引起的污染，对土壤造成了严重的影响。随着石油开采量的不断增加和石油有机物污染的日益严重，特别是地下油罐和输油管线的腐蚀渗漏，污染土壤和地下水源，不仅造成了土壤盐碱化、毒化，导致了土壤破坏和废毁，其含有的有毒物质还能抑制表面植被的生长，进一步加剧表层土壤生态的恶化程度。因此，石油有机物污染土壤的修复成为目前研究的热点。
中国专利文献CN103215204A（申请号201310099767.X）公开了一种高效降解菲的节杆菌菌株及其应用，所述的降解菲的节杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.6581，该菌株能够有效降解土壤及油泥中多环芳烃和杂环类物质，特别是菲类物质，可有效应用于黄土塬区石油有机物污染土壤的修复和土壤中多环芳烃（PAHs）污染物的生物降解处理，特别是菲的降解率可达98％以上。该菌株虽然可以降解多环芳烃和杂环类物质，但由于石油有机物污染土壤的修复不仅需要多环芳烃和杂环类物质的降解，更需要相关植被的及时恢复，但该方案无法实现该目的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株节杆菌和一种复合修复菌剂及其制备方法与应用，该复合修复菌剂既有良好的降解石油烃、多环芳烃等的作用，又可以促进土壤表面植被的生长，从而实现对石油有机物污染土壤快速修复的目的。
本发明的技术方案如下：
一株节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO. 27035。
一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) AM21，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO. 27033。
一株伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)ZQ1-3，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC No. 20953。
一种复合修复菌剂，包括节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21和伸长盐单胞菌ZQ1-3。
根据本发明优选的，所述复合修复菌剂还包括草炭土。
根据本发明优选的，所述复合修复菌剂的活菌浓度为（5～10）×108cfu/g。
根据本发明优选的，所述复合修复菌剂中，节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21和伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数之比为（1~3）：（1~3）：（1~5）。
在本发明一种优选的技术方案中，上述复合修复菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）分别将节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3进行活化培养，制得活化节杆菌AM28、活化恶臭假单胞菌AM21、活化伸长盐单胞菌ZQ1-3；
（2）将步骤（1）制得的活化节杆菌AM28、活化恶臭假单胞菌AM21、活化伸长盐单胞菌ZQ1-3分别进行种子培养，制得节杆菌AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液、伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液；
（3）将步骤（2）制得的节杆菌AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液、伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液进行混合发酵培养，制得混合菌液；
（4）取步骤（3）制得的混合菌液与草炭土混合，制得复合修复菌剂。
根据本发明优选的，步骤（1）中所述活化培养的条件为：33～37℃活化培养1～2天。
根据本发明优选的，步骤（1）中所述活化培养时使用的活化培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g、蒸馏水1 L，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤（2）中所述种子培养的条件为：33～37℃、120～180转/分钟摇床培养20～28h。
根据本发明优选的，步骤（2）中所述种子培养时使用的种子培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述混合发酵培养的条件为：33～37℃、溶氧20%～70%的条件下发酵培养。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述混合发酵培养时使用的发酵培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，石油0.5g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述混合发酵培养时节杆菌AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液和伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液的接种量分别为发酵培养基体积的2%～10%。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述混合菌液中，节杆菌AM28的菌体浓度为1.0×108～1.0×1010cfu·mL-1，恶臭假单胞菌AM21的菌体浓度为1.0×108～1.0×1010cfu·mL-1，伸长盐单胞菌ZQ1-3的菌体浓度为1.0×108～1.0×1010cfu·mL-1。
上述复合修复菌剂在修复石油有机物污染土壤中的应用。
根据本发明优选的，所述应用的步骤如下：
向含油量3～10%的石油有机物污染土壤或油泥中接种复合修复菌剂，复合修复菌剂与石油有机物污染土壤或油泥的质量比为（1～5）︰100，调节含水率为20～25%，混匀，堆置进行石油有机物的降解。
有益效果：
1、本发明从石油烃、多环芳烃等石油有机物污染土壤中筛选出节杆菌AM28，与已知的节杆菌相比，对多环芳烃的降解效率更高，在含有多环芳烃的有机物污染土壤修复中效果突出。
2、本发明从石油烃、多环芳烃等石油有机物污染土壤中筛选出的恶臭假单胞菌AM21，不仅对石油烃具有良好的降解效果，而且有植物促生作用，促进植物根系及地上部的生长量，协同提高石油烃的降解效率。
3、本发明中的伸长盐单胞菌ZQ1-3筛选自滨海环境中，在盐碱环境中能够高效的降解石油烃，适合我国大部分的油田，特别是对沿海的石油有机物污染修复更为有效。
4、本发明以节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3三株菌株制备的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂，可以协同提高石油烃的降解效率，而且具有植物促生作用，更适合植物-微生物联合修复石油有机物污染土壤，且能适应盐碱环境中石油烃的降解。因此，本发明的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂应用范围广，市场前景广阔。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中使用的草炭土为普通市购产品。
实施例中涉及的微生物：
节杆菌(Arthrobacter sp.) AM28，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO. 27035；
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) AM21，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO. 27033；
伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)ZQ1-3，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC No. 20953。该菌株在专利CN114989998A中已经公开。
实施例1
一种石油有机物污染土壤的复合修复菌剂的制备方法，步骤如下：
（1）分别将节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3在活化培养基中于35℃条件下活化培养2天，制得活化节杆菌AM28、活化恶臭假单胞菌AM21、活化伸长盐单胞菌ZQ1-3；
其中，所述活化培养基的组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g、蒸馏水1 L，pH 7.0；
（2）将步骤（1）制得的活化节杆菌AM28、活化恶臭假单胞菌AM21、活化伸长盐单胞菌ZQ1-3分别接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得节杆菌AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液、伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液；
其中，所述种子培养基的组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
（3）将步骤（2）制得的节杆菌AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液、伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液分别按照发酵培养基2%的体积百分比共同接种至发酵培养基中进行混合发酵培养，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养40h，制得混合菌液，混合菌液中节杆菌AM28的菌体浓度为2.3×109cfu·mL-1，恶臭假单胞菌AM21的菌体浓度为2.1×109cfu·mL-1，伸长盐单胞菌ZQ1-3的菌体浓度为1.9×109cfu·mL-1；
其中，所述发酵培养基的组份如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，石油0.5g，dH2O水定容至1L；
（4）取步骤（3）制得的混合菌液与草炭土按质量比1︰7的比例混合，制得石油有机物污染土壤的复合修复菌剂。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数分别为3.0×108CFU/g、2.6×108CFU/g、2.4×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为44.5%。
实施例2
如实施例1所述的制备方法，不同之处在于：步骤（3）中所得混合菌液中节杆菌AM28的菌体浓度为3.4×109cfu·mL-1，恶臭假单胞菌AM21的菌体浓度为1.4×109cfu·mL-1，伸长盐单胞菌ZQ1-3的菌体浓度为3.1×109cfu·mL-1；
步骤（4）中取混合菌液与草炭土按质量比1︰10的比例混合，制得石油有机物污染土壤的复合修复菌剂。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数分别为3.1×108CFU/g、1.3×108CFU/g、2.8×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为43.6%。
对比例1
如实施例1所述的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂，不同之处在于：只含有节杆菌AM28和恶臭假单胞菌AM21，不含有伸长盐单胞菌ZQ1-3，具体制备方法如下：
（1）按照实施例1的方法活化节杆菌AM28和恶臭假单胞菌AM21；
（2）按照实施例1的方法培养节杆菌AM28种子液和恶臭假单胞菌AM21种子液；
（3）将步骤（2）制得的节杆菌AM28种子液和恶臭假单胞菌AM21种子液分别按照发酵培养基2%的体积百分比共同接种至发酵培养基中进行混合发酵培养，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养30h，制得混合菌液，混合菌液中节杆菌AM28的菌体浓度为2.5×109cfu·mL-1，恶臭假单胞菌AM21的菌体浓度为2.3×109cfu·mL-1；
其中，所述发酵培养基的组份如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，0.5g石油，dH2O水定容至1L；
（4）取步骤（3）制得的混合菌液与草炭土按质量比1︰5的比例混合，制得复合修复菌剂。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述节杆菌AM28、恶臭假单胞菌AM21的活菌数分别为4.2×108CFU/g 、3.8×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为40.2%。
对比例2
如实施例1所述的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂，不同之处在于：只含有节杆菌AM28和伸长盐单胞菌ZQ1-3，不含有恶臭假单胞菌AM21，具体制备方法如下：
（1）按照实施例1的方法活化节杆菌AM28和伸长盐单胞菌ZQ1-3；
（2）按照实施例1的方法培养节杆菌AM28种子液和伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液；
（3）将步骤（2）制得的节杆菌AM28种子液和伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液分别按照发酵培养基2%的体积百分比共同接种至发酵培养基中进行混合发酵培养，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养38h，制得混合菌液，混合菌液中节杆菌AM28的菌体浓度为3.0×109cfu·mL-1，伸长盐单胞菌ZQ1-3菌液的菌体浓度为2.8×109cfu·mL-1；
其中，所述发酵培养基的组份如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，石油0.5g，dH2O水定容至1L；
（4）取步骤（3）制得的混合菌液与草炭土按质量比1︰6的比例混合，制得复合修复菌剂。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述节杆菌AM28、伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数分别为4.2×108CFU/g 、3.8×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为36.5%。
对比例3
如实施例1所述的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂，不同之处在于：只含有恶臭假单胞菌AM21和伸长盐单胞菌ZQ1-3，不含有节杆菌AM28，具体制备方法如下：
（1）按照实施例1的方法活化恶臭假单胞菌AM21和伸长盐单胞菌ZQ1-3；
（2）按照实施例1的方法培养恶臭假单胞菌AM21种子液和伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液；
（3）将步骤（2）制得的恶臭假单胞菌AM21种子液和伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液分别按照发酵培养基2%的体积百分比共同接种至发酵培养基中进行混合发酵培养，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养45h，制得混合菌液，混合菌液中恶臭假单胞菌AM21的菌体浓度为4.6×109cfu·mL-1，伸长盐单胞菌ZQ1-3菌液的菌体浓度为3.8×109cfu·mL-1；
其中，所述发酵培养基的组份如下：
蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，石油0.5g，dH2O水定容至1L；
（4）取步骤（3）制得的混合菌液与草炭土按质量比1︰9的比例混合，制得复合修复菌剂。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数分别为4.4×108CFU/g 、3.7×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为34.6%。
对比例4
如实施例1所述的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂，不同之处在于：节杆菌AM28替换为节杆菌CGMCC1.1894，制备方法与实施例1相同。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述节杆菌CGMCC1.1894、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数分别为3.0×108CFU/g、2.6×108CFU/g、2.4×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为37.3%。
对比例5
如实施例1所述的石油有机物污染土壤的复合修复菌剂，不同之处在于：恶臭假单胞菌AM21替换为恶臭假单胞菌12，保藏编号为CGMCC 1.1820，制备方法与实施例1相同。
经检测，制得的复合修复菌剂中，所述节杆菌AM28、恶臭假单胞菌12、伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数分别为3.1×108CFU/g、2.4×108CFU/g、2.74×108CFU/g。
取上述制备的复合修复菌剂0.1 kg，添加至10 kg含油量5%的石油烃污染土壤中，调节土壤含水率为23%~25%，于泡沫箱中室温放置进行修复试验，30d后检测，石油烃降解率为33.4%。
实验例
实施例1~2、对比例1~5中制备的复合修复菌剂分别标记为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#菌剂，进行石油有机物污染土壤的修复实验。
实验用污染土壤分为两种，一种为原始的石油烃污染土壤，含油4.85%，含盐0.13%，标记为土-原始；配制质量比为10%的NaCl溶液，添加至原始的石油烃污染土壤中，使最终的含盐率为2.0%，然后自然晾干，标记为土-盐。
通过添加尿素、磷酸氢二铵调节土壤的C:N:P比例为100：（5~10）:1，保持土壤水分为23%~25%，添加土壤质量1%的1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#菌剂，进行修复试验，具体步骤如下：
试验于泡沫箱中进行，每个泡沫箱中装入对应的污染土壤10kg，不同处理添加不同的复合修复菌剂100g，复合修复菌剂添加完成后在每个泡沫箱中均匀撒播100粒多年生黑麦草种子，发芽后保留60棵。保持土壤水分23%~25%，修复120d后测定石油烃含量，计算降解率，并测定植物干重。
石油烃测定方法：
取冷冻干燥后的土壤样品3 g进行萃取：土壤样品放入50 mL螺旋盖离心管中，加入25 mL的二氯甲烷，涡旋振荡混匀1 min，超声15 min，6000 rpm离心10 min，将上清转移至干燥带塞的锥形瓶中。将剩余固体样品重复上述操作两次，将3次的上清混合，得萃取液，向萃取液中加入足量无水硫酸钠进行脱水，过滤。取干燥旋蒸瓶（重量为m1），将过滤得到的脱水后的石油溶液转移至旋蒸瓶，旋蒸至二氯甲烷基本挥发完全，然后30℃烘箱放置至恒重（重量为m2），计算石油烃的重量。
样品中石油烃重量=m2-m1。
采用以下公式计算石油烃的降解率(η)：
η(%)＝(ω0-ωx)/ω0×100%
式中：ω0为初始土壤样品中石油烃含量；ωx试验结束后土壤样品中石油烃含量。
土壤修复前后的数据检测结果如表1所示：
表1 不同菌剂对石油烃的降解率及植物干重
结果分析：通过表1的修复数据可以看出，原始的石油烃污染土壤以及含盐的石油烃污染土壤修复处理组中都是1#处理（实施例1）的修复效率最高，与3#~7#处理（对比例1~5）相比，可以看出三株菌株之间有协同促进作用。原始的石油烃污染土壤的修复中，除1#、2#处理外，3#处理也有较高的修复效率，这主要是由于节杆菌AM28和恶臭假单胞菌AM21对石油烃的高效降解以及恶臭假单胞菌AM21对植物的促生作用，然后植物与微生物协同促进了石油烃的快速降解。含盐的石油烃污染土壤的处理组中，除1#、2#处理外，5#处理的修复效率也较高，主要是由于伸长盐单胞菌ZQ1-3在盐碱环境中对石油烃的高效降解，以及恶臭假单胞菌AM21对植物促生后植物-微生物对石油烃的联合降解修复。因此，本发明的复合修复菌剂对普通石油烃污染土壤以及盐碱石油烃污染土壤均具有较高的修复效率，具有广阔的应用前景。

Claims (8)

1. 一种复合修复菌剂，其特征在于，包括节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28，还包括恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)AM21和伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)ZQ1-3；
所述节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO. 27035；
所述恶臭假单胞菌AM21于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO. 27033；
所述伸长盐单胞菌ZQ1-3于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC No. 20953。
2.如权利要求1所述的一种复合修复菌剂，其特征在于，所述复合修复菌剂还包括草炭土。
3.如权利要求1所述的一种复合修复菌剂，其特征在于，所述复合修复菌剂的活菌浓度为（5～10）×108cfu/g。
4. 如权利要求1所述的一种复合修复菌剂，其特征在于，所述复合修复菌剂中，节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28、恶臭假单胞菌AM21和伸长盐单胞菌ZQ1-3的活菌数之比为（1~3）：（1~3）：（1~5）。
5.权利要求1~4任一项所述的一种复合修复菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别将节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28、恶臭假单胞菌AM21、伸长盐单胞菌ZQ1-3进行活化培养，制得活化节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28、活化恶臭假单胞菌AM21、活化伸长盐单胞菌ZQ1-3；
（2）将步骤（1）制得的活化节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28、活化恶臭假单胞菌AM21、活化伸长盐单胞菌ZQ1-3分别进行种子培养，制得节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液、伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液；
（3）将步骤（2）制得的节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液、伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液进行混合发酵培养，制得混合菌液；
（4）取步骤（3）制得的混合菌液与草炭土混合，制得复合修复菌剂。
6.如权利要求5所述的一种复合修复菌剂的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i. 步骤（1）中所述活化培养的条件为：33～37℃活化培养1～2天；
ii. 步骤（1）中所述活化培养时使用的活化培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g、蒸馏水1 L，pH 7.0；
iii. 步骤（2）中所述种子培养的条件为：33～37℃、120～180转/分钟摇床培养20～28h；
iv. 步骤（2）中所述种子培养时使用的种子培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
v. 步骤（3）中所述混合发酵培养的条件为：33～37℃、溶氧20%～70%的条件下发酵培养；
vi. 步骤（3）中所述混合发酵培养时使用的发酵培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，石油0.5g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
vii. 步骤（3）中所述混合发酵培养时节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28种子液、恶臭假单胞菌AM21种子液和伸长盐单胞菌ZQ1-3种子液的接种量分别为发酵培养基体积的2%～10%；
viii. 步骤（3）中所述混合菌液中，节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28的菌体浓度为1.0×108～1.0×1010cfu·mL-1，恶臭假单胞菌AM21的菌体浓度为1.0×108～1.0×1010cfu·mL-1，伸长盐单胞菌ZQ1-3的菌体浓度为1.0×108～1.0×1010cfu·mL-1。
7.权利要求1所述的一种复合修复菌剂的应用，其特征在于，应用于修复石油有机物污染土壤。
8.如权利要求7所述的一种复合修复菌剂的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：
向含油量3～10%的石油有机物污染土壤或油泥中接种复合修复菌剂，复合修复菌剂与石油有机物污染土壤或油泥的质量比为（1～5）︰100，调节含水率为20～25%，混匀，堆置进行石油有机物的降解。
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