CN114989998A - 一株嗜盐石油烃降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株嗜盐石油烃降解菌及其应用。嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1‑3，于2020年10月26保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.20953。本发明首次公开了一株通过自然筛选获得的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1‑3，该菌株在含盐量为1～20wt％的条件下能够正常生长并降解石油烃，与现有已知的盐单胞菌相比，在耐高盐度条件下的石油烃降解方面具有显著的优势，可应用于高盐碱环境下的石油污染土壤和/或水体中石油烃的去除。
Description
技术领域
本发明涉及一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3及其应用，属于微生物及生物降解技术领域。
背景技术
我国的油田多位于盐碱地区，海滨区域的油田盐碱尤为严重。高盐碱等特殊生境的石油污染土壤修复时，石油烃降解微生物投加到高盐环境的石油烃污染土壤后，初期具有良好的修复效果，但在很短的时间内，一个月甚至半个月，投加的微生物在土壤菌群结构中所占比例迅速下降，而快速恢复到以耐盐或嗜盐微生物为主的投加前的稳定结构，严重影响了石油烃污染土壤的修复效果。
研究表明，石油污染土壤生物修复过程中土著微生物(native microorganisms)降解污染物的潜力最大，外来微生物在环境中难以保持较高的代谢活性，向污染环境接种的降解污染物的高效外来微生物(foreign microorganisms)受到土著微生物的竞争，在高盐的特殊生境中这种竞争关系尤为明显。
微生物修复是重要的石油烃污染土壤修复方法，研究表明，Pseudomonas(假单胞菌属)、Arthrobacter(节杆菌属)、Alcaligenes(产碱杆菌属)、Corynebacterium(棒状杆菌属)、Flavobacterium(黄杆菌属)、Achromobacter(无色杆菌属)、Micrococcus(微球菌属)、Nocardia(诺卡菌属)和Mycobacterium(分枝杆菌属)均具有高效的石油烃降解特性。然而，上述微生物主要为非耐盐微生物，在盐碱环境中无法正常发挥降解作用，而高盐环境中的生物修复只能通过使用具有石油烃化合物降解能力的耐盐或嗜盐微生物来完成。中国专利文献CN110669700A(申请号201911082757.9)公开了一株高效石油烃降解菌泰坦尼克号盐单胞菌(Halomonas titanicae)HTPA16-9，在厌氧培养基中，正十六烷为唯一碳源，初始添加量为0.07734g，恒温33℃且避光静置，厌氧培养3个月后，测残余正十六烷量，计算降解率约为76.7％～86.5％。中国专利文献CN101838616A(申请号200910080012.9)公开了一株可降解多环芳烃的盐单胞菌仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1，属于嗜盐微生物，能在0.05％～27.5％的盐度范围内进行生长繁殖，最适宜生长的盐度范围为4％～10％，能够降解菲、蒽或荧蒽等多种多环芳烃。目前有耐盐或嗜盐菌对石油烃降解的报道，认为不同来源的菌株对环境的适应性及石油烃的降解都有所不同，而且，经过不同地区土壤环境差异的自然筛选，会对同一种属来源的不同菌株的耐盐适应性及石油烃降解能力产生不同程度的影响。因此，不同区域环境中筛选到的同一种属的菌株在不同的环境中对石油烃的降解能力会有较大的差别。
本发明利用胜利油田滨海盐碱环境的特殊性，以环境的自筛选为手段，得到一株嗜盐而且石油烃降解效率高的盐单胞菌Halomonas elongata ZQ1-3，并研究了其培养和应用方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongataZQ1-3及其应用。
本发明技术方案如下：
一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.20953。
根据本发明优选的，所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3在含盐量为1～20wt％条件下生长繁殖。
进一步优选的，所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3在含盐量为9～18wt％条件下生长繁殖。
根据本发明优选的，所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3降解C10-C40的饱和烃。
上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的培养方法，包括如下步骤：
(1)取嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3划线于固体活化培养基上，活化培养，得活化后菌株；
(2)取步骤(1)得到的活化后菌株接种至液体培养基中，摇床培养，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比1％～10％转接至扩大培养基中，扩大培养，制得Halomonas elongata ZQ1-3菌液。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述固体活化培养基的组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，琼脂20g/L，余量水，pH自然。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述活化培养的条件为：28～32℃倒置培养1～2天。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述液体培养基与步骤(3)中所述扩大培养基均为高盐液体培养基，组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，余量水，pH自然。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述摇床培养的条件为：28～32℃转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养2～5天。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述扩大培养的条件为：28～32℃、溶氧20～40％的条件下，扩大培养1～2天。
一种含有上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的石油烃降解菌剂。
本发明中，上述石油烃降解菌剂可以是液体菌剂也可以是固体菌剂；在石油烃降解菌剂中可以只含有Halomonas elongata ZQ1-3一种菌也可以包含有其他菌株。在本发明一种优选的技术方案中，所述石油烃降解菌剂为液体菌剂，是经菌株培养后得到的Halomonas elongata ZQ1-3菌液。在本发明一种优选的技术方案中，所述石油烃降解菌剂为固体菌剂，是将培养得到的Halomonas elongata ZQ1-3菌液与有机质固体载体混合后得到的。
一种石油烃降解液体菌剂，是上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3菌液。
一种石油烃降解固体菌剂，是上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3菌液与有机质载体按质量比1︰(10～20)的比例混合制得。
进一步优选的，所述有机质载体为草炭土、锯末和麸皮草，质量比为(1～3)︰(1～3)︰(1～3)；优选的所述炭土、锯末和麸皮的质量比为3︰1︰1。
进一步优选的，所述石油降解固体菌剂的活菌浓度为(2～5)×109cfu/g。
一种石油烃降解复合菌剂，包括上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongataZQ1-3和苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35。
根据本发明优选的，所述苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，2020年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.19745。
根据本发明优选的，所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3和苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的有效菌浓比为(1～3)︰(1～3)；优选为1:1。
根据本发明优选的，所述石油烃降解复合菌剂是将Halomonas elongata ZQ1-3菌液和苍白杆菌MG35菌液与有机质载体按质量比1︰(10～20)的比例混合制得。
进一步优选的，所述有机质载体为草炭土、锯末和麸皮草，质量比为(1～3)︰(1～3)︰(1～3)；优选的所述炭土、锯末和麸皮的质量比为3︰1︰1。
在本发明优选的一种技术方案中，上述菌剂中Halomonas elongata ZQ1-3菌液和苍白杆菌MG35菌液均按照上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的培养方法培养得到。
根据本发明优选的，所述石油烃降解复合菌剂的活菌浓度为(1～10)×109cfu/g。
上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3在修复石油污染的水体和/或土壤中的应用。
上述菌剂在修复石油污染的水体和/或土壤中的应用。
根据本发明优选的，所述应用步骤如下：
向含油量为3～7％的石油污染土壤中接种上述菌剂，菌剂与石油污染土壤的质量比为(1～10)︰100，调节含水率为20～25％，混合混匀，自然堆置降解。
上述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3或上述菌剂在盐碱环境石油污染水体和/或土壤修复中的应用。
本发明的技术特点和有益效果：
本发明首次公开了一株通过自然筛选获得的嗜盐石油烃降解菌Halomonaselongata ZQ1-3，该菌株在含盐量为1～20wt％的条件下能够正常生长并降解石油烃，在含盐量为9～18wt％条件下更加适宜菌株生长，与现有已知的盐单胞菌相比，在耐高盐度条件下的石油烃(尤其是C10-C40饱和烃)降解方面具有显著的优势，可应用于高盐碱环境下的石油污染土壤和/或水体中石油烃的去除。
本发明中的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3与专利文献CN110669700A中的泰坦尼克号盐单胞菌(Halomonas titanicae)HTPA16-9相比，其耐盐性更强，石油烃降解效率更高。Halomonas elongata ZQ1-3在含盐量为9～18wt％条件下生长更好，而Halomonas titanicae HTPA16-9在筛选及降解时培养基中氯化钠含量仅为22g/L。本发明Halomonas elongata ZQ1-3在5％氯化钠含量、降解15d后，石油烃的降解率达到65.7％，Halomonas titanicae HTPA16-9在22g/L氯化钠含量、正十六烷为唯一碳源、恒温避光静置、厌氧培养3月后，正十六烷的降解率约为76.7％～86.5％，降解时间长、效率低，降解条件复杂。本发明中Halomonas elongata ZQ1-3除了对正十六烷烃具有较高的降解效率之外，对C10-C40的饱和烃都具有较好的降解效果。
本发明中的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3与专利文献CN101838616A中的仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1相比，其耐盐性更强，石油烃的降解类型不同。本发明的Halomonas elongata ZQ1-3能在1～20％的盐度范围内生长繁殖，适宜生长的盐度范围为9～18％，Halomonas xianhensis A-1能在0.05～27.5％的盐度范围内生长繁殖，适宜生长的盐度范围为4～10％，从菌株适宜生长的盐度范围分析，本发明的Halomonas elongata ZQ1-3耐盐性更强。饱和烃(烷烃)是石油的主要成分，泄露的烃类物质灌注入土壤的空隙中，影响土壤的通透性，破坏原油的土壤水相、气相和固相结构，影响土壤中微生物的生长，也可以常伴随水的流动而发生迁徙，导致污染区域不断扩大；多环芳烃作为石油中的有害物质具有致癌、致畸、致突变等作用，可以通过食物链进入生物体乃至人体中，直接危害人体健康。饱和烃和多环芳烃都是石油中主要的污染成分，本发明的Halomonas elongata ZQ1-3主要降解饱和烃，尤其是C10-C40的饱和烃，Halomonasxianhensis A-1主要降解多环芳烃，尤其是菲、蒽和荧蒽。
本发明还提供了一种石油烃降解复合菌剂，主要是由Halomonas elongata ZQ1-3和苍白杆菌MG35组成，在有效菌浓相同的条件下，Halomonas elongata ZQ1-3和苍白杆菌MG35组成的复合菌剂对于石油烃的降解效率显著高于单独的Halomonas elongata ZQ1-3或苍白杆菌MG35，说明两株菌复合形成的复合菌剂对石油烃降解有协同促进作用。
附图说明
图1为Halomonas elongata ZQ1-3的16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为Halomonas elongata ZQ1-3在不同NaCl浓度下的生长曲线。
图3为Halomonas elongata ZQ1-3对不同碳数石油烃的降解率柱状图。
图4为石油烃降解复合菌剂对石油烃的降解率曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作及步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
生物材料来源：
一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.20953。
一株苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，2020年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.19745。该菌株在专利CN202010443089.4中已经公开，在本发明中不涉及微生物保藏。
培养基：
无机盐培养基，每升组分包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，dH2O定容至1L。
石油-无机盐固体培养基，每升组分包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，石油20g，琼脂20g，dH2O定容至1L。
石油-无机盐液体培养基，每升组分包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，石油20g，dH2O定容至1L。
实施例1
一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的分离和鉴定：
采集胜利油田滨海高浓度石油污染土壤2g，置于150mL无菌三角瓶中，加入无菌无机盐培养基50mL，在30℃、150rpm条件下培养3d，吸取菌液，用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5倍，各涂布100μL至无菌的石油-无机盐固体培养基，在30℃条件下静置培养3d，挑取生长快、菌落大的克隆至50mL石油-无机盐液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养3d，再吸取100μL菌液涂布至无菌的石油-无机盐固体培养基，挑取单菌落。
取培养后挑取的单菌落送测序公司进行测序，经检测，16S rDNA序列含有1392bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
菌种鉴定过程如下：
样品：本发明筛选的细菌菌液；
细菌基因组DNA提取试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
TAE缓冲液(50×，1L)：Tris 242g、冰醋酸57.1mL、Na2EDTA·2H2O 37.2g、加水至1L；
琼脂糖：BIOWET，AGAROSE G-10；
2×Pfu PCR MasterMix、D2000 DNA Marker、核酸染料，loading buffer等：生工生物工程(上海)股份有限公司；
DNA纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
离心管、枪头等耗材：美国Gene Era Biotech公司；
引物：由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，按照合成单加入ddH2O，制成10μM溶液。
1、基因组DNA提取，按细菌基因组DNA提取试剂盒操作；
2、PCR扩增
2.1通用引物信息，见表1，
表1、细菌通用引物信息
2.2PCR扩增体系组分及构成，见表2，
表2、PCR扩增体系
2.3PCR扩增程序
预变性：94℃，3min；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸，72℃，1.5min(共35个循环)；延伸72℃，10min；4℃保存；
3、琼脂糖凝胶电泳检测
制备1.0％的琼脂糖凝胶，电泳时电压设置为18V/cm，电泳时间为20min；采用核酸染料进行琼脂糖电泳染色，采用紫外凝胶成像系统进行拍照，结果如图1所示，样品泳道中有且仅有一条明亮的目的条带，条带的大小为1400bp左右；
4、纯化回收
使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收产物送青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序拼接序列的blast比对结果见表3，
表3、测序拼接序列的blast比对结果
通过序列16S rDNA进行序列比对，发现遗传关系最接近的菌株为Halomonaselongata BK-AB8，NCBI登录号为KJ185379.1。
经上述菌种鉴定，本发明筛选的菌种属于Halomonas elongata，命名为Halomonaselongata ZQ1-3，2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCCNo.20953。
实施例2
嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的培养方法，步骤如下：
(1)取嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3划线于固体培养基上，32℃倒置活化培养2天，得活化后菌株；
(2)取步骤(1)得到的活化后菌株接种至液体培养基中，32℃转速为150转/分钟的条件下，摇床培养2天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比2％转接至液体培养基中，32℃、溶氧30％的条件下，扩大培养2天，制得Halomonas elongata ZQ1-3菌液，菌液中活菌浓度为2×109cfu/mL。
其中，所用培养基如下：
液体培养基，每升组分包括如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钾20g，七水硫酸镁15g，氯化钠130g，水定容至1L，pH自然。
固体培养基，每升组分包括如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钾20g，七水硫酸镁15g，氯化钠130g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
一种石油烃降解菌剂，由上述制得的Halomonas elongata ZQ1-3菌液与有机质载体(草炭土︰锯末︰麸皮＝3︰1︰1，质量比)按质量比1︰10的比例混合，制得石油烃降解固体菌剂；自然放置5天后检测，固体菌剂中活菌浓度为3.3×109cfu/g。
实施例3
嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的耐盐性能实验，步骤如下：
(1)调节LB培养基中的NaCl含量，分别配制NaCl质量浓度为3％、6％、9％、12％、15％、18％的LB液体培养基；
(2)取实施例2中步骤(2)制得的种子液，按体积百分比2％的接种量接种至步骤(1)制备的不同NaCl含量的LB液体培养基中；
(3)将步骤(2)接种后的培养液在32℃、溶氧30％的条件下，培养5天。
在培养过程中，每隔12h测定菌液OD600，绘制菌株生长曲线，结果如图2所示，Halomonas elongata ZQ1-3的生长在NaCl低浓度下(3wt％和6wt％)表现出先增加后减少的趋势，而在NaCl高浓度下(9wt％、12wt％、15wt％和18wt％)表现出先增长后趋于稳定的趋势，说明低盐条件不利于Halomonas elongata ZQ1-3的稳定生长，Halomonas elongataZQ1-3具有嗜盐特性。
培养5天后，计活菌数，NaCl质量浓度为3％、6％、9％、12％、15％、18％的LB液体培养基的发酵液中的活菌数分别为3.1×108、3.3×108、2.9×109、3.2×109、3.1×109cfu/mL；上述结果同样说明了Halomonas elongata ZQ1-3在高盐条件下比在低盐条件下生长更好，具有嗜盐特性。
实施例4
嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3高盐环境下在石油污染水体修复中的应用，步骤如下：
(1)将石油-无机盐液体培养基中NaCl的质量浓度分别调至1％、5％、10％、15％、20％，按体积百分比2％的比例接入实施例2中步骤(2)制得的种子液；
(2)将步骤(1)接种后的培养液在摇床中32℃、150rpm培养降解15d。
采用气相法(HJ 1021-2019)检测残留C10-C40的石油烃组分，并计算降解率，结果如图3所示，嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3在NaCl质量浓度1％、5％、10％、15％、20％条件下对石油烃的降解率分别为31.2％、65.7％、29.8％、28.6％、27.3％，而且对石油中的不同碳数石油烃均有较好的降解效果。
本实施例所用石油-无机盐液体培养基，每升组分包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，石油20g，dH2O定容至1L。并根据需求调整培养基中的NaCl的浓度。
实施例5
由嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3制备的石油烃降解菌剂在高盐石油烃污染土壤修复中的应用，步骤如下：
(1)将含油率4.58％的滨海石油污染盐碱土壤(可溶性盐含量为1.08％)与实施例2制得的石油烃降解菌剂按照质量比50:1的比例混合均匀，用灭菌蒸馏水调节菌土混合物含水率为25％，此时的活菌浓度为4.8×108CFU/mL；
(2)保持菌土混合物含水率为25％，自然堆置高度75cm，保持室温(25±5℃)下降解30d。
采用气相法(HJ 1021-2019)检测残留的石油烃组分，并计算降解率，30d后石油污染盐碱土壤的含油率为2.44％，嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3对含油量为4.58％的石油污染盐碱土壤中石油的降解率为46.7％；30天后活菌浓度为3.8×108CFU/mL，说明石油污染盐碱环境基本不会对Halomonas elongata ZQ1-3的生长产生影响，维持了Halomonas elongata ZQ1-3的生长活性，持续发挥对石油烃污染土壤的修复能力。
实施例6
一种石油烃降解复合菌剂，包括嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3和耐盐菌株苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35；将Halomonas elongata ZQ1-3菌液和苍白杆菌MG35菌液与有机质载体混合后制得；
上述石油烃降解复合菌剂在高盐石油烃污染土壤修复中的应用，步骤如下：
(1)将嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3和苍白杆菌MG35分别按照实施例2所述的培养方法进行培养，所得菌液离心，然后用灭菌蒸馏水洗涤菌体2次，重悬，调节重悬菌液至OD600＝1.0；
(2)设置以下三组菌剂：
取OD600＝1.0的苍白杆菌MG35重悬菌液10mL添加至50g有机质载体(草炭土︰锯末︰麸皮＝3︰1︰1，质量比)，室温(25±5℃)放置3d制备菌剂1，活菌浓度为3.52×109cfu/g；
取OD600＝1.0的Halomonas elongata ZQ1-3重悬菌液10mL添加至50g有机质载体(草炭土︰锯末︰麸皮＝3︰1︰1，质量比)，室温(25±5℃)放置3d制备菌剂2，活菌浓度为3.38×109cfu/g；
分别取OD600＝1.0的苍白杆菌MG35重悬菌液5mL和OD600＝1.0的Halomonaselongata ZQ1-3重悬菌液5mL一起添加至50g有机质载体(草炭土︰锯末︰麸皮＝3︰1︰1，质量比)，室温(25±5℃)放置3d制备菌剂3，活菌浓度为3.47×109cfu/g；
50g有机质载体(草炭土︰锯末︰麸皮＝3︰1︰1，质量比)，调节水分含量20％左右室温(25±5℃)放置3d，为对照组CK；
(3)将CK有机质载体以及菌剂1、菌剂2、菌剂3分别添加至500g石油含量(重量法测定)3.23％的石油污染土壤(可溶性盐含量为1.03％)中，调节并保持水分含量为25％，每天搅拌通风一次，降解25d。
重量法监测不同处理组中石油烃的残留，并计算降解率，结果如图4所示，25d后CK组的石油烃降解率为14.3％，菌剂1的石油烃降解率为29.9％，菌剂2的石油烃降解率为32.4％，菌剂3的石油烃降解率为42.2％。可见，菌剂1、菌剂2和菌剂3的是由降解率均高于对照组，其中，两株菌组合形成的复合菌剂对石油烃的降解效率最高，说明两株菌对石油烃降解具有协同促进作用，取得了预料不到的技术效果。
结果分析：
通过实施例3和实施例4中嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的耐盐生长及耐盐石油烃降解数据来看，本发明所公开的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongataZQ1-3在NaCl含量18％时能够正常培养，而且在NaCl含量10％-20％条件下对石油烃也有良好的降解效果。适应范围较广，具有良好的应用价值。
通过实施例6中嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3以及耐盐菌株苍白杆菌MG35复合形成的复合菌剂对石油烃的降解数据，可以看出两株菌复合形成的复合菌剂对石油烃降解有协同增效作用，复合菌剂的应用比单菌效果更佳，具有更好的推广应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生态研究所（山东省科学院中日友好生物技术研究中心）
<120> 一株嗜盐石油烃降解菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> Halomonas elongata ZQ1-3
<400> 1
accgtggtga tcgccctccg aagttaggct aaccacttct ggtgcagtcc actcccatgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtgccattc tgatgcacga 120
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ctttatgaga ttagctccac gtcgccgctt tgcaacccat tgtaccggcc attgtagcac 240
gtgtgtagcc ctacccgtaa gggccatgat gacttgacgt cgtccccacc ttcctccggt 300
ttgtcaccgg cagtctccct agagttcccg accgaatcgc tggcaaatag ggacaagggt 360
tgcgctcgtt acgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac agccatgcag 420
cacctgtctg tgcgctcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttcgc acgatgtcaa 480
gggtaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcgactta 600
gtgcgttaac tgcgccacaa aggtctcgag gaccccaacg gctagtcgac atcgtttacg 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctacccac gctttcgtac ctcagcgtca 720
gtgtcagtcc agaaggccgc cttcgccact ggtattcctc ccgatctcta cgcatttcac 780
cgctacaccg ggaattctac cttcctctcc tgcactctag cctaacagtt ccggatgccg 840
ttcccaggtt gagcccgggg ctttcacaac cggcttatca agccgcctac gcacgcttta 900
cgcccagtaa ttccgattaa cgctcgcacc ctccgtatta ccgcggctgc tggcacggag 960
ttagccggtg cttcttctgc gagtgatgtc tcccttgccg ggtattaacc gacaagcatt 1020
cttcctcgct gaaagtgctt tacaacccga gggccttctt cacacacgcg gcatggctgg 1080
atcagggttg cccccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agttcgggcc 1140
gtgtctcagt cccgatgtgg ctgatcatcc tctcagacca gctacggatc gtcgccttgg 1200
tgagccgtta cctcaccaac cagctaatcc gacataagct catccgatag cgcaaggtcc 1260
gaagatcccc tgctttcccc cgtagggcgt atgcggtatt agcttgagtt tcctcaagtt 1320
atcccccact accgggcaga ttcctatgca ttactcaccc gtccgccgct cgacgcctcc 1380
tagcaagcta gg 1392
Claims (10)
1.一株嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3，其特征在于，于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.20953。
2.如权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的16S rDNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
ii.所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3在含盐量为1～20wt％条件下生长繁殖；
iii.所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3降解C10-C40的饱和烃。
3.权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3划线于固体活化培养基上，活化培养，得活化后菌株；
(2)取步骤(1)得到的活化后菌株接种至液体培养基中，摇床培养，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比1％～10％转接至扩大培养基中，扩大培养，制得Halomonas elongata ZQ1-3菌液。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.步骤(1)中所述固体活化培养基的组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，琼脂20g/L，余量水，pH自然；
ii.步骤(1)中所述活化培养的条件为：28～32℃倒置培养1～2天；
iii.步骤(2)中所述液体培养基与步骤(3)中所述扩大培养基均为高盐液体培养基，组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，余量水，pH自然；
iv.步骤(2)中所述摇床培养的条件为：28～32℃转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养2～5天；
v.步骤(3)中所述扩大培养的条件为：28～32℃、溶氧20～40％的条件下，扩大培养1～2天。
5.一种含有权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3的石油烃降解菌剂。
6.一种石油烃降解液体菌剂，其特征在于，是权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3菌液。
7.一种石油烃降解固体菌剂，其特征在于，是权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3菌液与有机质载体按质量比1︰(10～20)的比例混合制得；
优选的，所述有机质载体为草炭土、锯末和麸皮草，质量比为(1～3)︰(1～3)︰(1～3)；
优选的，所述石油降解固体菌剂的活菌浓度为(2～5)×109cfu/g。
8.一种石油烃降解复合菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3和苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35；
其中，所述苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，2020年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.19745；
优选的，所述嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3和苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的有效菌浓比为(1～3)︰(1～3)；
优选的，所述石油烃降解复合菌剂是将Halomonas elongata ZQ1-3菌液和苍白杆菌MG35菌液与有机质载体按质量比1︰(10～20)的比例混合制得；
优选的，所述有机质载体为草炭土、锯末和麸皮草，质量比为(1～3)︰(1～3)︰(1～3)；
优选的，所述石油烃降解复合菌剂的活菌浓度为(1～10)×109cfu/g。
9.权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3或权利要求5～8任一项所述的菌剂在修复石油污染的水体和/或土壤中的应用。
10.权利要求1所述的嗜盐石油烃降解菌Halomonas elongata ZQ1-3或权利要求5～8任一项所述的菌剂在盐碱环境石油污染水体和/或土壤修复中的应用。
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