CN111647528B - 一种具有解磷作用的石油降解菌及其培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有解磷作用的石油降解菌及其培养方法与应用，本发明公开了一株苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，菌种保藏号CGMCC No.19745，该菌株具有降解石油、解磷和耐盐的作用，在石油污染土壤的修复及生态恢复方面有非常明显的优势。

Description

一种具有解磷作用的石油降解菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一种具有解磷作用的石油降解菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
随着石油产品需求量的不断增加，石油及其制品通过多种途径进入环境，对土壤和水体造成了严重污染，并且威胁着人类的健康，石油污染土壤技术的研究及应用正日益受到广泛重视与关注。石油降解是指利用物理修复、化学修复、生物修复技术等手段来使石油降解和分散，从而达到治理石油污染的目的。由于物理修复(如热处理)在破坏土壤中污染物的同时也破坏了土壤的组分和结构，而且价格昂贵；化学修复效果较好，但所使用的化学试剂会产生二次污染，限制了其应用范围；然而用生物降解的方法优点是迅速，无残毒，低成本，因此受到广泛关注。
生物降解是指由生物催化的复杂化合物的分解过程。而在石油降解中微生物首先通过自身的代谢产生分解酶，裂解重质的烃类和原油，降低石油的粘度，另外在其生长繁殖过程中，能产生诸如溶剂、酸类、气体、表面活性剂和生物聚合物等有效化合物利于驱油，然后由其他的微生物进一步的氧化分解成为小分子而达到降解的目的。
目前生物修复技术被认为是一种绿色环保、无二次污染、高效、可彻底降解污染物的具有发展前景的石油污染修复方法。但由于微生物的降解作用受其自身生长条件的限制，并且其在进行石油降解过程中能否与其他微生物协同进行石油降解直接决定了最终的降解速度和降解程度，因此筛选具有不同功能的石油降解菌，为后续构建能够协同进行石油降解的微生物菌群奠定基础。
微生物生长繁殖过程中遗传物质的合成等过程需要磷元素，因此，有效磷的存在对石油污染土壤修复过程微生物的繁殖有很大影响，直接影响了修复效率。而且石油污染土壤的生态恢复、植物生长等也需要磷的存在。具有解磷作用的微生物是石油污染区域生物修复及生态恢复的需要。
我国主要石油开采区与盐渍化区域高度重合，严重影响该区域的农业可持续发展。长期的自然及人为活动等因素的影响，导致我国北方形成大面积的盐渍土区域，目前，我国盐渍化土壤、残余盐渍化土壤以及潜在盐渍化土壤的总面积超过100万平方公里，占我国陆地面积的1/10，而且主要集中在华北、东北以及西北农耕区。而且，胜利油田、大庆油田、辽河油田、大港油田、长庆油田、延长油田、新疆油田、塔河油田、塔里木油田、青海油田等北方主要油田的采油区域与我国我盐渍化土壤覆盖区域高度重合，石油污染与盐渍化的双重胁迫严重影响农作物的生长，一般石油烃降解微生物在盐渍化土壤环境中修复效率极低。高盐环境的石油污染土壤修复时，石油烃降解微生物投加到高盐环境的石油烃类污染土壤后，初期具有良好的修复效果，但在很短的时间，例如，一个月甚至半个月，在盐碱环境的胁迫下，投加的微生物在土壤菌群结构中所占比例迅速下降，而快速回复到以耐盐或嗜盐微生物为主的稳定结构，严重影响了石油烃类的降解修复效果。因此，耐盐的降解石油烃类的微生物的筛选对生物修复的应用推广至关重要。
解磷菌，又称溶磷菌，是指土壤中具有能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态这种能力的微生物。土壤磷素循环是以微生物活动为中心的，微生物的活动对土壤中磷元素的转化和有效性影响很大。
现有技术中均是采用多种不同功能的微生物进行复合，制备复合菌剂实现石油的降解。但由于微生物之间存在营养物质的竞争抑制，因此在实际使用过程中受限制因素较多。中国专利文献CN109321504A(申请号201811356566.2)公开了一种复合功能石油烃降解微生物菌剂及其制备方法与应用。一种油泥石油降解菌剂，包括如下有效活菌成分：解磷菌、固氮菌、石油烃降解菌；所述解磷菌为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，菌种保藏号CGMCC No.16104；所述石油烃降解菌为石油烃降解菌(Bacillusparamycoides)3，菌种保藏号CGMCC No.16238。
现有技术中对苍白杆菌的应用报道较多，但是同一种苍白杆菌具有多种功能报道较少，进一步的就一种苍白杆菌同时具有降解石油的作用、解磷的作用和耐盐的作用，尚未见相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种具有解磷作用的石油降解菌及其培养方法与应用。
本发明技术方案如下：
一株苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，2020年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.19745。
所述苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35下述简称为苍白杆菌MG35
上述苍白杆菌MG35的培养方法，包括如下步骤：
(1)取苍白杆菌MG35接种于固体活化培养基，活化培养，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至液体培养基中培养，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比2％～10％转接至扩大培养基中，扩大培养，制得(5～10)×109cfu/mL的菌液。
根据本发明优选的，步骤(1)中，取苍白杆菌MG35划线于固体活化培养基上。
根据本发明优选的，步骤(1)中，固体活化培养基的组份包括如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，琼脂20g/L，余量水，pH自然。
根据本发明优选的，步骤(1)中，活化条件为：28～32℃倒置培养1～2天。
根据本发明优选的，步骤(2)中的液体培养基与步骤(3)中的扩大培养基相同，包括组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，余量水，pH自然。
根据本发明优选的，步骤(2)中的培养条件为：培养温度为28～32℃，转速为100～200转/分钟的条件下，培养1～2天。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的扩大培养条件为：28～32℃、溶氧20～30％的条件下，扩大培养1～2天。
一种石油降解菌剂，由上述制得的菌液与有机质载体按质量比1︰(10～20)的比例混合，制得石油降解菌剂。
根据本发明优选的，所述有机质载体为草炭土。
根据本发明优选的，所述石油降解菌剂的活菌浓度为(2～5)×109cfu/g。
所述石油降解菌剂为菌液与有机质载体混合制得，由于有机质载体可以为菌剂提供一定的营养物质，所以菌剂在有机质载体中能够繁殖。
上述苍白杆菌MG35在处理石油污染的水体和/或土壤中的应用。
上述石油降解菌剂在处理石油污染土壤中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
向含油量为3～10％的石油污染土壤中接种所述石油降解菌剂，石油降解菌剂与石油污染土壤的质量比为(1～5)︰100，调节含水率为20～25％，混合混匀，自然堆置进行降解。
上述苍白杆菌MG35在降解土壤中难溶性磷的应用。
上述苍白杆菌MG35在盐碱性土壤中降解难溶性磷的应用。
上述苍白杆菌MG35在盐碱性土壤中降解石油和难溶性磷的应用。
本发明技术方案的有益效果
1、本发明从滨海盐碱石油污染土壤中筛选获得了一株耐盐的、具有解磷作用的石油降解菌，该株菌既具有耐盐、解磷作用，还可以利用石油作为唯一碳源进行石油的降解，由于我国大部分油田为盐碱环境，因此本发明的涉及的菌剂适合我国大部分油田，具有广阔的市场应用前景。
2、本发明涉及的菌剂具有解磷作用，能促进微生物的石油降解活性，并且能促进石油污染修复区域植物的生长，有利于污染区域的修复和相应生态环境的恢复。
3、本发明制得的菌剂，对高盐碱环境下含油量为3～10％的石油污染土壤或油泥的降解率在30d内可达21～50％。
附图说明
图1是苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35菌种鉴定时16S rDNA扩增后的电泳结果照片；
图中：泳道M是:D2000 DNA Marker，泳道MG35是：苍白杆菌(Ochrobactrumdaejeonense)MG35菌种16S rDNA扩增后的泳道。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。
生物材料
苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，2020年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.19745。
培养基
无机盐培养基，每升组份包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，dH2O定容至1L；
石油-无机盐固体培养基，每升组份包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，石油100g，琼脂20g，dH2O定容至1L。
石油-无机盐液体培养基，每升组份包括如下：
KNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 130g，FeSO4·7H2O 0.01g，石油100g，dH2O定容至1L。
实施例1
一株苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的分离和鉴定
采集胜利油田滨海高浓度石油污染土壤2g，置于150mL无菌三角瓶中，加入无菌无机盐培养基50mL，在30℃、150rpm条件下培养3d，吸取菌液，用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5倍，各涂布100μL至无菌的石油-无机盐固体培养基，在30℃条件下静置培养3d，挑取生长快、菌落大的克隆至50mL石油-无机盐液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养3d，即吸取100μL菌液涂布至无菌的石油-无机盐固体培养基，挑取单菌落。
取培养后的菌落送测序公司进行测序，经检测，16S rDNA序列含有1356bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
菌种鉴定过程如下：
样品：本发明涉及的细菌菌液；
细菌基因组DNA提取试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
TAE缓冲液(50×，1L)：Tris 242g、冰醋酸57.1ml、Na2EDTA.2H2O 37.2g、加水至1L；
琼脂糖：BIOWET，AGAROSE G-10；
2×Pfu PCR MasterMix、D2000 DNA Marker、核酸染料，loading buffer等：生工生物工程(上海)股份有限公司；
DNA纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
离心管、枪头等耗材：美国Gene Era Biotech公司
引物：由苏州金唯智生物科技有限公司合成，按照合成单加入ddH2O，制成10μM溶液。
1、基因组DNA提取，按DP302试剂盒操作。
2、PCR扩增
2.1通用引物信息，见表1
表1
Figure BDA0002504668630000051
2.2 PCR扩增体系组分及构成，见表2
表2
Figure BDA0002504668630000052
Figure BDA0002504668630000061
2.3 PCR循环参数
预变性：94℃，3min；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸，72℃，1.5min(共35个循环)；延伸72℃，10min；4℃保存。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
制备1.0％的琼脂糖凝胶，电泳时电压设置为18V/cm，电泳时间为20min。采用核酸染料进行琼脂糖电泳染色，采用紫外凝胶成像系统进行拍照。结果如图1所示。
4、纯化回收
使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
测序拼接序列及blast比对：见表3
表3
Figure BDA0002504668630000062
通过序列16S rDNA进行序列比对，发现遗传关系最接近的菌株编号为NR_117262.1。
经上述菌种鉴定，本发明涉及的菌种属于Ochrobactrum daejeonense，命名为苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35，2020年4月27号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No.19745。
实施例2
一株苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的培养及菌剂的制备方法，步骤如下：
本实施例所用培养基：
液体培养基，每升组分包括如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钾20g，七水硫酸镁15g，氯化钠130g，水定容至1L，pH自然。
固体培养基，每升组分包括如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钾20g，七水硫酸镁15g，氯化钠130g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
(1)取苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35划线于上述固体培养基上，32℃倒置活化培养2天，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至上述液体培养基中，32℃转速为150转/分钟的条件下，摇床培养2天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比2％转接至上述液体培养基中，32℃、溶氧30％的条件下，扩大培养2天，制得发酵菌液，活菌浓度为2×109cfu/mL。
一种石油降解菌剂，由上述步骤(3)制得的菌液与草炭土按质量比1︰10的比例混合，制得石油降解菌剂；自然放置两天后检测，所述菌剂的活菌浓度为2.3×109cfu/g。
实施例3
苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的耐盐实验，步骤如下：
(1)调节LB培养基中的NaCl含量，分别配制NaCl质量浓度为3％、6％、9％、12％、15％的LB液体培养基；
(2)取实施例2中步骤(2)制得的种子液，按2％的接种量接种至本实施例3步骤(1)制备的不同NaCl含量的LB液体培养基中；
(3)将步骤(2)接种后的培养液在32℃、溶氧30％的条件下，培养2天，计活菌数；NaCl质量浓度为3％、6％、9％、12％、15％的LB液体培养基的发酵液中的活菌数分别为2.6×109、3.1×109、3.2×109、3.3×109、3.2×109cfu/mL。
实施例4
苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35在石油降解中的应用，步骤如下：
(1)将含油率5.15％的滨海石油污染盐碱土壤与实施例2制得的石油降解菌剂按照质量比20:1的比例混合均匀，用灭菌蒸馏水调节含水率为20％；
(2)保持菌土混合物水分20％，保持室温(25±5℃)下降解30d；
采用红外分光光度法(HJ1051-2019)测土壤中的石油的降解率，苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35对含油量为5.15％的石油污染盐碱土壤石油降解率在30d后剩余含油率为3.54％，降解率可达31.3％。
实施例5
苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的解磷作用的应用，步骤如下：
向含NaCl质量浓度为12％，同时含Ca3(PO4)2浓度为1％的盐渍土壤中接种实施例2步骤(3)制备的苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35的发酵菌液，按照质量体积比20：1的比例接种，单位g/ml，在温度为32℃的条件下，培养5天，采用NYT 1121.7-2014规定的方法检测初始土壤中有效磷含量为66mg/kg，以接种灭活的苍白杆菌(Ochrobactrumdaejeonense)MG35菌液的上述土壤作为对照，在温度为32℃的条件下，培养5天，检测对照土壤中可溶性磷酸盐含量。
经检测，接种苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)MG35菌液的土壤中可溶性磷酸盐含量增加至625mg/kg，而对照土壤中可溶性磷酸盐含量为68mg/kg，较初始含量几乎无变化。
结果分析
通过上述实施例的降解数据可以看出，本发明所公开的苍白杆菌(Ochrobactrumdaejeonense)MG35在进行污染介质中石油烃降解的同时，可以释放土壤中结合态的磷为有效磷，而有效磷是微生物生长繁殖及植物生长所必需的营养来源，并且该菌具有耐盐性，因此，本菌株在石油污染土壤的修复及生态恢复方面有非常明显的优势，有较为广阔的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东迈科珍生物科技有限公司
<120> 一种具有解磷作用的石油降解菌及其培养方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1356
<212> DNA
<213> Ochrobactrum daejeonense
<400> 1
gcgccttcgg gtaaaaccaa ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa 60
cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccaacttca tgcactcgag 120
ttgcagagtg caatccgaac tgagatggtt tttggagatt agctcacact cgcgtgctcg 180
ctgcccactg tcaccaccat tgtagcacgt gtgtagccca gcccgtaagg gccatgagga 240
cttgacgtca tccccacctt cctctcggct tatcaccggc agtcccctta gagtgcccaa 300
ctcaatgctg gcaactaagg gcgagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360
acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtctccg atccagccga actgaagaag 420
agtgtctcca ctctccgcga tcgggatgtc aagggctggt aaggttctgc gcgttgcttc 480
gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagttttaat 540
cttgcgaccg tactccccag gcggaatgtt taatgcgtta gctgcgccac cgaagagtaa 600
actccccaac ggctaacatt catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
ttgctcccca cgctttcgca cctcagcgtc agtaatggac cagtgagccg ccttcgccac 720
tggtgttcct ccgaatatct acgaatttca cctctacact cggaattcca ctcacctctt 780
ccatactcaa gactaacagt atcaaaggca gttccggggt tgagccccgg gatttcaccc 840
ctgacttatt agtccgccta cgtgcgcttt acgcccagta aatccgaaca acgctagccc 900
ccttcgtatt accgcggctg ctggcacgaa gttagccggg gcttcttctc cggttaccgt 960
cattatcttc accggtgaaa gagctttaca accctagggc cttcatcact cacgcggcat 1020
ggctggatca ggcttgcgcc cattgtccaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 1080
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggctga tcatcctctc agaccagcta tggatcgtcg 1140
ccttggtagg cctttacccc accaactagc taatccaacg cgggctcatc atttgccgat 1200
aaatctttcc cccccataaa atgccagggc attttatgat tcctgaaatt ttaaaggggg 1260
gcacatacgg tattagcagt cgtttccaac tgttgttccg tagcaaatgg tagattccca 1320
cgcgttactc acccgtctgc cgctccctcc gaagag 1356

Claims (9)

1.一株苍白杆菌（Ochrobactrum daejeonense）MG35，2020年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No. 19745。
2.权利要求1所述的苍白杆菌（Ochrobactrum daejeonense）MG35的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取苍白杆菌MG35接种于固体活化培养基，活化培养，制得活化后菌株；
（2）取步骤（1）制得的活化后菌株接种至液体培养基中培养，制得种子液；
（3）取步骤（2）制得的种子液，按体积百分比2%～10%转接至扩大培养基中，扩大培养，制得（5～10）×109cfu·mL-1的菌液；
步骤（1）中，取苍白杆菌MG35划线于固体活化培养基上；
步骤（1）中，固体活化培养基的组份包括如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，琼脂20g/L，余量水，pH自然；
步骤（1）中，活化条件为：28～32℃倒置培养1～2天；
步骤（2）中的液体培养基与步骤（3）中的扩大培养基相同，包括组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钾20g/L，七水硫酸镁15g/L，氯化钠130g/L，余量水，pH自然；
步骤（2）中的培养条件为：培养温度为28～32℃，转速为100～200转/分钟的条件下，培养1～2天；
所述步骤（3）中的扩大培养条件为：28～32℃、溶氧20～30%的条件下，扩大培养1～2天。
3.一种石油降解菌剂，其特征在于，由权利要求2制得的菌液与有机质载体按质量比1︰（10～20）的比例混合制得；所述有机质载体为草炭土。
4.如权利要求3所述石油降解菌剂，其特征在于，所述石油降解菌剂的活菌浓度为（2～5）×109cfu/g。
5.权利要求1所述苍白杆菌（Ochrobactrum daejeonense）MG35在处理石油污染的水体和/或土壤中的应用。
6.权利要求1所述苍白杆菌（Ochrobactrum daejeonense）MG35在降解土壤中难溶性磷的应用。
7.权利要求1所述苍白杆菌（Ochrobactrum daejeonense）MG35在盐碱性土壤中降解难溶性磷的应用。
8.权利要求3所述的石油降解菌剂在处理石油污染土壤中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用，步骤包括如下：
向含油量为3～10%的石油污染土壤中接种所述石油降解菌剂，石油降解菌剂与石油污染土壤的质量比为（1～5）︰100，调节含水率为20～25%，混合混匀，自然堆置进行降解。
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