CN101838616B

CN101838616B - 一株可降解多环芳烃的盐单胞菌及其应用

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Publication number: CN101838616B
Application number: CN2009100800129A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 赵百锁; 宁大亮
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2009-03-17
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2029-03-17
Also published as: CN101838616A

Abstract

本发明公开了一株可降解多环芳烃的盐单胞菌及其应用。本发明的仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941是盐单胞菌属的新菌种，分离自石油污染的高盐环境，能够降解菲、蒽或荧蒽等多种多环芳烃，并利用菲、蒽或荧蒽作为生长的唯一碳源。在盐度为5％、加有0.5％酵母粉的液体培养基中，10天内能将100mg/L的菲全部降解，平均降解速率达10mg/(L·d)；同时该菌株能够在高盐度(27.5％)和较宽的盐度范围内(0.05～27.5％)生长，属于中度嗜盐细菌类，对控制盐环境中多环芳烃的污染有独特的优势，尤其适合高盐环境以及盐浓度变化较大的环境。本发明的仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941可用于多环芳烃的降解。

Description

一株可降解多环芳烃的盐单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株可降解多环芳烃的盐单胞菌及其应用。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是指两个或两个以上苯环以链状、角状或串状排列组成的化合物，主要来自于木材、化石燃料、煤焦油产品或食物等有机质的不完全燃烧，多环芳烃在环境中分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中都有检出。多环芳烃大多数为有毒物质，许多有三致效应，即致癌、致畸变和致突变，迄今为止已发现的多环芳烃类致癌物及其衍生物已经超过400种，不乏苯并(a)芘这样的强致癌物质。多环芳烃具有的半挥发性、亲脂性、高生物蓄积性和难降解等特性，使其能够在环境中长时间存在、长距离迁移并富集于生物体，给人类健康和生态系统安全造成长期而严重的危害。因此，1998年，美国、加拿大和欧洲共32个国家订立的《关于长距离越境空气污染物公约》中将多环芳烃明确定为必须控制的持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)。

环境中的多环芳烃除少部分可以发生光化学分解外，大部分主要依赖生物降解途径慢慢消失，因此微生物降解是控制多环芳烃污染较为经济有效的方法。然而，多环芳烃污染常常伴随着盐浓度较高的环境，例如多环芳烃随着石油的突发事故、落地油及含油污水排放等对沿海湿地中的盐碱滩环境造成严重污染，含油和含盐量都比较高(盐度＞3.5％w/v)的油田采出水排放会使接纳环境中的盐度和多环芳烃含量同时升高，酿成污染。普通降解菌虽然能有效降解多环芳烃却难以在较高的盐浓度下生长，而嗜盐降解菌的研发能够解决这一矛盾，因此对控制多环芳烃污染有重要意义。

中度嗜盐菌是指能够在盐浓度为3％～15％的条件下有最佳生长能力的极端微生物类群。中度嗜盐菌分布极其广泛，在盐湖、海洋等盐水环境，盐碱地、盐池等盐土环境和盐渍发酵食品等人工环境中都能够被发现。中度嗜盐菌易于在高盐环境中生长繁殖，因而能够最大程度减少发酵过程中其它菌类的污染；同时营养要求比较简单，可以利用多种有机物作为碳源和氮源；它们独特的生理生化特性使其具有较高的应用价值。中度嗜盐菌在高盐浓度下能够降解苯甲醛、苯酚等有毒有害的难降解物质，所以利用中度嗜盐菌在生理生化上的独特优势来处理环境污染日益受到关注。Maltseva等人分离的I-18菌株具有高活性的儿茶酚过氧化酶、粘康酸环异构酶和二烯内脂水解酶活性，在含有5.85％NaCl、pH 8.4～9.4的条件下可降解苯甲酸、3-氯苯甲酸和4-氯苯甲酸。海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)在高达20％的盐浓度下仍能降解烃类。盐单胞菌(Halomonas halodurans)可裂解苯甲酸脂和芳烃类的芳香环。有些盐单胞菌(Halomonas)的菌株可以降解酚类物质，也有些盐单胞菌科(Halomonadaceae)的菌株能够利用氯代芳烃化合物作为碳源和能源。已有研究采用含中度嗜盐菌的生物膜反应器处理盐度达15％的污水，苯酚的降解率达到99％。然而，目前关于可降解多环芳烃的中度啫盐菌的报道还很少，已发现的多环芳烃降解菌中，缺少像中度嗜盐菌这样能在高盐度和较宽的盐度范围发挥降解作用的菌种，也很少有能够降解多种多环芳烃类物质的嗜盐菌。

发明内容

本发明的目的是提供一株可降解多环芳烃的盐单胞菌。

本发明所提供的盐单胞菌是从山东省东营市仙河镇胜利油田的土壤中筛选得到的。根据其形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等证实属于盐单胞菌属(Halomonas)，将其命名为仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1。仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1已于2009年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №2941。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状、无鞭毛，没有运动性，大小为(1.15～1.40)μm×(0.50～0.63)μm。该菌株的菌落呈圆形、光滑、隆起、黄色、有光泽、边缘整齐特征。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941为好氧细菌，可生长pH范围为5.5～9.0，最适生长pH值为7.2；可生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为30℃；该菌株属于嗜盐微生物，能在0.05～27.5％的盐度范围内进行生长繁殖，最适宜生长的盐度范围为4～10％。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941无法利用蔗糖、麦芽糖、α-乳糖和D-木糖产酸，可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖产酸；该菌株不能水解明胶和吐温80；该菌株的氧化酶、过氧化氢酶、脲酶为阳性，DNA酶为阴性；该菌能使硝酸盐还原，但不具有亚硝酸盐还原能力；该菌能利用D-阿拉伯糖、D-纤维二糖、乳糖、酪氨酸、L-天冬酰胺作为唯一碳源和能源。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941对抗生素中的磺胺甲恶唑、氯林霉素和万古霉素敏感，而对头孢曲松、头孢噻肟钠、头孢噻酚钠、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、氨苄青霉素、克拉霉素、红霉素、盘尼西林和四环素具有抗性。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941细胞中的脂肪酸主要包括十六碳饱和脂肪酸(27.1％)、十六碳ω7c单不饱和脂肪酸(24.0％)、十八碳ω7c单不饱和脂肪酸(21.27％)、ω8c-环式十九碳饱和脂肪酸(8.0％)和3-羟基十二碳饱和脂肪酸，并含有少量的十二碳饱和脂肪酸(3.84％)和十碳饱和脂肪酸(2.79％)；主要呼吸醌为泛醌Q9。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941的G+C摩尔百分含量为67.1％；该菌株16S rRNA基因序列的GenBank登录号为EF421176，与盐单胞菌属的模式菌株期望盐单胞菌DSM 9502^T(Halomonas desiderata DSM 9502^T)、壁生盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonas muralis DSM 14789^T)、潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 9661^T(Halomonas pantelleriensis DSM 9661^T)和坎帕尼亚盐单胞菌DSM15293^T(Halomonas campaniensis DSM 15293^T)的16S rRNA基因序列同源性分别为96.0％、95.6％、95.5％和95.3％，与盐单胞菌属其它菌株的16S rRNA基因序列相似性低于95％。

仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941与壁生盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonas muralis DSM 14789^T)和潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 9661^T(Halomonas pantelleriensis DSM 9661^T)的DNA杂交同源性都很低，分别为18％和18％；同时，该菌株的生理生化特性、细胞壁脂肪酸组成也与上述模式菌株有明显差异，说明仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941是盐单胞菌属的一个新菌种。

本发明的另一个目的是提供一种降解多环芳烃的方法。

本发明所提供的降解多环芳烃的方法，是用所述仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis)A-1 CGMCC №2941对待测样品进行处理，使多环芳烃得到降解。

上述方法中，所述多环芳烃为菲、蒽或荧蒽。

以仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941为活性成分制备的生物制剂也属于本发明的保护范围。

本发明的仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941是盐单胞菌属的新菌种，分离自石油污染的高盐环境，能够降解菲、蒽或荧蒽等多种多环芳烃，并利用菲、蒽或荧蒽作为生长的唯一碳源。在盐度为5％、加有0.5％酵母粉的液体培养基中，10天内能将100mg/L的菲全部降解，平均降解速率达10mg/(L·d)；同时该菌株能够在高盐度(27.5％)和较宽的盐度范围内(0.05～27.5％)生长，属于中度嗜盐细菌类，对控制盐环境中多环芳烃的污染有独特的优势，尤其适合高盐环境以及盐浓度变化较大的环境。本发明的仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941可用于多环芳烃的降解。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。

附图说明

图1为仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941在扫描电子显微镜下的形态照片

图2为仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941在透射电子显微镜下的形态照片

图3为仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941的16S rRNA基因序列的系统发育分析图

图4为仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941对菲的降解曲线图

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941的分离及鉴定

一、采用醋酸-硝酸混合纤维素膜平板法分离菌株

海盐合成培养基(SSDM)的组成为：NaCl 79.45g/L、MgCl₂·6H₂O 6.9g/L、MgSO₄·7H₂O 10.45g/L、CaCl₂·7H₂O 0.75g/L、KCl 2.1g/L、NaHCO₃0.1g/L、NaBr0.25g/L、微量元素溶液1mL/L；以上各成分的含量对应盐度为10％的培养基(培养基的盐度等于培养基中各无机盐组分质量之和除以培养基的体积)，其它盐度的培养基可按此比例进行配制；另含有(NH₄)₂SO₄4.0g/L，其余为水；采用5M KOH浓缩液调节培养基的pH至7.5。其中，微量元素溶液的组成为：Ca(NO₃)₂·4H₂O800mg/L、FeSO₄.7H₂O 400mg/L、CuSO₄·5H₂O 80mg/L、ZnSO₄·7H₂O 40mg/L、MnSO₄·4H₂O 40mg/L、NaMO₄·2H₂O 8mg/L、H₃BO₃6mg/L、K₂HPO₄500mg/L，其余为水。

将菲、蒽和荧蒽分别溶解于乙醚中，分别配制成浓度为1mg/mL的菲溶液、蒽溶液和荧蒽溶液。

在盐度为5％的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1.5～1.8％的琼脂糖后，0.06MPa条件下灭菌20min，随后趁热将培养基均匀倾倒于玻璃培养皿中，等培养基凝固后，放置于37℃环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面覆上已灭菌的醋酸-硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0.45μm、直径90mm，购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上分别加1mL上述配制的浓度为1mg/mL的菲的乙醚溶液、蒽的乙醚溶液或荧的乙醚溶液并涂布均匀，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将1mL不含菲、蒽或荧蒽的乙醚涂布在上述纤维素膜平板上作为空白对照。

将采自山东省东营市仙河镇胜利油田的土壤样品加入到盐度为5％的上述海盐合成培养基中，常温条件下200r/min振荡30min；吸取1mL悬浮液于离心管中，5000r/min离心10min；弃去上清液，再加入相同体积的盐度为5％的上述海盐合成培养基进行洗涤。以上洗涤过程重复3次，再将菌体沉淀进行一系列梯度稀释后分别涂布在上述含有菲、蒽或荧蒽的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上，将涂布后的平板置于30℃条件下静置培养15天。实验设三次重复。

结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加菲、蒽或荧蒽作为碳源的平板上，土壤样本中的微生物无法生长；相应的，在加有菲、蒽或荧蒽的平板上有菌株能够生长，说明这些单菌落对应的菌株能够降解菲、蒽或荧蒽并以菲、蒽或荧蒽为唯一碳源生长。挑取能够降解菲的单菌落A-1作进一步研究。

二、菌株的形态特征

SSDMY培养基的配制：在盐度为5％的上述步骤一的海盐合成培养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为5.0g/L，0.06MPa条件下灭菌20min。

将上述步骤一分离得到的菌株A-1接种至SSDMY培养基中，当细胞生长至对数生长后期，菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。

将处于对数生长期的细胞，采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态，结果如图1和图2所示；同时进行革兰氏染色，于40×100倍的光学显微镜下观察菌体细胞的形态。

结果表明，上述步骤一筛选到的菌株的菌落直径为2～4mm，呈圆形、光滑、隆起、黄色、有光泽、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈杆状、无鞭毛，没有运动性，大小为(1.15～1.40)μm×(0.50～0.63)μm。

三、菌株的生长特性

上述步骤一筛选到的菌株属于革兰氏阴性、好氧细菌。该菌株最适生长pH值是7.2，可生长pH范围是5.5～9.0；最适生长温度为30℃，可生长的温度范围为10～42℃。该菌株属于中度嗜盐细菌，能在0.05～27.5％的盐度范围内进行生长繁殖，适宜生长盐范围度为4～10％。

四、菌株的生化特征

1、碳源利用

以SSDM为基本培养基，另包括以Biolog通用的95种碳源的糖、醇、酸作为唯一碳源，检查菌株细胞的生长。

2、糖类产酸

糖类产酸培养基的组成为：(NH₄)₂HPO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、KCl 0.2g/L、酵母浸膏0.2g/L、糖或醇类10g/L，pH 7.2～7.5；上述培养基配好后，加入质量百分含量为2％的溴百香里兰，使其在培养基中的终浓度为1mL/L。

在糖类产酸培养基中分别加入D-半乳糖、海藻糖、D-葡萄糖、甘露糖、D-术糖、D-果糖、麦芽糖和蔗糖，使其在培养基中的终浓度为1％，调节培养基的pH为7.5；再在每升培养基中加入质量百分含量为1.6％的溴甲酚紫水溶液1～2mL，该指示剂的变色范围为pH 4.5(黄色)～7.0(紫色)。将上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中后，35℃培养24h后开始观察培养基的颜色。以不接种上述步骤一筛选到的菌株的试管为阴性对照。培养基颜色变黄色者为产酸阳性菌株，阴性反应要连续观察7～14d。

3、淀粉水解

肉汤培养基的组成为：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L。

在肉汤培养基中加入可溶性淀粉，使其在培养基中的终浓度为0.2％。将上述步骤一筛选到的菌株点接于上述培养基平板上(每个平板点接5株)，35℃培养2～5d形成菌苔后，在平板上滴加Lugal氏碘液(同革兰氏染色的碘液)，使碘液覆盖在平板表面。如在菌苔周围或菌苔下(将菌苔移去后观察)的培养基由蓝色变为透明，则为淀粉水解阳性菌株；若菌苔下和菌苔周围的培养基都为深蓝色，说明该菌株为淀粉水解阴性。

4、明胶水解

明胶水解培养基的组成为：蛋白胨5g/L、明胶100～150g/L，pH 7.2～7.4。

将明胶水解培养基调pH为7.2～7.4，分装于试管中，使管中培养基的高度约为4～5cm。取上述步骤一筛选到的菌株穿刺接种于上述培养基中，20℃培养2d后观察结果。为判断阴性结果，需培养3～4周。若培养基部分或者全部变成可流动的流体，则为明胶水解阳性菌株；若仍为固态，则说明是明胶水解阴性菌株。

5、吐温80水解

在盐度为5％的SSDMY培养基中加入吐温80，使其在培养基中的终浓度为1％，将上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中，每个平板点接3～5株，35℃培养2～4d，菌落周围有白色晕圈出现为阳性反应。

6、氧化酶活性

将上述步骤一筛选到的菌株接种在SSDMY固体培养基上，30℃培养24h。在一干净的培养皿内放一张“新华1号”定性滤纸，滴加质量百分含量为1％的四甲基对苯二胺盐酸盐溶液使滤纸浸湿，用竹签挑取菌苔，在滤纸上画线。1min之内滤纸变紫色者为阳性反应，反之为阴性反应。

7、过氧化氢酶活性

将上述步骤一筛选到的菌株接种于SSDMY固体培养基斜面上，30℃培养24h，在菌苔上加入数十滴体积百分含量为3％的H₂O₂溶液，立即检查结果。在5min之内出现气泡者为阳性反应，但是往往立即出现气泡，个别菌株也会在1min之内出现气泡；无气泡出现者为阴性反应。

8、DNA酶活性

提取上述步骤一筛选到的仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941的DNA，在盐度为5％的SSDMY培养基中分别加入上述DNA和甲苯胺兰(Toluid-blue)，使其在培养基中的终浓度分别为2‰和0.1‰，将上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中，每个平皿点接3～5株，35℃培养2～4d，如果菌落周围有粉红色晕圈出现则为反应阳性，反之为阴性。

9、脲酶活性

在盐度为5％的SSDMY培养基中加入酚红，调节pH值，使溶液呈橙黄色，0.06MPa灭菌20min，待培养基冷却至40～50℃时加入过滤除菌的尿素溶液，使其在培养基中的终浓度为2％，制作试管斜面。将上述步骤一筛选到的菌株划线接种于上述试管斜面上，35℃培养2～4d后观察结果，培养基变成粉红色为阳性，反之为阴性反应。

10、硝酸盐还原反应

硝酸盐还原能力检测培养基的组成为：蛋白胨10g/L、琥珀酸钠10g/L、NaNO₃1g/L、K₂HPO₄1g/L、MgSO₄0.5g/L、KCl 0.2g/L；pH 7.2。

将上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中，分别在接种2、5和7d后检查硝酸盐还原情况，以不接种上述步骤一筛选到的菌株的培养基作为空白对照。

具体检查方法如下：在白色比色皿中加入1滴含有上述步骤一筛选到的菌株的菌液，再加入Griess试剂A、B各1滴，如出现粉红、玫瑰红、橙色或棕色，则表明硝酸盐被还原成亚硝酸；如加入Griess试剂后无颜色变化，可加入二苯胺试剂3～5滴，若出现蓝色反应，说明培养液中的硝酸盐依然存在，则该菌为硝酸盐反应阴性；如果加入二苯胺试剂后无任何颜色出现，说明亚硝酸盐被进一步分解为其他产物，为硝酸盐反应阳性。

以上实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株不能利用蔗糖、麦芽糖、α-乳糖和D-木糖产酸，可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖产酸；该菌株不能水解吐温80、明胶和可溶性淀粉；该菌株有氧化酶、过氧化氢酶、脲酶和硝酸盐还原的活性，但是没有DNA酶、亚硝酸还原的活性；该菌株能利用D-阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、酪氨酸、L-天冬酰胺作为唯一碳源和能源。

五、抗生素抗性

上述步骤一筛选到的菌株对抗生素中的磺胺甲恶唑、氯林霉素和万古霉素敏感；而对头孢曲松、头孢噻肟钠、头孢噻酚钠、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、氨苄青霉素、克拉霉素、红霉素、盘尼西林和四环素具有抗性。

六、与盐单胞菌属模式菌株生理生化特征的比较

将上述步骤一筛选到的菌株的生理生化特征与盐单胞菌属模式菌株的生理生化特征相比较，结果如表1所示。其中，潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 9661^T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661^T)和壁生盐单胞菌DSMZ 14789^T(Halomonas muralisDSMZ 14789^T)均来自德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Culture，DSMZ)。

表1筛选得到的菌株与盐单胞菌属模式菌株的生理生化特征比较

表1中，+表示结果为阳性，-表示结果为阴性，ND表示未检测，W表示反应较弱。

七、菌株的细胞化学成分分析

1、呼吸醌的检测

(1)取质量大于1mg的上述步骤一筛选到的菌株，10000r/min离心10min，用30mL质量百分含量为1％的NaCl溶液洗涤菌体，离心。

(2)将上述步骤(1)得到的菌体沉淀转入50mL离心管中，加入质量百分含量为1％的NaCl溶液10mL和由氯仿-甲醇组成的混合液(氯仿和甲醇的体积比为2∶1)20mL，振荡均匀直至菌体分散，4℃10000r/min离心10min。

(3)离心后样品分三层，上层是水，中层是残渣物，下层是氯仿(脂溶性成分)，用滴管小心去除上层水层，将下层氯仿层转移至100mL茄形瓶中。

(4)再次用20mL由氯仿-甲醇组成的混合液(氯仿和甲醇的体积比为2∶1)对中间混层进行萃取，振荡30min以上，4℃10000r/min离心10min，小心将氯仿层转移合并至上述步骤(3)的100mL茄形瓶中，重复萃取残渣过程1次，合并萃取液。

(5)将萃取液合并在100mL茄形瓶中，40℃水浴，用旋转蒸发仪浓缩蒸干后，在茄形瓶中加入20mL正己烷，摇床振荡30min，用滴管转移至50mL离心管中。

(6)加入10mL纯水于离心管中，剧烈振荡清洗两次，小心移出上层溶液至100mL茄形瓶中，用旋转蒸发仪浓缩蒸干后，加入20mL正己烷溶解(此步注意不要引入水)。

(7)将两个Sep-Park Plus Silica连接，用5mL正己烷冲洗小柱子，将上述步骤(6)制备的样品上柱，使流速控制在10-20滴/min以内，再用20mL的正己烷以同样流速洗柱子。

(8)采用含2％体积百分含量乙醚的正己烷洗脱液20mL进行洗脱，甲基萘醌类(menaquinone)洗出液接入到50mL茄形瓶中；再用含10％体积百分含量乙醚的正己烷洗脱液20mL进行洗脱，泛醌(ubiquinone)洗出液接入到另一50mL茄形瓶中。

(9)将上述步骤(8)中的两个样品分别用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂，加入2-3mL丙酮，小型摇床上摇动数分钟，最后分别转移至保存管中(溶液颜色与样品有关)。

(10)将保存管抽至真空，加入200uL丙酮，随后采用高效液相色谱分析，采用C₁₈反相色谱柱，流动相为甲醇和异丙醚的混合液(体积比9∶2)。

结果表明，上述步骤一筛选到的菌株主要以辅酶Q9(泛醌9)作为主要呼吸醌。

2、脂肪酸检测

(1)溶液的配制

溶液I：将45g氢氧化钠溶于300mL甲醇的水溶液中(甲醇和水的体积比为1∶1)；

溶液II：将190mL比重为1.19g/mL的浓盐酸和275mL甲醇溶于135mL蒸馏水中；

溶液III：将200mL正己烷与200mL乙醚混合均匀；

溶液IV：将10.8g氢氧化钠溶于900mL蒸馏水中；

溶液V：饱和的氯化钠溶液(质量百分含量为26.5％)。

(2)提取方法和步骤

取适量上述步骤一筛选到的菌株的培养物置于8mL螺口玻璃管中，加入1mL溶液I，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；

待样品冷却后，加入2mL溶液II，拧紧螺盖振荡，随后精确控制温度为80±1℃，水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；

在冷却的样品管中加入1.25mL溶液III，快速振荡10min左右，弃去下层水相；

在剩余的有机相中加入3mL溶液IV及几滴溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二的上层有机相置于气相色谱样品瓶中备用。

(3)分析方法

采用气相色谱仪(HP 6890)，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及气相色谱化学工作站(HP Chemstation ver A 5.01)；色谱柱为Ultra-2柱(长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm)；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每分钟升温5℃至260℃，随后以40℃/min升温至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氮气，流速为0.5mL/min，分流进样模式，分流比100∶1，进样量2μL；检测器温度为300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气(氮气)流速30mL/min。

结果表明，上述步骤一筛选到的菌株细胞壁脂肪酸中主要包括十六碳饱和脂肪酸(27.1％)、十六碳ω7c单不饱和脂肪酸(24.0％)、十八碳ω7c单不饱和脂肪酸(21.27％)、ω8c-环式十九碳饱和脂肪酸(8.0％)和3-羟基十二碳饱和脂肪酸，还含有少量的十二碳饱和脂肪酸(3.84％)和十碳饱和脂肪酸(2.79％)。

将该菌细胞壁中脂肪酸组成与潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 9661^T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661^T)和壁生盐单胞菌DSMZ 14789^T(Halomonas muralisDSMZ 14789^T)进行比较，结果如表2所示。

表2筛选得到的菌株与盐单胞菌属模式菌株的脂肪酸组成比较

八、菌株的16S rRNA基因序列测定和系统发育分析

提取上述步骤一筛选到的菌株的总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物，正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃6min；然后94℃45s，54℃45s，72℃90s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接到T-Easy载体上，送英俊生物有限公司进行测序；采用Clustal X程序(1.64b)，系统发育分析通过MEGA(2.1)软件采用近邻结合法和最大简约法分析。

结果表明，上述步骤一筛选到的菌株的16S rRNA基因序列如GenBankAccession No.EF421176所示，其16S rRNA基因序列的系统发育分析图如图3所示。

根据其16S rRNA基因序列比对和系统发育分析结果判定，上述步骤一筛选到的菌株属于盐单胞菌属(Halomonas)，并且与盐单胞菌属的模式菌株期望盐单胞菌DSM 9502^T(Halomonas desiderata DSM 9502^T)、壁生盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonas muralis DSM 14789^T)、潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661^T)和坎帕尼亚盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonascampaniensis DSM 15293^T)的16S rRNA基因序列的同源性分别为96.0％、95.6％、95.5％和95.3％，与盐单胞菌属其它菌株的16S rRNA基因序列的相似性低于95％。

九、与盐单胞菌属模式菌株的DNA-DNA杂交分析

1、菌体细胞基因组DNA纯度的测定

提取上述步骤一筛选到的菌株的总DNA，取10μL DNA样品于1.5mL离心管中，加入190μL 0.1×SSC溶液进行溶解，使总体积为200μL，即将DNA样品稀释20倍，用枪吸打数次，将DNA样品混匀、打碎。用紫外分光光度计分别测量260nm、280nm、230nm和270nm时的紫外吸收值，适合做DNA/DNA杂交实验的DNA样品必须符合以下条件：

OD(260nm)/OD(280nm)＞1.8，说明蛋白质含量符合要求；

OD(260nm)/OD(230nm)＞2.0，说明糖含量符合要求；

OD(260nm)＞OD(270nm)，说明酚含量符合要求。

2、G+C摩尔百分含量的测定

采用热变性温度法测定DNA样品的G+C摩尔百分含量，仪器包括紫外分光光度计(Lambda Bio 20型)、温度控制仪(PTP-1)、循环水浴。整个测定过程由UV Winlab软件控制。具体测定过程如下：

(1)Tm值的测定

将上述DNA样品用0.1×SSC溶液进行适当稀释，使其吸光度为0.2～0.5；依次打开UV Winlab软件中的DNADEF.MTD窗口和PE Applications软件中的Templab窗口设定合适的参数，然后开始测定。

在两个比色杯中各加入1mL 0.1×SSC溶液，将比色杯放入比色架内，根据计算机的提示进行仪器的调零；然后将比色杯取出，加入200μL上述稀释好的DNA样品溶液，插入温度传感器探头，将比色杯放回可加热的比色架内，通过计算机控制温控仪升温，在30min内使样品温度由70℃均匀的上升到90℃，其间记录DNA样品在260nm处的吸光值，得到DNA样品的变性曲线。测定结束后，利用计算机相关软件计算出变性曲线的一阶导数曲线，记录一阶导数曲线峰值所对应的温度，即为DNA样品的解链温度，即Tm值。

(2)DNA的G+C摩尔百分含量的计算

如果DNA的G+C摩尔百分含量值在25％～75％的范围内，其Tm值与DNA的G+C摩尔百分含量之间呈线形关系。为消除温度误差及其他实验误差，需用大肠杆菌K12菌株(购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司)的DNA作为参照。在0.1×SSC溶液中，G+C摩尔百分含量的计算公式为：

DNA的G+C摩尔百分含量＝51.2+2.08×[Tm(X)-Tm(R)]。

其中，Tm(X)为上述步骤一筛选到的菌株的Tm值；Tm(R)为大肠杆菌K12菌株的Tm值。

3、DNA-DNA杂交试验

(1)DNA样品的剪切：用于DNA-DNA杂交的样品浓度要求A₂₆₀(260nm吸光度)大于2.0(约100μg/mL)。先将上述步骤一筛选到的菌株的DNA用0.1×SSC调到A₂₆₀＝2.0左右，为使样品的浓度一致，要求各样品的A₂₆₀值的差异小于0.1。取3mL上述步骤一筛选到的菌株的DNA置于5mL离心管中，加入0.72mL 10×SSC溶液，使缓冲液的终浓度为2×SSC。用超声波剪切DNA样品，其输出功率为6W，剪切的时间为4min，间隔时间为2s，重复3次。因超声波剪切时会产生相当的热量，可能导致剪切的DNA样品发生降解，因此在剪切过程中DNA样品应置于冰上。剪切完毕后迅速将样品按0.6mL分装在1.5mL离心管中，置于-20℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳来检测样品的剪切质量。一般要求DNA片段的大小集中在2×10⁵～5×10⁵Da(400～800bp)。

(2)DNA变性：将上述剪切过的DNA用0.1×SSC溶液精确配制成OD₂₆₀为1.5-2.0，根据公式：TOR(最适复性温度)＝0.51×(G+C摩尔百分含量)+47℃，计算TOR值，根据TOR值设定温度，预热比色杯。

(3)打开分光光度计和电脑，选择合适的程序，固定波长为260nm，固定温度为TOR，用2×SSC溶液调零，总时间为30min，每隔15s测一次吸光度值。

(4)吸取200μL上述制备的DNA样品，分别和200μL预备杂交的DNA(即同一属的模式菌株：期望盐单胞菌DSM 9502^T(Halomonas desiderata DSM 9502^T)、壁生盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonas muralis DSM 14789^T)、潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonas pantelleriensis DSM 9661^T)和坎帕尼亚盐单胞菌DSM14789^T(Halomonas campaniensis DSM 15293^T)的基因组DNA)混合，将上述DNA混合液分别加到1.5mL离心管中，同时加400μL 10×SSC于另一离心管中，将上述离心管全部放入100℃水浴10min后，用预热的枪头吸取96μL热的10×SSC溶液加入到装有上述DNA混合液的热的离心管中，使其终浓度为2×SSC，迅速吸取稀释后的DNA混合溶液200μL加入到预热到TOR温度值的比色杯中，测定吸光度，并做出复性曲线。

(5)根据下面的公式计算杂交率：

式中：V_a、V_b、V_m分别表示样品A、B和混合样品M(A+B)的复性速率。

4、DNA-DNA杂交分析结果

上述实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株的DNA与已发表的盐单胞菌属的模式菌株潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 9661^T(Halomonas pantelleriensis DSM 9661^T)和壁生盐单胞菌DSM 14789^T(Halomonas muralis DSM 14789^T)的DNA同源性都比较低，分别为11％和18％。且该菌株的G+C摩尔百分含量为67.1％，而潘泰莱里亚盐单胞菌DSM 9661^T和壁生盐单胞菌DSM 14789^T的G+C摩尔百分含量分别为65.0％和62.4％。

基于以上测定结果，将上述步骤一筛选到的菌株鉴定为仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1，并于2009年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №2941。

实施例2、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941降解菲的性能

将菲溶于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；在盐度为5％的上述实施例1的海盐合成培养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为0.5％，同时在培养基中加入上述过滤除菌的菲溶液，使菲在培养基中的终浓度为100mg/L。

将仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941按照5％的接种量接入上述培养基中，在30℃、转速为200r/min的好氧避光条件下培养10d。同时，以不加菲但是加入二甲基甲酰胺的培养基作为对照，用于检查仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941是否能利用二甲基甲酰胺；以不接种细菌的作为空白对照，用于扣除菲挥发的影响；以接种仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis)A-1 CGMCC №2941死菌体的作为死菌对照，用于扣除菌体吸附的影响。

培养过程中，定时取样，利用高效液相色谱法(HPLC)测定菲的降解率；Waters600E液相色谱仪，色谱柱为Supelcosil LC₁₈-DB，流动相(甲醇和水，体积比为80∶20)，流速1mL/min，检测波长254nm。

实验设三次重复。菲的降解曲线如图4所示，结果表明，仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941在10天内能将100mg/L的菲全部降解，对菲的平均降解速率可达10mg/(L·d)。

实施例3、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941降解蒽的性能

将蒽溶解于乙醚中，配制成为浓度为1mg/mL的溶液。

在盐度为5％的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1.5～1.8％的琼脂糖后，0.06MPa条件下灭菌20min，随后趁热将培养基均匀倾倒于玻璃培养皿中，等培养基凝固后，放置于37℃环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面覆上已灭菌的醋酸-硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0.45μm、直径90mm，购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加1mL上述配制的浓度为1mg/mL的蒽的乙醚溶液并涂布均匀，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含蒽的乙醚涂布在上述纤维素膜平板上作为空白对照。

将仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941接种于SSDMY液体培养基中，常温条件下140r/min振荡培养4天；吸取1mL菌悬液于离心管中，5000r/min离心10min；弃去上清液，将菌体沉淀涂布在上述含有蒽的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上，将涂布后的平板置于30℃条件下静置培养15天。

结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加蒽作为碳源的平板上，仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941无法生长；相应的，在加有蒽的平板上仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941能够生长，说明仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941能够降解蒽并以蒽为唯一碳源生长。

实施例4、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941降解荧蒽的性能

将荧蒽溶解于乙醚中，配制成为浓度为1mg/mL的溶液。

在盐度为5％的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1.5～1.8％的琼脂糖后，0.06MPa条件下灭菌20min，随后趁热将培养基均匀倾倒于玻璃培养皿中，等培养基凝固后，放置于37℃环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面覆上已灭菌的醋酸-硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0.45μm、直径90mm，购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加1mL上述配制的浓度为1mg/mL的荧蒽的乙醚溶液并涂布均匀，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含荧蒽的乙醚涂布在上述纤维素膜平板上作为空白对照。

将仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941接种于SSDMY液体培养基中，常温条件下140r/min振荡培养4天；吸取1mL菌悬液于离心管中，5000r/min离心10min；弃去上清液，将菌体沉淀涂布在上述含有荧蒽的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上，将涂布后的平板置于30℃条件下静置培养15天。

结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加荧蒽作为碳源的平板上，仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941无法生长；相应的，在加有荧蒽的平板上仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941能够生长，说明仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC №2941能够降解荧蒽并以荧蒽为唯一碳源生长。

Claims

1.仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1，其保藏登记号为CGMCC No.2941。

2.仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC No.2941在降解多环芳烃中的应用；所述多环芳烃为菲、蒽或荧蒽。

3.一种降解多环芳烃的方法，是用权利要求1所述仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis)A-1 CGMCC No.2941对待测样品进行处理，使多环芳烃得到降解；所述多环芳烃为菲、蒽或荧蒽。

4.一种降解多环芳烃的生物制剂，其活性成分为权利要求1所述仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-1 CGMCC No.2941；所述多环芳烃为菲、蒽或荧蒽。