CN110564635A - 一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌l1与应用 - Google Patents

一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌l1与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1与应用，该菌株于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No.16526。本发明首次发现了普罗威登斯菌属(Providencia)的菌株具有石油烃降解功能，且对石油中四种组份的降解具有差异选择性，特别是对于石油组分之一的正构烷烃具有非常显著的降解效果，可以应用于石油污染物的处理，具有广阔的应用前景。

Description

一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌L1与应用
技术领域
本发明涉及一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1与应 用，属于石油降解技术领域。
背景技术
自20世纪70年代末以来，随着工业化进程的加快和社会的发展，石油的生产量和消费 量不断增加，进而促进了石油开采业及石油化工行业的迅猛发展。在开采、运输以及加工的 过程中，由于泄露、堆置、挥发等人为或不可控因素造成土壤的石油污染。据有关统计显示， 当下世界范围内石油年产量达22亿吨，其中有超过800万吨的原油在开采、运输、加工和 贮藏过程中因事故等原因进入环境中。就中国而言，每年因各种原因进入环境中的石油达 60万吨，导致约500万公顷的土地受到石油污染物的侵害。
石油在进入土壤环境之后，会填充土壤孔隙，导致土壤的通透性降低，打破原来的水、 气、固三相平衡体系，植物根系和微生物获得氧气和养料的途径受阻，从而影响植物以及土 著微生物的生长。在雨水的冲刷、淋洗、下渗等作用下，土壤中的石油烃会进入到地下水层， 污染地下水，并随水流迁移造成更大范围的水源污染。此外，石油烃组成复杂，包含多种烃 类(支链烷烃、饱和烃、脂环烃、芳香烃)及少量其他有机物(氮氧化物、硫化物、环烷酸 类等)。其中，某些多环芳烃和苯类物质具有致癌、致畸、致突变等三致效应，危及动植物及土壤微生物生存，并通过富集和扩大作用对人体生命健康构成威胁。因此，开展石油污染土壤修复的研究工作具有重要意义。
前人开展了大量的研究，目前对于石油污染土壤的修复技术，主要包括物理、化学及生 物修复技术。其中，无论是物理还是化学方法，对修复土壤的破坏都比较大，即便能够使石 油烃的含量达到标准，土壤的再利用率也值得质疑。除此之外，物理方法的工程量比较大， 有时还需异位修复，人力、物力以及财力消耗较大，而化学方法也面临二次污染和成本的问 题。研究表明，微生物修复因其成本低、无二次污染、处理效果好等特点，已成为修复石油 污染土壤的关键技术，具有显著的社会效益和环境效益。因此，获得石油高效降解菌是提高 其生物降解效率的重要环节。利用微生物降解作用，可将石油中的各个组分转化为核酸、酯 类、多糖和氨基酸等自身需要的生命物质，产生一些低分子化合物。目前对石油有降解作用 的微生物大多数为芽孢杆菌属、假单孢杆菌属、鞘氨醇杆菌属、不动杆菌属和红球菌属等。 原油中的微生物在外加营养物质的条件下可大量繁殖，并优先降解原油中的直链烷烃和带侧 链的芳香烃类，将大分子物质转化成小分子烃类。因此，激活并筛选原油中的微生物，用于 筛选出高效降解石油的菌株对石油污染土壤的生物修复技术具有重要的意义。
雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)，革兰阴性杆菌，大小(0.4～0.6)μm×(1.0～3.0)μm，两端钝圆，形态呈明显的多形性，可为杆状、球杆状、球形、丝状等有 明显多形性。无荚膜，不形成芽孢。有周身鞭毛，运动活泼。有菌毛，可粘附于真菌等细胞 表面。
中国专利文献CN104531582A(申请号201410837662.4)公开了一种用于降解二甲戊灵 农药的菌株及其菌剂和应用。该菌株为雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)JZB42C003，已于2014年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏号为CGMCC No.9977。上述JZB42C003菌株对土壤、水果、蔬菜或水体中 残留的二甲戊灵或高效氯氰菊酯降解效果好，对基础无机盐培养液中浓度为50mg/L的二甲 戊灵，采用本发明的菌株JZB42C003处理5天后降解率达到68.5％。对基础无机盐培养液 中浓度为50mg/L的高效氯氰菊酯，采用本发明的菌株JZB42C003处理5天后降解率达到 55.7％。
上述菌株对苯胺类除草剂具有较好的降解效果，但目前尚未有该属的微生物对于降解石 油烃类化合物具有降解效果的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1与应用。
本发明的技术方案如下：
一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1，该菌株于2018 年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCCNo.16526。
上述高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1是从自然界中分 离得到的，菌株L1是通过对原油添加营养物质，激活原油中的微生物，并从原油激活后的 微生物中分离获得。
在诱导培养基中添加原油(5g/L)，30℃、160rpm培养10d，吸取10ml培养液转接至相同液体摇瓶中，原油浓度5g/L，继续培养10d，共转接5次，取1ml的培养液，利用无 菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释液均匀涂布到NB培养基上，28℃倒置培养48h，最终分 离得到菌株；分离的到的菌株L1，经检测，其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，属于变 形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、普罗威登斯菌属(Providencia)。
所述雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1在营养琼脂培养基(NB)上划线 培养48h，菌落呈淡黄色，边缘较薄，中间偏厚，单菌落边缘光滑整齐，有湿润感，兼性厌氧，经革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阴性菌，显微镜下该菌株呈杆状。
所述菌株雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的生理生化鉴定试验结果如 下：甲基红试验(阳性)、V-P试验(阴性)、脲酶试验(阳性)、吲哚反应(阳性)、肌醇产酸实验(阳性)、葡萄糖产气实验(阴性)、可以利用D-阿拉伯醇、半乳糖、甘露醇，不能 利用鼠李糖。
所述菌株雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的16S rRNA序列如SEQID No.1 所示，通过NCBI官方网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序与其他已登录 细菌菌株的16S rRNA序列进行比对，结果表明该菌株与Providencia rettgeri相似性最 高，同源性达99％。
所述菌株雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1能够利用原油作为唯一碳源 生长繁殖。
利用所述菌株雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1制备石油降解生物酶， 处理不同时间对石油的降解效果发现随着生物酶与石油混合时间的延长，生物酶对其降解效 果逐步提高，经5h降解后，降解率为56.68％，然后随着时间的增加，生物酶对石油的降解 有所下降，并趋于稳定。说明分离到菌株L1对石油具有较好的降解效果。
利用所述菌株雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1制备石油降解生物酶， 处理不同时间对石油的降解效果发现处理石油5h后，胶质含量从26.96％提高到32.67％，而 处理8h后，胶质含量又降至28.42％。而沥青质则由最初的14.67％降至12.16％，继续处理 至8h，沥青质相对含量没有明显变化。对于烷烃和芳烃来说，处理5h后，两者的相对含量 均有所下降，但没有显著性差异。处理8h后，芳烃含量有所提高，达到了25.18％。说明菌 株对石油具有降解作用，同时改变了石油四组分的相对含量。
利用所述菌株雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1制备石油降解生物酶， 处理不同时间对石油的降解效果发现石油通过生物酶处理后，其中正构烷烃(C8-C41)均有 所减少。尤其是短链烷烃，例如C8、C10、C11，处理5h后通过GC已经检测不到。然后处理5h以后，发现一些短链烷烃(C8-C20)相对含量反而有所提高，同时发现目标石油中的中长链烷烃C26、C30、C31、C32和C38相对含量也有所减少。正构烷烃的降解率在12.38-43.59％之间，其中C32的处理5h的降解率为43.59％，表明该该菌对石油，尤其是石油组分之一正构烷烃具有较好的降解效果。
上述高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的培养方法，步 骤如下：
(1)取雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1接种与营养琼脂培养基中，在 25～30℃培养20～28h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接入营养肉汤液体培养基中，25～30℃、150～200rpm 摇床培养20～28h，制得菌液；
(3)将步骤(2)制得的菌液按照3～10％的体积比转接至液体发酵培养基中，25～30℃， 150～200rpm培养15～20h，制得发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，营养琼脂培养基每升组份如下：
蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂18.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0～7.4。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，营养肉汤液体培养基每升组份如下：
蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0～7.4。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基，组份如下，均为质量百分比：
MgSO4·7H2O 0.5％，NaCl 0.5％，豆饼粉3％，余量水。
上述雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1在制备高效石油降解生物制剂中 的应用。
上述应用，步骤如下：
(i)取雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的发酵液，按体积百分比1～5％的比例接种至诱导培养基中，在28～32℃、好氧条件下培养至对数生长后期，离心，收集菌体；
(ii)将步骤(i)制得的菌体加入PBS缓冲液，破碎，离心，收集上清，制得粗制生 物酶；
(iii)将步骤(ii)制得的制得粗制生物酶与甲酸脱氢酶混合，加入甲酸钠，制得高效石油降解生物制剂。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，诱导培养基每升组份如下：
1.0g NH4NO3，0.5g K2HPO4，0.02g MgSO4，1.0g NaCl，0.02mg CaCl2，0.002mgFeCl3， 5.0g酵母抽提物，10.0g蛋白胨，水定容至1L。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，好氧条件为150～180rpm摇床培养。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、8000rpm离心10min。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，PBS缓冲液浓度为0.01M，pH 7.5；PBS缓冲液与菌体的比例15ml:1g。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，破碎为采用超声波破碎，条件如下：功率320W、总超声时间17min，每工作2s间歇2s。
根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，粗制生物酶与甲酸脱氢酶混合的体积比为3:5。 甲酸脱氢酶制备方法参见中国专利文献“乳糖在提高重组菌表达CbFDH酶的稳定性中的应 用”，申请号：201810406990.7。
根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，甲酸钠的使用浓度为1650～1680mmol/L。
上述高效石油降解生物制剂在修复石油及多环芳烃污染的土壤中的应用。
上述雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1在制备高效石油降解生物菌剂中 的应用。
上述应用，步骤如下：
取雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的发酵液，按体积质量比1:(1.5～ 2.5)的比例与灭菌后的草炭混匀，单位ml/g，干燥，即得。
将上述步骤中所得的发酵液与灭菌的草炭按体积质量比1:2，单位ml/g，自然风干，备 用。
上述高效石油降解生物菌剂在修复石油及多环芳烃污染的土壤中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
将高效石油降解生物菌剂同石油污染土壤按照重量比1:(10～20)比例混匀，每周翻 土一次，维持土壤含水量20～50wt％，修复80～100天，即可。
有益效果
本发明首次发现了普罗威登斯菌属(Providencia)的菌株具有石油烃降解功能，且对 石油中四种组份的降解具有差异选择性，特别是对于石油组分之一的正构烷烃具有非常显著 的降解效果，可以应用于石油污染物的处理，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1、实施例2中石油-二氯甲烷OD230标准曲线；
图2、实施例2中不同时间对石油的降解率曲线图；
图3、实施例2中不同时间处理后石油四组分的相对含量柱状图；
图4、实施例2中原油经菌株生物酶/FDH处理前后烷烃含量柱状图；
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
实施例1石油降解菌的分离与鉴定
1、培养基配方
诱导培养基(/L)：1.0g NH4NO3，0.5g K2HPO4，0.02g MgSO4，1.0g NaCl，0.02mgCaCl2， 0.002mg FeCl3，5.0g酵母抽提物，10.0g蛋白胨，121℃灭菌20min。使用前加入石油，石 油添加量为5g/L。
营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用。该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为营养琼脂培养基。
2、菌株的分离
采用传统菌株筛选方法，利用摇瓶培养实验进行。在诱导培养基中添加原油(5g/L)， 30℃、160rpm培养10d，吸取10ml培养液转接至相同液体摇瓶中，原油浓度5g/L，继续培养10d，共转接5次，取1ml的培养液，用灭菌生理水稀释成浓度10-1悬液，连续作10 倍梯度稀释，吸取不同稀释度悬液200μl，涂布在营养肉汤琼脂培养基平板上，28℃培养28～72h，观察菌株的生长情况，挑取单菌落进行培养，最终共分离获得7株单菌。
3、菌株对石油的降解
将得到的菌株按照2％接种量接种到诱导培养基中，30℃、160rpm培养至对数生长后期， 4℃、8000rpm离心10min，收集菌体。菌体按照一定比例加入PBS缓冲液(0.01M，pH7.5) 进行菌体破碎。破碎条件：功率320W、总超声时间17min(工作/间歇，2s/2s)，破碎结束后，离心，收集上清即为粗制生物酶。
收集得到的生物酶和甲酸脱氢酶(甲酸脱氢酶制备方法参见专利“乳糖在提高重组菌表 达CbFDH酶的稳定性中的应用”，申请号：201810406990.7)以3:5(体积比)混合，每份 样品中添加0.1g甲酸钠，充分溶剂后加入到已准备好的石油样品中，30℃恒温培养一定时 间，进行石油烃的萃取，计算石油降解率。
4、石油烃的萃取及检测
样品中按1:1的体积比加入二氯甲烷，摇床培养半小时，超声十分钟；利用分液漏斗对 超声后的溶液进行萃取，收集有机相，重复三次。向得到的有机相中加入无水硫酸钠，静置 过夜。对萃取过的样品进行抽提，旋蒸，定量，利用重量法检测石油降解。
利用提取的生物酶降解石油的方法筛选到一株对石油有较好降解效果的菌株，标号为菌 株L1。
5、菌株的生理生化鉴定指标
主要进行了甲基红试验、V-P试验、吲哚反应、脲酶试验、肌醇产酸试验、葡萄糖产气 试验、及D-阿拉伯醇、半乳糖、甘露醇、鼠李糖利用试验。具体实验结果见表1。
表1：菌株L1生理生化特性
生理生化测定 结果 生理生化测定 结果
甲基红 + 葡萄糖产气 -
V-P试验 - D-阿拉伯醇 +
吲哚反应 + 半乳糖 +
脲酶试验 + 甘露醇 +
肌醇产酸试验 + 鼠李糖 -
阳性：+；阴性：-
6、菌株的16S rRNA验证
将菌株L1接种在营养肉汤液体培养基中，28℃摇床培养36h，12000rpm离心收集菌体， 利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株L的基因组。利用引物7F和1540R进行 PCR扩增。
上述引物序列如下：
7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’
1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
PCR产物纯化后送至上海生物工程股份有限公司进行序列测定，测序结果与NCBI网站 数据库中的序列进行同源性比对分析。结果发现本发明分离纯化得到的菌株L1的16SrRNA 序列与Providencia rettgeri RB151同源性达99％，进化距离最近。与该菌种所属的其他 菌种也有较高同源性。
综上，根据菌株的生理生化特性结合分子验证，将菌株L1命名为雷氏普罗维登斯菌 (Providencia rettgeri)L1。
实施例2利用菌株L1制备的生物酶对石油的降解实验
1、菌悬液的制备
将纯化后的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1接入含有5ml的NB液体培 养基中过夜活化培养至对数期，转接到含有50ml诱导培养基的250ml三角瓶中培养至对数 期，经5000rpm离心10min收集菌体，用PBS缓冲液洗菌3次，按照按1:15(W：V)的比 例加入PBS缓冲液，低温保存备用。
2、细胞破碎及对石油的降解
采用实施例1中所述方法制备生物酶，利用生物酶方法检测菌株对石油的降解情况。收 集得到的混合酶液和FDH以3:5(体积比)混合，每份样品中添加0.1g甲酸钠，充分溶剂 后加入到已准备好的石油样品中，30℃恒温培养一定时间，进行石油烃的萃取，通过紫外分 光光度法计算石油降解率。
利用二氯化碳将原油进行梯度稀释，绘制原油的标准曲线(图1)。将样品用二氯甲烷 溶解，稀释一定倍数，在230nm处测其OD值，根据标准曲线计算石油降解率，利用SPSS21.0 软件进行数据显著性差异分析。
利用生物酶检测菌株不同时间对石油的降解，结果见图2。由图2可以看到，随着生物 酶与石油混合时间的延长，生物酶对其降解效果逐步提高，经5h降解后，降解率为56.68％， 然后随着时间的增加，生物酶对石油的降解有所下降，并趋于稳定。说明雷氏普罗维登斯菌 (Providencia rettgeri)L1对石油具有较好的降解效果。
3、石油烃四组分分析
根据中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T5119-1995《原油族组分柱层析分析方法》 测定处理过程中不同时间段石油烃的烷烃、芳烃、胶质和沥青质含量。
结果见图3，发现利用雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1制备的生物酶处 理石油5h后，胶质含量从26.96％提高到32.67％，而处理8h后，胶质含量又降至28.42％。 而沥青质则由最初的14.67％降至12.16％，继续处理至8h，沥青质相对含量没有明显变化。 对于烷烃和芳烃来说，处理5h后，两者的相对含量均有所下降，但没有显著性差异。处理 8h后，芳烃含量有所提高，达到了25.18％。说明雷氏普罗维登斯菌(Providenciarettgeri) L1对石油具有降解作用，且对四种组份的降解具有差异选择性，同时改变了石油四组分的 相对含量。
4、石油烃正构烷烃组分分析
将得到的石油烃正构烷烃溶解于正己烷中，利用GC分析生物酶处理前后烷烃组分的变 化，进样量为1.0μl，毛细管色谱柱为CP7910柱(30m×0.32mm×0.25)，分流进样(1:2)， 载气为N2。起始温度40℃，保留时间2min，以10℃/min升温至350℃，保留时间10min。
石油烃正构烷烃组分分析结果见图4。通过图4可以看出，石油通过生物酶处理后，其 中正构烷烃(C8-C41)均有所减少。尤其是短链烷烃，例如C8、C10、C11，处理5h后通过 GC已经检测不到。然后处理5h以后，发现一些短链烷烃(C8-C20)相对含量反而有所提高， 同时发现目标石油中的中长链烷烃C26、C30、C31、C32和C38相对含量也有所减少。正构烷烃的 降解率在12.38-43.59％之间，其中C32的处理5h的降解率为43.59％，表明该该菌对石油， 尤其是石油组分之一正构烷烃具有较好的降解效果。
实施例3生物修复菌剂的制备
(1)种子培养
将-80℃保存的雷氏普罗维登斯菌CGMCC No.16526接种于营养琼脂培养基上，28℃培养 24h，将长出的单菌落转接到营养肉汤培养基内，28℃，180rpm摇床培养24h，最终雷氏普 罗维登斯菌CGMCC No.16526的菌液。
(2)液体发酵
将步骤(1)中制得的菌液按照体积比5％的比例分别转接到液体发酵培养基中，28℃， 180rpm培养16h，最终得到雷氏普罗维登斯菌CGMCC No.16526的发酵菌液。经检测，雷氏 普罗维登斯菌CGMCC No.16526的菌液中的有效活菌数分别为2.2×109cfu/ml。
上述步骤(2)中液体发酵培养基成分如下：MgSO4·7H2O 0.5％，NaCl 0.5％，豆饼粉3％。
(3)菌剂制备
将草炭进行高压灭菌，121℃灭菌2h，将步骤(2)中所得的发酵液与草炭按1:2(V:W) 混匀，自然风干，备用。
实施例4生物修复菌剂的应用效果试验
采用实施例3制备的生物修复菌剂进行盆土试验。
石油污染的土壤制备方法如下：采集土样，按照重量比5％加入新鲜石油，自然风干， 粉碎，混匀。
将上述石油污染的土壤分别制备三组土样做对照实验：
一组土样：称取石油污染的土壤1.0kg，加入以雷氏普罗维登斯菌CGMCC No.16526为 主要成分的生物修复菌剂50g；
二组土样：称取石油污染的土壤1.0kg，加入以雷氏普罗维登斯菌CGMCC No.16526为 主要成分的生物修复菌剂100g；
三组土样：称取石油污染的土壤1.0kg。
实验步骤如下：
将上述三组土样，分别装入花盆，调节土壤含水量至20～50wt％，疏松土壤，室温放 置一个月。
采用常规的重量法测定石油含量，计算公式为：
石油总烃(g/kg)＝蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1－含水率％)*1000。
经过三个月的修复，一组土样的石油降解率为24.79％，二组土样的石油降解率为35.92％。
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心)
<120> 一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌L1与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1385
<212> DNA
<213> Providencia rettgeri
<400> 1
gtcgagcggt aacaggggaa gcttgcttcc cgctgacgag cggcggacgg gtgagtaatg 60
tatggggatc tgcccgatag agggggataa ccactggaaa cggtggctaa taccgcataa 120
tctcttagga gcaaagcagg ggaacttcgg tccttgcgct atcggatgaa cccatatggg 180
attagctagt aggtgaggta atggctcacc taggcgacga tccctagctg gtctgagagg 240
atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg cgtgtatgaa gaaggcctta 360
gggttgtaaa gtactttcag tcgggaggaa ggcgttgatg ctaatatcat caacgattga 420
cgttaccgac agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 480
tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc aggcggttga ttaagttaga 540
tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggaatg gcatctaaga ctggtcagct agagtcttgt 600
agaggggggt agaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccgg 660
tggcgaaggc ggccccctgg acaaagactg acgctcaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720
caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt cgatttgaag gttgttccct 780
tgaggagtgg ctttcggagc taacgcgtta aatcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840
gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900
gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga gaacttagca gagatgcttt 960
ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt tgttgccagc gattcggtcg 1080
ggaactcaaa ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1140
catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg cgtatacaaa gagaagcgac 1200
ctcgcgagag caagcggaac tcataaagta cgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc 1260
gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga atgctacggt gaatacgttc 1320
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctaaaa gaagtaggta 1380
gcctt 1385

Claims (10)

1.一株高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1，该菌株于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No.16526。
2.权利要求1所述高效降解石油的雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的培养方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1接种与营养琼脂培养基中，在25～30℃培养20～28h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接入营养肉汤液体培养基中，25～30℃、150～200rpm摇床培养20～28h，制得菌液；
(3)将步骤(2)制得的菌液按照3～10％的体积比转接至液体发酵培养基中，25～30℃，150～200rpm培养15～20h，制得发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，营养琼脂培养基每升组份如下：
蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂18.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0～7.4；
优选的，所述步骤(2)中，营养肉汤液体培养基每升组份如下：
蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0～7.4；
优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基，组份如下，均为质量百分比：
MgSO4·7H2O 0.5％，NaCl 0.5％，豆饼粉3％，余量水。
4.权利要求1所述雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1在制备高效石油降解生物制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(i)取雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的发酵液，按体积百分比1～5％的比例接种至诱导培养基中，在28～32℃、好氧条件下培养至对数生长后期，离心，收集菌体；
(ii)将步骤(i)制得的菌体加入PBS缓冲液，破碎，离心，收集上清，制得粗制生物酶；
(iii)将步骤(ii)制得的制得粗制生物酶与甲酸脱氢酶混合，加入甲酸钠，制得高效石油降解生物制剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中，诱导培养基每升组份如下：
1.0g NH4NO3，0.5g K2HPO4，0.02g MgSO4，1.0g NaCl，0.02mg CaCl2，0.002mg FeCl3，5.0g酵母抽提物，10.0g蛋白胨，水定容至1L；
优选的，所述步骤(i)中，好氧条件为150～180rpm摇床培养；
优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、8000rpm离心10min；
优选的，所述步骤(ii)中，PBS缓冲液浓度为0.01M，pH 7.5；PBS缓冲液与菌体的比例15ml:1g；
优选的，所述步骤(ii)中，破碎为采用超声波破碎，条件如下：功率320W、总超声时间17min，每工作2s间歇2s；
优选的，所述步骤(iii)中，粗制生物酶与甲酸脱氢酶混合的体积比为3:5；
优选的，所述步骤(iii)中，甲酸钠的使用浓度为1650～1680mmol/L。
7.权利要求1所述雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1在制备高效石油降解生物菌剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下：
取雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)L1的发酵液，按体积质量比1:(1.5～2.5)的比例与灭菌后的草炭混匀，单位ml/g，干燥，即得；
优选的，所述发酵液与灭菌的草炭按体积质量比1:2，单位ml/g，混匀，自然风干，备用。
9.权利要求4所述高效石油降解生物菌剂在修复石油及多环芳烃污染的土壤中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤如下：
将高效石油降解生物菌剂同石油污染土壤按照重量比1:(10～20)比例混匀，每周翻土一次，维持土壤含水量20～50wt％，修复80～100天，即可。
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