CN102899271B - 高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌16f及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）16F，保藏号为CGMCC No.6367。该分枝杆菌16F可以高效、安全、快速地降解多环芳烃和单环苯系化合物，可以在好氧条件下以芴、萘、蒽、苊、菲、芘和苯并芘为唯一碳源和能源生长并降解，并且还能利用苯、间二甲苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚等其他多种芳香有机物。对链霉素、利福平、四环素、卡那霉素等抗生素敏感，对老化土壤中的混合多环芳烃和水体中的单环苯系有机物降解效果较好，可以用于芳香烃类有机复合污染的水土环境的修复与净化，对于促进可持续发展具有重要意义，具有广阔的应用前景。

Description

高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌16F及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学领域及环境生物技术领域，具体地说，涉及一株高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌16F及其应用。

背景技术

多环芳烃（PAHs）是指两个或两个以上苯环以稠环和非稠环形式相连接的有机化合物。PAHs在环境中普遍存在，其极低的水溶性、稳定的环状结构是造成这类化合物持久性的主要原因。人类及动物癌症病变有70%-90%是环境中化学物质引起的，而PAHs则是环境致癌化学物质中最大的一类。由于这类化合物具有致癌、致畸和致突变的特性，对人类健康和生态环境均具有潜在的危险而引起世界各国的普遍重视。近几十年来，环境中的多环芳烃（PAHs）含量不断增加，美国环保局已经列出了16种PAHs作为环境污染的优先控制污染物（Keith&Telliard,1979），我国政府也将7种PAHs列入中国环境优先污染物黑名单。因此，净化与修复PAHs污染的环境已成为研究的热点。

尽管PAHs能够通过化学氧化、光解和挥发等途径降解和转移，但是微生物降解是影响自然界中PAHs持久性的最关键因素。生物修复被认为是目前去除环境中有机物的最经济有效的方法。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其生物降解速率降低。因此，低分子量的多环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃因水溶性更低，吸附性更强，从而降低了生物可利用性，较长期存在于环境中。目前关于微生物降解PAHs的研究，主要集中于PAHs降解微生物的筛选、分离与纯化，目前分离到的降解微生物主要有分枝杆菌（Mycobacterium）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、微球菌属（Micrococcus）、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingomonas）、气单胞菌属（Aeromonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、诺卡氏菌属（Nocardioides）、海杆菌属（Marinobacter）、弧菌属（Vibrio）、拜叶林克氏菌属（Beijernckia）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、蓝细菌（Cyanobacteria）、解环菌属（Cycloclastieus）等。其中分枝杆菌是一类非常重要的降解细菌。Mycobacterium vanbaalenii PYR-1是第一株降解芘的分枝杆菌（Hetikamp,1988；Heitkamp等,1988）。之后，研究人员又发现许多不同的分枝杆菌，如Mycobacterium sp.strainBB1（Boldrin等,1993）、Mycobacterium sp.RJGII-135（Schneider等,1996）、Mycobaterium sp.KR20（Rehmann等,1998）、Mycobateriumsp.AP1（Vila等，2001）及Mycobaterium sp.JLS（Miller等,2004）、Mycobacterium flavescens（Dean-Ross,1996）、Mycobaterium sp.KMS（Chun等,2012）等。其中Mycobacterium vanbaalenii PYR-1、Mycobacterium sp.JLS和Mycobaterium sp.KMS已经完成全基因组的测序工作（http://img.jgi.doe.gov ）。美国Cerniglia实验室对Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的研究最为深入，率先阐明了芘、荧蒽的完整代谢途径和不同多环芳烃降解的代谢网络（Kim等，2006；Kweon等，2007；Kweon等，2011）。

苯系化合物是一类易挥发的单环芳香类化合物，包括苯、甲苯、乙苯、二甲苯等，简称为BTEX，BTEX主要存在于原油和石油产品中，广泛应用于农药、化纤纺织、塑料化工等行业，是环境中分布较广的一类有毒化合物。与多环芳烃类似，BTEX也具有“三致效应”，被许多国家列入优先控制污染物，且已被确认为强致癌物质。研发废水、废气中BTEX的污染控制技术显得十分重要和迫切。

目前，微生物降解技术是降解苯系有机物的最有效方法之一。采用微生物法处理环境中BTEX等有毒化合物的关键之一便是获得具有高效降解BTEX能力的优良菌株。人们已经分离出了多株BTEX降解菌，主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、诺卡氏菌属（Nocardioides）、黄杆菌属（Flavobacterium）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、产碱杆菌属（Alcaligenes）和Cladophialophora等。但是这些已有的降解菌株仅能降解某一种或两种苯系化合物，降解底物范围有限，且大多数菌株的降解效率有待进一步提高。

由上可知，目前用于多环芳烃或苯系有机物污染修复的菌剂多是针对两类污染物中的一种或多种，利用单一细菌或真菌以及混合菌系进行降解。比如在“一种多环芳烃降解菌剂的制备方法（公开号CN101423807A）”中，利用新型菌株Mycobacterium sp.SN12，经过7天，对芘和菲的降解率分别为91.5%和95.2%。在“一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法（公开号CN 101177679A）”中，42天后微球菌对芘和苯并芘的降解率分别为30.7%和25.7%，动胶杆菌对芘和苯并芘的降解率分别为31.4%和21.9%。而在“具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌及其应用（公开号CN 101624576A）”中，菌株Mycobacterium cosmeticum byf-4在35h时，甲苯被降解完全，苯、乙苯、邻二甲苯先后在41h、45h、50h被降解完。事实上，土壤或者水体等环境中的污染尤其是工业场地的环境污染常常表现出明显的复合污染特征。因此，单独使用现有菌剂中的任何一种，往往很难奏效。而对PAHs和BTEX两类污染物均能实现高效降解的菌株较鲜见。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时具有降解多种多环芳烃和单环苯系有机物的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）16F及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一株高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）16F，分离自北京焦化厂重度污染土壤中，经过人工富集培养、分离纯化获得，该菌经Biolog和16SrDNA双重鉴定为分枝杆菌属（Mycobacterium sp.），16S rDNA的GenBank登录号为JN966739，菌株命名为16F。微生物学特性：革兰氏染色阳性，短杆状，无芽孢，生物学特性为接触酶、氧化酶阳性，菌落呈鲜黄色、圆形、边缘整齐、表面光滑、较湿润、不透明，专性需氧，24℃至37℃生长良好，可利用麦芽糖、乙酸、龙胆二糖碳源生长，最适生长pH为6.5-7.55，对50mg/L的氨苄青霉素具有抗性。该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2012年07月18日，保藏编号：CGMCC No.6367。

本发明还提供含有所述分枝杆菌16F的菌剂。

本发明还提供所述分枝杆菌16F或所述菌剂在降解多环芳烃和/或单环苯系有机物中的应用。所述多环芳烃为芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、荧蒽、苯并荧蒽、苯并蒽或苯并芘等中的一种或多种，所述单环苯系有机物为苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、苯酚、水杨酸或邻苯二酚等中的一种或多种。

前述的应用，其是将分枝杆菌16F的菌悬液加入到含有多环芳烃和/或单环苯系有机物的基础盐培养基中，在30℃150rpm避光条件下摇床培养，进行底物降解。其中，分枝杆菌16F的菌悬液浓度为3.5×10⁸～4.5×10⁸CFU/mL，优选4.1×10⁸CFU/mL。

所述基础盐培养基配方为：硫酸铵2.5g，硫酸亚铁0.28mg，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钾1.36g，硫酸镁0.25g，氯化钙10.7mg，氯化钠0.5g，氯化铁0.004g，1.0mL微量金属液，1mL维生素复合溶液，加水至1000mL并将pH控制在7.2-7.4，摇匀后作为液体培养基备用。其中微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂035mg,CuCl₂0.20mg,H₃BO₃6.0mg,MnCl₂·4H₂O 25mg,Na₂MoO₄·2H₂O 3.0mg,NiCl₂·2H₂O 2.0mg,ZnCl₂2.5mg，加水至1000mL；维生素复合溶液的组成为：维生素B61.0mg，维生素H 0.5mg，维生素C 1.5mg，加水至1000mL。

分枝杆菌16F的功能特性如下：可以在好氧条件下以芴、萘、蒽、苊、菲、芘和苯并芘为唯一碳源和能源生长并降解。例如，当芴、芘、苯并芘的初始浓度分别为50mg/L、100mg/L和12.5mg/L时，7天、5天和15天后的降解去除率分别为91.3%、92.9%和48.8%，并且还能利用苯、间二甲苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚等其他多种芳香有机物，对初始浓度为200ppm的苯、200ppm的甲苯和100ppm的二甲苯，在5天、4天和3天后的降解去除率分别为：99.9%，99.6%和90%。对链霉素、利福平、四环素、卡那霉素等抗生素敏感，对老化土壤中的混合多环芳烃降解效果较好，21天对总多环芳烃的去除率达到了76.45%。

本发明进一步提供用于扩增所述分枝杆菌16F 16SrDNA的引物对，包括上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和下游引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

本发明的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）16F可以高效、安全、快速地降解多环芳烃和单环苯系化合物，其可在好氧条件下以芴、萘、蒽、苊、菲、芘和苯并芘为唯一碳源和能源生长并降解，并且还能利用苯、间二甲苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚等其他多种芳香有机物。对链霉素、利福平、四环素、卡那霉素等抗生素敏感，对老化土壤中的混合多环芳烃和水体中的单环苯系有机物降解效果较好，可以用于芳香烃类有机复合污染的水土环境的修复与净化，对于促进可持续发展具有重要意义，具有广阔的应用前景。

本发明提供的同时具有降解多种多环芳烃和单环苯系有机物的分枝杆菌16F，为开展多种高环多环芳烃和苯系有机物降解的机理研究和多环芳烃复合污染水土环境修复技术的构建提供了新的种质资源，并为研发复合污染土壤的修复技术体系提供了科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例2中菌株16F降解初始浓度为100ppm的芘紫外扫描图。

图2为本发明实施例2中菌株16F针对初始浓度为50ppm的芘的降解曲线。

图3为本发明实施例2中菌株16F针对初始浓度为200ppm的芘的降解曲线。

图4为本发明实施例2中不同金属离子对菌株16F降解率的影响。

图5为本发明实施例2中菌株16F针对初始浓度为50mg/L的芴的降解曲线。

图6为本发明实施例2中菌株16F针对初始浓度为12.5mg/L的苯并芘的降解曲线。

图7为本发明实施例4中菌株16F针对模拟污染土壤（芘的初始浓度为100mg/L）的降解曲线。

图8为本发明实施例5中菌株16F针对老化土中16种多环芳烃的去除率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1同时具有降解多种多环芳烃和单环苯系有机物的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）16F的分离纯化

具体步骤如下：

（1）采集北京焦化厂重度污染的土壤样品，将其通过8目网筛后立即放置于4℃冰箱中保存备用。

（2）向体积为500mL的开口玻璃瓶中加入200μL浓度为50g/L芘的丙酮混合溶液，超净台中放置4小时除去丙酮，或将玻璃瓶开口放置24小时自然风干。

（3）向步骤（2）中开口玻璃瓶中加入200-300mL基础盐培养基，在转速为120r/min的条件下搅拌30min，然后加入步骤（1）中的土壤50g；然后置于温度为25-30℃转速为120r/min的摇床中搅拌富集驯化培养14天，然后摇匀后均匀吸取10毫升富集液转入新的玻璃瓶中，以上操作连续转接5次。玻璃瓶中同样加有同等浓度的芘和200-300mL基础盐培养基，其中基础盐培养基的组成为：硫酸铵2.5g，硫酸亚铁0.28mg，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钾1.36g，硫酸镁0.25g，氯化钙10.7mg，氯化钠0.5g，氯化铁0.004g，1.0mL微量金属液，1mL维生素复合溶液，加水至1000mL并将pH控制在7.2-7.4，摇匀后作为液体培养基备用。其中微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂035mg,CuCl₂0.20mg,H₃BO₃6.0mg,MnCl₂·4H₂O 25mg,Na₂MoO₄·2H₂O 3.0mg,NiCl₂·2H₂O 2.0mg,ZnCl₂2.5mg，加水至1000mL；维生素复合溶液的组成为：维生素B61.0mg，维生素H 0.5mg，维生素C 1.5mg，加水至1000mL。

（4）向体积为1000mL的锥形瓶内加入600mL基础盐培养基、0.6mL微量金属液、0.6mL维生素复合溶液，摇匀后作为液体培养基备用。

（5）向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤（4）配制的液体培养基和0.9g琼脂，然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65-70℃时，在超净工作台中将其倒入直径9cm的培养皿中，将该培养皿在超净工作台中半开盖放置6小时，以除去培养基表面多余的水分。

（6）在超净工作台中向步骤（5）中的培养皿中加入0.04mL浓度为50g/L芘的丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿，同时用玻璃棒均匀涂布，使芘的丙酮溶液能够均匀分布在培养基表面上，该培养皿在超净工作台中半开盖放置12小时，以除去培养基表面的丙酮。

（7）在超净工作台中吸取1mL步骤（3）得到的多环芳烃富集液，用无菌水依次稀释至10mL、100mL和1000mL，然后从中分别吸取1.0mL加入步骤（6）制备好的培养皿中，用无菌玻璃棒涂布培养皿使接种有混合菌群的培养基稀释溶液均匀分布。将培养皿放入温度为30℃的培养箱中培养观察，7-15天后便可发现有明显的菌落出现。

（8）在超净工作台中挑取步骤（7）培养皿中的菌落，进行重复分离，初步分离纯化得到可能降解多环芳烃的纯菌种。

（9）多环芳烃降解菌的复筛：将初步分离纯化的各菌株接种于Luria-Bertani培养基中，培养至OD₆₀₀约为0.6，离心去上清，用基础盐液体培养基洗涤并悬浮菌体；Luria-Bertani培养基（以下简称为LB培养基）的组成为：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.2-7.4，121℃湿热灭菌20min。基础盐培养基组成与步骤（3）中成分相同。

（10）吸取步骤（9）中的菌悬液1.0mL接入装有以芘为唯一碳源的基础盐液体培养基中，以芘为唯一碳源的基础盐液体培养基组成如下：在灭菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入无机盐液体培养基，使多环芳烃终浓度为终浓度为100mg/L；30℃，150rpm避光摇床培养10天，设置不加菌悬液的作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果，从而复筛出能降解多环芳烃的降解菌。该菌经Biolog和16S rDNA双重鉴定为分枝杆菌属（Mycobacterium sp.），16S rDNA的GenBank的登录号为JN966739，菌株命名为16F。

实施例2分枝杆菌16F的降解实验

（1）在灭菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入无机盐液体培养基，使多环芳烃终浓度为终浓度为100mg/L，接入1%体积含量的Mycobacterium sp.16F菌悬液，对照为不接菌体的空白对照，30℃，150rpm避光摇床培养，分别在1天、2天、3天、4天和5天经紫外分光光度计和气相-质谱联机检测，紫外扫描图见图1，菌株16F可以在48h内降解75%的初始浓度为100mg/L的芘，5天可以降解92%以上。

菌悬液制备方法：挑取菌株Mycobacterium sp.16F的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30℃，120rpm摇床振荡培养72-96小时；然后用无菌水调节至每mL的Mycobacterium sp.16F菌悬液中含有4.1×10⁸CFU/mL的Mycobacterium sp.16F菌体，以下实施例中所提及的菌悬液如无特殊说明均按照此方法制备。

（2）在灭菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入无机盐液体培养基，使多环芳烃终浓度为50mg/L，接入1%体积含量的Mycobacterium sp.16F菌悬液，对照为不接菌体的空白对照，30℃，150rpm避光摇床培养，分别在0天-7天经紫外分光光度计和气相-质谱联机检测，降解曲线见图2。从图2中可以看出，而对于初始浓度为50ppm的芘，5天时可降解94%以上，可以在7天内降解完全。

（3）在灭菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入无机盐液体培养基，使多环芳烃终浓度为200mg/L，接入2%体积含量的Mycobacterium sp.16F菌悬液，对照为不接菌体的空白对照，30℃，150rpm避光摇床培养，分别在1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天经紫外分光光度计和气相-质谱联机检测，降解曲线详见图3。在24h至48h内降解较快，平均降解速率达3.1ppm/h，然后降解速度变慢，直至7天时降解率达到99%以上，结果如图3所示。

（4）为研究各种金属离子对于菌株的多环芳烃降解能力是否存在影响，设计液体摇瓶实验，实验初始条件为：含50ppm芘的基础盐溶液中添加1mM各类重金属离子，150rpm，30℃避光摇床培养36h，然后分别检测降解效果（图4）。从图4可以看出，菌株16F在三氯化铁和氯化亚铁存在时降解率较不含金属离子（加菌）的降解率提高了19.8%和8.2%，而其他诸如锌、铜、锰及微量元素混合液都对菌株16F降解存在抑制作用。

（5）在灭菌三角瓶中加入50g/L芴的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入无机盐液体培养基，使多环芳烃终浓度为50mg/L，接入2%体积含量的Mycobacterium sp.16F菌悬液，对照为不接菌体的空白对照，30℃，150rpm避光摇床培养，分别在0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天经紫外分光光度计和气相-质谱联机检测，降解曲线见图5。从图5中可以看出，菌株16F在前48h内对50ppm芴的降解慢于同浓度的芘，在48h至96h内降解较快，平均降解速率达0.63ppm/h，然后降解速度变慢，直至168h时降解率达到91.3%。

（6）在灭菌三角瓶中加入5g/L苯并芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入无机盐液体培养基，使多环芳烃终浓度为12.5mg/L，接入2%体积含量的Mycobacterium sp.16F菌悬液，对照为不接菌体的空白对照，30℃150rpm避光摇床培养，分别在10天、15天、20天、25天、30天、35天用气相-质谱联机检测，降解曲线见图6。菌株16F对初始浓度为12.5ppm的苯并芘，在10天左右降解即可达到48.34%，但是此后降解基本处于停滞状态，至30天时降解率达到53.29%，说明菌株对苯并芘可以较快降解，但是不能将其完全降解。

实施例3分枝杆菌16F降解底物实验

将Mycobacterium sp.16F接种至不同浓度（50-500mg/L,见表1）的水杨酸、邻苯二酚、苯酚、苯、二甲苯、甲苯等底物的基础盐培养基中，同时设底物空白对照（只加底物不加菌），在150r/min,30℃摇床中避光振荡培养2天、4天和6天后测定生物量和检测底物的降解情况。Mycobacterium sp.16F的生长和降解情况见表1，结果表明Mycobacterium sp.16F均能利用一定浓度的实验底物进行生长繁殖并且降解，其中，培养4天后观察到初始时以固体或油状漂浮在培养液中的苯、二甲苯、甲苯消失，经GC-MS检测均已100%降解，而对于高浓度底物的耐受性而言，苯系有机物中苯>甲苯>二甲苯；而水溶性较好的水杨酸、邻苯二酚、苯酚则通过紫外分光光度计检测培养液中其存在，初始浓度为50mg/L的水杨酸、初始浓度为100mg/L苯酚、初始浓度为200mg/L邻苯二酚，分别培养4天、6天和2天后经检测均已100%降解。这表明菌株Mycobacterium sp.16F降解底物的范围很广。

表1菌株16F对不同底物的降解多样性

注：“+”表示利用并降解，“-”不生长或不降解，“N”表示未检测

实施例4分枝杆菌16F降解模拟污染土壤中的芘的实验

（1）取未遭受多环芳烃污染（以芘作为模式污染物）的褐土，过100目筛，充分混匀后分成10等份，每份200g，自然风干至近乎恒重，随机取其中5份，记作处理组1-5，剩余的5份记作对照组1-5，1-5表明实验均重复五次。

（2）首先将对照组中的200g土壤均匀播散于1000mL的长方形铝盒中，土样覆盖住铝盒底部时开始喷洒芘的乳浊液（用丙酮溶解99%的固体分析纯芘，制为50g/L的贮存母液，取0.4mL溶解于65mL灭菌液体LB培养基中，采用喷壶喷洒）。喷壶喷洒至铝盒中的土样土壤湿透，然后重复撒土-喷液操作直至土样和芘的乳浊液完全混合均匀为止，将铝盒盖好盖子后避光静置，此时土样中芘的理论浓度应为100mg/kg。

（3）处理组初始操作与步骤（2）类似，但是芘的乳浊液配制量略少，为35mL，喷洒过程同步骤（2），降解菌株Mycobacterium sp.16F悬浮液的使用量为30mL（悬浮液制作方法前述实施例1中完全相同），在每次喷洒完芘的乳浊液后立即喷洒，流程为撒土-----喷液-----洒菌，重复这一流程直至土样、芘的乳浊液和降解菌剂同时用完为止，将铝盒盖好盖子后避光静置。

（5）七天后处理组1-5用降解菌剂Mycobacterium sp.16F强化喷洒一次，使用量为30mL，对照组则用同等体积的灭菌液体LB喷洒。

（6）对每个铝盒中定期取样，初定为0、2、4、6、8、10和12天，取样方法为S型25点取样，取样后混合均匀，经ASE100加速萃取后通过GC-MS检测降解效果。

结果如图7所示，褐土被芘污染后，加入Mycobacterium sp.16F制备的菌悬液，12天以后土壤中的芘含量下降了94.26%，证明该菌株有应用于突发性多环芳烃污染应急处理的潜力。

本试验所用土样的部分理化性质见表2。

表2土壤样品部分理化性质

实施例5分枝杆菌16F修复实际PAHs污染土壤实验

在实施例4的基础上，进一步改进使Mycobacterium sp.16F能够用于修复实际PAHs污染土（简称老化土），实验具体步骤如下：

（1）供试土壤：采自北京焦化厂某多环芳烃（PAHs）高风险区表层土壤（0~25cm），经自然风干，过8目筛（3mm筛），调节其土壤含水量35%左右，以供试验用。将多环芳烃污染的老化土充分混匀后分成10等份，每份400g，分别记作处理1-5和对照1-5，1-5表明实验均重复五次。将老化土均匀播散于1500mL的长方形不锈钢盒中，土样覆盖住铝盒底部时开始喷洒菌株16F的菌悬液60mL（制备的菌悬液含菌量为4.1×10⁸CFU/mL）喷壶喷洒至盒中的土样湿透，然后重复撒土-----喷液操作直至土样和菌悬液完全混合均匀为止，将铝盒盖好盖子后避光静置，对照采用清水喷洒60mL。

（2）菌株16F的菌悬液制备：将菌株16F的单菌落经LB液体试管培养6天，并按照1%的体积比转接于液体LB培养基的三角瓶中，于30℃，150rpm的摇床培养3-4天。定时测OD₆₀₀，等菌株16F生长至对数生长期后，8000rpm离心10min收获菌体，用无菌水清洗两次后用基础盐培养基悬浮，即为菌的悬浮液，菌悬液含菌量为4.10×10⁸CFU/mL。

（3）14天后处理1-5用降解菌剂Mycobacterium sp.16F强化喷洒一次，使用量为60mL，对照1-5组则用同等体积的灭菌水喷洒。

（4）对每个铝盒中定期取样，初定为0、7、14、21、28天，取样方法为S型25点取样，取样后混合均匀，经ASE100加速萃取后通过GC-MS检测降解效果。

修复前，供试土壤中持久性有机污染物16种多环芳烃（PAHs）组分总含量为558.17mg/kg，而加菌处理0天时16种多环芳烃（PAHs）组分总含量为514.37mg/kg，而经过21天处理后，加菌处理的16种多环芳烃（PAHs）组分总含量为49.0mg/kg，没有添加营养的清水对照为208.05mg/kg，总去除率达到了76.45%，对16种多环芳烃的去除效率见图8。

实施例6分枝杆菌16F的抗生素敏感性实验

抗生素敏感试验采用最小抑制浓度法（MIC法），分别采用试管稀释法和琼脂稀释法，将两者结果合并为表3，具体实施步骤如下：

（1）试管稀释法先将测试抗生素氨苄青霉素、链霉素、利福平、卡那霉素、四环素等五种常用的抗生素作一系列倍比稀释（终浓度分别为20、50、100ppm），然后各试管加入1.2×10⁷CFU/mL的16F菌液50微升，摇匀，经30℃,120rpm培养后5-7天，每天取样测定OD₆₀₀，如果OD₆₀₀不出现明显升高，即为对该种抗生素敏感，反之则为抗性或者耐药。

（2）琼脂稀释法将不同剂量的抗生素，分别加于融化并冷至45℃的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基，接种测试菌于该培养基上，经30℃,120rpm培养后5-7天观察，被检菌生长情况，最低药物抑制细菌生长者，即最小抑菌浓度（MIC），证明该菌能够耐受该浓度的抗生素。

表3的实验结果表明，菌株16F对链霉素、利福平、卡那霉素、四环素等四种常用代表性抗生素敏感，对氨苄青霉素中度敏感。

本实施例说明当菌体被释放到自然环境中时，不会因携带耐药因子而在土著菌间传播，为Mycobacterium sp.16F的实际应用提供了理论基础和安全保证。

表3菌株16F的抗生素敏感性实验结果

注：“+”表示抗性，“-”表示敏感，“N”表示未检测

实施例7分枝杆菌16F的生物活性和降解特性研究

生物活性测试采用常规的稀释涂布法，选择经LB培养基培养好的菌体，分别以液体状态保存于4℃、30℃和35℃，分别在30天、60天和90天时进行菌落计数，并分别以芘、芴、苯并芘和甲苯为降解底物进行其降解能力验证其活菌统计结果见表4。

表4菌株16F的生物活性和降解特性

注：“+”表示降解效率提高，“N”表示降解效率无变化，“-”表示降解效率降低

本实施例说明当菌体在广泛的环境中都有较顽强的生存力，并且降解性能不退化，证明Mycobacteriumsp.16F在实际应用中的应用潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一株高效降解多环芳烃和单环苯系有机物的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）16F，保藏号为CGMCC No.6367。

2.含有权利要求1所述分枝杆菌16F的菌剂。

3.权利要求1所述分枝杆菌16F或权利要求2所述菌剂在降解多环芳烃和/或单环苯系有机物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃为芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、荧蒽、苯并荧蒽、苯并蒽或苯并芘中的一种或多种，所述单环苯系有机物为苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、苯酚、水杨酸或邻苯二酚中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其是将分枝杆菌16F的菌悬液加入到含有多环芳烃和/或单环苯系有机物的基础盐培养基中，在30℃，150rpm避光条件下摇床培养，进行底物降解；

所述基础盐培养基配方为：硫酸铵2.5g、硫酸亚铁0.28mg、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾1.36g、硫酸镁0.25g、氯化钙10.7mg、氯化钠0.5g、氯化铁0.004g、微量金属液1mL和维生素复合溶液1mL，加水至1000mL，pH值7.2-7.4；其中微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂035mg、CuCl₂0.20mg,、H₃BO₃6.0mg、MnCl₂·4H₂O25mg、Na₂MoO₄·2H₂O3.0mg、NiCl₂·2H₂O2.0mg和ZnCl₂2.5mg，加水至1000mL；维生素复合溶液的组成为：维生素B61.0mg、维生素H0.5mg和维生素C1.5mg，加水至1000mL。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，分枝杆菌16F的菌悬液浓度为3.5×10⁸～4.5×10⁸CFU/mL。

7.用于扩增权利要求1所述分枝杆菌16F16S rDNA的引物对，所述引物对为：上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和下游引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。