CN101423806A

CN101423806A - 一种有机芳香化合物降解菌及其应用

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Publication number: CN101423806A
Application number: CNA2007101579045A
Authority: CN
Inventors: 苏振成; 张惠文; 李新宇; 李旭; 张成刚
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2007-11-02
Filing date: 2007-11-02
Publication date: 2009-05-06

Abstract

本发明涉及污染土壤及水的生物修复，具体地说是一种有机芳香化合物降解菌，该菌是分子杆菌属的菌株，于2007年7月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M207110；鉴别特征为Mycobacterium gilvum SN12。本发明筛选的菌株降解性能稳定，降解底物范围较广，适用于多环芳烃污染土壤及水的生物修复。

Description

一种有机芳香化合物降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及污染土壤及水的生物修复，具体地说是利用微生物的方法降解污染环境中的多环芳烃污染物，本发明降解菌适用于石油污染土壤及水的生物修复。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布于环境中的有机化学污染物，是石油、煤炭等化石燃料燃烧过程及能源转化过程的副产物，对人体具有潜在的三致危害性，对生物体产生遗传毒性，国际癌研究中心(IARC)列出的94种对实验动物致癌的化合物，其中15种属于多环芳烃。多环芳烃是一类难降解有机物污染物，具有较高的稳定性，随着苯环数量增加，脂溶性越强，水溶性越低，生物可降解性也随着降低，在环境中存在的时间越长。由于多环芳烃的潜在致癌性、致畸性、致突变性，已引起各国的重视。土壤、水都是多环芳烃的重要载体，多环芳烃污染土壤、水的生物修复技术由于二次污染少，现在倍受关注。研究表明，微生物降解是降低多环芳烃污染的主要技术手段。

芘是多环芳香族化合物，不溶解于水，挥发性差、为无色、棱形晶体(不纯物为黄色)，别名：嵌二萘，其分子式：C16H10，可以以土壤、水等作为载体，具有潜在毒性、致癌性及致畸诱变作用，芘本身不具遗传毒性，但是它的酮类代谢物比母体毒性更大且有致突变性，所以芘常被作为监测多环芳烃污染的指示物和其它多环芳烃光化学降解、生物降解的模型分子c121。能够降解芘的微生物也不少，如分技杆菌、红球菌、黄杆菌、假单抱茵、糙皮侧耳、白瓶霉菌、雅致小克银汉霉、黑曲霉等。

芘污染以及它的酮类代谢物污染已引起各国环境科学家的极大重视。由于其化学稳定性，对芘污染物的净化和处理一直是一个难题。关于芘的净化技术大多处于研究阶段，始终没有成熟、高效且易行的处理方法。现在世界各国都趋于利用生物过程处理芘的污染物，然而，生物降解多环芳烃污染物还没有被证明技术上的高效可行性。对于一般的微生物来说，芘等多环芳烃化合物是难以作为营养物质利用的。所以选择利用以芘为营养物质的优势特效菌净化芘是解决芘污染问题的有效方法。因此，展开对芘的优势特效降解细菌的研究具有一定的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效降解芘等高分子量多环芳烃的有机芳香化合物降解菌菌种，及上述菌种在降解多环芳烃中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明所提供的高效降解菌Mycobacterium sp.SN12来源于辽宁抚顺石油三厂污水渠渠首污泥。经人工驯化后分离纯化得到。该菌是分子杆菌属(Mycobacterium sp.)的菌株SN12，生物学特性为菌体形态为短杆状，两端钝圆，革兰氏阳性，，在牛肉膏蛋白胨(NR)平板上单菌落呈金黄色，圆形垫状、边缘整齐、表面光滑，与培养基结合不牢固。该菌生长缓慢，经30℃，平均7天培养能形成可见单菌落，30天培养单菌落直径仅为0.4cm。菌株16S rDNA的Genbank登陆号为DQ512892。

于2007年7月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M207110；鉴别特征为Mycobacterium gilvum SN12。

菌株Mycobacterium sp.SN12 16SrRNA全长序列(1406bp)与GeneBank中已知序列Mycobacterium gilvum isolate VM0442的序列相似性为100％。其基因组中具有芘降解基因nidA。不含有菲降解基因(phnAc)和萘降解基因(ndoB)。

该菌最适生长及最佳降解温度为30℃，在低于10℃或高于40℃时不生长；最适生长pH值为7，当pH值低于5或高于10时，其生长受到明显抑制。在好氧条件下高效降解芘，在无机盐培养基中，7天内可将100mg/L的芘降解94.4％，14天芘降解率可达100％；可将600mg/L芘在7天内降解56.06％，14天内降解95.46％。

该菌还能以菲、苊、芴为唯一碳源和能源生长，在无机盐培养基中培养7天可将100mg/L的菲降解99.37％、将100mg/L的苊降解71.80％、将100mg/L的芴降解45.29％。

所述无机盐培养基为(g/L)：MgSO₄·7H₂O—0.2，MnSO.H₂O—0.02，CaCl—0.15，FeSO₄·7H₂O—0.01，NH₄·NO₃—1.0，KH₂PO₄—0.4，Na₂HPO₄—0.6，蒸馏水—1000，PH7.0；

菌株Mycobacterium sp.SN12的培养基还可为牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏—5，蛋白胨—10，NaCl—5，蒸馏水—1000，PH—7.2～7.4。

本发明筛选的菌株降解性能稳定，降解底物范围较广，适用于多环芳烃污染土壤及水的生物修复。

附图说明

图1为温度对菌株Mycobacterium sp.SN12生长的影响。

图2为不同温度对菌株Mycobacterium sp.SN12降解芘的影响。

图3为菌株Mycobacterium sp.SN12对芘的降解曲线。

图4为不同芘浓度对菌株Mycobacterium sp.SN12降解芘的影响。

图5为邻位相连法建立的菌株Mycobacterium sp.SN12系统发育进化树。

图6为琼脂糖凝胶电泳检测菌株Mycobacterium sp.SN12基因扩增结果；其中，M：DL2000；Lane1，分枝杆菌16SrRNA(578bp)；Lane2，芘降解基因nidA(508bp)；Lane3，萘降解基因ndoB(642bp)；Lane4，菲降解基因phnAc(462bp)。

具体实施方式

实施例1：菌株Mycobacterium sp.SN12的形态及生理生化特性

Mycobacterium sp.SN12菌体形态为短杆状，两端钝圆，革兰氏阳性，但不易被染色。在NR平板上单菌落呈金黄色，圆形垫状、边缘整齐、表面光滑，与培养基结合不牢固。该菌生长缓慢，经30℃，平均7天培养能形成可见单菌落，30天培养单菌落直径仅为0.4cm。根据微生物鉴定手册设计生理生化试验，唯一碳源利用试验制成含唯一碳源的无机盐培养基平板。其生理生化特性试验结果见附表1

表1 菌株Mycobacterium sp.SN12的生理生化特性

内容结果内容结果
内容结果内容结果	吲哚试验 — 唯一碳源利用试验：柠檬酸盐试验 — 木糖 —乙酰甲基甲醇(V.P.)试验 — 果糖 +甲基红(M.R.)试验　　　　　　 — 蔗糖 +淀粉水解试验 — 蕈糖 —产氨试验 + 麦芽糖 +硝酸盐还原试验 + 鼠李糖 +明胶液化试验 + 棉子糖 +过氧化氢酶试验 + 山梨糖 —产硫化氢试验 + 阿拉伯糖 —肌醇 +

实施例2：菌株Mycobacterium sp.SN1216SrDNA序列测序及结果分析

将N12菌体破碎，提取核酸进行PCR扩增，使用试剂盒纯化PCR产物，对已纯化的PCR产物测序获得该菌16SrDNA全长序列(1406bp)；

其具有序列表SEQ ID No：1中的碱基序列。

SEQ ID No：1：

1 TGGCTCAGGA CGAACGCTGG CGGCGTGCTT AACACATGCA AGTCGAACGG

51 AAAGGCCCTT CGGGGTACTC GAGTGGCGAA CGGGTGAGTA ACACGTGGGT

101 GATCTGCCCT GCACTTTGGG ATAAGCCTGG GAAACTGGGT CTAATACCGA

151 ATAGGACCGC ATGCTTCATG GTGTGTGGTG GAAAGCTTTT GCGGTGTGGG.

201 ATGGGCCCGC GGCCTATCAG CTTGTTGGTG AGGTAATGGC TTACCAAGGC

251 GACGACGGGT AGCCGGCCTG AGAGGGTGAC CGGCCACACT GGGACTGAGA

301 TACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGCACAATGG

351 GCGCAAGCCT GATGCAGCGA CGCCGCGTGA GGGATGACGG CCTTCGGGTT

401 GTAAACCTCT TTCGCCAGGG ACGAAGCGCA AGTGACGGTA CCTGGAGAAG

451 AAGGACCGGC CAACTACGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG TAGGGTCCGA

501 GCGTTGTCCG GAATTACTGG GCGTAAAGAG CTCGTAGGTG GTTTGTCGCG

551 TTGTTCGTGA AAACTCACAG CTTAACTGTG GGCGTGCGGG CGATACGGGC

601 AGACTTGAGT ACTGCAGGGG AGACTGGAAT TCCTGGTGTA GCGGTGGAAT

651 GCGCAGATAT CAGGAGGAAC ACCGGTGGCG AAGGCGGGTC TCTGGGCAGT

701 AACTGACGCT GAGGAGCGAA AGCGTGGGGA GCGAACAGGA TTAGATACCC

751 TGGTAGTCCA CGCCGTAAAC GGTGGGTACT AGGTGTGGGT TTCCTTCCTT

801 GGGATCCGTG CCGTAGCTAA CGCATTAAGT ACCCCGCCTG GGGAGTACGG

851 CCGCAAGGCT AAAACTCAAA GAAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGCGG

901 AGCATGTGGA TTAATTCGAT GCAACGCGAA GAACCTTACC TGGGTTTGAC

951 ATGCACAGGA CGCCGGCAGA GATGTCGGTT CCCTTGTGGC CTGTGTGCAG

1001 GTGGTGCATG GCTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC

1051 CGCAACGAGC GCAACCCTTG TCTCATGTTG CCAGCACGTT ATGGTGGGGA

1101 CTCGTGAGAG ACTGCCGGGG TCAACTCGGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA

1151 AGTCATCATG CCCCTTATGT CCAGGGCTTC ACACATGCTA CAATGGCCGG

1201 TACAAAGGGC TGCGATGCCG TGAGGTGGAG CGAATCCTTT CAAAGCCGGT

1251 CTCAGTTCGG ATCGGGGTCT GCAACTCGAC CCCGTGAAGT CGGAGTCGCT

1301 AGTAATCGCA GATCAGCAAC GCTGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA

1351 CACACCGCCC GTCACGTCAT GAAAGTCGGT AACACCCGAA GCCGGTGGCC

1401 TAACCC

(1)SEQ ID No：1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

^*长度：1406碱基对

^*类型：核酸

^*链型：双链

^*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：菌株Mycobacterium sp.SN12

将该全长序列与GeneBank中已知序列进行比对，结果表明，其与Mycobacterium gilvum isolate VM0442的序列相似性为100％，与Mycobacterium sp.TA27等菌株的序列相似性为98％～99％，结合生理生化试验结果，确定该菌株为分枝杆菌属，系统发育关系见图5。菌株N12在Genebank登录号为DQ512892。

实施例3：菌株Mycobacterium sp.SN12特异引物PCR扩增及结果分析

对菌株Mycobacterium sp.SN12进行分枝杆菌属16SrRNA和三个降解基因PCR扩增。扩增引物见表2。

分枝杆菌16SrRNA扩增反应条件为：在95℃预变性15秒后进行50个循环：94℃变性3秒，50℃退火10秒，74℃延伸30秒，最后72℃延伸2min；三个降解基因扩增反应条件为：在94℃预变性后进行30个循环：94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸50秒，最后72℃延伸8min。扩增结束后，取10μL扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳(见图6)。

基因扩增结果表明，菌株N12基因组中含有分枝杆菌属特有的16SrRNA，进一步说明N12为一株分枝杆菌。由于N12基因组中含有N12芘降解基因(nidA)，但不含有菲降解基因(phnAc)和萘降解基因(ndoB)，所以认为N12应具有芘降解能力。经检测，未发现有质粒存在，说明芘降解基因(nidA)位于染色体上。

表2 基因扩增所用引物序列及扩增片断大小

实施例4：菌株Mycobacterium sp.SN12最适生长及最佳芘降解温度

由图1可以看出30℃为该菌株的最适生长温度，在此温度下，菌浓度峰值最高，在第四天进入平稳期；在15℃条件下培养也见生长，但生长缓慢；在35℃条件下培养4天便进入平稳期，且生物量低。与此同时测定了菌株N12在不同温度条件下对芘的降解情况，由图2可知在30℃条件下降解效率最高，其次分别为25℃、20℃、35℃和15℃。

实施例5：菌株Mycobacterium sp.SN12对芘的降解

通过对1g/L的标准浓度芘-甲醇溶液进行2倍梯度顺次稀释至0.016μg/mL，并在芘的最大紫外吸收波长240nm处测定吸光度，获得以浓度为Y值以吸光度为X值的标准曲线。发现当芘浓度在0～1μg/mL时浓度对吸光度线性关系十分显著，通过线性回归获得其方程为Y＝2.2276X+0.0067，R²＝0.9999。以此对萃取产物进行适当稀释，使之浓度落于上述范围内便可通过吸光度值换算成芘浓度。

试验结果表明菌株N12具有很强的芘降解能力。对于含芘100mg/L的无机盐培养基，由其对芘的降解曲线(见图4-2)可知，其降解曲线与30℃生长曲线相一致，菌体生长的对数期(2～5天)，也是降解效率最高的时期，培养至第4天时，已经降解69.44％，但其降解效率也开始有所降低，培养至第10天，还有2.16％残留芘未被降解。但当培养至第14天时可以将芘完全降解。

菌株N12也具有很强的芘污染耐受能力，在含较高浓度芘的无机盐培养基中依然可以生长并将芘降解，但随着芘浓度的升高，降解水平下降。经过7天培养可将200mg/L芘降解93.00％、将400mg/L芘降解56.47％、将600mg/L芘降解56.06％、800mg/L芘降解48.97％、1000mg/L芘降解27.36％；当培养至第14天时，可以将600mg/L芘降解95.46％。

实施例6：菌株Mycobacterium sp.SN12的降解谱

实验证明：菌株N12还能以菲、苊、芴为唯一碳源和能源生长，但不能以蒽、萘、苯并芘为唯一碳源和能源生长。在无机盐培养基中培养7天可将100mg/L的菲降解99.37％、100mg/L的苊降解71.80％、100mg/L的芴降解45.29％。但前文提到该分枝杆菌N12不含有菲降解基因(phnAc)，结果却表明该菌株具有很强的菲降解能力。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院沈阳应用生态研究所

<120>一种有机芳香化合物降解菌及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1406

<212>DNA

<213>菌株Mycobacterium sp.SN12

<220>

<221>rRNA

<222>(1)..(1406)

<223>

<400>1

Claims

1.一种有机芳香化合物降解菌，该菌是分子杆菌属的菌株，于2007年7月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M207110；鉴别特征为Mycobacterium gilvum SN12。

2.一种权利要求1所述降解菌的应用，其特征在于：所述降解菌可用于有机芳香化合物的降解。

3.按照权利要求2所述降解菌的应用，其特征在于：所述有机芳香化合物为多环芳烃类化合物。

4.按照权利要求3所述降解菌的应用，其特征在于：所述多环芳烃类化合物为芘、菲、苊和/或芴，降解过程中，降解菌适用的降解体系中芘、菲、苊或芴的浓度为50-600mg/L。