CN113493744B - 一株烟曲霉及其在污水处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株烟曲霉及其在污水处理中的应用。本发明首先从生活污水中分离到一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株SWS2，该菌株已经于2021年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021865。该菌株96h内能将模拟污水培养基中的氨氮含量减少48.50mg·L‑1、硝基氮含量减少10.08mg·L‑1、亚硝基氮含量减少9.90mg·L‑1，磷含量减少38.99mg·L‑1，化学需氧量减少1219mg·L‑1，降解率分别为87.85％、71.95％、65.4％、99.95％和93.76％，具有应用于污水处理中降解N、P含量的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一株烟曲霉及其在污水处理中的应用，尤其是在降解污水中的N、P中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着我国社会经济及城市化进程的快速发展，水体环境污染问题越来越严重。污水是由于水里掺入了新的物质或者因为外界条件的变化，导致水变质不能继续保持原来的使用功能。据统计，我国污水、废水排放量每天约为1亿多吨，截至2016年2月，全国295座城市存在1811个水体污染，其中，河流有1545条，占抽查水体总样本的85.4％；湖、塘合计264个，占14.6％，每年由于水污染造成的经济损失高达377亿元。水体污染破坏城市水体的生态系统，严重影响其景观功能，有损周围群众的感官体验，已成为制约经济和社会发展的一大障碍。
污水是指生活、生产排出的受到污染的、丧失其原本使用功能的水。少量的污染物可以通过水体的自净作用进行自我修复，而过多的污染物进入水体，不仅会破坏其本来的价值和作用，还会破坏水体本身的自净作用，导致水体受到污染。污染水影响了水生生物的生存家园，也会对人类的日常生活、工业生产等方面造成很大的影响，甚至会引起生物富集，导致一些污染物，如残留农药、重金属盐等物质沿生态系统中的食物链或食物网中各营养级的传递，逐步在生物体内积累，对各营养级生物造成巨大伤害作用。按照污水来源，污水可以分为：工业废水、生活污水、养殖污水、商业污水和表面径流。污水处理是为了使污水达到排入某一水体或再次使用的水质要求对其进行净化的过程。污水处理被广泛应用于建筑、农业、交通、能源、石化、环保、城市景观、医疗、餐饮等各个领域，也越来越多地走进寻常百姓的日常生活。
在水污染治理过程中，微生物可以利用污水中的有机物并将其分解，从而达到净化水体的作用。目前，对水质净化起到重要作用的微生物大约有以下几种：光合细菌、酵母菌、硝化细菌、反硝化细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、白腐菌等。微生物法处理污染水体效果良好且具有不易造成二次污染，更加安全、环保、经济的特点，从而被广泛关注。
中国专利文献CN112094758A(申请号202011043866.2)公开了一种烟曲霉菌株及其在降解聚乙烯醇中的应用。该菌株能在以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源的固体无机盐培养基或液体无机盐培养基中生长并降解PVA，在24小时内能将液体培养基中PVA的浓度减少2.72g/L，具有应用于环境中PVA污染微生物处理的潜力。
中国专利文献CN105441339A(申请号201610004133.5)公开了一种烟曲霉及其应用。该烟曲霉可用于降解芘，并进一步用于降解多环芳烃，为芘污染和其他多环芳烃污染的生物处理工程提供强有力的帮助。
中国专利文献CN109182143A(申请号201811142205.8)公开了一种烟曲霉LSD-1及其培养方法和应用。这种烟曲霉LSD-1能够将甾醇降解为二氧化碳和水，对甾醇降解率达到57.83％。
中国专利文献CN107090412A(申请号201710372182.9)公开了一种降解联苯菊酯的烟曲霉及其应用。该烟曲霉对菊酯具有降解作用，对水中的菊酯的降解率可达70.5％；对土壤中菊酯浓度的降解率可达53.6％。
中国专利文献CN104480024A(申请号201410814363.9)公开了一种乙酸丁酯降解菌——烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)HD-2，可以降解乙酸丁酯、氯苯、α-蒎烯、异丙醇或乙酸乙酯，其降解高效、耐受能力强。
中国专利文献CN102329734A(申请号201010223818.1)公开了一种烟曲霉及其应用，能以咪唑乙烟酸为唯一碳源生长，并且其在含200mg·L-1咪唑乙烟酸的基础盐培养基中培养8天，可使咪唑乙烟酸的降解率达82.91％，为治理咪唑乙烟酸污染土壤和水体提供技术支持。
上述专利文献中公开的烟曲霉均可以降解一定的有机污染物，但是采用烟曲霉降解污水中的N、P未见报道。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一株烟曲霉及其在污水处理中的应用。该菌株可以快速、有效的降解污水中的N(氨氮、硝基氮和亚硝基氮)和P，降低化学需氧量且不造成二次污染，在生活污水处理方面具有良好的应用前景。
本发明首先从生活污水中分离到一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株SWS2，该菌株已经于2021年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2021865。上述烟曲霉菌株SWS2在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长为表面深绿色，背面苍白色菌落。光学显微镜下可见淡绿色分生孢子，其梗壁光滑、呈短柱状；顶囊孢子呈烧瓶状；小分生孢子呈球形、绿色有小刺；小梗在顶囊上半部，单层。
上述烟曲霉菌株SWS2的普通培养可以采用PDA培养基。
上述烟曲霉菌株SWS2的大量发酵，可以采用下述的发酵培养基：蔗糖3％，麸皮3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.1％，KCl 0.05％，水1000毫升，121℃湿热灭菌30min。
上述烟曲霉菌株的优选培养温度为28℃，培养时间为2天。
本发明还公开了上述烟曲霉菌株SWS2在污水处理中的应用。进一步的，在降解污水中的N、P中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下具有以下有益效果：
本发明首次提供了能够降解污水中N、P含量的烟曲霉菌株，该菌株96h内能将模拟污水培养基中的氨氮含量减少48.50mg·L-1、硝基氮含量减少10.08mg·L-1、亚硝基氮含量减少9.90mg·L-1，磷含量减少38.99mg·L-1，化学需氧量减少1219mg·L-1，降解率分别为87.85％、71.95％、65.4％、99.95％和93.76％，具有应用于污水处理中降解N、P含量的潜力。
根据GB 18918-2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》，氨氮降解后浓度6.71mg·L-1达到国家排放一级标准B 8.00mg·L-1；磷降解后浓度0.02mg·L-1达到国家排放一级标准A 0.50mg·L-1；化学需氧量降解后浓度81mg·L-1达到国家排放二级标准，该菌株在污水的处理方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为烟曲霉SWS2平板菌落图；
图2为烟曲霉SWS2在20×光学显微镜下的形态图；
图3为烟曲霉SWS2的系统发育树；
图4为烟曲霉SWS2在模拟污水培养基中的生长形态；
图5为烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中的氨氮的降解曲线；
图6为烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中的硝基氮的降解曲线；
图7为烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中的亚硝基氮的降解曲线；
图8为烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中的磷的降解曲线；
图9为烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中的化学需氧量的降解曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：烟曲霉SWS2的分离
取100mL生活污水于500mL锥形瓶中，28℃、160r/min振荡培养3d后，挑取培养液中的菌丝球在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上划线纯化，28℃倒置培养2d后，分别挑取呈烟绿色的单菌落，转接至PDA培养基试管斜面中，于28℃培养2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用，命名为SWS2。
SWS2的长期保藏：将PDA培养斜面上的孢子刮下，制成含孢子108的菌悬液，加入50％甘油，混匀，-70℃保存。
实施例2：烟曲霉SWS2的鉴定
(1)形态学特征
如图1所示，上述SWS2菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长为表面深绿色，背面苍白色菌落。如图2所示，光学显微镜下可见淡绿色分生孢子，其梗壁光滑、呈短柱状；顶囊孢子呈烧瓶状；小分生孢子呈球形、绿色有小刺；小梗在顶囊上半部，单层。
(2)18S rDNA序列分析
将SWS2菌株接种到马铃薯葡萄糖水中，于28℃，160r/min摇床培养24h。所述马铃薯葡萄糖水配方为：马铃薯浸出粉6.0g，葡萄糖20.0g。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在真菌18S rDNA基因通用引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′的引导下进行PCR扩增，PCR长度为642bp。
表1 PCR的扩增体系及组分(50μL)
反应条件：97℃，3min；97℃，15s，55℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃，10min；4℃保存。
将PCR扩增产物与10×Loading Buffer混合，进行25-30min的1％琼脂糖凝胶电泳，电压为18V/cm，电泳时间为20min，采用核酸染料进行琼脂糖电泳染色，采用紫外凝胶成像系统进行拍照。使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收产物测序。将所测18s rDNA序列(SEQ No.1)于NCBI数据库中的序列进行比对，并用MEGA7.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图3所示。
烟曲霉基因序列(SEQ No.1)：
CCCCAAATTTCTTCCCCCCCCCCCCCTTTTTTGTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTAGTTTTTTTTTTTTCCTCCAAAAG。
经形态学特征及18S rDNA序列分析，鉴定菌株SWS2为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，该菌株已经于2021年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2021865。
实施例3：烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中氨氮、硝基氮、亚硝基氮、磷、化学需氧量的降解试验
制备模拟污水培养基1000mL，分装于5个500mL锥形瓶中，配方如表2所示，微量元素配方如表3所示。
表2模拟污水培养基配方
表3微量元素配方
烟曲霉SWS2在模拟污水培养基中的生长形态如图4所示。烟曲霉SWS2对模拟污水培养基中氨氮、硝基氮、亚硝基氮、磷、化学需氧量的降解试验如下。
(1)纳氏试剂分光光度法测定水中氨氮含量及标准曲线绘制
根据国家标准HJ-535-2009《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》的测定方法，绘制氨氮标准曲线并测定SWS2菌种处理0h、24h、48h、72h、96h的模拟生活污水中氨氮残余量。
表4氨氮标准曲线测定
将表4中的将氨氮标准工作液替换为水样，水样为接入菌落计数结果为2×108cfu·mL-1的SWS2菌种、按照表2配制的模拟生活污水，测定其氨氮的含量。
根据公式(1)，计算烟曲霉对模拟污水中氨氮的脱除效果，并绘制降解曲线。
式(1)中，ρN——水样中氨氮的质量浓度，mg·L-1；
m——相应于吸光值的氨氮含量，μg；
V——试样体积，mL。
如图5所示，模拟污水中的氨氮含量在96h内，由55.21mg·L-1降低至6.71mg·L-1，降解效率达到87.85％，证明SWS2菌种具有优良的氨氮降解率。
(2)麝香草酚分光光度法测定水中硝基氮含量及标准曲线绘制
选择麝香草酚分光光度法进行测定，绘制硝基氮标注曲线并测定SWS2菌种处理0h、24h、48h、72h、96h的模拟生活污水中硝基氮残余量。
表5硝基氮标准曲线测定
将表5中的将硝酸盐氮标准使用液替换为水样，水样为接入菌落计数结果为2×108cfu·mL-1的SWS2菌种、按照表2配制的模拟生活污水，测定其硝基氮的含量。
根据公式(2)，计算烟曲霉对模拟污水中硝基氮的脱除效果，并绘制降解曲线。
式(2)中，c——硝基氮浓度，mg·L-1；
m——相应于吸光值的硝基氮含量，μg；
V——试样体积，mL。
如图6所示，模拟污水中的硝基氮含量在96h内，由15.01mg·L-1降低至4.21mg·L-1，降解效率达到71.95％，证明分离得到的SWS2菌种具有良好的硝基氮降解率。
(3)分光光度法测定水中亚硝基氮含量及标准曲线绘制
根据国家标准GB/T 7493-1987《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》的测定方法，绘制亚硝基氮标准曲线并测定SWS2菌种处理0h、24h、48h、72h、96h的模拟生活污水中亚硝基氮残余量。
表6亚硝基氮标准曲线测定
将表6中的将亚硝酸盐氮标准使用液替换为水样，水样为接入菌落计数结果为2×108cfu·mL-1的SWS2菌种、按照表2配制的模拟生活污水，测定其亚硝基氮的含量。
根据公式(3)，计算烟曲霉对模拟污水中亚硝基氮的脱除效果，并绘制降解曲线。
式(3)中，cN——亚硝酸盐浓度，mg·L-1；
mN——相应于吸光值的亚硝酸盐氮含量，μg；
V——试样体积，mL。
如图7所示，模拟污水中的亚硝基氮含量在96h内，由15.22mg·L-1降低至5.32mg·L-1，降解效率达到65.04％，证明SWS2菌种具有良好的亚硝基氮降解率。
(4)钼酸铵分光光度法测定水中磷含量及标准曲线绘制
根据国家标准GB/T 11893-1989《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》的测定方法，绘制磷标准曲线并测定SWS2菌种处理0h、24h、48h、72h、96h的模拟生活污水中亚硝基氮的残余量。
表7磷标准曲线测定
将表7中的将磷酸盐标准工作液替换为水样，水样为接入菌落计数结果为2×108cfu·mL-1的SWS2菌种、按照表2配制的模拟生活污水，测定其磷的含量。
根据公式(4)，计算烟曲霉对模拟污水中磷的脱除效果，并绘制降解曲线。
式(4)中，c——磷浓度，mg·L-1；
m——相应于吸光值的磷含量，μg；
V——试样体积，mL。
如图8所示，模拟污水中的磷含量在96h内，由39.01mg·L-1降低至0.02mg·L-1，降解效率达到99.95％，证明SWS2菌种具有优良的磷降解率。
(5)重铬酸盐法测定水中的化学需氧量
根据国家标准GB/T 1191SWS2989《水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》的测定方法，测定SWS2菌种处理0h、24h、48h、72h、96h的模拟生活污水中化学需氧量。
向回流装置中加入10mL水样，水样为接入菌落计数结果为2×108cfu·mL-1的SWS2菌种、按照表2配制的模拟生活污水。加入沸石和2.0mL硫酸汞溶液、5.0mL重铬酸钾溶液。摇匀后，向沿冷凝管缓慢加入15mL硫酸银-硫酸溶液，溶液沸腾开始计时，188℃沸腾回流2h。回流结束后，冷却至室温，加入2滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液进行滴定，直至溶液颜色变为红褐色且30s不褪色即为滴定终点，记录硫酸亚铁铵消耗体积。
根据公式(5)，计算烟曲霉对模拟污水中化学需氧量的去除效果，并绘制降解曲线。
式(5)中，ρ——水样中的化学需氧量，mg·L-1；
C——硫酸铁铵标准溶液浓度，mol·L-1；
V0——以实验用水为空白试验所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液体积，mL；
V1——水样测定消耗的硫酸亚铁铵标准溶液体积，mL；
V2——水样体积，mL；
f——样品稀释倍数；
8000——1/4O2的摩尔质量以mg·L-1为单位的换算值。
如图9所示，模拟污水中的磷含量在96h内，由1300mg·L-1降低至81mg·L-1，去除效率达到93.76％，证明SWS2菌种能对模拟污水中的还原性有机物及亚硝酸盐有较好的降解作用。
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<110> 山东省科学院生物研究所
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Claims (4)
1.一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株SWS2，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2021865。
2.权利要求1所述的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株SWS2在污水处理中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述的污水处理为：降解污水中的N和P，降低化学需氧量。
4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述降解污水中的N包括氨氮、硝基氮和亚硝基氮。
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