CN113215023A - 一种蜡状芽孢杆菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种蜡状芽孢杆菌及应用，蜡状芽孢杆菌(Baciluscereus)HC7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21660；可有效修复水体，可用于修复黑臭水体，降低水中COD、氨氮等污染物浓度，提升水体DO、ORP、透明度，明显改善水体水质，该菌株温度适应范围广，有较强的环境适应性，环境稳定性好，可耐低温脱氨，修复水体接种量少，应用成本低，具有巨大的推广价值。

Description

一种蜡状芽孢杆菌及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种蜡状芽孢杆菌及应用。
背景技术
随着城市化进程的加快、经济的快速发展，越来越多的生产废水和生活污水排入河流，造成了河流不同程度的污染，其中较为严峻的就是河流黑臭现象。在我国，水体黑臭已成为近几十年来普遍存在的问题，安徽南淝河，浙江温瑞塘河，江苏太湖、安徽巢湖都有黑臭水相关报道。黑臭水体存在诸多危害，不仅影响了城市形象，也会导致水体生态系统恶化，给周边居民造成健康影响，因此，黑臭水体修复技术的研究显得尤为迫切。
黑臭水体修复技术可分为化学修复、物理修复、生物修复。其中化学修复存在向水体中引入污染物造成二次污染的风险，物理修复成本较高，容易破坏水体生态系统，导致黑臭复发，生物修复具有环境友好、成本低廉、技术简单、易于维护等优点，是目前水环境修复和黑臭水体治理研究领域的热点。
投加菌剂是常用的一种生物修复方法，强化微生物分解功能，利用微生物对污染物的吸收转化达到降解污染物的目的。高效的专用降解菌可在污染严重的水体中通过利用有机物、硫化氢、氨等作为供氢体合成自身的组成物质，增加溶解氧，从而起到净化污水的作用。目前，黑臭水体的专用微生物菌种数量有限、降解效果参差不齐、相关工艺技术有待发展。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种蜡状芽孢杆菌及应用，该菌株温度适应范围广，有较强的环境适应性，环境稳定性好，可耐低温脱氨，修复水体接种量少，应用成本低，具有巨大的推广价值。本申请还提公开了菌剂及菌剂制备方法简单，降低了应用成本，具有巨大的推广价值。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种蜡状芽孢杆菌(Baciluscereus)HC7，所述蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.21660，保藏日期为2021年01月18日。
上述蜡状芽孢杆菌的16srDNA如SEQ ID NO.1所示:
AGCTTGCTACATCAGTAGTCTGATCGTGCGAGCAGAATGGATTAAGAGCTGTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGGTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGGCCGCCAGGCTGAAACATCAAAGGATATTGACGGGGGGCCCTCA
本发明还提供了一种菌剂，含上述的蜡状芽孢杆菌。
优选的，所述菌剂由上述的蜡状芽孢杆菌活化培养后制备得到。
一种菌剂的制备方法，包括：将所述蜡状芽孢杆菌活化培养至对数期，得到种子液。
优选的，所述菌剂具体包括：将所述蜡状芽孢杆菌接种于LB培养基中，30℃振荡培养至对数期，得到种子液。
优选的，所述菌剂制备方法还包括：所述种子液发酵培养得到菌液。
优选的，所述菌剂制备方法还包括：所述种子液接种于LB培养基中，30℃振荡培养，得到菌液。
优选的，所述菌剂制备方法还包括：所述种子液接种于LB培养基中，30℃振荡培养，140r/min培养10h，得到菌液。
本发明还提供了上述蜡状芽孢杆菌或上述菌剂在修复水体中的应用。
本发明还提供了一种净化水体的方法，包括：上述蜡状芽孢杆菌活化培养后接种至待净化的水体中进行处理。
优选的，所述方法具体包括：将含所述蜡状芽孢杆菌的菌剂接种至待净化的水体中进行处理；所述菌剂接种量为待净化的水体体积的0.1％～5％。
优选的，所述方法具体包括：所述蜡状芽孢杆菌活化培养后得到种子液，种子液接种至待净化的水体中进行处理；种子液接种量为待净化的水体体积的0.1％～3％。
优选的，种子液接种量为待净化的水体体积的0.1％。
优选的，所述方法具体包括：所述蜡状芽孢杆菌活化培养后得到种子液，所述种子液发酵培养得到菌液，所述菌液接种至待净化的水体中进行处理；所述菌液接种量为待净化的水体体积的5％。
优选的，所述方法具体包括：所述蜡状芽孢杆菌活化培养后得到种子液，所述种子液发酵培养得到菌液，所述菌液接种至待净化的水体中进行处理，所述菌液分5次接种；每次所述菌液接种量为待净化的水体体积的1％。
优选的，所述处理过程温度条件为15℃～30℃。
优选的，所述处理过程温度条件为20℃～25℃。
优选的，所述处理过程pH条件为5～9。
优选的，所述处理过程pH条件为6～7。
优选的，所述水体为黑臭水体。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
目前在黑臭水体修复中，黑臭水体的专用微生物菌种数量有限，复合菌剂制备工艺复杂，菌剂普遍存在稳定性差，低温去除氨氮效果差的问题。专利CN101691569B报道的是蜡状芽胞杆菌应用于含氮废水，是对氨氮去除率，而非是对黑臭水体的修复。专利CN1215991C制备的低温硝化菌剂应用于养殖水体，而非是对黑臭水体的修复，且15℃时氨氮去除率为56％，低温去除氨氮效果差。专利CN104004695B报道的耐低温芽孢杆菌也是用于养殖池塘水质的净化，17℃对氨氮的去除率为38.06％，低温去除氨氮效果差。
本发明提供一种蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7，菌株氧化酶、过氧化氢酶、淀粉酶、脂肪酶鉴定均呈阳性，对不同种类有机物代谢活性较高；该菌株可有效修复水体，可用于修复黑臭水体，降低水中COD、氨氮等污染物浓度，提升水体DO、ORP、透明度，明显改善水体水质。该菌株温度适应范围广，适应地表水的常规pH，菌株在实际应用中有较强的环境适应性，且菌株可耐低温脱氨，15～25℃时对氨氮的去除率为84％～99％。该菌株接种于黑臭水体进行水体修复，接种量少，可有效降低黑臭水体修复成本。此外，该菌株接种20d后仍定植于环境中，环境稳定性好，降低了应用成本。本发明蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7应用成本低，具有巨大的推广价值。
本发明还提供了蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7的菌剂，菌剂为种子液或菌液，将所述蜡状芽孢杆菌活化培养至对数期，得到种子液，所述种子液发酵培养得到菌液。种子液和菌液均可用于修复黑臭水体，降低水中COD、氨氮等污染物浓度，提升水体DO、ORP、透明度，明显改善水体水质。本发明菌剂制备方法简单，降低了应用成本，具有巨大的推广价值。
附图说明
图1为本发明蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7菌株生长曲线；
图2为本发明蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7菌落形态图；
图3为本发明蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7革兰氏染色图；
图4为不同温度下蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7对黑臭水体中COD去除效果对比图；
图5为不同温度下蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7对黑臭水体中氨氮去除效果对比图；
图6为不同pH下蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7对黑臭水体中COD去除效果对比图；
图7为不同pH下蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7对黑臭水体中氨氮去除效果对比图；
图8为不同投加量下蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7对黑臭水体中COD去除效果对比图；
图9为不同投加量下蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7对黑臭水体中氨氮去除效果对比图；
图10为实施例3修复前后微生物群落结构(目水平)图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
一种蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21660，保藏日期为2021年01月18日。
本发明还提供了一种菌剂，含上述的蜡状芽孢杆菌。
实施例1
一、菌株的筛选
1、黑臭水体土著菌株的富集。
对成都市凤凰二沟黑臭河流中水体和底泥进行取样，样品放置于低温储藏箱中转运。
水体中土著菌株富集：摇动混匀取20mL水体加入150mL富集培养基中，恒温震荡箱30℃，140r/min培养2天，复取20mL培养液加入150mL富集培养基进行培养，重复三次即得到水体土著菌株富集培养液。
底泥中土著菌株富集：取5g底泥加入装有150mL灭菌生理盐水的三角瓶中，加入几颗玻璃珠进行磁力搅拌30分钟。取20mL搅拌后液体加入150mL富集培养基中，恒温震荡箱30℃，140r/min培养2天，复取20mL培养液加入150mL富集培养基进行培养，重复三次即得到底泥土著菌株富集培养液。
2、分离纯化。
将富集培养液进行梯度稀释，分别稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，在无菌环境中，用移液器分别吸取各稀释液80μL进行平板涂布，随后将平板翻转，置于恒温培养箱中，30℃培养24-48h。挑取单菌落至新的平板上进行划线纯化，该过程重复三次，最终得到的单菌保存于试管斜面培养基中。
3、定性初筛。
向人工模拟黑臭水体中添加琼脂作为初筛培养基平板。挑取前述得到的菌株至初筛培养基上进行平板划线，培养48h后观察菌落生长情况。选取生长旺盛的菌株进行进一步复筛。
4、定量复筛。
将上述菌株接种于150mLLB培养基中，恒温震荡箱30℃，140r/min培养48h。在无菌环境中，用移液器吸取3mL培养液，5000r/min离心5min，倒掉上清，用无菌生理盐水将沉淀清洗三次后加入100ml人工模拟黑臭水体中。五天后测定黑臭水体COD、氨氮、DO、ORP、透明度，根据水质指标公式评价其修复效果。选取修复效果最好的菌株，命名为：HC7。
制备HC7种子液：在无菌条件下将HC7接种于LB培养基中，30℃恒温振荡箱培养，每隔2h取样测OD600，绘制HC7生长曲线，生长曲线如图1所示。取对数期培养液作为种子液。
二、菌株鉴定
1、生理生化特性鉴定。
将HC7接种于富集培养基上，置于30℃的恒温培养箱中进行培养，24h后观察菌落形态，菌落形态如图2所示。革兰氏染色图如图3所示，该菌株为革兰氏阳性菌，乳白色圆形，好氧菌。
对该菌进行相关酶活性与生理生化指标鉴定，包括氧化酶活性鉴定、过氧化氢酶活性鉴定、淀粉酶活性鉴定、脂肪酶活性鉴定(油脂水解实验)、脲酶活性鉴定(尿素实验)、糖发酵试验、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验。各检测方法如下：
(1)氧化酶活性：在无菌环境中将氧化酶试纸用无菌水浸湿，再用一次性接种针挑取HC7菌落涂在试纸上。观察颜色变化，蓝色为阳性，2min内不变色为阴性。
(2)过氧化氢酶活性：无菌环境，挑取HC7菌落于载玻片上，滴一滴3％过氧化氢溶液，立即观察有无气泡产生。有则为阳性。
(3)淀粉酶活性：制备固体淀粉培养基(蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，可溶性淀粉0.2wt％，琼脂2wt％，NaCl0.5wt％)，挑取HC7菌落进行平板划线，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h后滴入少量鲁哥氏碘液，菌落周围出现无色透明圈即为淀粉酶阳性。
(4)油脂水解实验：制备固体油脂培养基(蛋白胨1wt％，牛肉膏0.5wt％，NaCl0.5wt％，花生油1wt％，琼脂2wt％，1.6％(w/v)中性红水溶液1mL,pH7.2；调好pH后再加入中性红；分装时需不断搅拌使油均匀分布在培养基中)，挑取HC7菌落进行平板划线，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h后观察菌落颜色，出现红色斑点为阳性，否则为阴性。
(5)脲酶活性鉴定：在试管中制备尿素斜面培养基(尿素2wt％，琼脂1.5wt％，NaCl0.5wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，蛋白胨0.1wt％，酚红0.0012wt％，pH6.8)，将HC7菌落接种至该斜面培养基中，置于35℃恒温培养箱培养48h，培养基变红色为阳性，否则为阴性。
(6)糖发酵实验：制备糖发酵液体培养基(蛋白胨1wt％，NaCl0.5wt％，1.6％(w/v)溴甲酚紫乙醇溶液1wt％，糖溶液1wt％)，糖发酵液体培养基中放入倒置的杜氏小管，在无菌环境中，将HC7接种至糖发酵液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养48h，培养基变黄色为产酸阳性，杜氏小管中有气泡为产气阳性，否则为阴性。
(6)甲基红试验：制备试验用培养基(0.5wt％蛋白胨，0.5wt％磷酸氢二钾)，取上述HC7种子液于无菌环境及操作下按10％(v/v)接种量接种于甲基红培养基中，分别培养2d、6d，得到培养液A，随后取8ml得到的培养液A于试管中，加入一滴1g/L甲基红试剂，若培养液A显红色即甲基红阳性，否则为阴性。
(7)V-P试验：制备试验用培养基，取上述HC7种子液于无菌环境及操作下按10％(v/v)接种量接种于甲基红培养基中，分别培养2d、6d，得到培养液B，培养完毕后取8ml培养液B于试管中，加入1ml0.3％肌酸溶液(肌酸使用40％氢氧化钠溶解)，若培养液B显红色，继续放置1h，仍未变色即V-P实验阳性，否则为阴性。
(8)吲哚试验：配置吲哚培养基(1wt％蛋白胨，5wt％氯化钠，调pH为7.6)，配置吲哚试剂(称取0.5g对二甲基氨基苯甲醛于150ml锥形瓶中，加入47.5ml95％(v/v)乙醇溶液，加入10ml浓盐酸)。取HC7种子液于无菌环境及操作下按10％(v/v)接种量接种到吲哚培养基中，30℃恒温培养箱中培养3d，培养完毕后，得到培养液C，取10ml培养液C于试管，加入3mL戊醇，静置20min后沿管壁加入2ml吲哚试剂，若培养液C显示红色即吲哚阳性，否则为阴性。
结果如表1所示。
表1生理生化指标鉴定结果
Figure BDA0002965262660000091
其中，“-”表示呈阴性，“+”表示呈阳性。
2、分子鉴定。
采用生工细菌DNA提取试剂盒提取纯化后的HC7菌的总DNA，以之为模板，选取16SrRNA细菌通用引物进行PCR扩增，并进行跑胶纯化及回收，PCR产物交由生工进行测序，得到长度为918bp的序列，具体序列如SEQ ID 1所示：
AGCTTGCTACATCAGTAGTCTGATCGTGCGAGCAGAATGGATTAAGAGCTGTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGGTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGGCCGCCAGGCTGAAACATCAAAGGATATTGACGGGGGGCCCTCA
利用BLAST将所测得的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已登录的序列进行同源性比较，HC7同源性最近菌株为Bacillus cereus，序列覆盖率为96％，相似性为99％。
筛选、鉴定出的菌株HC7为蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7，所述蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21660，保藏日期为2021年01月18日。
实施例2
不同理化因素对菌株修复黑臭水体效果的影响
探究理化因素影响时，分别将实施例1中的HC7种子液接种于人工模拟黑臭水体中，人工模拟黑臭水体初始值为COD 78mg/L,氨氮16mg/L，DO 0mg/L，氧化还原电位ORP-217mV，透明度13cm，按照《黑臭水体整治工作指南》中黑臭水体判别标准属于重度黑臭。8d后取样，测定人工模拟黑臭水体化学需氧量COD、氨氮、溶解氧DO、氧化还原电位ORP、透明度，每组三个平行。氨氮按照HJ 535-2009纳氏试剂分光光度法测定，其它指标按照《水和废水监测分析方法(第四版)》中所述方法进行测定。
1、不同温度对黑臭水体修复效果的影响
设4个实验组，将实施例1中的HC7种子液人工模拟黑臭水体体积3％的投加量接种于人工模拟黑臭水体中，实验温度分别为15℃，20℃，25℃，30℃，人工模拟黑臭水体pH为7±0.2。不同温度条件下HC7菌株对黑臭水体中COD和氨氮去除效果如图4(不同温度下HC7对黑臭水体中COD去除效果对比图)、图5(不同温度下HC7对黑臭水体中氨氮去除效果对比图)所示，修复前后黑臭水体中DO、ORP、透明度如表2所示。
表2不同温度条件下HC7对黑臭水体中DO、ORP、透明度影响对比
指标 DO(mg/L) ORP(mV) 透明度(cm)
原水 0 -217 13
15℃处理 5.34 119 21.7
20℃处理 5.1 127 20.5
25℃处理 4.92 111 13.3
30℃处理 5.01 112 12.3
从图4～5可以看出，不同温度对HC7菌株去除COD和氨氮的影响效果不同。温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃时，COD去除率分别为51％、65％、53％、51％，氨氮去除率分别为84％、87％、99％、87％；温度为20℃时COD去除效果最好，温度为25℃、30℃时COD去除率降低，结合表2可以看出此时水体透明度较低，可能是由于菌体增殖死亡后释放出溶解性COD所致；所有处理组COD均低于40mg/L，满足地表V类水标准；温度为25℃时氨氮去除效果最好，浓度接近0mg/L，所有处理组氨氮去除率均大于80％。
结果表明：上述蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7活化培养后得到HC7种子液，HC7种子液接种至待净化的人工模拟黑臭水体中进行处理，所述处理过程温度条件为15℃～30℃，能够明显降低化学需氧量COD、降低氨氮、增加溶解氧DO、增加氧化还原电位ORP、增加透明度，即可以明显改善黑臭水体水质。优选为20℃～25℃，20℃～25℃时COD和氨氮的去除效果较好，所有处理组水质指标均能达到黑臭消除的标准，表明该菌株温度适应范围广。
2、不同pH对黑臭水体修复效果的影响
设5个实验组，将实施例1中的HC7种子液以人工模拟黑臭水体体积3％的投加量接种于人工模拟黑臭水体中，人工模拟黑臭水体pH值分别为pH＝5，pH＝6，pH＝7，pH＝8，pH＝9，实验温度为30℃。不同pH条件下HC7菌株对黑臭水体中COD和氨氮去除效果如图6(不同pH下HC7对黑臭水体中COD去除效果对比图)、图7(不同pH下HC7对黑臭水体中氨氮去除效果对比图)所示，修复前后黑臭水体中DO、ORP、透明度如表3所示，修复前后黑臭水体中COD和氨氮如表4所示。
表3不同pH下HC7对黑臭水体中DO、ORP、透明度影响对比
Figure BDA0002965262660000121
Figure BDA0002965262660000131
表4不同pH下COD和氨氮降解效果
Figure BDA0002965262660000132
如图6～7所示，不同pH对HC7菌株去除COD和氨氮的影响效果不同。pH为6时，HC7菌株对COD去除效果最好，此时COD由78mg/L降至27mg/L，达到地表Ⅳ类水标准，COD去除率达到了64％以上，其它处理组COD去除率均大于50％；随着水体pH升高，氨氮的去除率呈现上升趋势，pH为9时，氨氮去除效果最好，通常情况下pH值能改变细胞膜的通透性和表面带电性，导致分子态氨氮进入细胞，造成毒害，但该菌株对pH耐受性较高，代谢活性较强，吸收分子态氨氮后降解加快；从表3可以看出，各处理组DO、ORP、透明度均能满足黑臭消除的标准。
结果表明：上述蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7活化培养后得到HC7种子液，HC7种子液接种至待净化的人工模拟黑臭水体中进行处理，所述处理过程pH条件为5～9，能够明显降低化学需氧量COD、降低氨氮、增加溶解氧DO、增加氧化还原电位ORP、增加透明度，即可以明显改善黑臭水体水质。优选为6～7，pH为6～7时，HC7菌株对黑臭水体综合修复效果较好，该pH值为地表水的常规pH，表明HC7菌株在实际应用中有较强的环境适应性。
3、不同投加量对黑臭水体修复效果的影响
设5个实验组，分别按人工模拟黑臭水体体积0.1％，0.5％，1％，2％，3％的投加量，接种于人工模拟黑臭水体中，人工模拟黑臭水体pH为7±0.2，实验温度为30℃。不同投加量下HC7菌株对黑臭水体中COD和氨氮去除效果如图8(不同投加量下HC7对黑臭水体中COD去除效果对比图)、图9(不同投加量下HC7对黑臭水体中氨氮去除效果对比图)所示，修复前后黑臭水体中DO、ORP、透明度如表5所示。
表5不同投加量下HC7对黑臭水体中DO、ORP、透明度影响对比
指标 DO(mg/L) ORP(mV) 透明度(cm)
原水 0 -217 13
投加量0.1％ 4.65 135 12
投加量0.5％ 4.91 107 15.85
投加量1％ 5.29 98 16.95
投加量2％ 5.54 103 16.7
投加量3％ 5.14 99 17.1
由图8～9可知，投加不同量的HC7对黑臭水体修复效果不同。投加量为0.1％，0.5％，1％时，COD去除率几乎不变，分别为62％，64％，63％，COD浓度均低于30mg/L；当投加量增加至2％时，可能是由于HC7增殖死亡后菌体释放出COD，COD去除率降低至40％；氨氮去除率随HC7投加量增加而降低，最高去除率为92.42％，当HC7投加量增加时，水体中COD浓度较高，硝化菌等自养菌生长被抑制，因此氨氮去除率降低；由表4可知水体各项理化指标较好，黑臭水体修复效果较好。
结果表明：上述蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7活化培养后得到HC7种子液，HC7种子液接种至待净化的人工模拟黑臭水体中进行处理，所述处理过程HC7种子液接种量为待净化的人工模拟黑臭水体体积的0.1％～3％，能够明显降低化学需氧量COD、降低氨氮、增加溶解氧DO、增加氧化还原电位ORP、增加透明度，即可以明显改善黑臭水体水质。HC7菌株修复黑臭水体时最佳接种量为0.1％，投加较少的菌剂即可以实现良好的修复效果，有利于节约成本。
实施例3
1、菌液的配制：将实施例1中的HC7种子液以10％(v/v)接种量转接至LB培养基中，恒温振荡箱30℃，140r/min培养10h，即得菌液。
2、方法：取黑臭水体，水温为20～25℃时，采用喷洒的方式向黑臭水体中喷洒菌液，菌液接种量为修复前黑臭水体体积的1％，喷洒当日水体曝气24h，随后停止；3d之后再次喷洒菌液，菌液接种量为修复前黑臭水体体积的1％，喷洒当日水体曝气24h，随后停止；一共喷洒5次菌液(每次菌液接种量均为修复前黑臭水体体积的1％)。总修复时间为20d。测定修复前后水体的COD、氨氮、DO、ORP、透明度。测定修复前后水体中微生物群落结构。
自然黑臭水体环境较为复杂，为了使菌株能够定植于自然环境中，单次接种量相比实施例2(实验对象为人工模拟黑臭水)扩大了10倍。次数变为5次。
化学需氧量COD使用Lovibond COD测定仪按HJ/T 399-2007标准快速消解分光光度法测定；氨氮按照HJ 535-2009纳氏试剂分光光度法测定；溶解氧DO按照《水和废水监测分析方法(第四版)》中所述电极法用便携式测定仪进行原位测定；氧化还原电位ORP按照《水和废水监测分析方法(第四版)》中所述电化学法进行原位测定；透明度按照《水和废水监测分析方法(第四版)》中所述方法用透明度计进行测定；黑臭等级根据《城市黑臭水体整治工作指南》中所述城市黑臭水体污染程度分级标准进行判定。
3、结果：处理结果如表6所示。修复前后微生物群落结构(目水平)如图10所。
表6 HC7修复前后黑臭水体水质指标
Figure BDA0002965262660000161
结果表明：修复后水体后微生物群落结构改变，芽孢杆菌为主要菌群，表明蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)HC7在环境中稳定存在，且能够明显降低化学需氧量COD、降低氨氮、增加溶解氧DO、增加氧化还原电位ORP、增加透明度，即可以明显改善黑臭水体水质。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川君和环保股份有限公司
<120> 一种蜡状芽孢杆菌及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 918
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)
<400> 1
agcttgctac atcagtagtc tgatcgtgcg agcagaatgg attaagagct gtgctcttat 60
gaagttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccataaga ctgggataac 120
tccgggaaac cggggctaat accggataac attttgaacc gcatggttcg aaattgaaag 180
gcggcttcgg ctgtcactta tggatggacc cgcgtcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240
ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300
agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360
tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta 420
gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta 540
ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac 600
cgtggagggt cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt 720
ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagaggggtt ccgcccttta gtgctgaagt 840
taacgcatta agcactccgc ctgggggagt acgggccgcc aggctgaaac atcaaaggat 900
attgacgggg ggccctca 918

Claims (10)

1.一种蜡状芽孢杆菌(Baciluscereus)HC7，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌(Baciluscereus)HC7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21660。
2.一种菌剂，其特征在于，含权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌。
3.一种菌剂的制备方法，其特征在于，包括：将所述蜡状芽孢杆菌活化培养至对数期，得到种子液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括：所述种子液发酵培养得到菌液。
5.权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌或权利要求2～4任意一项所述的菌剂在修复水体中的应用。
6.一种净化水体的方法，其特征在于，包括：权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌活化培养后接种至待净化的水体中进行处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：将含蜡状芽孢杆菌的菌剂接种至待净化的水体中进行处理；所述菌剂接种量为待净化的水体体积的0.1％～5％。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述处理过程温度条件为15℃～30℃。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述处理过程pH条件为5～9。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述水体为黑臭水体。
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