CN111268805A - 一株蜡状芽孢杆菌及在猪粪沼液絮凝中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株蜡状芽孢杆菌及在猪粪沼液絮凝中的应用。具体应用为：在所述猪粪沼液中加入所述蜡状芽孢杆菌发酵产物，再加入所述助凝剂，混匀后，静置即可。使用本发明所述方法，可针对性絮凝猪粪沼液，絮凝效果高达84％以上。

Description

一株蜡状芽孢杆菌及在猪粪沼液絮凝中的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株蜡状芽孢杆菌及在猪粪沼液絮凝中的应用。

背景技术

近年来，随着畜禽养殖规模的不断扩大，养殖污水排放量也日益增加。如果将养殖污水直接排入环境，会带来严重的环境问题。厌氧消化是处理养殖污水的常用方法，其不仅可以实现畜禽养殖废弃物的无害化处理，也可以产生沼气、提供清洁能源。与此同时，伴随着沼气工程的快速发展，大量的沼液随之产生。但沼液存在含水量较高、储存运输困难、经济价值相对较低等缺陷。当工程规模过大、产生的沼液量远远超过当地农田最大消纳量时，沼液就变成了一种难以治理的废水。如果将这部分沼液随意排放，会对自然环境尤其是水体环境造成严重伤害。因此，对沼液进行无害化处理，使其达到相关标准尤为重要。然而，现有对沼液的处理方法均需要先絮凝沉淀去除沼液中的颗粒悬浮物(SS)。

目前广泛应用的絮凝剂主要有：以铝系为代表的无机高分子絮凝剂，及以聚丙烯酰胺为代表的有机高分子絮凝剂。无机絮凝剂有着经济、用法简单的优点；但同时也存在用量大、絮凝效果低、成本高、腐蚀性强等缺陷。有机高分子絮凝剂是20世纪60年代后期才发展起来的一类新型废水处理剂，与传统絮凝剂相比，它能成倍提高效能，且用量少，浮渣产量少，絮凝能力强，絮体容易分离，除油及除悬浮物效果好。但由于大多数有机高分子絮凝剂本身或其水解、降解产物有毒，且合成用丙烯酰胺单体有毒，会麻醉人的中枢神经，残余单体具有“三致”效应(致畸、致癌、致突变)，不符合当今环境友好发展的趋势。另外，当使用无机高分子或有机高分子作为絮凝剂时，沉淀物中的大量铝离子或聚丙烯酰胺的存在也会影响沼渣、沼液作为高品质肥料的使用。

由于微生物絮凝剂可以克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，不存在二次污染，使用安全，近年来在微生物絮凝剂的研究日益受到重视。但沼液天然具有一定的杀菌作用，能在沼液中良好生长的微生物菌种资源匮乏，絮凝效果也并不理想。另外，不同沼液由于各自组分的不同，可在一种沼液中生长良好的菌株并不一定适应另一种沼液的环境。因此，可应用于沼液的微生物絮凝剂发展受限。如能针对特定沼液提出具有特定絮凝效果的微生物絮凝剂，将具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株蜡状芽孢杆菌及在猪粪沼液絮凝中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株蜡状芽孢杆菌，于2019年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.17865。

相应的，一株蜡状芽孢杆菌，其16S rDNA如SEQ ID No.1所示。

相应的，所述蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用。

优选的，所述应用中使用硫酸铁为助凝剂。

优选的，所述硫酸铁的用量为

助凝剂质量g/絮凝体系总体积mL。

优选的，所述应用为：在所述猪粪沼液中加入所述蜡状芽孢杆菌发酵产物，再加入所述助凝剂，混匀后，静置。

优选的，所述蜡状芽孢杆菌发酵产物为蜡状芽孢杆菌发酵液的上清液。

优选的，所述蜡状芽孢杆菌发酵产物取自发酵第3天的发酵液。

优选的，所述蜡状芽孢杆菌在发酵过程中，使用葡萄糖或蔗糖为碳源。

优选的，所述蜡状芽孢杆菌在发酵过程中，使用蛋白胨或尿素为氮源。

本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的蜡状芽孢杆菌，并利用所述蜡状芽孢杆菌发酵获得的上清液制备了一种可针对性絮凝处理猪粪沼液的絮凝剂。

附图说明

图1为使用不同发酵时间的发酵液絮凝高岭土溶液的效果展示图；

图2为使用不同助凝剂絮凝高岭土溶液的效果展示图；

图3为使用不同种类絮凝剂絮凝高岭土溶液的效果展示图；

图4为使用不同外加碳源对絮凝高岭土溶液影响的效果展示图；

图5为使用不同外加氮源对絮凝高岭土溶液影响的效果展示图；

图6为助凝剂用量对絮凝猪粪沼液影响的效果展示图；

图7为发酵液用量对絮凝猪粪沼液影响的效果展示图；

图8为发酵液絮凝不同批次猪粪沼液照片；

图9为发酵液絮凝牛粪沼液照片；

图10为发酵液絮凝鸡粪沼液照片；

图11为发酵液絮凝酒糟沼液照片；

图12为不同絮凝剂絮凝猪粪沼液的对比照片；

图13为其它蜡状芽孢杆菌絮凝猪粪沼液的照片。

具体实施方式

本发明涉及的培养基配方为：葡萄糖10g/L；蛋白胨0.5g/L、酵母提取物0.5g/L、尿素0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，pH为7～9，115℃灭菌20min。如需固体培养基，则添加20g/L的琼脂。

本发明涉及的对高岭土溶液进行絮凝的实验方法为：取4g/L的高岭土溶液40mL，加入絮凝剂，再加入助凝剂，搅拌均匀后，静置10min后观察絮凝效果。絮凝率的计算方法为：采用分光光度计法分别测定高岭土处理前后吸光度值的变化，以计算絮凝率。具体为：取液面下2cm的液体，测定其在550nm的吸光度值，根据加入絮凝剂处理与空白的吸光度值变化得到絮凝率。计算公式为：高岭土絮凝率＝(A-B)/A×100％。其中，A为空白组在550nm下的吸光度值，B为加入絮凝剂处理后在550nm下吸光度值。

本发明涉及的对沼液进行絮凝的实验方法为：取20mL沼液，加入絮凝剂，再加入助凝剂，搅拌均匀后，静置10min后观察絮凝效果。絮凝率的计算方法为：采用浊度仪测定沼液处理前后浊度的变化来计算。具体为：取液面下2cm的液体，测定处理前后浊度的变化，从而计算出絮凝率。计算公式为：沼液絮凝率＝(M-N)/M×100％。其中，M为空白组的浊度，N为加入絮凝剂处理后的浊度。

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。

实施例一：絮凝剂产生菌的筛选与鉴定

取中国科学院成都生物研究所实验室发酵罐内保存的活性污泥10mL至装有50mL无菌水的150mL三角瓶中，摇匀后静置1min，取5mL到装有100mL所述培养基的150mL三角瓶中，在pH＝7、30℃下160r/min摇床培养24h。随后采用稀释涂布法分10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6六个梯度稀释发酵液后涂布于所述固体培养基上，挑取不同的单菌落，再用平板划线法分离单个菌落三次以上，直至菌落形态一致，得到纯化菌种。将纯化后的菌种接种5mL到装有100mL所述培养基的150mL三角瓶中，在pH＝7、30℃下160r/min摇床培养72h，每隔24h取一次样，以常用助凝剂氯化钙为助凝剂，测量以猪粪沼液为处理对象的絮凝率，选出絮凝效果好的菌种。

将获得的菌种进行测序分析：采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，然后测序分析，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。测序结果经NCBI数据库中的BLAST比对，菌株AS33与蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的同源性为100％，因此鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌。

将所述蜡状芽孢杆菌命名为：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2019年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.17865。

实施例二：蜡状芽孢杆菌絮凝高岭土溶液的条件优化

配置相同所述培养基分装于150mL三角瓶中，接种蜡状芽孢杆菌进行培养，以高岭土为处理对象，以发酵液为絮凝剂，在40mL、4g/L的高岭土悬浊液体系中，采用单因素试验考察不同时间、不同助凝剂、不同助凝剂用量和不同絮凝剂用量对菌体生长及絮凝效果的影响。除考察因素外，发酵条件为：pH＝7、30℃、160r/min摇床培养3天。絮凝剂用量为2％(％指絮凝剂与待絮凝沼液体积间的体积比，后文无特殊说明则与此相同。2％为一般用量)。具体如下：

1、絮凝剂发酵时间(菌浓度)的优化。未添加助凝剂，160r/min摇床培养7d，每24h取样一次发酵液作为絮凝剂，测量絮凝率。结果如图1所示。在使用了助凝剂的情况下，第5天(发酵液中活菌浓度为1.9×10⁸CFU/mL左右；发酵液的OD₆₀₀为2.3)絮凝效果最佳，第3天(发酵液中活菌浓度为2×10⁸CFU/mL左右；发酵液的OD₆₀₀为2.1)与第5天效果相当。实际应用时，需发酵至发酵液中活菌浓度为1×10⁶CFU/mL～5×10⁸CFU/mL，且发酵液的OD₆₀₀为1～2.5。在活菌浓度为1.8×10⁸CFU/mL、上清液的OD₆₀₀为2时，絮凝效果最佳。考虑到实际使用时培养时间过长则成本过高，故后续试验中选择第三天的发酵液作为絮凝剂。

2、助凝剂的优化。取步骤1中发酵至第3天的发酵液，分别选用硫酸铝、氯化铝、硫酸铁、硫酸钙、氯化钙为助凝剂，各助凝剂的添加量为万分之一(助凝剂质量g/絮凝体系总体积mL)。测量絮凝率。结果如图2所示，选择硫酸铁作为助凝剂时，絮凝效果最佳。

3、絮凝剂种类的选择。选择步骤1中发酵3天获得发酵液，分别取发酵液的离心上清液、发酵液的离心沉淀、发酵液离心沉淀破碎后的离心上清液、发酵液离心沉淀破碎后的离心沉淀，分别作为絮凝剂，并以硫酸铁为助凝剂，分别测量絮凝率。结果如图3所示。后续试验均使用发酵液的离心上清液作为絮凝剂。

4、外加碳源的优化。分别使用葡萄糖10g/L，木糖10g/L，蔗糖9.5g/L，可溶性淀粉9.5g/L，柠檬酸钠14.3g/L，乙醇7.7g/L，乙酸钠13.7，丙酸钠10.7g/L作为外加碳源，分别替换所述培养基中10g/L的葡萄糖。使用调整后的新培养基培养所述蜡状芽孢杆菌。分别测量各组絮凝率。结果如图4所示。

5、外加氮源的优化。分别使用3.2g/L蛋白胨、1.8g/L氯化铵、3.3g/L硝酸钾、1.0g/L尿素作为外加氮源，替换所述培养基中的氮源(蛋白胨0.5g/L、酵母提取物0.5g/L、尿素0.5g/L和(NH4)2SO4 0.5g/L)。外加氮源的总量为0.5g/L的N。分别测量各组絮凝率，结果如图5所示。

根据上述试验，最终确定，在后续试验中，取所述蜡状芽孢杆菌第三天的发酵液作为絮凝剂(下文将该絮凝剂简称为AS33)；以硫酸铁作为助凝剂；以蔗糖为碳源、尿素为氮源时生长良好；以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源时絮凝率最高，达到85.21％。

实施例三：蜡状芽孢杆菌絮凝猪粪沼液的条件优化

选择成都双流区某养猪场沼气工程的猪粪沼液，进行絮凝试验。测试猪粪沼液中初始氨氮含量约为3011mg/L，COD为9000～12000mg/L。配置相同所述培养基分装于150mL三角瓶中，接种蜡状芽孢杆菌进行培养。以所述猪粪沼液为处理对象，以发酵液离心上清液为絮凝剂，在40mL猪粪沼液体系中，采用单因素试验考察不同助凝剂用量和不同絮凝剂用量对菌体生长及絮凝效果的影响。获得发酵液的发酵条件为：pH＝7、30℃、160r/min摇床培养3天。具体如下：

1、助凝剂用量的优化。絮凝剂用量为4％(絮凝剂体积：待絮凝沼液体积)。以硫酸铁为助凝剂，分别加入

的助凝剂。其中，比值具体指助凝剂质量：总体系体积(g/mL)。为方便操作，配置400μL为1.000％的助凝剂溶液。分别测定各组测量絮凝率。结果如图6所示：添加

的助凝剂时，絮凝效果最佳；添加

的助凝剂时，絮凝效果略弱于

2、絮凝剂用量的优化。使用

的硫酸铁溶液，分别加入1％、2％、3％、4％、5％体积的絮凝剂。所述絮凝剂指步骤1获得的发酵3天的发酵液的上清液。其中，比值指絮凝剂体积：待絮凝沼液体积。分别测量絮凝率。结果如图7所示。图7中分别使用0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL发酵液作为絮凝剂。使用4％絮凝剂时，效果最佳。

实施例四：蜡状芽孢杆菌絮凝不同来源的猪粪沼液效果展示

选择成都市双流区某养猪场沼气工程不同批次的猪粪沼液，进行絮凝试验。试验方法同实施例三，其中，硫酸铁用量为

絮凝剂用量4％。絮凝率分别为：84.58％、86.47％、81.29％、86.77％、83.69％。并任意选取4瓶絮凝猪粪沼液的效果进行展示，如图8所示。证明蜡状芽孢杆菌对猪粪沼液确实存在针对性絮凝效果，与猪粪沼液批次无关。

实施例五：蜡状芽孢杆菌絮凝其它沼液效果展示

以发酵3天的蜡状芽孢杆菌发酵液的上清液为絮凝剂，以硫酸铁为助凝剂，在与实施例四相同的条件下，分别对牛粪沼液、鸡粪沼液、酒糟沼液进行絮凝。所述牛粪沼液取自石家庄某奶牛场沼气工程；所述鸡粪沼液取自山东某鸡粪沼气工程；所述酒糟沼液取自遵义播州区某酒糟沼气工程。

牛粪沼液、鸡粪沼液、酒糟沼液的絮凝效果分别如图9、10、11所示，絮凝率分别为30.49％、4.51％、4.21％。上述结果证明，本发明提供的蜡状芽孢杆菌对沼液的絮凝效果主要体现于猪粪沼液上，如果对沼液种类进行更换，则无法达到良好的絮凝效果。可能的原因为：猪粪沼液中所含有的某种或某些特定物质与本发明提供的蜡状芽孢杆菌或其代谢产物间产生了特定反应，从而出现优异的针对性絮凝效果。

实施例六：其它絮凝剂絮凝猪粪沼液效果展示

1、在与实施例四相同条件下，分别使用絮凝剂AS28(产自粪产碱菌，CGMCCNo.17863)+硫酸铁助凝剂、絮凝剂AS30(产自缺陷短波单胞菌，CGMCC No.17864)+硫酸铁助凝剂、本发明的蜡状芽孢杆菌絮凝剂(AS33)+硫酸铁助凝剂、硫酸铁、聚合氯化铝和聚丙烯酰胺作为絮凝剂，对猪粪沼液进行絮凝。结果如图12所示，絮凝率分别为3.76％、50.21％、84.58％、2.71％、1.96％、0.57％。

2、从中国微生物菌种保藏管理中心购买CGMCC1 No.1.9067蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，在与实施例四相同的条件下，添加硫酸铁助凝剂，对猪粪沼液进行絮凝。结果如图13所示，絮凝率为19.54％，效果不理想。

上述试验证明，本发明提供的AS33确实对猪粪沼液具有针对性絮凝效果，使用其它微生物制备的絮凝剂或使用一般的化学絮凝剂均难以达到相当的效果。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一株蜡状芽孢杆菌及在猪粪沼液絮凝中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

<400> 1

ggttcgacgc gtgctataca tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc ggataacatt ttgaaccgca tggttcgaaa ttgaaaggcg 180

gcttcggctg tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360

gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420

aagaacaagt gctagttgaa taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg 540

ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600

ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg 720

taactgacac tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcga 949

Claims (10)

1.一株蜡状芽孢杆菌，其特征在于：于2019年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.17865。

2.一株蜡状芽孢杆菌，其特征在于：其16S rDNA如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1或2所述蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用。

4.根据权利要求3所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述应用中使用硫酸铁为助凝剂。

5.根据权利要求4所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述硫酸铁的用量为

助凝剂质量g/絮凝体系总体积mL。

6.根据权利要求4所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述应用为：在所述猪粪沼液中加入所述蜡状芽孢杆菌发酵产物，再加入所述助凝剂，混匀后，静置。

7.根据权利要求6所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌发酵产物为蜡状芽孢杆菌发酵液的上清液。

8.根据权利要求7所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌发酵产物取自发酵第3天的发酵液。

9.根据权利要求6所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌在发酵过程中，使用葡萄糖或蔗糖为碳源。

10.根据权利要求6所述的蜡状芽孢杆菌在絮凝猪粪沼液中的应用，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌在发酵过程中，使用蛋白胨或尿素为氮源。

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