CN111100807B

CN111100807B - 一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌zaa002菌株及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN111100807B
Application number: CN201911180926.2A
Authority: CN
Inventors: 刘大群; 李小琼; 张程程; 章检明; 吴卫成; 胡海娇; 忻晓庭
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-11-27
Also published as: CN111100807A

Abstract

本发明公开了一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株，已于2018年8月21日保藏于中国典型培养微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.2018554。该海杆菌ZAA002菌株的分离方法，包括如下步骤：1)取榨菜高盐废水，并将该高盐废水进行加水稀释；2)采用逐步稀释法将样品进行初步分离筛选后，经LB培养基活化，再多次转接到废水中，并从中选取生长培养周期短且OD600≥0.5的菌株作为初筛菌株；3)将初筛菌株接种于经过水质调节过的废水中，选取对废水COD处理效果≥50％的菌株，作为复筛菌株，并将该复筛菌株置于培养箱培养，待长出明显菌落，并经进一步划线纯化，进而获得纯菌种ZAA002菌株。该海杆菌ZAA002菌株应用于榨菜废水COD的降解，5天内COD的降解达54.5％。

Description

一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及蔬菜加工与食品生物技术领域，具体涉及一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

榨菜是我国传统的著名酱腌制品，同德国的甜酸甘蓝、欧洲酱黄瓜一起并称为世界三大名腌菜，以浙江、重庆和四川为国内最主要的产地，全国榨菜成品年产量达90万吨以上。榨菜生产过程会产生大量废水，包括腌制、淘洗、脱盐等生产工艺中排放的废水中有很高的盐浓度和有机物浓度。当前，盐渍蔬菜行业存在淡水耗量大、卤水大量排放且高盐(含盐量﹥10％)、高污染物浓度(COD浓度高达40000mg/L)、难降解、排放易导致河流、村镇饮用水源及农田土壤严重污染等问题，严重制约了我国盐渍蔬菜行业的发展及市场的推广。以浙江省为例，浙江省是全国榨菜第二大主产区，年加工榨菜约150万吨，每加工1吨榨菜成品将产生约1.5吨的污水，仅海宁31家榨菜企业每天污水排放量为1300余吨，每年浙江省产生的榨菜污水高达225万吨，据此测算浙江省每年产生的盐渍蔬菜废水约为400-500万吨。榨菜在给我国农民带来经济效益的同时，也极大地污染了环境。因为我国传统意义上的榨菜腌制是依靠食盐的高渗透压和高盐量等方法进行的，包括目前的低盐产品也是高盐坯料经脱盐而加工成的，高盐榨菜坯料的含盐量高达13％～15％以上。高盐使榨菜坯料得以较长时间的保存，但是高盐的弊端除给人类因长期食用高钠低钾容易引发高血压等疾病外，高浓度的含盐废水排放(COD含量高达40000mg/g)会使河网水体及农田受到严重污染从而导致水体黑臭、土壤板结及盐碱化环境污染严重。

如今，盐渍蔬菜加工废水的治理办法主要是传统生化法，其存在占地面积大、资金投入大、污水排放时间、排放量不规律以及耐盐菌群驯化难、COD的降解能力差、盐分含量高、运行维护困难、治污成本较高等缺点，导致企业治污积极性不高，环保部门监管困难，分布乡镇的盐渍蔬菜企业经常把未经有效处理的废水偷偷排放，对受纳水体水环境形成以及周边河田等造成严重威胁。

微生物作为污水生物处理的主体，决定着整个系统的处理效果。因此，深入探究处理过程中的微生物群落结构对污水处理工艺的运行和优化具有指导性意义。传统微生物检测主要通过镜检、纯种分离、培养计数和生理生化鉴定等方法对微生物分析，测定，培养过程复杂耗时，可培养的细菌仅占污泥中微生物总数的1％-5％，加之选择培养技术等定量方法准确性低，使得废水处理微生物研究处于“黑匣子”阶段。近年来，现代分子生物学技术引起了广泛关注，它能高效、快捷地分析微生物种群多样性、发育水平、群落结构域分布及微生物动态变化等。

授权公告号为CN101629153B的中国专利文献公开了一种利用复合菌群处理榨菜废水的方法，该方法使用以盐单胞菌、假丝酵母菌、海杆菌和芽孢杆菌为主的复合菌群，结合SBR工艺对榨菜废水进行处理，具有较好的COD去除率。但是，该方法利用到SBR工艺，SBR工艺包括：进水、曝气、沉淀、排泥、排水和闲置共六个工序，其工艺较为复杂，且对工艺参数要求比较高。另外，该复合菌群中的混合菌株之间会出现拮抗作用。

发明内容

本发明针对榨菜废水浓度COD浓度高、难降解等问题，提出了一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株及其筛选方法和应用，该海杆菌能高效降解榨菜废水中的COD，可广泛应用于榨菜污水处理。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株，已于2018年8月21日保藏于中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2018554；拉丁文名称为Marinobacter shengliensis ZAA002。

作为优选，所述海杆菌ZAA002菌株的16SrRNA序列如SEQ.NO 3所示。

一种如上所述的分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株的筛选方法，包括如下步骤：

1)取榨菜高盐废水，并将该高盐废水进行加水稀释；

2)采用逐步稀释法将样品进行初步分离筛选后，经LB培养基活化，再多次转接到废水中，并从中选取生长培养周期短且OD600≥0.5的菌株作为初筛菌株；

3)将初筛菌株按照10～20％接种量接种于废水中，测定其废水处理效果，选取对废水COD处理效果≥50％的菌株，作为复筛菌株，并将该复筛菌株置于培养箱培养，待长出明显菌落，并经进一步划线纯化，进而获得纯菌种ZAA002菌株。

作为优选，步骤1)中，将该高盐度废水稀释至盐度控制在2～10％。

作为优选，步骤2)中，选取生长培养周期短，且0.5≤OD600≤0.8的菌株作为初筛菌株。OD600为0.5-0.8之间时，为细菌处于对数期，即微生物处于最旺盛生长的对数生长期。

一种如上所述的海杆菌ZAA002在降解榨菜废水COD的应用。

一种如上所述海杆菌ZAA002菌株接种于优化培养基中获得的发酵液。

一种如上所述的发酵液在抑制黄曲霉毒素产生菌的孢子萌发和黄曲霉毒素的合成，以及抑制黄曲霉毒素的生长中的应用。将本发明的海杆菌ZAA002菌株接种于优化培养基中，在20-36℃温度下，振荡培养4-12天，即可得到含有高效活性物质的发酵液，该发酵液即使稀释30倍后，仍可100％抑制黄曲霉毒素产生菌的孢子萌发和黄曲霉毒素的合成，稀释40倍后，仍可100％抑制黄曲霉毒素的生长。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株及其应用，本发明提供的菌株应用于榨菜废水COD的降解，5天内COD的降解达54.5％；该菌株接种于优化培养基中培养得到含有高效活性物质的发酵液可100％抑制黄曲霉毒素产生菌的孢子萌发和黄曲霉毒素的合成，以及黄曲霉毒素的生长。其工艺较简单，且对工艺参数要求比较低。另外，避免了使用混合菌株时出现拮抗作用。

附图说明

图1为不同盐度对微生物的生长的影响；

图2为不同接种量对COD降解的影响；

图3为本发明提供的ZAA002菌株划线图；

图4为厌氧装置图；

图5为本发明提供的ZAA002菌株处理COD效果；

图6为抑菌图谱。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

一、海杆菌ZAA002的筛选

本发明所说的海杆菌ZAA002菌株，已于2018年8月21日保藏于中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M2018554；拉丁文名称为Marinobacter shengliensis ZAA002。

一种海杆菌ZAA002菌株的分离，按以下步骤进行：

1)取榨菜高盐废水，并将该高盐废水进行加水稀释；具体的，榨菜高盐废水由于盐度过高，COD为36195.6mg/L，氨氮含量(NH₃-N)为730.3mg/L，总氮含量(TN)为2121.3mg/L，总磷含量(TP)为214.4mg/L，pH为5，盐度高达18％，属于高盐高COD含量的废水。盐度太高不利于微生物的生长，所以将该废水稀释6倍，使得盐度控制在2～10％，以有利于菌的生长。这是因为盐度高导致微生物难以生存。如图1所示，当盐度控制在3％时最有利于菌的生长。

前期对废水进行水质调节，按照C：N：P＝100：5：1，添加C源、N源、P源，分别为葡萄糖、硫酸铵和磷酸氢二钾，pH调节到7。

2)结合Hungate亨盖特滚管技术，采用逐步稀释法将样品进行初步分离筛选后，滚管置于30℃培养箱内进行培养，待菌株出现明显菌落，将菌株接种于无菌的废水中，选取生长周期较短，并且OD600≥0.5的菌株进行下步实验。

借助全自动高通量移液平台，将上诉菌株先经LB培养基活化，而再多次转接到废水中，最终从中选取生长培养周期时间短并且OD600≥0.5的菌株作初筛(PS)菌株；作为优选，选取生长培养周期短，且0.5≤OD600≤0.8的菌株作为初筛菌株。

3)将初筛菌株按照10％或20％接种量接种于经过水质调节过的废水中，测定其废水处理效果，如图2所示，选取对废水COD处理效果≥50％的菌株，作为复筛菌株，并将该复筛菌株置于30℃培养箱培养，待长出明显菌落，并经进一步划线纯化，进而获得纯菌种ZAA002菌株，如图3所示。

本发明所述的ZAA002菌株经16S rRNA基因分子鉴定为海杆菌Marinobacter的一个新菌，革兰氏染色阳性。

二、海杆菌ZAA002在降解榨菜废水COD的应用

1)将上述菌株于榨菜废水中进行培养，培养至菌体初始总浓度保持在OD600＝0.5以上。

2)培养后的菌株装入厌氧装置，如图4所示，有效容积为500mL，顶部插入两根管子，1#管子为进样、取样管，其一端深入容器底部，另一端接通注射器用于取样；2#管子为产气管，接通产气装置。产气装置倒扣的量筒，待菌种接种完后，调整量筒内液面到接近顶部。厌氧装置底部放置磁力转子，用于均匀搅拌。密封好的厌氧装置置于水槽中，水槽底端外部放置有磁力搅拌器。水槽中放置有加热棒，以调节水温。

3)将榨菜废水稀释6倍，经调节营养比例后，装于厌氧装置中，厌氧装置置于水槽中，连接产气装置。将厌氧菌群接种于该废水中，密封好，每日取样观察菌群的生长状态、检测废水的COD数据。在第4天，COD去除率达50％，在第5天的降解效果无明显增加。故该废水的合适处理时间为4d，结果如图5所示。相对于现有的废水处理方法，其工艺步骤比较简单。另外，如图6所示，将本发明的海杆菌ZAA02菌株接种于优化培养基中，在20-36℃温度下，振荡培养4-12天，即可得到含有高效活性物质的发酵液，该发酵液即使稀释30倍后，仍可100％抑制黄曲霉毒素产生菌的孢子萌发和黄曲霉毒素的合成，稀释40倍后，仍可100％抑制产黄曲霉毒素产生菌的生长。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株及其筛选方法和应用

<130> Z171136

<140> 2019111809262

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgccagcmg ccgcgg 16

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgtcaattc mtttragttt 20

<210> 3

<211> 1434

<212> DNA

<213> Marinobacter shengliensis

<400> 3

accccgtggg tatcgtcctc ccgaaggtta gactaactac ttctggtgca atccactccc 60

atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcgac attctgattc 120

gcgattacta gcgattccga cttcacggag tcgagttgca gactccgatc cggactacga 180

cgcgttttaa gggattggcg cactctcgcg agttggcagc cctctgtacg cgccattgta 240

gcacgtgtgt agccctggcc gtaagggcca tgatgacctg acgtcatccc caccttcctc 300

cggtttgtca ccggcagtct ccctggagtt ctcagcmtta cctgctagca accagggata 360

ggggttgcgc tcgttacggg amttaaccca acatctcmcg acacgagctg acgacggcca 420

tgcagcacct gtctcagagt tcccgaaggc accaatccat ctctggaaag ttctctggat 480

gtcaaggcca ggtaaggttc ttcgcgttgc gtcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattca tttgagtttt aaccttgcgg ccgtactccc caggcggtca 600

acttagtgcg ttagctgcgc cactaagact tcaagagtcc caacggctag ttgacatcgt 660

ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag 720

tgtcagtgtt ggtccaggta gccgccttcg ccactggtgt tccttcctat atctacgcat 780

ttcaccgcta cacaggaaat tccactaccc tctaccacac tctagtcaga cagttcgaaa 840

tgccgttccc aggttaagcc cggggctttc acatctcgct tacctaacca cctacgcgcg 900

ctttacgccc agtaattccg attaacgctt gcaccctccg tattaccgcg gctgctggca 960

cggagttagc cggtgcttct tctgcgagta acgtcaatcc ctgaaggtat taacttcaga 1020

gccttcctcc tcgctgaaag tgctttacaa cccgaaagcc ttcttcacac acgcggcatg 1080

gctggatcag ggttgccccc attgtccaat attccccact gctgcctccc gtaggagttc 1140

gggccgtgtc tcagtcccga tgtggctgat catcctctca gaccagctac ggatcgtcgc 1200

cttggtaggc ctttacccca ccaactagct aatccgactt aggctcatcc agtagcgcaa 1260

ggtccgaaga tcccctgctt tctcccgtag gacgtatgcg gtattaatcc gggtttcccc 1320

gggctatccc ccactactgg gcagattcct aagcattact cacccgtccg ccgctcgtca 1380

gcggggtgca agcaccccct gtaccgctcg acttgcatgg ttaagctgcg caca 1434

Claims

1.一种分离自高盐榨菜废水中的海杆菌ZAA002菌株（Marinobacter shengliensisZAA002），并已于2018年8月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2018554。

2.一种如权利要求1所述的海杆菌ZAA002在降解榨菜废水COD的应用。

3.一种如权利要求1所述海杆菌ZAA002菌株接种于优化培养基中获得的发酵液。