CN101580550B - 一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途 - Google Patents

一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途 Download PDF

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Abstract

一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途。从中国渤海海域野生菲律宾蛤仔黏附污泥中分离获得的好氧菌株ZHT4-13、鉴定为罗氏菌属(Ruthia sp.)。经种子培养、扩大培养，其发酵液经乙醇沉淀离心分离得到细胞外多糖MBF4-13。经测定出该细胞外多糖MBF4-13具有较高的絮凝活性，对高岭土的FR值达到80％以上；对六价铬离子去除率达69.3％；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、墨水蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达86.11％、99.49％和97.84％；对活性污泥的性能及结构也有明显改善作用。具有开发新型微生物絮凝剂的潜在价值。

Description

一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途
技术领域
本发明属于水、废水处理领域。涉及悬浮杂质的絮凝和沉淀，为用于沉积分离的絮凝剂；特别涉及一种微生物絮凝剂产生菌的来源、菌种发酵培养方法、其产生的絮凝剂MBF4-13的制备方法以及该絮凝剂在废水处理中絮凝、沉淀和脱色的用途。
背景技术
絮凝剂是水处理技术中常用的药剂之一。近年来，应用最广泛的传统高分子聚合物类絮凝剂不断被发现存在威胁人类健康和破坏生态环境的潜在问题，研究环保无公害的新型絮凝剂便成为了水处理研究的热点问题，其中报道最多的当属微生物絮凝剂。目前已经从土壤、活性污泥、生活污水、各种工业废水等环境中筛选得到多种微生物絮凝剂产生菌，其中报道较多的有Nakamura等发现的产生微生物絮凝剂AJ7002的酱油曲霉AJ7002、Takagi等发现的产生PF101的拟青霉和Kurane等产生NOC-1的红平红球菌等，这些微生物絮凝剂相对于传统高分子化学絮凝剂来说具有环境友好、无二次污染的优点，但目前仍普遍存在生产成本高、产量低、絮凝活性低等问题，尚处于实验室研究阶段，离大规模推广应用还相差较大。本研究发现菲律宾蛤仔黏附污泥具有极好的絮凝特性，分离得到一株絮凝剂产生菌，鉴定为放线菌科罗氏菌属，并从中制备得到絮凝剂胞外多糖MBF4-13。
目前为止尚未见有报道从该类环境中分离得到的罗氏菌属用于微生物絮凝剂制备、各种废水处理及活性污泥性能改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的微生物絮凝剂产生菌及其细胞外多糖的制备方法。
本发明的进一步的目的是提供了该微生物絮凝剂在水体中固体悬浮物、重金属的去除，染料废水脱色及改善活性污泥性能中的应用。
本发明中涉及的一株好氧菌株Rothia sp.ZHT4-13是从中国渤海海域野生菲律宾蛤仔黏附污泥中分离获得，该菌株适合的生长盐度为0.5％～5.0％；对水体中多种悬浮颗粒具有絮凝活性，依据TAKARA公司的16S rDNA全序列测定并通过Blast同源性比对鉴定为Rothia sp.，即罗氏菌属，已于2008年09月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.2684。
菌株Rothia sp.ZHT4-13具有下述性质：菌株细胞呈球形，菌体大小为(0.5～0.8)μm，成团，不运动，革兰氏染色为阳性，甲基红、硝酸盐和过氧化氢反应呈阳性，最佳生长温度为30℃，最佳生长初始pH值为8.0。
菌株Rothia sp.ZHT4-13的16S rDNA基因全序列(1427bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genbank基因序列数据库提交，登录号为EU873349。
其全序列如下：ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGCGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACGTGAGTAACCTGCCTTTAACTCTGGGATAAGCCTTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCAACCCTCGCATGAGGTGTTGGTGGAAAGGGATTTTGTACTGGTTTTAGATGGGCTCACGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGGAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTTTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGAACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACTAGACCGCCTCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCTGGTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTTGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGATGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGAGTCGTCGAAGG。
这株好氧罗氏菌ZHT4-13可以利用常规的液体培养方式，可使用培养基中含有用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中碳源可为葡萄糖、D-果糖、蔗糖、淀粉、乳糖等。氮源可为尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。至于其他营养源则可适当添加一些无机盐类，例如氯化钠。磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐。对于温度、时间也无严格要求，10～35℃均可以生长，但作为一株絮凝剂产生菌，培养条件应以絮凝剂产量高、絮凝效果好为培养标准，同时考虑氢离子浓度、搅拌条件、发酵液体积等条件，以获得最好的效果。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取到微生物絮凝剂-细胞外多糖，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其他杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养菌株Rothia sp.ZHT4-13产生微生物絮凝剂为最佳。
液体发酵培养基的质量配比为：
蔗糖                    15～25g
(NH4)2SO4               0.3～1.0g
NaCl                    2～8g
MgSO4·7H2O             0.5～1.5g
KH2PO4                  2～8g
K2HPO4                  0.5～3.5g
蒸馏水                  1000ml
调节pH为7.0～8.0；121℃，0.1MPa，20min高压灭菌后接入种子液；
(1)种子液培养：制作营养琼脂固体斜面，接种菌株ZHT4-13，培养箱恒温35±1℃培养1～2天；加入v/v＝1∶1的无菌水，15～35℃旋涡振荡2～6min使菌体细胞悬浮于水中，制成菌体细胞种子液备用；
(2)扩大发酵培养：每100ml发酵液接入0.1～0.4ml种子液，于30～35℃恒温，100～200r/min旋涡振荡培养3～4天；
(3)提取：将完成发酵培养的菌液于8000r/min离心10～25min，上层发酵液加入2～5倍体积的冷乙醇置于4℃冰箱中8～24h，9000～12000r/min离心10～25min取沉淀，真空干燥，得细胞外多糖粗制品。
(4)精制：上述样品加0.5～1体积水混匀，1000～2000r/min室温涡旋振荡1～5min，加入2～5倍体积体积冷乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置8～24h，9000～12000r/min离心10～25min取沉淀，真空干燥，得微生物絮凝剂MBF4-13精制品。
本发明从菲律宾蛤仔黏附污泥中分离纯化并筛选出一株高效微生物絮凝剂产生菌Rothia sp.ZHT4-13，并提取得到细胞外多糖作为微生物絮凝剂，通过对高岭土悬浊液的絮凝活性测试法(R.Kurane，K.Takeda，T.Suzuki.Screening andCharacteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986：2301～2307)测定出该聚合多糖具有较高的絮凝活性，FR值达到80％以上，对重金属离子的吸附率达90％以上。利用本发明的细胞外聚合多糖制备高效微生物絮凝剂，对生活、工业等废水处理极具潜在用途。
以下用实例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为微生物絮凝剂MBF4-13的红外光谱。
图2为絮凝前后活性污泥制片的显微观察。其中A、原活性污泥菌胶团；B、絮凝培养后菌胶团；C、原活性污泥中丝状菌；D、絮凝培养后污泥中的原生动物。
具体实施方式
实例1：好氧菌株Rothia sp.ZHT4-13胞外多糖的提取
液体发酵培养基为：蔗糖15g；(NH4)2SO4 0.3g；NaCl 2g；MgSO4·7H2O 0.5g；KH2PO4 2g；K2HPO4 0.5g；蒸馏水1000ml；调节pH为7～8(采用NaOH和H2SO4调节酸碱度)；121℃，0.1MPa，20min高压灭菌后接入种子液。
A.种子液培养：制作营养琼脂固体斜面，接种菌株ZHT4-13，培养箱恒温35±1℃培养1天；加入适量(v/v＝1∶1)无菌水，15～20℃旋涡振荡2min使菌体细胞悬浮于水中，制成菌体细胞种子液备用。
B.扩大发酵培养：每100ml发酵液接入0.1ml种子液，于30～35℃恒温，100～200r/min旋涡振荡培养4天。
C.提取：将完成发酵培养的菌液于8000r/min离心10min，上层发酵液加入2倍体积的冷乙醇置于4℃，冰箱中8h，9000～12000r/min离心10min取沉淀，真空干燥，得细胞外多糖粗制品。
D.精制：上述样品加0.5倍体积水混匀，1000～2000r/min室温涡旋振荡1～5min，加入2倍体积体积冷乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置8h，9000r/min离心10min取沉淀，真空干燥，得微生物絮凝剂MBF4-13精制品，其红外光谱如附图所示。
实例2：好氧菌株Rothia sp.ZHT4-13胞外多糖的提取
液体发酵培养基为：蔗糖20g；(NH4)2SO4 0.5g；NaCl 5g；MgSO4·7H2O 1.0g；KH2PO4 5g；K2HPO4 2.0g；蒸馏水1000ml；调节pH为7～8(采用NaOH和H2SO4调节酸碱度)；121℃，0.1MPa，20min高压灭菌后接入种子液。
A.种子液培养：制作营养琼脂固体斜面，接种菌株ZHT4-13，培养箱恒温35±1℃培养2天；加入适量(v/v＝1∶1)无菌水，20～25℃旋涡振荡4min使菌体细胞悬浮于水中，制成菌体细胞种子液备用。
B.扩大发酵培养：每100ml发酵液接入0.2ml种子液，于30～35℃恒温，100～200r/min旋涡振荡培养4天。
C.提取：将完成发酵培养的菌液于8000r/min离心15min，上层发酵液加入2倍体积的冷乙醇置于4℃，冰箱中12h，10000r/min离心15min取沉淀，真空干燥，得细胞外多糖粗制品。
D.精制：上述样品加1倍体积水混匀，1000～2000r/min室温涡旋振荡3min，加入2倍体积体积冷乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置12h，10000r/min离心15min取沉淀，真空干燥，得微生物絮凝剂MBF4-13精制品，其红外光谱如附图所示。
实例3：好氧菌株Rothia sp.ZHT4-13胞外多糖的提取
液体发酵培养基为：蔗糖25g；(NH4)2SO4 1.0g；NaCl 8g；MgSO4·7H2O 1.5g；KH2PO4 8g；K2HPO4 3.5g；蒸馏水1000ml；调节pH为7～8(采用NaOH和H2SO4调节酸碱度)；121℃，0.1MPa，20min高压灭菌后接入种子液。
A.种子液培养：制作营养琼脂固体斜面，接种菌株ZHT4-13，培养箱恒温35±1℃培养2天；加入适量(v/v＝1∶1)无菌水，30～35℃旋涡振荡6min使菌体细胞悬浮于水中，制成菌体细胞种子液备用。
B.扩大发酵培养：每100ml发酵液接入0.4ml种子液，于30～35℃恒温，100～200r/min旋涡振荡培养3天。
C.提取：将完成发酵培养的菌液于8000r/min离心25min，上层发酵液加入5倍体积的冷乙醇置于4℃，冰箱中24h，9000～12000r/min离心25min取沉淀，真空干燥，得细胞外多糖粗制品。
D.精制：上述样品加1倍体积水混匀，1000～2000r/min室温涡旋振荡1～5min，加入5倍体积体积冷乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置24h，12000r/min离心25min取沉淀，真空干燥，得微生物絮凝剂MBF4-13精制品，其红外光谱如附图所示。
实例4：絮凝活性的测定
采用对高岭土悬浊液的絮凝活性测试法(R.Kurane，K.Takeda，T.Suzuki.Screening and Characteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986：2301-2307)取5g/l的高岭土悬浊液93ml，加入5ml 1％(m/v)CaCl2做助凝剂，加入2ml待测样品，调节pH值为9，混合快速搅拌1min，再慢速搅拌5min，静置10min，取水平面下1cm处混合液，可见分光光度计测550nm下吸光度A，同时以2ml蒸馏水代替样品作为对照，测吸光度B，计算絮凝率，FR(％)＝(A-B)/A×100％。则ZHT4-13产细胞外多糖MBF4-13对高岭土悬浊液的絮凝率为86.22％。
实例5：重金属Cr6+吸附测定
取10mg/l重金属Cr6+溶液9ml于试管中，加入1ml待测样品，漩涡振荡1min，静置1h后取水平面下1cm处混合液，用二苯碳酸二肼分光光度法(喻林.水质检测分析方法标准实务手册，中国环境科学出版社，2002：89～164)测吸光度A，同时以1ml蒸馏水代替样品作为对照，测吸光度A0，计算脱色率，DR(％)＝(A-A0)/A×100％。则ZHT4-13产细胞外多糖MBF4-13对重金属Cr6+的去除率为69.3％。
实例6：脱色活性测定
取10ml亚甲基蓝和孔雀石绿(10mg/L)以及10mL结晶紫(20mg/L)于大试管中，加入1ml浓度为2g/L的MBF4-13，漩涡振荡1min，调节溶液pH值为9，静置30min后取水平面下1cm处溶液，测定相应染料在最大吸收波长处的吸光度，计算脱色率，DR(％)＝(A-A0)/A×100％。则ZHT4-13产细胞外多糖MBF4-13对亚甲基蓝、孔雀石绿和结晶紫的脱色率分别为86.11％、99.49％和97.84％。
实例7：活性污泥性能改善实验
在新鲜活性污泥中加入微生物絮凝剂MBF4-13，投加量为2g/L，搅拌均匀，适量曝气，2天后测SV30、SVI，并做活性污泥压片显微观察污泥中微生物种类。实验结果表明SV30、SVI分别由原活性污泥的380、81.02降至350、74.63，说明活性污泥沉降性能有了一定的提高。显微观察表明絮凝培养后菌胶团结构变得更紧密、丝状菌相对减少、出现了能显示良好水质的指示生物-轮虫等原生动物(如下图所示)，表明该微生物絮凝剂的投加对活性污泥起到了良好的改善性能及结构的作用。
菌株Rothia sp.ZHT4-13的16S rDNA基因全序列表
SEQUENCE LISTING
<110>大连交通大学
<120>一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1427
<212>DNA
<213>菌株Rothia sp.ZHT4-13的16S rDNA基因全序列
<400>1
acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgatga agcccagctt gctgggcgga  60
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gaggaacacc aatggcgaag gcaggtctct gggctgtaac tgacgctgag aagcgaaagc  720
atggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg  780
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agtacggccg caaggctaaa actcaaagaa attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc  900
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ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct    1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc aagtcacgaa agttggtaac    1380
acccgaagcc gatggcctaa ccccttgtgg gagggagtcg tcgaagg                  1427

Claims (4)

1.一株好氧罗氏菌属菌株Rothia sp.ZHT4-13 CGMCC No.2684代谢产物胞外多糖，用如下步骤对ZHT4-13菌株培养和代谢产物胞外多糖的提取：
(1)液体发酵培养基的制备：原料用量配方为：
Figure FSB00000467479000011
调节pH为7.0～8.0；121℃，0.1MPa，20min高压灭菌后接入种子液；
(2)种子液培养：制作营养琼脂固体斜面，接种菌株ZHT4-13，培养箱恒温35±1℃培养1～2天；加入v/v＝1∶1的无菌水，15～35℃旋涡振荡2～6min使菌体细胞悬浮于水中，制成菌体细胞种子液备用；
(3)扩大发酵培养：每100ml发酵液接入0.1～0.4ml种子液，于30～35℃恒温，100～200r/min旋涡振荡培养3～4天；
(4)提取：将完成发酵培养的菌液于8000r/min离心10～25min，上层发酵液加入2～5倍体积的冷乙醇置于4℃冰箱中8～24h，9000～12000r/min离心10～25min取沉淀，真空干燥，得细胞外多糖粗制品；
(5)精制：上述样品加0.5～1体积水混匀，1000～2000r/min室温涡旋振荡1～5min，加入2～5倍体积冷乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置8～24h，9000～12000r/min离心10～25min取沉淀，真空干燥得精制品。
2.如权利要求1所述的好氧罗氏菌属菌株Rothia sp.ZHT4-13 CGMCC No.2684代谢产物胞外多糖的制备方法，其特征在于工艺步骤为：
(1)液体发酵培养基的制备：原料用量配方为：
Figure FSB00000467479000012
Figure FSB00000467479000021
调节pH为7.0～8.0；121℃，0.1MPa，20min高压灭菌后接入种子液；
(2)种子液培养：制作营养琼脂固体斜面，接种菌株ZHT4-13，培养箱恒温35±1℃培养1～2天；加入v/v＝1∶1的无菌水，15～35℃旋涡振荡2～6min使菌体细胞悬浮于水中，制成菌体细胞种子液备用；
(3)扩大发酵培养：每100ml发酵液接入0.1～0.4ml种子液，于30～35℃恒温，100～200r/min旋涡振荡培养3～4天；
(4)提取：将完成发酵培养的菌液于8000r/min离心10～25min，上层发酵液加入2～5倍体积的冷乙醇置于4℃冰箱中8～24h，9000～12000r/min离心10～25min取沉淀，真空干燥，得细胞外多糖粗制品；
(5)精制：上述样品加0.5～1体积水混匀，1000～2000r/min室温涡旋振荡1～5min，加入2～5倍体积冷乙醇沉淀，于4℃冰箱中静置8～24h，9000～12000r/min离心10～25min取沉淀，真空干燥，得微生物絮凝剂MBF4-13精制品。
3.根据权利要求2所述的好氧罗氏菌属菌株ZHT4-13 CGMCC No.2684代谢产物胞外多糖的制备方法，其特征在于工艺步骤(2)种子液培养中生长初始pH值为7.0～8.0，生长温度为35±1℃。
4.如权利要求1所述好氧罗氏菌属菌株ZHT4-13 CGMCC No.2684代谢产物胞外多糖在废水处理中作为絮凝剂，用于固体悬浮物去除、重金属去除、染料脱色、活性污泥性能改善的用途。
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