CN102965322A - 一种锰氧化复合菌系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够氧化Mn2+的复合菌系及其在水体或固体基质中的应用，该复合菌系能够将水体或固体基质中的Mn2+氧化生成不溶于水的锰氧化物。该Mn2+氧化复合菌系包括两个分属于不同属的菌株，分别为Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B，其保藏号分别为CGMCC No.6631和CGMCC No.6947。将本发明的Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B用于自然水体中Mn2+的氧化，其操作温度(10-30℃)在常温范围，其操作pH值(6.5-8.5)在中性范围，具有很高的Mn2+氧化效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种锰氧化复合菌系及其应用。具体而言，所述复合菌系包括节杆菌(Arthrobacter sp.)QXT-31和鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)QXT-31B，其保藏号分别为：CGMCC No.6631和CGMCC No.6947。
背景技术
二价锰离子(Mn2+)是正常机体必需的微量元素之一，但是长期摄入过量则会引起类神经症和自主神经功能障碍。我国锰矿的开采量和消耗量保持高速增长态势，不可避免地在这个环节产生大量Mn2+的排放和污染，因而造成地表水中Mn2+的污染。另外，由于地质构造等原因，许多我们许多地方的地下水中Mn2+浓度经常超标。而Mn2+在自然温度(低于40℃)和pH值(小于8)条件下性质稳定，时常存在于饮用水水源地的水体中(包括地下水和地表水)，并且浓度时常超标，因此在饮用水的处理工艺中除锰工艺占有重要地位。
目前中国生活饮用水水质标准中锰的限值是0.1mg/L，除锰工艺主要有、空气接触氧化除锰、氯接触氧化过滤除锰和高锰酸钾接触氧化除锰，但最新发现环境中广泛存在着锰氧化微生物，并且在一些除锰的滤池中也发现了锰氧化微生物，锰氧化微生物可以利用酶促反应催化氧化Mn2+，生成不溶于水的锰氧化物(主要是二氧化锰)【见反应式1】。而该锰氧化物又是一个良好的吸附剂和氧化剂，具有高的比表面积和催化氧化能力，可以吸附重金属离子并氧化难降解有机污染物。另外，在自然条件下，由生物催化的锰氧化速率比纯化学的锰氧化速率高3-5个数量级，所以有理由相信，锰氧化微生物在除锰的滤池中不仅对锰去除作用有很大的促进作用，而且对于共存的其他金属离子和难降解有机物都有吸附和降解作用。另外生物除锰成本低廉，效率较高，所以如能强化除锰滤池中锰氧化微生物的作用，将会在不显著增加水处理成本的前提下明显提高包括Mn2+在内的金属离子和有机污染物的去除效率，因此强化锰氧化微生物成为水质净化工艺中新兴的研究热点。
而这一环节重要而基础的工作就是从环境中筛选到能大规模培养并能适应自然水质的锰氧化微生物。目前已筛选出的锰氧化微生物包含细菌和真菌，其中对锰氧化细菌的研究更为深入。已知的锰氧化细菌主要从属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，目前研究主要以五株锰氧化模式菌展开，分别是芽孢杆菌SG-1(Bacillus)、假单胞菌MnB1和GB-1(Pseudomonas putida)、纤发菌SS-1(Leptothrix discophora)以及土微菌ACM3067(Pedomicrobium)。但是这些研究大多以实验室中的纯培养研究为主，菌株在复杂自然水质条件下的适应性和锰氧化活性不知可否。因为自然水质条件下，存在着营养缺乏和土著微生物的竞争作用，这些都影响到菌株的存活和锰氧化活性。因此寻找能适应自然水质条件的锰氧化菌株的工作显得十分重要。本发明的锰氧化复合菌系能够适应复杂自然水体并发挥锰氧化作用，因此具有强大的工程应用前景。
本发明所涉及的锰氧化复合菌系只在两株菌一起培养时才均有锰氧化活性，单独培养时则无锰氧化活性，这个特殊的锰氧化现象在国际上尚属首次发现。这两株菌的锰氧化特性的发现不仅对除锰工程有重要意义，也丰富了微生物锰氧化的理论研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种锰氧化复合菌系及其在水体(例如，自然水体、废水)或固体基质中应用。
具体地，在第一方面，本发明提供一种锰氧化复合菌系，所述锰氧化复合菌系包括节杆菌(Arthrobacter sp.)QXT-31和鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)QXT-31B，上述两种菌株分别于2012年9月27日和2012年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其相应的保藏号分别为CGMCC No.6631和CGMCC No.6947。
所述Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B均来源于湖南湘潭锰矿堆放锰矿的土壤，经驯化、分离、纯化得到。Arthrobacter sp.QXT-31是阳性革兰氏杆菌，好氧，生长在固体培养基呈白色、表面光滑的圆形菌落。Sphingopyxis sp.QXT-31B是革兰氏阴性菌，生长在固体培养基呈黄色，表面光滑的圆形菌落。这两株菌单独培养时不能氧化Mn2+，但是一起培养时能在短时间内将Mn2+氧化生成锰氧化物。Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的16S rDNA序列依次如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。
上述两株菌之间的关系应该属于目前微生物研究热点之一——群体感应效应。上述两株菌在混合培养时产生锰氧化现象，而混合培养前两者可以是单独培养再混合培养，也可以是一直混合培养，并且对于事先单独培养再混合培养的情况，在混合培养时对两者的接种体积比没有限制。对比两株菌单独培养和混合培养的生长情况，未发现混合培养时两株菌之间存在显著的抑制现象。
在第二方面，本发明提供所述复合菌系(包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)用于去除水体或固体基质中Mn2+的应用。本发明的复合菌系(包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)可用于水体或固体基质中Mn2+的氧化，具体方法是将Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的菌液离心收集后添加到含Mn2+的水体(例如，生活废水、焦化废水、地下水等)或固体基质(例如，土壤)中，在10-35℃，pH值为6.5-8.5的条件下培养适当的时间，培养时间因复合菌系添加时的活性和水质条件而异，一般不大于7天。
所述Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B在水体中培养的温度优选为20-35℃，最佳温度为30℃，pH值条件优选为pH 7.0-8.5，最佳pH值为7.5。
在第三方面，以上述Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B为活性成分的微生物菌剂也属于本发明的保护范围；该菌剂中可根据需要，添加可接受的辅料。
另外，本领域技术人员应该理解，包含本发明的锰氧化复合菌系(即，包含Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)的微生物菌剂还可以与其他重金属螯合剂、生物分解剂(例如，某些菌类)组合使用，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，只要这些成分组合后能够发挥各自需要的功能活性即可。
在第四方面，本发明提供一种去除水体或固体基质中Mn2+的方法，所述方法包括下述步骤：将权利要求1所述的锰氧化复合菌系接种到含Mn2+的水体或固体基质中，在10-35℃，pH值为6.5-8.5的条件下培养适当的时间。本领域技术人员应该理解，培养时间因复合菌系添加时的活性和水质/固体基质的性质而异，一般不大于7天。
在本发明中，所述水体可以是包含需要去除Mn2+的所有水体，包括但不限于，生活废水、焦化废水、地下水等，所述固体基质包括但不限于土壤。
因此，本发明提供下述各项：
1.一种锰氧化复合菌系，所述复合菌系包括节杆菌(Arthrobacter sp.)QXT-31和鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)QXT-31B，其保藏号分别为：CGMCC No.6631和CGMCC No.6947。
2.由第1项所述的锰氧化复合菌系，其特征在于，所述Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B共同培养时能够将Mn2+氧化成不溶于水的锰氧化物，而上述两株菌单独培养则对Mn2+无氧化活性。
3.由第2项所述的锰氧化复合菌系，其特征在于，所述复合菌系在pH 6.5-8.5具有Mn2+氧化活性，并且在10-30℃具有Mn2+氧化活性，在不高于1000μM浓度Mn2+条件下能生长，在不高于500μM浓度Mn2+条件下具有Mn2+氧化活性。
4.由第2项所述的锰氧化复合菌系，其特征在于，所述复合菌系能在不灭菌的水体或固体基质中生存并发挥Mn2+氧化活性。
5.由第4项所述的锰氧化复合菌系，其中所述水体包括生活废水、焦化废水、地下水，其中所述固体基质包括土壤。
6.一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含保藏号为CGMCC No.6631的节杆菌QXT-31菌株和保藏号为CGMCC No.6947的鞘脂单胞菌QXT-31B菌株作为活性成分。
7.第1项所述的锰氧化复合菌系用于去除水体或固体基质中Mn2+的应用。
8.第7项所述的应用，其中所述水体包括生活废水、焦化废水、地下水，其中所述固体基质包括土壤。
9.一种去除水体或固体基质中Mn2+的方法，所述方法包括下述步骤：
将第1项所述的锰氧化复合菌系接种到含Mn2+的水体或固体基质中，在10-35℃，pH值为6.5-8.5的条件下培养适当的时间。
10.第9项所述的方法，其中所述水体包括生活废水、焦化废水、地下水，其中所述固体基质包括土壤。
本发明的有益技术效果：
本发明的Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B，以10％的投菌量，在30℃，170r/min，pH值为7.0的条件下，可以在48h内将浓度为100μM的Mn2+完全氧化。在Mn2+初始浓度高达1000μM的PYG培养基中，复合菌系能保持生长活性，并在Mn2+初始浓度高达500μM的PYG培养基中有Mn2+氧化活性，最佳温度为30℃，最佳pH值为7.5。
本发明复合菌系中的Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B取自锰矿的土壤，都是土壤中常见的的优势菌种，能适应复杂的环境条件，因而该复合菌系的在水体和固体基质中氧化除Mn2+的应用前景广阔。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1A和图1B分别为Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的扫描电镜照片。
图2为本发明的复合菌系(包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)对Mn2+的生物氧化。
图3A和图3B分别为本发明的复合菌系(包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)在不同浓度Mn2+培养基中的生长曲线和Mn2+浓度曲线。
图4A和图4B分别为本发明的复合菌系(包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)在不同温度下的生长曲线和Mn2+氧化曲线。
图5A和图5B分别为本发明的复合菌系(包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B)在不同pH下的生长曲线和对Mn2+的氧化情况。
图6A和图6B分别为不加本发明的复合菌系和加本发明的复合菌系的生活废水中的微生物生长曲线和Mn2+浓度曲线。
序列表说明
| SEQ ID No：1 | Arthrobacter sp.QXT-31的16S rDNA序列 |
| SEQ ID No：2 | Sphingopyxis sp.QXT-31B的16S rDNA序列 |
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，其中所用的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
实施例1、Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的分离、纯化及其鉴定
1、Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的分离及纯化
Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B是从湖南湘潭锰矿堆放锰矿的土壤中取样，经过驯化、分离及纯化得到的，其中Arthrobacter sp.QXT-31是革兰氏阳性菌，Sphingopyxis sp.QXT-31B是革兰氏阴性菌。具体步骤如下：
取湖南湘潭锰矿堆放锰矿的土壤，把2g土壤加到高温灭菌(115℃，25分钟)的稀释100倍的PYG(peptone-yeast extract-glucose)培养基中(蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏各0.25g/L，CaCl2.2H2O含量0.01g/L，MgSO4.7H2O含量0.5g/L，MnCl2含量100μM，去离子水1L)，培养基中缓冲液为终浓度为10-20mM的HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，中文名称为N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)，pH 7.5。其中MnCl2溶液和HEPES缓冲液采用0.22μm滤膜过滤灭菌添加，培养温度30℃，振荡转速为170rpm。每次驯化7天，驯化结束后取5mL驯化后的菌液添加到新制备的45mL的PYG培养基中继续驯化，共驯化4次。
驯化结束后，用灭菌自来水将菌液稀释10-1到10-7倍，各取0.1mL稀释液于含100μM Mn2+的固体培养基(上述PYG液体培养基中加入2％琼脂而制得)上涂布分离，30℃培养。长出明显菌落后，挑取在菌落上形成有棕色物质的单菌落，划线分离纯化。将这些菌株的PYG培养液于-70℃保存在终浓度为25％的甘油中，分别给以编号。
通过考察菌的生长速率及Mn2+氧化速率，确定编号为31的菌株做重点研究，但经进一步分离纯化鉴定，发现这是由两株从属于两个属的菌株组成，分属于节杆菌属(Arthrobacter)和鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis)，分别命名为Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B。
Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B复合菌系的液体培养条件是：在250mL锥形瓶中加入100mL PYG培养基，并添加终浓度为10-20mM的pH 6.5-8.5的HEPES缓冲液，摇床设为20-30℃，170rpm。通过离心收集菌体，离心条件为3000-4500r/min，2min。
该Arthrobacter sp.QXT-31菌株是革兰氏阳性杆菌，专性好氧，在固体培养基中是白色、表面光滑的圆形菌落，对数生长期菌体呈杆状，稳定期菌体呈球形。生长稳定期菌QXT-31的扫描电镜照片如图1A所示。
该Sphingopyxis sp.QXT-31B菌株是革兰氏阴性杆菌，好氧，在固体培养基中是黄色、表面光滑的圆形菌落。生长稳定期菌QXT-31B的扫描电镜照片如图1B所示。
2、Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的16S rDNA鉴定
通过16S rDNA序列分析并在NCBI数据库中进行序列比对，分别确定QXT-31菌和QXT-31B分别从属于节杆菌属(Arthrobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis)，所以分别命名为Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B。
16S rDNA鉴定具体步骤如下：
以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒分别提取两个菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板，设计引物进行PCR片断基因扩增。上下游引物序列分别为：
27F：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’
1492R：5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’
PCR设定程序为：先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃终延伸15min，4℃保存。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶分离，纯化与回收后测序。测序结果Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的16S rDNA依次具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的核苷酸序列。
将QXT-31的16S rDNA测序结果(SEQ ID No：1)导入GenBank中进行同源性比对，结果表明与它同源性最高的前10个菌株均属于节杆菌属(Arthrobacter)，最大相似菌株为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)，相似度99％(1348个碱基)。所以能够判断该菌株属于节杆菌属，命名为Arthrobactersp.QXT-31。
将QXT-31B的16S rDNA测序结果(SEQ ID No：2)导入GenBank中进行同源性比对，结果表明与它同源性最高的8个菌株中有6株从属于鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis)，最大相似菌株也为鞘脂单胞菌属的Sphingopyxis ginsengisoli，相似度99％(1312个碱基)。所以能够初步判断该菌株属于鞘脂单胞菌属，命名为Sphingopyxis sp.QXT-31B。
菌株Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B已分别于2012年9月27日和2012年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏号分别为CGMCC No.6631和CGMCC No.6947。
实施例2、包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的复合菌系对Mn2+的生物氧化特征研究
1、包括Arthrobacter sp.QXT-31和Sphingopyxis sp.QXT-31B的复合菌系对Mn2+的生物氧化
在添加Mn2+的PYG培养基中，考察本发明的复合菌系对Mn2+的氧化能力。发现本发明的复合菌系对Mn2+有很好的氧化能力，能在较短时间内将Mn2+全部氧化成不溶于水的锰氧化物。具体步骤如下：
1.1)取2mL本发明的复合菌系的菌液，接种到装有100mL不含Mn2+的PYG培养基的三角瓶中，30℃，170rpm振荡培养48小时。
1.2)取10mL步骤1.1)所述的培养48小时的菌液，加入到250mL的三角瓶中，并加入90mL的新鲜PYG液体培养基，并将pH 7.0-7.5的HEPES缓冲液和Mn2+母液一起用高温灭菌的0.22μm滤膜过滤后添加到培养基中，使得HEPES的终浓度为10mM，Mn2+终浓度为100μM(即，根据Mn的原子量为55可换算成Mn2+的质量浓度为5.5mg/L)，30℃，170rpm振荡培养48小时。
1.3)在步骤1.2)所述的培养过程中，间隔特定时间分别取在步骤1.2)所述的反应液，测定Mn2+浓度和菌密度。检测方法如下所述：
菌密度：用岛津U-3010型紫外-可见光分光光度计，在波长为600nm处检测菌液吸光度。
Mn2+浓度：培养液样品由0.45μm滤膜过滤后，通过电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，700系列)测定培养液中剩余Mn2+的浓度。
结果如图2所示，由图2可以看出，菌密度随时间快速增长至稳定期，而这段时间Mn2+浓度稳定不变，从20小时起Mn2+浓度直线下降，并在7个小时内完全氧化形成不溶于水的棕黑色的絮状锰氧化物。
2、本发明的复合菌系在不同浓度Mn2+条件下的生长和锰氧化
由不同Mn2+初始浓度下的培养实验发现：本发明的复合菌系能完全氧化500μM及更低浓度的Mn2+，并且随着Mn2+初始浓度的提高，复合菌系的锰氧化活性会稍有延迟。具体步骤如下：
2.1)将步骤1中的步骤1.1)制备得到的复合菌系悬液以体积比10％的接种量接种于新的PYG培养基中，并将HEPES缓冲液用高温灭菌的0.22μm滤膜过滤后添加到培养基中，使得HEPES的终浓度为10mM。
2.2)再将步骤2.1)制备得到的复合菌系菌液分装到5个250mL的三角瓶中，然后分别加入一定体积的Mn2+母液，其Mn2+终浓度分别为100μM、200μM、500μM、1000μM、3000μM，将各个三角瓶用封口膜密封，30℃，170rpm振荡培养。
2.3)在步骤2.2)所述的培养过程中，间隔特定时间(为了既能说明问题，又不增加无谓的工作量，取样时间可在微生物的不同培养时期而异，一般时间间隔在1h-gh不等)分别取在步骤2.2)所述的反应液，测定Mn2+浓度和菌密度。Mn2+浓度和菌密度检测方法如步骤1中的步骤1.3)所述。
结果如图3A和图3B所示，图3A为菌密度曲线，图3B为Mn2+浓度变化曲线。如图3A所示，随着Mn2+浓度的提高，复合菌系的生长速度呈一定下降的下降趋势，在3000μM的Mn2+浓度的体系中，菌的生长被强烈抑制；由图3B所示，复合菌系对于500μM及更低浓度的Mn2+都能彻底氧化，但随着Mn2+浓度的提高，复合菌系对Mn2+的氧化活性出现时间有所延迟。虽然1000μM和3000μM的Mn2+完全抑制了复合菌系的锰氧化活性，但是500μM的Mn2+浓度已经远远高于常见的河水或地下水中Mn2+的浓度。说明本发明的复合菌系能够彻底氧化常见水体中浓度范围内的Mn2+。
3、本发明的复合菌系在不同温度下的生长和锰氧化特性
在不同培养温度下研究复合菌系的生长和锰氧化特征，发现本发明的复合菌系在10～30℃均具有Mn2+氧化活性，从实际应用的角度看，选择30℃较为适宜。具体步骤如下：
将步骤1中的步骤1.1)制备得到的复合菌系以体积比10％的接种量接种于新的PYG培养基中，并以过滤灭菌的方式加入终浓度为100μM的Mn2+和10mM的pH为7.0的HEPES缓冲液。分别取100mL培养液分装至三个250mL三角瓶中，分别置于10℃、20℃、30℃的摇床中振荡培养，170rpm。然后按照步骤1中的步骤1.3)所述的方法进行取样，测定培养过程中的Mn2+浓度变化和菌密度。
结果如图4A和4B所示。图4A为菌密度曲线，图4B为Mn2+浓度变化曲线。从图4A和图4B可以看出，随着培养温度的下降，复合菌系的生长和锰氧化时间都会有所延迟，10℃时的生长和氧化速度最慢，20℃时的速度稍快，30℃时速度最高。这说明细菌最适的生长、氧化温度处于30℃左右，考虑到实际污水处理工艺的实际情况，复合菌系的培养温度选择30℃较为合理。复合菌系能在10℃的低温下发挥锰氧化活性，显示出其对温度很强的适应性。
4、复合菌系在不同pH值下的锰氧化特性
由不同起始pH值条件的氧化实验，发现复合菌系最适锰氧化pH值为7.5。具体步骤如下：
将步骤1中的步骤1.1)制备得到的复合菌系以体积比10％的接种量接种于新的PYG培养基中，并以过滤灭菌的方式加入终浓度为100μM的Mn2+。然后取100mL菌液分装到6个250mL三角瓶中，再分别用相应pH值的HEPES缓冲液调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.5。将各个三角瓶用封口膜密封，在30℃，170rpm的摇床中振荡培养。培养过程中，按照步骤1中的步骤1.3)所述的方法进行取样，测定培养过程中的菌密度和Mn2+浓度变化，绘制相应的变化曲线。
结果如图5A和5B所示，图5A为菌密度曲线，图5B为Mn2+浓度变化曲线。从图5A和图5B可以看出，在实验选用的6个pH条件下复合菌系均能快速生长至稳定期，虽然在pH值为5.5和6.0时，复合菌系对Mn2+没有氧化活性，但在pH 6.5-8.5之间，复合菌系能将Mn2+全部氧化，而这个pH范围与自然界中大多水体的pH值一致，表明该复合菌系在自然水体pH条件下能够发挥锰氧化活性。
实施例3、本发明的复合菌系在实际生活废水中的锰氧化效果
将本发明的复合菌系添加到实际生活废水中考察Mn2+氧化能力，发现复合菌系能够适应实际生活废水，能在生活废水中发挥锰氧化活性。具体步骤如下：
将实施例2步骤1中的步骤1.1)制备得到的复合菌系于3000-4500rpm离心2分钟以收集菌体，并用PBS磷酸缓冲液(NaCl：2.7mM；Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；pH 7.1)清洗菌体1次，然后离心后将菌体添加到1个1000mL三角瓶中，再倒入600mL的实际生活废水(随机取自中科院生态环境研究中心生活区下水道)，使混匀后OD600比加菌前增加约0.4，然后用过滤灭菌的方式加入终浓度为100μM的Mn2+，最后分装到3个500mL的三角瓶中，每个三角瓶装入200mL含菌液的生活废水。另外做3个不加复合菌系的生活废水的空白对照，也以过滤灭菌方式加入终浓度为100μM的Mn2+。将各个三角瓶用封口膜密封，在30℃，170rpm振荡培养。培养过程中，按照实施例2步骤1中的步骤1.3)所述的方法进行取样，测定培养过程中的菌密度和Mn2+浓度变化，绘制相应的变化曲线。
结果如图6A和6B所示，不加本发明的复合菌系的空白对照中土著微生物的生物量无显著上升，主要原因可能是生活废水中的营养物质有限，不能支持微生物的大量增殖，并且Mn2+浓度无显著变化；而加了本发明的复合菌系的体系中，微生物的生物量虽然有所下降，但是Mn2+在7个小时内被完全氧化。
具已有文献报道可知，生活废水、河水中因会受到污染常常含Mn2+，常见浓度在0.5mg/L左右(约合10μM)，浙江一湿地入水中Mn2+的全年平均值为0.28mg/L；地下水中Mn2+浓度会高一些，李圭白对全国地下水Mn2+浓度做了调查，部分地区Mn2+浓度高达11mg/L(约合200μM)。而经实验验证，本发明的锰氧化复合菌系在不高于1000μM浓度Mn2+条件下能生长，在不高于500μM浓度Mn2+条件下具有Mn2+氧化活性，可见，本发明的复合菌系显示出在废水体系中很强的适应性和Mn2+氧化能力，具备在实际生活废水中原位生成生物氧化锰的能力。
实施例4、利用本发明的锰氧化复合菌系去除水体或固体基质中的Mn2+
由于本发明的锰氧化复合菌系中的两株菌均是土壤中常见的优势菌，能够10-30℃，pH 6.5-8.5，Mn2+浓度500μM以下发挥锰氧化活性，并且能够与生活废水、焦化废水的土著微生物共存并发挥锰氧化活性，所以能够合理推论本发明的复合菌系具有在其他水体(如，生活废水、焦化废水、地下水等)或固体基质(如，土壤)中氧化Mn2+的潜力。
在应用于实际水体前可用以下步骤来检验，具体步骤如下：
水体：将实施例2步骤1中的步骤1.1)制备得到的复合菌系于3000-4500rpm离心2分钟以收集菌体，并用PBS磷酸缓冲液(NaCl：2.7mM；Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；pH 7.1)清洗菌体1次，然后离心后将菌体添加到1个1000mL三角瓶中，再倒入600mL的选用水体，使混匀后OD600比加菌前增加约0.4，最后分装到3个500mL的三角瓶中，每个三角瓶装入200mL含菌液的选用水体。另外做3个不加复合菌系的选用水体的空白对照。将各个三角瓶用封口膜密封，在30℃，170rpm振荡培养。培养过程中，按照实施例2步骤1中的步骤1.3)所述的方法进行取样，测定培养过程中的菌密度和Mn2+浓度变化，绘制相应的变化曲线。根据加该复合菌系处理中Mn2+浓度显著低于空白处理中Mn2+浓度来判断该发明的复合菌系是否适用于氧化选用水体中Mn2+。
固体基质：将实施例2步骤1中的步骤1.1)制备得到的复合菌系于3000-4500rpm离心2分钟以收集菌体，并用PBS磷酸缓冲液(NaCl：2.7mM；Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；pH 7.1)清洗菌体1次，然后将菌体加入到选用的固体基质中，混匀后于生化培养箱中30℃恒温培养，培养时间会因选用基质的不同而异，一般不超过7天。空白处理为不加复合菌系的该固体基质，两个处理分别做3个平行。培养结束后，用不含Mn2+的水浸提固体基质中的Mn2+，并按照实施例2步骤1中的步骤1.3)所述的方法测定浸出液中Mn2+的浓度。如果加该复合菌系处理浸出液中Mn2+浓度显著低于空白处理浸出液的Mn2+浓度，则可判断本发明的复合菌系适用于氧化选用固体基质中的Mn2+。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (10)
1.一种锰氧化复合菌系，所述复合菌系包括节杆菌(Arthrobacter sp.)QXT-31和鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)QXT-31B，其保藏号分别为：CGMCC No.6631和CGMCC No.6947。
2.由权利要求1所述的锰氧化复合菌系，其特征在于，所述节杆菌QXT-31和鞘脂单胞菌QXT-31B共同培养时能够将Mn2+氧化成不溶于水的锰氧化物，而上述两株菌单独培养则对Mn2+无氧化活性。
3.由权利要求2所述的锰氧化复合菌系，其特征在于，所述复合菌系在pH 6.5-8.5具有Mn2+氧化活性，并且在10-30℃具有Mn2+氧化活性，在不高于1000μM浓度Mn2+条件下能生长，在不高于500μM浓度Mn2+条件下具有Mn2+氧化活性。
4.由权利要求2所述的锰氧化复合菌系，其特征在于，所述复合菌系能在不灭菌的水体或固体基质中生存并发挥Mn2+氧化活性。
5.由权利要求4所述的锰氧化复合菌系，其中所述水体包括生活废水、焦化废水、地下水，其中所述固体基质包括土壤。
6.一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含保藏号为CGMCC No.6631的节杆菌QXT-31菌株和保藏号为CGMCC No.6947的鞘脂单胞菌QXT-31B菌株作为活性成分。
7.权利要求1所述的锰氧化复合菌系用于去除水体或固体基质中Mn2+的应用。
8.权利要求7所述的应用，其中所述水体包括生活废水、焦化废水、地下水，其中所述固体基质包括土壤。
9.一种去除水体或固体基质中Mn2+的方法，所述方法包括下述步骤：
将权利要求1所述的锰氧化复合菌系接种到含Mn2+的水体或固体基质中，在10-35℃，pH值为6.5-8.5的条件下培养适当的时间。
10.权利要求9所述的方法，其中所述水体包括生活废水、焦化废水、地下水，其中所述固体基质包括土壤。
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