CN117417838A - 一种好氧反硝化真菌共培养物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种好氧反硝化真菌共培养物、制备方法及其应用，该共培养物中包括真菌Trichoderma afroharzianum H1和Aspergillus niger C1。该制备方法包括制备菌株悬浮液、制备种子接种液和制备共培养物共三个步骤。该好氧反硝化真菌共培养物能够用于水库水体原位修复。本发明的好氧反硝化真菌共培养物，与两株真菌单独培养相比，两株真菌的共培养物硝氮去除速率大幅度提升；将该共培养物用于水库水体的原位修复时，其硝酸盐去除率和氮去除率均大幅度提升。
Description
技术领域
本发明属于水体污染治理技术领域，涉及水体污染的微生物治理，具体涉及一种好氧反硝化真菌共培养物、制备方法及其应用。
背景技术
生物脱氮技术具有高效、低耗、安全稳定和脱氮彻底等众多优点，是当前最具发展前景的水体脱氮技术，其中低碳氮比脱氮是水处理关注的重点领域。在水源水库的碳氮比处于较低的水平（C/N=1/3，N=1～3 mg/L）时，会使微生物不能优异生长。由于水源水库不能通过外加有机碳源（如甲醇，醋酸盐等）的方式进行碳氮比的提高，并且外加碳源也会使成本增加，在这种条件下贫营养好氧反硝化微生物可以为水源水库的原位修复提供一种新的解决方案。
目前，与好氧反硝化微生物的研究大多数集中在单菌株好氧反硝化微生物筛选及应用上，例如授权公告号为CN116355761A的中国专利给出了一种处理低碳氮比微污染水体的好氧反硝化真菌新方法，该方法提供了一种筛选好氧反硝化真菌的方案。另外有少量研究报道了细菌和藻类为主的共培养，例如申请公开号为CN108483638A的中国专利公开了一种微生物共同培养促进反硝化过程稳定快速进行的方法，该方法将产电细菌G.sulfurrenducens和经甲醛驯化后获得的反硝化细菌共同培养，以培养基中的乙酸钠和硝酸盐作为电子供体和受体在培养基碳氮比为1～9下的硝酸盐进行了去除。
上述现有技术中主要存在如下缺陷：
第一，虽然单一真菌在低碳氮比微污染水体中能够达到较好的脱氮效果，但如果将多株好氧反硝化真菌进行共培养，有望进一步提高脱氮效果，但是目前尚未到公开的相关报道。
第二，虽然以细菌为主的共培养能够实现快速的反硝化过程，有望达到较好的脱氮效果，但是与真菌相比，由于细菌的细胞壁成分简单，因此其对有毒化合物和恶劣自然环境的抵抗力较差，不适用于水库水体的原位修复。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种好氧反硝化真菌共培养物、制备方法及其应用，解决现有技术中在低碳氮条件下，利用好氧反硝化真菌的水体修复方法有待进一步完善的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种好氧反硝化真菌共培养物，包括两株好氧反硝化真菌；一株真菌命名为Trichoderma afroharzianumH1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM 20231207 H1；另一株真菌命名为Aspergillus nigerC1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 20231208 C1。
本发明还具有如下技术特征：
本发明还保护一种如上所述的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，该方法具体包括如下步骤：
步骤一，制备菌株悬浮液：
从真菌固体培养基上分别挑取两株好氧反硝化真菌，然后共同接种到反硝化液体培养基中，在温度为28～37℃，转速为100～200 rpm条件下，黑暗培养24～72h，再离心收集细胞，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞多次，最后调整菌丝体的浓度，制得菌株悬浮液。
步骤二，制备种子接种液：
将步骤一的菌株悬浮液接种到反硝化液体培养基中，在温度为28～37℃，转速为100～200 rpm条件下，黑暗培养24～72h，制得种子接种液。
步骤三，制备共培养物：
将步骤二的种子接种液接种到含有负载的反硝化液体培养基中，在温度为28～37℃，转速为100～200 rpm条件下黑暗培养，每隔1～3天用新鲜的反硝化液体培养基替换掉旧培养基，在培养10～20天后，收集负载，用水将负载表面冲洗多次，该负载上附着的菌体即为好氧反硝化真菌共培养物。
具体的，步骤一中，菌株悬浮液中菌丝体的浓度为0.1～0.5g/L。
具体的，步骤二中，菌株悬浮液和反硝化液体培养基的接种体积比为（0.5～2）:（7～10）。
具体的，所述的负载为聚氨酯泡沫。
优选的，所述的温度为30℃，转速为130 rpm。
本发明还保护如上所述的好氧反硝化真菌共培养物用于水库水体原位修复的应用。
具体的，该应用的方法包括：将好氧反硝化真菌共培养物接种到原水中，向原水中持续充氧，让原水中的溶解氧浓度维持在5～15 mg/L。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
（Ⅰ）本发明的好氧反硝化真菌共培养物，与两株真菌单独培养相比，两株真菌的共培养物硝氮去除速率大幅度提升，并且共培养物中的两个菌株存在协同增效作用。
（Ⅱ）由于真菌对环境的抵抗能力更强，因此本发明的好氧反硝化真菌共培养物更适用于水库水体的原位修复。与两株真菌的单一培养物用于水体修复相比，两株真菌的共培养物的硝酸盐去除率和氮去除率均大幅度提升，并且共培养物中的两个菌株存在协同增效作用。
（Ⅲ）本发明的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，对设备要求简单，易于操作，适用于绝大多数实验室和工厂。
（Ⅳ）本发明的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，采用聚氨酯泡沫立方块作为菌体负载，由于聚氨酯泡沫具有大孔网状结构，比表面积高，因此能够有效固定微生物，使得水库水体的原位修复能够稳定长效进行。
附图说明
图1为两株真菌的系统发育树。图1中：（a）为菌株C1的系统发育树。（b）为菌株H1的系统发育树。
图2为两株真菌的硝氮去除能力结果统计图。图2中：（a）为菌株C1单独培养时，培养基中硝氮、亚硝氮、氨氮和总氮的变化曲线。（b）为菌株H1单独培养时，培养基中硝氮、亚硝氮、氨氮和总氮的变化曲线。（c）为菌株C1和H1共同培养时，培养基中硝氮、亚硝氮、氨氮和总氮的变化曲线。（d）为菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养时，培养基中溶解性有机碳的变化曲线。
图3为电子传递链活性结果统计图。图3中：（a）为菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养时，真菌胞内的ATP浓度柱状统计图。（b）为菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养时，真菌胞内电子转移活性柱状统计图。
图4为将两株真菌用于治理水体污染的结果统计图。图4中：（a）为菌株C1单独培养时，水库原水中硝氮、亚硝氮、氨氮和总氮的变化曲线。（b）为菌株H1单独培养时，水库原水中硝氮、亚硝氮、氨氮和总氮的变化曲线。（c）为菌株C1和H1共同培养时，水库原水中硝氮、亚硝氮、氨氮和总氮的变化曲线。（d）为菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养时，水库原水中溶解性有机碳的变化曲线。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
需要说明的是，本发明中所有用到的试剂和培养基，在没有特殊说明的情况下，均采用本领域已知的试剂和培养基，例如：
真菌固体培养基采用现有技术中已知的常规的真菌固体培养基，其配方和制备方法如下：䏡蛋白胨为5.0 g/L，葡萄糖为10.0 g/L，磷酸二氢钾为1.0 g/L，氯硝胺为0.002g/L，硫酸镁为0.5 g/L，虎红为0.025 g/L，氯霉素为0.1 g/L，琼脂为15.0 g/L；将上述各组分加入超纯水中定容至1L，搅拌直至完全溶解，然后将pH值调节为5.6 ± 0.2（25℃），于121℃高温灭菌30分钟后备用。
反硝化液体培养基采用现有技术中已知的常规的反硝化液体培养基，其配方和制备方法如下：KNO3为0.108 g/L，KH2PO4为1.5 g/L，葡萄糖为0.413 g/L，MgSO4·7H2O为0.1g/L，Na2HPO4·12H2O为5.0 g/L，微量元素母液为2mL；将上述各组分加入超纯水中定容至1L，搅拌直至完全溶解，然后将pH值调节为7.0～7.2，于121℃高温灭菌30分钟后备用。
上述微量元素母液的配方和制备方法如下：4.4 mg的ZnSO4，100 mg的乙二胺四乙酸，10.2 mg的MnCl2·4H2O，11 mg的CaCl2，10 mg的FeSO4·7H2O，3.2 mg的CuSO4·5H2O，2.2mg的(NH4)6Mo7O24·4H2O，3.2 mg的CoCl2·6H2O；将上述各组分加入超纯水中定容至1L，搅拌直至完全溶解，然后将pH值调节为7.0～7.2，于121℃高温灭菌30分钟后备用。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例给出一种好氧反硝化真菌共培养物，包括两株好氧反硝化真菌，一株真菌命名为Trichoderma afroharzianum H1，中文属名为非洲哈茨木霉，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 20231207，保藏时间为2023年7月6日，保藏地址：武汉。
Trichoderma afroharzianumH1的ITS序列为：5’-CCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT-3’。
另一株真菌命名为Aspergillus niger C1，中文属名为黄曲霉菌，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 20231208，保藏时间为2023年7月6日，保藏地址：武汉。
Aspergillus nigerC1的ITS序列为：5’-ATGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAGTTGGGTGTTTAACGGCTGTGGACGCGCCGCGCTCCCGATGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGAGACGGCCACCGCCAAGGCAGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAAACGCCTACGAGAGGCGCCGAGAAGGCTCAGATTATAAAAAAAACCCGCGAGGGGGTATACAATAAGAGTTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCTTGGTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCAGAGATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAG-3’。
本实施例中，上述两株好氧反硝化真菌的筛选方法具体包括如下步骤：
步骤一，富集培养：
将从水源水库中采集到的泥水混合物进行超声处理，超声功率为40%（200W），超声为10s，制得悬浮液；然后取5mL的悬浮液，采用梯度稀释法将悬浮液稀释至10倍、100倍和1000倍；分别取100 μL稀释后的悬浮液涂布到真菌固体培养基上，每个稀释梯度涂布三个平板作为平行；将涂布后的平板放置于30℃的生化培养箱中培养5～7天，直至形成菌落。
步骤二，分离纯化：
将长有菌落的平板从生化培养箱中取出，于无菌环境下挑取青绿色的绒毛状菌体，然后在新的真菌固体培养基上进行划线分离，确保恒温培养箱氧气充足，将平板倒置放入30℃恒温培养箱中培养3～5天。重复上述步骤，直至固体平板上的菌落呈现清晰的青绿色，且外观大小一致，无伴生其他的杂菌为止，挑取所有的青绿色菌落进行培养，获得候选真菌。本实施例中，共筛选获得132株候选真菌。
步骤三，反硝化性能筛选：
将筛选到的132株候选真菌接种于反硝化液体培养基中，进行反硝化筛选。本实施例中，最终筛选到了两株菌，记为C1和H1。
步骤四，菌株鉴定：
步骤4.1，生物学形态鉴定：
H1菌落直径较大，菌落颜色为淡黄色边缘为白色丝状，生物学形态显示为丝状真菌。C1菌落直径略小于H1，菌落颜色为墨绿色，菌落边缘为浅黄色，生物学形态显示为丝状真菌。
步骤4.2，专性好氧鉴定：
将H1和C1接种至反硝化液体培养基中进行培养，待其到达稳定期后，转接至厌氧瓶中并冲入氮气密封；放入30℃恒温培养箱培养7天后，若菌株无明显生长迹象，则说明该菌株为严格好氧反硝化真菌，结果表明H1和C1均为好氧反硝化真菌。
步骤4.3，分子生物学鉴定：
采用引物ITS1和ITS4进行PCR，引物ITS1的序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG，引物ITS4的序列为TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR体系为：0.5μL Template（基因组DNA，20-50 ng/μL）、2.5μL 10×Buffer（含Mg2+）、1 μL dNTP（各2.5 mM）、0.5 μL聚合酶、引物ITS1和ITS4（10uM）各0.5 μL，蒸馏水9.5μL。PCR的扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变形45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃修复延伸10min、4℃终止反应。
PCR结束后获得真菌ITS片段，真菌ITS片段经测序后，将其与NCBI中已知的丝状真菌ITS序列进行比对，并建立系统发育树，如图1所示。由图1可知，菌株H1与Trichoderma afroharzianum具有88%的相似度，菌株C1与Aspergillus niger有87%的相似度。
本实施例中，对两株好氧反硝化真菌的功能进行了测试，具体如下：
（A）硝氮和溶解性有机碳去除能力测试：
将约2mL的菌株悬浮液分别接种到含有150mL反硝化液体培养基的200mL锥形瓶中。然后将培养物放置在振荡培养箱中以130r/min和30°C孵育5天，实验中溶解氧浓度需要维持在接近7 mg/L，每间隔12小时收集样品，样品经过0.22μm滤膜过滤，选取上清液分析硝氮（NO3 --N）、亚硝氮（NO2 --N）、氨氮（NH4 +-N）、总氮（TN）和溶解性有机碳（DOC）的浓度，结果如图2所示。
由图2可知，将菌株C1或H1单独培养时，反硝化液体培养基中硝氮和总氮的含量变化不大，而将菌株C1和H1共同培养时，反硝化液体培养基中硝氮和总氮的含量大幅度降低，根据图2的数据进行计算后可知，菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养在对数期的硝氮去除速率分别为19%、11%和70%；上述结果说明，与C1或H1单独培养相比，将菌株C1和H1共同培养后的硝氮去除能力大幅度提升，并且两个菌株存在协同增效作用。
此外，根据图2的数据进行计算后可知，菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养的溶解性有机碳去除率分别为72.44%，70.22% 和92.67%；上述结果说明，与C1或H1单独培养相比，将菌株C1和H1共同培养后的溶解性有机碳去除能力大幅度提升，并且两个菌株存在协同增效作用。
（B）电子传递链活性检测：
采用NIR Stain Kit及NOS Stain Kit（Solarbio，USA）分别对亚硝酸还原酶和氧化亚氮还原酶的活性进行检测，然后使用全波长多功能酶标仪（Thermo Scientific，USA）对真菌细胞酶活性进行测定，结果如图3所示。将图3的数据进行计算后可知，与单独培养相比，将菌株C1和H1共同培养后，真菌胞内ATP浓度提升了近1.4倍，真菌胞内电子转移活性提升了3倍。
实施例2：
本实施例给出一种好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，该方法具体包括如下步骤：
步骤一，制备菌株悬浮液：
实施例1的两株好氧反硝化真菌保存在真菌固体培养基上，从真菌固体培养基上分别挑取两株好氧反硝化真菌，然后共同接种到反硝化液体培养基中，在温度30℃，转速130 rpm条件下，黑暗培养48h，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞3次，最后，将菌丝体的浓度调整为0.3g/L（干重），制得菌株悬浮液。
步骤二，制备种子接种液：
将10 mL步骤一的菌株悬浮液接种到 90 mL 反硝化液体培养基中，然后将其在温度30℃，转速130 rpm条件下，黑暗培养48h，制得种子接种液。
步骤三，制备共培养物：
将15 mL步骤二的种子接种液接种到含有135 mL反硝化液体培养基的250 mL的锥形瓶中，反硝化液体培养基中浸泡了若干灭过菌的聚氨酯泡沫立方体，然后将锥形瓶在温度30℃，转速130 rpm条件下黑暗培养，每隔2天用新鲜的反硝化液体培养基替换掉锥形瓶中的旧培养基，在培养14 d后，收集5个聚氨酯泡沫立方体，用超纯水将聚氨酯泡沫立方体表面冲洗三次，该聚氨酯泡沫立方体上附着的菌体即为好氧反硝化真菌共培养物。
实施例3：
本实施例给出将实施例1的好氧反硝化真菌共培养物用于水库水体原位修复的应用，该应用的方法包括：
将附着有好氧反硝化真菌共培养物的聚氨酯泡沫立方体接种到含有1.5 L的调节过的原水的2 L的烧杯中，通过使用一个空气泵向烧杯中持续充氧，让原水中的溶解氧浓度维持在9.5mg/L，营造好氧环境，每天收集10 mL的原水测定硝氮（NO3 --N）、亚硝氮（NO2 --N）、氨氮（NH4 +-N）、总氮（TN）和溶解性有机碳（DOC）的浓度，所有实验均进行3次重复，实验结果如图4所示。
本实施例中，原水来源于2022年12月份李家河水库引水塔中层（30m），采样包括水体表层、中层以及底层，采集的水样进行水质稳定，3小时内运送至实验室，该原水的水质信息如表1所示。
表1、李家河水库引水塔中层水质参数
对比例1：
本对比例给出将实施例1的好氧反硝化真菌Trichoderma afroharzianumH1单一培养物用于水库水体原位修复的应用，该应用的方法与实施例3基本相同，区别在于：将附着有好氧反硝化真菌Trichoderma afroharzianumH1单一培养物的聚氨酯泡沫立方体接种到含有1.5 L的调节过的原水的2 L的烧杯中。
本对比例中，好氧反硝化真菌Trichoderma afroharzianumH1单一培养物的制备方法与实施例2的方法基本相同，区别在于：步骤一中，从真菌固体培养基上挑取Trichoderma afroharzianumH1，然后接种到反硝化液体培养基中。
本对比例中，最终的水体污染治理结果如图4所示。
对比例2：
本实施例给出实施例1的好氧反硝化真菌Aspergillus nigerC1的单一培养物用于水库水体原位修复的应用，该应用的方法与实施例3基本相同，区别在于：将附着有好氧反硝化真菌Aspergillus nigerC1单一培养物的聚氨酯泡沫立方体接种到含有1.5 L的调节过的原水的2 L的烧杯中。
本对比例中，好氧反硝化真菌Aspergillus nigerC1单一培养物的制备方法与实施例2的方法基本相同，区别在于：步骤一中，从真菌固体培养基上挑取Aspergillus nigerC1，然后接种到反硝化液体培养基中。
本对比例中，最终的水体污染治理结果如图4所示。
从实施例3、对比例1和对比例2中能够得出如下结论：
根据图2的数据进行计算后可知，菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养在7d后硝酸盐残留量分别为1.10 mg/L、1.25mg/L和0.4 mg/L，菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养对水库原水的硝酸盐去除率分别为20.41%、7.72%和70.29%；菌株C1单独培养、菌株H1单独培养、菌株C1和H1共同培养的总氮去除率分别为24.05%, 12.66%和73.42%；说明将菌株C1和H1共同培养后，对水库原水的硝酸盐去除能力大幅度提升，并且两个菌株存在协同增效作用。
此外，菌株C1或菌株H1单独培养时存在亚硝酸盐的积累，而菌株C1和H1共同培养体系中几乎观察不到的亚硝酸盐积累，进一步说明菌株C1和H1共同培养能够大幅度提高真菌的水体脱氮能力。该研究为提处理水库微污染水体中硝酸盐的可能提供了一条新途径，其真菌共培养脱氮的增强对于饮用水处理具有指导意义。
Claims (8)
1.一种好氧反硝化真菌共培养物，其特征在于，包括两株好氧反硝化真菌；一株真菌命名为Trichoderma afroharzianum H1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 20231207 H1；另一株真菌命名为Aspergillus niger C1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 20231208 C1。
2.一种如权利要求1所述的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
步骤一，制备菌株悬浮液：
从真菌固体培养基上分别挑取两株好氧反硝化真菌，然后共同接种到反硝化液体培养基中，在温度为28～37℃，转速为100～200 rpm条件下，黑暗培养24～72h，再离心收集细胞，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞多次，最后调整菌丝体的浓度，制得菌株悬浮液；
步骤二，制备种子接种液：
将步骤一的菌株悬浮液接种到反硝化液体培养基中，在温度为28～37℃，转速为100～200 rpm条件下，黑暗培养24～72h，制得种子接种液；
步骤三，制备共培养物：
将步骤二的种子接种液接种到含有负载的反硝化液体培养基中，在温度为28～37℃，转速为100～200 rpm条件下黑暗培养，每隔1～3天用新鲜的反硝化液体培养基替换掉旧培养基，在培养10～20天后，收集负载，用水将负载表面冲洗多次，该负载上附着的菌体即为好氧反硝化真菌共培养物。
3.如权利要求2所述的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，其特征在于，步骤一中，菌株悬浮液中菌丝体的浓度为0.1～0.5g/L。
4.如权利要求2所述的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，其特征在于，步骤二中，菌株悬浮液和反硝化液体培养基的接种体积比为（0.5～2）:（7～10）。
5.如权利要求2所述的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，其特征在于，所述的负载为聚氨酯泡沫。
6.如权利要求2所述的好氧反硝化真菌共培养物的制备方法，其特征在于，所述的温度为30℃，转速为130 rpm。
7.如权利要求1所述的好氧反硝化真菌共培养物用于水库水体原位修复的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用的方法包括：将好氧反硝化真菌共培养物接种到原水中，向原水中持续充氧，让原水中的溶解氧浓度维持在5～15 mg/L。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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