CN109554309B - 一株丛毛单胞菌w2及其在脱氮中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株丛毛单胞菌及其在脱氮中的应用，属于污水处理技术领域。本发明提供的异养硝化‑有氧反硝化的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，保藏编号为CGMCC No.12459。本发明将该丛毛单胞菌制备成脱氮微生物膜后，安装在改进型膜生物反应器中，对污水中的氨氮的平均去除率提升20％以上，对总氮的平均去除率提升33％以上，从而提高膜生物反应器的出水水质。

Description

一株丛毛单胞菌W2及其在脱氮中的应用
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一株丛毛单胞菌W2及其在脱氮中的应用。
背景技术
膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor，简称MBR)是一种由膜分离单元与生物处理单元相结合的高效污水处理技术，以膜组件取代二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥浓度，提高生物处理有机负荷，减少污水处理设施占地，并通过保持低污泥负荷减少污泥量。与传统的生化水处理技术相比，膜生物反应器具有以下优点：处理效率高、出水水质好；设备紧凑、占地面积小；易实现自动控制、运行管理方便。
但是，由于膜生物反应器处理污水是在连续曝气状态下运行，缺少反硝化过程，虽然氨氮可以快速被氧化为硝态氮，但是污水中总氮的去除效果并不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株丛毛单胞菌W2及其在脱氮中的应用，在好氧条件下可以转化氨氮为硝态氮，同时具有反硝化脱氮功能，在曝气条件下，可提高对污水总氮的去除效果，提高出水水质，节约污水处理成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株异养硝化-有氧反硝化的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，保藏编号为CGMCC No.12459。
本发明提供了一种上述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株在脱氮微生物膜中的应用。
本发明还提供了一种脱氮微生物膜，包括载体和负载在所述载体上的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，所述丛毛单胞菌W2由上述菌株培养得到。
本发明还提供了上述脱氮微生物膜的制备方法，包括以下步骤：
1)将丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株接种于液体培养基中进行活化培养，得丛毛单胞菌种子液；所述液体培养基包括以下重量份的组分：酵母膏3～6份，糖蜜3～6份，硫酸铵3～5份和生活污水750～1500份；
2)将步骤1)得到的所述丛毛单胞菌种子液接种于所述液体培养基中进行有氧培养，得丛毛单胞菌液；
3)将步骤2)得到的所述丛毛单胞菌液与魔芋胶混合，得喷淋液；所述魔芋胶在所述丛毛单胞菌液中的重量百分含量为1～3％；
4)将步骤3)所述喷淋液喷淋到载体上至饱和，干燥后得脱氮微生物膜。
优选的，步骤1)所述活化培养的温度为25～35℃，时间为16～30h。
优选的，步骤1)所述生活污水包括经过污水处理厂处理的调节池污水。
优选的，步骤2)所述接种的接种量为2～15％。
优选的，步骤2)所述有氧培养时，液体培养基中的溶解氧浓度大于2mg/L。
优选的，步骤2)所述丛毛单胞菌液中活菌数超过2×109CFU/毫升。
本发明还提供了一种改进型膜生物反应器，包括上述脱氮微生物膜或利用上述制备方法制备得到的脱氮微生物膜，所述脱氮微生物膜的体积为所述改进型膜生物反应器的1～5％。
本发明提供了一株丛毛单胞菌W2及其在脱氮中的应用，所述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.12459，保藏日期为2016年5月17日。本发明所述丛毛单胞菌W2在好氧条件下可以转化氨氮为硝态氮，同时具有反硝化脱氮功能，可将其应用到脱氮微生物膜中，并安装在改进型膜生物反应器中，微生物膜可以逐步富集生物反应器中的微生物，形成多层次微生物膜结构，增加反应器中的生物量，增强降解污染物和抗冲击能力，在本发明实施例中，改进型膜生物反应器对氨氮的平均去除率提升20％以上，对总氮的平均去除率提升33％以上，能够提高膜生物反应器的出水水质。
保藏信息
本发明提供了一株丛毛单胞菌(Comamonas sp.)，菌株编号为W2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.12459，保藏日期为2016年5月17日。
具体实施方式
本发明提供了一株异养硝化-有氧反硝化的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，保藏编号为CGMCC No.12459。具体保藏信息为：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.12459，保藏日期为2016年5月17日。本发明所述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株的筛选过程，优选的包括：①将污水处理厂的活性污泥样品，接种至异养硝化培养基中进行异养培养，得异养硝化菌培养物；所述异养培养基包括以下浓度的原料：(NH4)2SO42.5g/L，Na2HPO4·12H2O 2.0g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，柠檬酸钠3.3g/L，0.2％(体积比)微量元素溶液；所述微量元素溶液组成包括EDTA-Na250g/L，ZnSO42.2g/L，CaCl25.5g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L；②将步骤①得到的所述异养硝化菌培养物接种于有氧反硝化培养基中进行有氧培养，得有氧反硝化菌培养物；所述有氧反硝化培养基中包括以下浓度的原料：KNO32.0g/L，Na2HPO4·12H2O 2.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，柠檬酸钠3.7g/L，0.2％(体积比)微量元素溶液；其中微量元素溶液的组成包括：EDTA-Na250g/L，ZnSO42.2g/L，CaCl25.5g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L；③将步骤②得到的所述有氧反硝化菌培养物接种在异养硝化培养基固态平板上进行分离培养，挑取单菌落接种于有氧反硝化培养基平板上分离培养，筛选后得丛毛单胞菌W2菌株。
本发明步骤①所述接种的接种量优选为6～15％，更优选为8～12％，最优选为10％。本发明在进行所述异养培养时，优选的每隔24小时更换一次新鲜的异养硝化培养基，所述更换的量优选为所述异养硝化培养基体积的5～20％，更优选为8～15％，最优选为10％。本发明所述异养培养的温度优选为27～35℃，更优选为28～32℃，最优选为30℃。本发明所述异养培养的转速优选为100～220rpm，更优选为140～180rpm，最优选为150rpm。本发明所述异养培养的时间优选为20～30d。
本发明步骤②所述接种的接种量优选为10～50％，更优选为20～45％，最优选为30％。本发明在进行所述有氧培养时，优选的每隔24小时更换一次新鲜的有氧反硝化培养基，所述更换的量优选为所述有氧反硝化培养基体积的5～20％，更优选为8～15％，最优选为10％。本发明所述有氧培养的温度优选为27～35℃，更优选为28～32℃，最优选为30℃。本发明所述有氧培养的转速优选为100～220rpm，更优选为140～180rpm，最优选为150rpm。本发明所述有氧培养的时间优选为10～20d。
本发明步骤③所述筛选优选为将所述接种于有氧反硝化培养基平板上分离培养的单菌落接种于异养硝化培养基和有氧反硝化培养基的混合培养基中，于30℃、150r/min振荡培养，每隔12小时，取样分析混合培养基培中的氨氮、硝态氮和总氮的含量，连续取样5天，选出氨氮、硝态氮和总氮含量下降最快的菌株，编号为W2。
本发明筛选得到W2后，优选的还包括菌种鉴定的过程，所述菌种鉴定优选包括提取W2菌株的16S rRNA基因进行测序分析，测序结果与NCBI数据库进行序列相似性比对，与Pseudononas菌属的大多数菌株相似性大于99％，初步鉴定W2菌株属于假单胞菌属。
本发明优选的还包括对W2菌株的生物学特性观察：在LB培养基平板上的单菌落为不规则圆形、表面凹凸不平、湿润、嫩黄色、不透明、呈粘稠态；显微镜下观察其形状为杆状，无鞭毛，大小为(0.2-0.4)μm×(1.0-1.8)μm。
本发明提供了一种上述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株在脱氮微生物膜中的应用。
本发明还提供了一种脱氮微生物膜，包括载体和负载在所述载体上的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，所述丛毛单胞菌W2由上述菌株培养得到。
本发明还提供了上述脱氮微生物膜的制备方法，包括以下步骤：
1)将丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株接种于液体培养基中进行活化培养，得丛毛单胞菌种子液；所述液体培养基包括以下重量份的组成：酵母膏3～6份，糖蜜3～6份，硫酸铵3～5份，生活污水750～1500份；
2)将步骤1)得到的所述丛毛单胞菌种子液接种于所述液体培养基中进行有氧培养，得丛毛单胞菌液；
3)将步骤2)得到的所述丛毛单胞菌液与魔芋胶混合，得喷淋液；所述魔芋胶在所述丛毛单胞菌液中的重量百分含量为1～3％；
4)将步骤3)所述喷淋液喷淋到载体上至饱和，干燥后得脱氮微生物膜。
本发明在制备所述脱氮微生物膜时，将丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株接种于液体培养基中进行活化培养，得丛毛单胞菌种子液；所述液体培养基包括以下重量份的组分：酵母膏3～6份，糖蜜3～6份，硫酸铵3～5份和生活污水750～1500份。本发明所述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株优选为LB斜面培养基保藏的菌株，本发明对所述LB斜面培养基保藏的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术即可。本发明所述活化培养优选为震荡培养，所述震荡培养的时间优选为16～30h，更优选为20～28h，最优选为24h。本发明所述震荡培养的温度优选为25～35℃，更优选为28～32℃，最优选为30℃。本发明所述震荡培养的转速优选为120～200rpm，更优选为140～180rpm，最优选为150rpm。本发明所述液体培养基中包含有酵母膏，所述酵母膏的重量份优选为4～5.8份，更优选为4.35～5.2份，最优选为5份。本发明所述液体培养基中包含有糖蜜，所述糖蜜的重量份优选为4～5.8份，更优选为4.35～5.2份，最优选为5份。本发明所述液体培养基中包含有硫酸铵，所述硫酸铵的重量份优选为3.2～4份，更优选为3.4～3.8份，最优选为3.5份。本发明所述液体培养基中包含有生活污水，所述生活污水的重量份优选为800～1400份，更优选为900～1200份，最优选为1000份。本发明对所述液体培养基中的原料来源并没有特殊限定，优选的所述生活污水包括经过污水处理厂处理的调节池污水。
得丛毛单胞菌种子液后，本发明将所述丛毛单胞菌种子液接种于所述液体培养基中进行有氧培养，得丛毛单胞菌液。本发明所述接种的接种量优选为2～15％，更优选为4～10％，最优选为5％。本发明所述有氧培养优选为向所述液体培养基中通无菌空气，使所述液体培养基中的溶解氧浓度大于2mg/L。本发明所述有氧培养的温度优选为25～35℃，更优选为28～34℃，最优选为32℃。本发明所述有氧培养的时间优选为12～30h，更优选为15～22h，最优选为18h。本发明在有氧培养完成后，优选的还包括菌落计数的过程，本发明对所述菌落计数的方法并没有特殊限定，优选为平板菌落计数法。在本发明中，所述丛毛单胞菌液中活菌数超过2×109CFU/毫升。
得丛毛单胞菌液后，本发明将所述丛毛单胞菌液与魔芋胶混合，得喷淋液；所述魔芋胶在所述丛毛单胞菌液中的重量百分含量为1～3％。本发明所述魔芋胶优选为食品级魔芋胶，所述魔芋胶在所述丛毛单胞菌液中的重量百分含量为2％。本发明对所述混合并没有特殊限定，优选为搅拌混合。本发明优选将所述喷淋液置于喷淋机储液罐中。
得喷淋液后，本发明将所述喷淋液喷淋到载体上至饱和，干燥后得脱氮微生物膜。本发明所述载体优选为软性填料，所述软性填料的材质优选包括聚丙烯膨体丝。本发明在进行所述喷淋时，优选将所述软性填料悬挂起来，打开喷淋机储液罐的喷淋器将喷淋液均匀喷洒在软性填料上，至刚刚有菌液滴落时吸附饱和，干燥后得脱氮微生物膜。本发明对所述干燥并没有特殊限定，优选为室温通风干燥。
本发明还提供了一种改进型膜生物反应器，包括上述脱氮微生物膜或利用上述制备方法制备得到的脱氮微生物膜，所述脱氮微生物膜的体积为所述改进型膜生物反应器的1～5％。本发明所述脱氮微生物膜的体积优选为所述改进型膜生物反应器的2％。
下面结合实施例对本发明提供的丛毛单胞菌及其在脱氮中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
自污水处理厂采集活性污泥，并于4℃保存运输到实验室作为目标菌的筛选材料，按照如下方法分离筛选得到异养硝化-有氧反硝化细菌：
①异养硝化培养基的制备：采用分析纯试剂和去离子水配制异养硝化培养基，其组成为(NH4)2SO42.5g/L，Na2HPO4·12H2O 2.0g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，柠檬酸钠3.3g/L，0.2％(体积比)微量元素溶液；其中微量元素溶液组成为EDTA-Na250g/L，ZnSO42.2g/L，CaCl25.5g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O1.6g/L；该异养硝化培养的pH范围为7.0～7.5；将配制好的异养硝化培养基于115℃高温灭菌25min。
②有氧反硝化培养基的制备：采用分析纯试剂和去离子水配制有氧反硝化培养基，其组成为KNO32.0g/L，Na2HPO4·12H2O 2.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，柠檬酸钠3.7g/L，0.2％(体积比)微量元素溶液；其中微量元素溶液组成为EDTA-Na250g/L，ZnSO42.2g/L，CaCl25.5g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O1.6g/L；该有氧反硝化培养基的pH范围为7.0～7.5；将配制好的有氧反硝化培养基于115℃高温灭菌25min。
③异养硝化菌的富集：取污水处理厂的活性污泥样品，按照体积比10％的接种量，接种至第①步骤制备的异养硝化培养基中进行富集，每隔24小时按照10％的体积比更换新鲜的异养硝化培养基；并于30℃、150r/min摇瓶中，连续培养20～30天，富集得到异养硝化菌培养物。
④有氧反硝化菌的富集：将第③步骤富集得到的异养硝化菌培养物，按照体积比30％的接种量，接种至第②步骤制备的有氧反硝化培养基中进行富集，每24小时按照10％的体积比更换新鲜的有氧反硝化培养基；并于30℃、150r/min摇瓶中，连续培养10～20天，富集得到有氧反硝化菌培养物。
⑤异养硝化-有氧反硝化菌株的分离筛选：将第④步骤富集得到的有氧反硝化菌培养物，采用稀释涂布平板法，先在异养硝化培养基固态平板上分离培养；待长出明显单菌落后，再用平板划线法，将单菌落逐一挑取，在有氧反硝化培养基平板上划线分离培养；然后挑取200个单菌落，分别接种于异养硝化培养基和有氧反硝化培养基三角瓶中，于30℃、150r/min振荡培养，每隔12小时，取样分析培养液中的氨氮、硝态氮和总氮的含量，连续取样5天，选出氨氮、硝态氮和总氮含量下降最快的菌株，编号为W2。
实施例2
对实施例1中得到的W2菌株进行鉴定和生物学特性观察。
菌种鉴定：对该菌株的16S rRNA基因进行测序分析，将测序得到的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库，登录号为：KT380551，与NCBI数据库进行序列相似性比对，与Pseudononas菌属的大多数菌株相似性大于99％，初步鉴定W2菌株属于假单胞菌属。
假单胞菌W2的生物学特性：其在LB培养基平板上的单菌落为不规则圆形、表面凹凸不平、湿润、嫩黄色、不透明、呈粘稠态；显微镜下观察其形状为杆状，无鞭毛，大小(长×宽)为(0.2-0.4)μm×(1.0-1.8)μm。
实施例3
酵母膏5公斤，糖蜜5公斤，硫酸铵3.5公斤，生活污水1吨，用氢氧化钠水溶液调节培养基pH至7.3，制备丛毛单胞菌的液体培养基。
向装有液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的丛毛单胞菌W2，于30℃，150转/分振荡培养24小时，得到丛毛单胞菌种子液；向装有液体培养基的发酵罐中接种体积比为5％的丛毛单胞菌种子液，于32℃，通无菌空气培养18小时；将培养好的发酵液经涂平板菌落计数，活菌数达到2×109CFU/毫升以上，得到丛毛单胞菌液。
实施例4
向实施例3得到的丛毛单胞菌培养液中按照重量比加入2％的食品级魔芋胶，搅拌均匀，装入喷淋机储液罐中；将比表面积大的聚丙烯膨体丝编织而成的软性填料悬挂起来，打开喷淋器将丛毛单胞菌培养液均匀喷洒在软性填料上，吸附量至饱和，室温通风干燥，即得到脱氮微生物膜。
将脱氮微生物膜按照体积比为2％安装在生物反应器中，构建成加载脱氮微生物膜的改进型MBR。
利用实施例4得到的改进型MBR进行脱氮实验：
设置空白对照组(不加载脱氮微生物膜的常规MBR)、实验I组(加载微生物膜1％的改进型MBR)和实验II组(加载微生物膜2％的改进型MBR)进行污水脱氮实验，实验结果如表1所示：
表1.污水脱氮实验出水氮含量对比
Figure BDA0001881595330000081
Figure BDA0001881595330000091
由上述实施例可知，本发明提供了一株丛毛单胞菌及其在脱氮中的应用，将该丛毛单胞菌制备成脱氮微生物膜后，安装在改进型MBR中，对污水中的氨氮的平均去除率提升20％以上，对总氮的平均去除率提升33％以上，从而提高膜生物反应器的出水水质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种改进型膜生物反应器，包括脱氮微生物膜，所述脱氮微生物膜的体积为所述改进型膜生物反应器的1～5％；
所述脱氮微生物膜，包括载体和负载在所述载体上的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2，所述丛毛单胞菌W2由异养硝化-有氧反硝化的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株培养得到，所述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株的保藏编号为CGMCCNo.12459；
所述脱氮微生物膜的制备方法，包括以下步骤：
1)将丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株接种于液体培养基中进行活化培养，得丛毛单胞菌种子液；所述液体培养基包括以下重量份的组分：酵母膏3～6份，糖蜜3～6份，硫酸铵3～5份和生活污水750～1500份；所述活化培养的温度为25～35℃，时间为16～30h；所述生活污水包括经过污水处理厂处理的调节池污水；
2)将步骤1)得到的所述丛毛单胞菌种子液接种于所述液体培养基中进行有氧培养，得丛毛单胞菌液；所述接种的接种量为2～15％；所述丛毛单胞菌液中活菌数超过2×109CFU/毫升；
3)将步骤2)得到的所述丛毛单胞菌液与魔芋胶混合，得喷淋液；所述魔芋胶在所述丛毛单胞菌液中的重量百分含量为1～3％；
4)将步骤3)所述喷淋液喷淋到载体上至饱和，干燥后得脱氮微生物膜。
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