CN109439569B - 异养硝化-有氧反硝化丛毛单胞菌、含有该菌的液体菌剂及其在膜生物反应器中的应用 - Google Patents

异养硝化-有氧反硝化丛毛单胞菌、含有该菌的液体菌剂及其在膜生物反应器中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一株具有异养硝化‑有氧反硝化功能的丛毛单胞菌（Comamonas sp.）W2，丛毛单胞菌W2菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12459。本发明还提供丛毛单胞菌W2液体菌剂，该液体菌剂是将丛毛单胞菌W2接种到液体培养基中发酵后得到，其中的活菌数达到2×109 CFU/毫升以上。将该液体菌剂添加到污水处理膜生物反应器中，在曝气的条件下，提高膜生物反应器对污水中总氮的去除效果，从而提高出水水质，节约污水处理成本。

Description

异养硝化-有氧反硝化丛毛单胞菌、含有该菌的液体菌剂及其 在膜生物反应器中的应用
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域，特别是涉及一株具有异养硝化-有氧反硝化丛毛单胞菌(Comamonassp.)W2、含有该菌的液体菌剂及其在膜生物反应器中的应用。
背景技术
膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor，简称MBR)是一种由膜分离单元与生物处理单元相结合的高效污水处理技术，以膜组件取代二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥浓度，提高生物处理有机负荷，减少污水处理设施占地，并通过保持低污泥负荷减少污泥量。与传统的生化水处理技术相比，膜生物反应器具有以下优点：处理效率高、出水水质好；设备紧凑、占地面积小；易实现自动控制、运行管理方便。
但是，由于膜生物反应器处理污水是在连续曝气状态下运行，缺少反硝化过程，虽然氨氮可以快速被氧化为硝态氮，但是污水中总氮的去除效果并不理想。
发明内容
本发明的目的在于提出一株具有异养硝化-有氧反硝化功能的丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2及其液体菌剂，将该液体菌剂添加到污水处理膜生物反应器中，在曝气的条件下，提高膜生物反应器对污水中总氮的去除效果，从而提高出水水质，节约污水处理成本。
基于上述目的，本发明提供的一株具有异养硝化-有氧反硝化功能的丛毛单胞菌，其为丛毛单胞菌(Comamonassp.)W2菌株，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.12459，保藏日期为2016年5月17日。
本发明还提供上述的丛毛单胞菌W2在污水处理膜生物反应器中的应用，具体用于污水中总氮的去除。
本发明还提供了一种含有上述的丛毛单胞菌W2的液体菌剂，所述液体菌剂中丛毛单胞菌W2的活菌数在2×109CFU/毫升以上。
本发明还提供了液体菌剂在污水处理膜生物反应器中的应用，所述液体菌剂用于污水处理膜生物反应器中总氮的去除。
上述应用的具体操作为：将液体菌剂添加到所述污水处理膜生物反应器中，每隔3～15天添加一次，污水处理膜生物反应器中液体菌剂每次的添加量为污水体积的0.1～1％。
本发明还提供了上述液体菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取硫酸铵、磷酸氢二钠和COD浓度为20～50g/L的淀粉废水，混合，用氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至7.0～7.8，得到丛毛单胞菌W2液体培养基；所述硫酸铵、磷酸氢二钠和COD浓度为20～50g/L的淀粉废水的质量比为(3～6):(0.2～0.5):1000；
步骤2：向丛毛单胞菌W2液体培养基中接种斜面保藏的丛毛单胞菌W2，于25～35℃条件下，120～200转/分钟振荡培养16～30小时，得到丛毛单胞菌W2液体种子；
步骤3：向丛毛单胞菌W2液体培养基接种丛毛单胞菌W2液体种子，于25～35℃条件下，通入无菌空气，培养12～30小时，得发酵液；所述丛毛单胞菌W2液体种子和液体培养基的体积比为(2～10):100；
步骤4：将发酵液经涂平板菌落计数，活菌数达到2×109CFU/毫升以上，即得到丛毛单胞菌W2的液体菌剂。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明从污水处理厂的活性污泥中分离筛选出一株能够同时具有异养硝化和有氧反硝化功能的高效脱氮细菌——丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2菌株，将其制备成液体菌剂，适量添加到MBR的膜池中，在曝气的条件下可以提高MBR系统对污水中总氮的去除效果。添加本发明实施例提供的菌剂后，膜生物反应器对氨氮的平均去除率提升20％，对总氮的平均去除率提升33％，从而提高膜生物反应器的出水水质。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1丛毛单胞菌(Comamonas sp.)W2的筛选与菌种鉴定
(1)筛选：
自平顶山市污水处理厂采集活性污泥，并于4℃保存，作为目标菌的筛选材料，按照如下方法分离筛选得到异养硝化-有氧反硝化细菌——丛毛单胞菌W2：
①异养硝化培养基的制备：采用分析纯试剂和去离子水配制异养硝化培养基，异养硝化培养基的组成为(NH4)2SO4 2.5g/L，Na2HPO4·12H2O 2.0g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，柠檬酸钠3.3g/L，0.2％(体积比)微量元素溶液；其中微量元素溶液组成为EDTA-Na2 50g/L，ZnSO4 2.2g/L，CaCl2 5.5g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O 5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L；该异养硝化培养的pH范围为7.0～7.3；将配制好的异养硝化培养基于115℃高温灭菌25min。
②有氧反硝化培养基的制备：采用分析纯试剂和去离子水配制有氧反硝化培养基，有氧反硝化培养基的组成为KNO3 2.0g/L，Na2HPO4·12H2O 2.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，柠檬酸钠3.7g/L，0.2％(体积比)微量元素溶液；其中微量元素溶液组成为EDTA-Na2 50g/L，ZnSO4 2.2g/L，CaCl2 5.5g/L，MnCl2·4H2O 5.1g/L，FeSO4·7H2O5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L；该有氧反硝化培养基的pH范围为7.0～7.3；将配制好的有氧反硝化培养基于115℃高温灭菌25min。
③异养硝化菌的富集：取污水处理厂采集并4℃保存的活性污泥样品，按照活性污泥和培养基体积比10％的接种量，接种至第①步骤制备的异养硝化培养基中进行富集，每隔24小时按照10％的体积比更换新鲜的异养硝化培养基，具体是指取10％培养液弃掉，再加入相同量的新配制的培养基；并于30℃、150r/min条件下连续振荡培养20～30天，富集得到异养硝化菌培养物。
④有氧反硝化菌的富集：将第③步骤富集得到的异养硝化菌培养物，按照异养硝化菌培养物和培养基体积比30％的接种量，接种至第②步骤制备的有氧反硝化培养基中进行富集，每24小时按照10％的体积比更换新鲜的有氧反硝化培养基；并于30℃、150r/min条件下连续振荡培养10～20天，富集得到有氧反硝化菌培养物。
⑤异养硝化-有氧反硝化菌株的分离筛选：采用稀释涂布平板法，将第④步骤富集得到的有氧反硝化菌培养物，先在异养硝化培养基固态平板(即在第①步骤制备异养硝化培养基中添加琼脂粉后制成)上分离培养；待长出明显单菌落后，再用平板划线法，将单菌落逐一挑取，在有氧反硝化培养基平板(即在第②步骤制备有养反硝化培养基中添加琼脂粉后制成)上划线分离培养；然后挑取200个单菌落，分别接种于异养硝化培养基和有氧反硝化培养基三角瓶中，于30℃、150r/min条件下振荡培养，每隔12小时，取样分析培养液中的氨氮、硝态氮和总氮的含量，连续取样5天，选出氨氮、硝态氮和总氮含量下降最快的菌株，编号为W2。
(2)菌种鉴定：对所得编号为W2菌株的16S rRNA基因进行测序分析，测序结果与NCBI数据库进行序列相似性比对，结果显示，该W2菌株与Comamonas terrigena strainNBRC 12685菌株的相似性为99.9％，鉴定W2菌株属于丛毛单胞菌属，其16S rRNA基因序列已提交到GenBank数据库，登录号为：KT380551。
(3)菌种保藏：将筛选得到的氨氮、硝态氮和总氮含量下降最快的菌株命名为Comamonas sp.W2，并于2016年5月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心进行专利保藏，其保藏编号为CGMCC No.12459。
实施例2丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备
作为本发明的一个实施例，所述丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备包括以下步骤：
(1)丛毛单胞菌W2液体培养基的制备：取硫酸铵3kg、磷酸氢二钠0.3kg和COD浓度为35g/L的马铃薯淀粉废水1吨，混合，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH至7.5，得丛毛单胞菌W2液体培养基；
(2)丛毛单胞菌W2液体种子的培养：将通过步骤(1)制备得到的丛毛单胞菌W2液体培养基装入三角烧瓶中，向装有该液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的丛毛单胞菌W2，于28℃、180转/分钟条件下振荡培养22小时，得到丛毛单胞菌W2液体种子；
(3)丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备：将通过步骤(1)制备得到的丛毛单胞菌W2液体培养基装入发酵罐中，向装有丛毛单胞菌W2液体培养基的发酵罐中接种丛毛单胞菌W2液体种子，于31℃条件下，向发酵罐中通入无菌空气，培养18小时，得发酵液；所述丛毛单胞菌W2液体种子和丛毛单胞菌W2液体培养基的体积比为7:100。
(4)将培养好的发酵液经涂平板菌落计数，丛毛单胞菌W2活菌数达到2×109CFU/毫升以上，即得到丛毛单胞菌W2液体菌剂。
实施例3丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备
作为本发明的一个实施例，所述丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备包括以下步骤：
(1)丛毛单胞菌W2液体培养基的制备：取硫酸铵3kg、磷酸氢二钠0.5kg和COD浓度为20g/L的马铃薯淀粉废水1吨，混合，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH至7.0，得丛毛单胞菌W2液体培养基；
(2)丛毛单胞菌W2液体种子的培养：将通过步骤(1)制备得到的丛毛单胞菌W2液体培养基装入三角烧瓶中，向装有该液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的丛毛单胞菌W2，于25℃、200转/分钟条件下振荡培养30小时，得到丛毛单胞菌W2液体种子；
(3)丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备：将通过步骤(1)制备得到的丛毛单胞菌W2液体培养基装入发酵罐中，向装有丛毛单胞菌W2液体培养基的发酵罐中接种丛毛单胞菌W2液体种子，于35℃条件下，向发酵罐中通入无菌空气，培养12小时，得发酵液；所述丛毛单胞菌W2液体种子和丛毛单胞菌W2液体培养基的体积比为2:100。
(4)将培养好的发酵液经涂平板菌落计数，丛毛单胞菌W2活菌数达到2×109CFU/毫升，即得到丛毛单胞菌W2液体菌剂。
实施例4丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备
作为本发明的一个实施例，所述丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备包括以下步骤：
(1)丛毛单胞菌W2液体培养基的制备：取硫酸铵6kg、磷酸氢二钠0.2kg和COD浓度为50g/L的马铃薯淀粉废水1吨，混合，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH至7.8，得丛毛单胞菌W2液体培养基；
(2)丛毛单胞菌W2液体种子的培养：将通过步骤(1)制备得到的丛毛单胞菌W2液体培养基装入三角烧瓶中，向装有该液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的丛毛单胞菌W2，于35℃、120转/分钟条件下振荡培养16小时，得到丛毛单胞菌W2液体种子；
(3)丛毛单胞菌W2液体菌剂的制备：将通过步骤(1)制备得到的丛毛单胞菌W2液体培养基装入发酵罐中，向装有丛毛单胞菌W2液体培养基的发酵罐中接种丛毛单胞菌W2液体种子，于25℃条件下，向发酵罐中通入无菌空气，培养30小时，得发酵液；所述丛毛单胞菌W2液体种子和丛毛单胞菌W2液体培养基的体积比为10:100。
(4)将培养好的发酵液经涂平板菌落计数，丛毛单胞菌W2活菌数达到2×109CFU/毫升以上，即得到丛毛单胞菌W2液体菌剂。
实施例5丛毛单胞菌W2液体菌剂在强化污水处理膜生物反应器脱氮中的应用
异养硝化是指微生物在利用有机底物的同时将氨氮转化为羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的过程。有氧反硝化是指微生物可以在有氧条件下，利用硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体进行呼吸作用。异养硝化菌和有氧反硝化菌的发现，打破了传统理论认为硝化反应只能由自养菌完成和反硝化反应只能在厌氧条件进行的认识，使得同步硝化反硝化(Simultaneous Nitrification and Denitrification，SND)成为可能。
具体地，采用如下方法在污水处理膜生物反应器中添加所述丛毛单胞菌W2液体菌剂：
在正常运行的生活污水处理膜生物反应器中添加上述实施例2制备得到的丛毛单胞菌W2液体菌剂，每隔3～15天添加一次，污水处理膜生物反应器中液体菌剂每次的添加量为其中的生活污水体积的0.1～1％。
添加本发明实施例提供的菌剂后，污水处理膜生物反应器对氨氮的平均去除率提升20％以上，对总氮的平均去除率提升33％以上，从而提高膜生物反应器的出水水质。对比运行数据如表1所示：
表1：不同液体菌剂添加量的污水处理膜生物反应器进水和出水水质
Figure BDA0001833211340000061
表中所述0.1％、0.5％液体菌剂是指污水处理膜生物反应器中液体菌剂每次的添加量为污水体积的0.1％、0.5％。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (3)

1.含有具有异养硝化-有氧反硝化功能的丛毛单胞菌W2的液体菌剂的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
步骤1：取硫酸铵、磷酸氢二钠和COD浓度为20～50 g/L的淀粉废水，混合，用氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至7.0～7.8，得到丛毛单胞菌W2液体培养基；所述硫酸铵、磷酸氢二钠和COD浓度为20～50 g/L的淀粉废水的质量比为（3～6）:（0.2～0.5）:1000；
步骤2：向丛毛单胞菌W2液体培养基中接种斜面保藏的丛毛单胞菌W2，于25～35℃条件下，120～200转/分钟振荡培养16～30小时，得到丛毛单胞菌W2液体种子；
丛毛单胞菌W2保藏编号为：CGMCC No.12459，
步骤3：向丛毛单胞菌W2液体培养基接种丛毛单胞菌W2液体种子，于25～35℃条件下，通入无菌空气，培养12～30小时，得发酵液；所述丛毛单胞菌W2液体种子和液体培养基的体积比为（2～10）:100；
步骤4：将发酵液经涂平板菌落计数，活菌数达到2×109 CFU/毫升以上，即得到丛毛单胞菌W2的液体菌剂。
2.采用权利要求1的制备方法制备的液体菌剂在污水处理膜生物反应器中的应用，其特征在于，所述液体菌剂用于污水处理膜生物反应器中总氮的去除。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体操作为：将液体菌剂添加到所述污水处理膜生物反应器中，每隔3～15天添加一次，污水处理膜生物反应器中液体菌剂每次的添加量为污水体积的0.1～1%。
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