CN112961790B - 一种耐高盐环境的异养硝化菌及其应用 - Google Patents

一种耐高盐环境的异养硝化菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种耐高盐环境的异养硝化菌菌株，名称为WW7，分类名称为Candida palmioleophila，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No.61320。本发明的异养硝化菌菌株能耐受含盐量为9%的高盐环境，能够应用在高盐医药化工废水处理方面，在盐度为4600mg/L的医药化工综合废水中，该菌株42h内氨氮去除率达到69.3%，TN去除率达到52.9%，COD去除率更是高达93.1%，在处理其它类型高浓度有机污染物及有毒有害物质的医药化工废水时，该菌株的氨氮、TN及COD去除效果都比较理想，具有一定的普适性。

Description

一种耐高盐环境的异养硝化菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物环保技术领域，具体涉及一种耐高盐环境的异养硝化菌及其应用。
背景技术
目前，随着现代医学技术快速发展，对医药产品需求剧增，医药中间体行业、原料药合成行业和医药制剂行业生产过程中排放的医药化工废水不断增加，而这类废水具有高盐、高NH4 +-H、高COD、高TP、生物毒性大等主要特点，不经处理直接排放会对环境造成严重破坏，必须经处理合格之后才能排放。传统处理医药化工废水的主要方法有微电解法、芬顿法、电化学法、膜分离法和生物法，前四种处理方法投资大、成本高、处理效率低、能耗过高，生物法是目前应用较为经济理想的方法。但医药化工废水中高浓度的盐离子、COD、NH4 +-H及有毒有机物不仅会抑制抑制微生物活性，还会降低微生物处理废水的效率，因此要实现脱氮过程就必须利用微生物作用先将有机氮和氨氮转化为硝酸盐氮。因此，筛选出既能耐高盐同时又能去除高浓度COD和NH4 +-H的异养硝化菌株成为生物法高效处理医药化工废水的关键因素。
利用微生物处理医药化工废水的效果主要取决于菌株对高盐环境的耐受能力，因此筛选出对耐高盐菌株是处理的关键。本发明通过不断提高筛选培养基中的含盐量驯化出高耐盐菌株，再筛选出COD和NH4 +-H去除率高的菌株，以期该菌株能较快适应医药化工废水的高盐浓度环境，在耐受高盐环境的同时还能降解废水中高浓度的COD和NH4 +-H。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐高盐环境的异养硝化菌及其应用。该异养硝化菌是从江西万年凤巢工业园污水处理厂的活性污泥中分离得到，该菌株可以应用于污水处理中。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种耐高盐环境的异养硝化菌，名称为WW7，分类名称为Candidapalmioleophila，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No 61320，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
本发明所述的异养硝化菌的固体培养特征为：异养硝化培养基，培养温度为30±1℃，培养48h，菌落直径1～2mm，菌落呈白色，表面湿润，较光滑，易挑起，半球状。
本发明所述的异养硝化菌菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：菌体较小，近似圆形，有出芽生殖的现象。
所述异养硝化菌菌株基因登陆号为：MW509952，ITS序列为：
CTCGGGGGCATTGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATGAGATCAGACTTGGTGTTTTGCAACCTTACTCTCGGGTGGGGCCCCTGCAGTTCATCGGGCCAGCATCAGTTTGGATGGTAGGATAATGGCATTGGAATGTAGCTTGGCTTCGGTTAAGTGTTATAGCCTTTGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCGTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGATCCTATACCGCCCGTCTTAACACCGAAACCA。
根据所述WW7菌株的形态特征和生理生化特征及ITS序列在NCBI数据库中Blast检索比对，应用MEGA 6.0软件采用NJ法绘制系统进化树，鉴定该菌株为Candidapalmioleophila。
所述异养硝化菌菌株筛选培养使用的培养基为：
异养硝化培养基：(NH4)2SO4 0.47g·L-1，琥珀酸钠5.62g·L-1，维氏盐溶液50mL，pH＝7.0；其中，维氏盐溶液：K2HPO4·3H2O 5.0g·L-1，MgSO4·7H2O 2.5g·L-1，NaCl 2.5g·L-1，MnSO4·4H2O 0.05g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05g·L-1。
如上所述的异养硝化菌菌株的耐盐性为NaCl质量浓度的9％。
如上所述的异养硝化菌菌株的筛选方法，筛选步骤如下：
(1)样品采集：取活性污泥，用取样瓶封装，4℃保藏备用；
(2)异养硝化菌菌株驯化：将活性污泥按2％接种量接种到异养硝化培养基中，30℃培养48～72h，再取该菌液以2％的接种量接种到质量浓度为1％的NaCl培养基中，依此类推，直到接种至质量浓度为9％的NaCl的上述培养基中，30℃培养48～72h，添加的NaCl质量分数梯度依次为1％、3％、5％、7％、9％；
(3)异养硝化菌菌株筛选：将含盐量为9％异养硝化培养基中的菌液用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-4～10-7的稀释菌液100μL分别涂布到固体平板上，30℃培养48～72h，挑取不同菌落形态的菌株保存到斜面上，于4℃备用；
(4)异养硝化菌菌株分离纯化：将筛选得到菌株在YPD平板上划线分离，在30℃恒温培养箱培养24h，重复划线三次以上，在显微镜下观察到形态单一的菌体则说明菌株已经分离纯化。
本发明还提供一种关于上述耐高盐环境的异养硝化菌菌株在污水处理方面的应用。
本发明还提供一种关于上述耐高盐环境的异养硝化菌菌株在制备菌种发酵剂中的应用。
本发明的优点和积极效果如下：
(1)本发明的菌株在高盐环境下生存能力强，生长速度快，适应期短，稳定期长，能更好适应污水中的高盐环境。
(2)本发明的菌株在处理高浓度有机污染物及有毒有害物质的医药化工废水时，该菌株的NH4 +-H、TN及COD去除效果都比较理想，投资成本小，经济效益高，能用于高浓度医药化工废水处理。
(3)本发明的菌株污水污水处理效果好，尤其是COD去除率高，并且能够在高盐环境下生存，该菌株在最适条件下有利于扩大培养，可以制成菌剂投放到污水处理池中进行大批量污水处理。
附图说明
图1为本发明所述的异养硝化菌菌株的菌落形态。
图2为本发明所述的异养硝化菌菌株的菌体形态。
图3为本发明所述的异养硝化菌菌株ITS序列的PCR电泳图谱。
图4为本发明所述的异养硝化菌菌株依据ITS序列建立的系统进化树。
图5为本发明所述的异养硝化菌菌株生长曲线。
图6为本发明所述的异养硝化菌菌株污水COD处理效果。
图7为本发明所述的异养硝化菌菌株污水NH4 +-H和TN处理效果。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
实施例1：本发明所述菌株分离筛选
步骤一、样品采集：取江西万年凤巢工业园污水处理厂的活性污泥，然后用取样瓶封装，4℃保藏备用。
步骤二、耐盐异养硝化菌菌株驯化：将活性污泥按2％接种量接种到异养硝化培养基中，30℃培养48～72h，再取该菌液以2％的接种量接种到质量浓度为1％的NaCl培养基中，依此类推，直到接种至质量浓度为9％的NaCl的上述培养基中，30℃培养48～72h，添加的NaCl质量分数梯度依次为1％、3％、5％、7％、9％。
步骤三、耐盐异养硝化菌菌株筛选：将含盐量为9％异养硝化培养基中的菌液用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-4～10-7的稀释菌液100μL分别涂布到固体平板上，30℃培养48～72h，挑取不同菌落形态的菌株保存到斜面上，于4℃备用。
步骤四、耐盐异养硝化菌菌株分离纯化：将筛选得到菌株在YPD平板上划线分离，在30℃恒温培养箱培养24h，重复划线三次以上，在显微镜下观察到形态单一的菌体则说明菌株已经分离纯化。
实施例2：本发明菌株显微形态和分子生物学鉴定
取所筛选得到的菌株进行显微形态和分子生物学方法鉴定，具体操作如下。
(1)采用固体平板培养法：固体培养YPD培养基，培养温度为：30±1℃，培养48h，菌落直径1～2mm，菌落呈白色，表面湿润，较光滑，易挑起，半球状，该菌株的菌落图片见说明书附图1。
本发明所述菌株在革兰氏染色后的显微形态特征：
革兰氏染色后再在400倍显微镜下观察到的菌体形态：菌体较小，近似圆形，有出芽生殖的现象，该菌株的显微图片见说明书附图2。
(2)分子生物学鉴定
①用接种环从斜面上挑适量菌体接种到异养硝化液体培养基中，30℃、170r/min培养24h，取2～3mL发酵液，10000转离心1min收集菌体。
②把离心获得的菌体用OMEGA公司的Yeast基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，具体步骤参照试剂盒内说明书。
③将提到的总DNA进行ITS序列PCR扩增，选用真菌通用引物ITS 1和ITS 4进行扩增。PCR反应体系50μL：Premix rTaq 25μL；ITS1 1μL；ITS4 1μL；模板1μL；ddH2O22μL。热循环参数95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，72℃延伸5min。反应结束后取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件为100V，50mA，30min，PCR扩增结果见说明书附图3，然后再将产物送至上海生工进行测序。
④扩增获得的序列经测序，菌株WW7的ITS核苷酸序列约为600bp，将测序获得的ITS基因序列(MW509952)提交到NCBI，利用Blast进行同源性比较。利用MEGA 6.0软件进行多序列比对分析，并用Neighbor-Joining法构建系统发育树，构建好系统发育树见说明书附图4。结果显示菌株WW7与Candida palmioleophila(GU37371.1)的同源性达99％以上。综合WW7菌株的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株WLW鉴定为Candida palmioleophila。
⑤将该菌株保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No 61320，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
实施例3：生长曲线的测定
用接种环取适量实施例1中所获得菌株接种到装有20ml异养硝化液体培养基的锥形瓶中，30℃、170r/min恒温摇床培养12h，再按1％接种量接种到装有100ml YPD液体培养基的锥形瓶中，每隔6h取样，在600nm波长进行光电比浊测定该菌株生长曲线。本发明所述的菌株生长曲线见说明书附图5。
由图5可以看出，0～6h为该菌株的适应期，6～36h为该菌株的对数生长期，36～72h为该菌株的稳定期。本发明所述菌株在9％NaCl的上述筛选培养基中适应期短，稳定期长，能更好适应污水中的高盐环境。
实施例4：本发明所述菌株污水处理效果
(1)江西华邦药业有限公司以抗生素系列原料药、医药中间体为主导产品，目前主要产品包括美罗培南MAP，美罗培南侧链，美罗培南粗品，舒巴坦酸，他唑巴坦酸，他唑巴坦酸等，生产过程中产生大量的生产废水。废水中含有大量有机污染物及有毒有害物质，该医药化工废水原水和综合水的COD值等一些参数见表1。
(2)取该医药化工废水的综合水接入10％所述菌株的菌液，在170r/min、30℃恒温摇床培养,每隔6小时取样，测量COD、TN和NH4 +-H含量变化。
表1两种水样的参数
Figure BDA0002996274010000061
由说明书附图6～7可知，该耐盐异养硝化菌株在处理盐度为4600mg/L的医药化工综合水时，36h氨氮去除率达到69.3％，42h时TN去除率达到52.9％，COD去除率更是高达93.1％，筛选时发现该菌株能耐受含盐量为9％的高盐环境下，在处理高浓度有机污染物及有毒有害物质时，该菌株的氨氮、TN及COD去除效果都比较理想，可用于高浓度医药化工废水处理。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西沃邦兴环保科技有限公司
<120> 一种耐高盐环境的异养硝化菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 581
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ctcgggggca ttgcttagta cggcgagtga gcggcaaaag ctcaaatttg aaatctggca 60
ccttcggtgt ccgagttgta atttgaagaa ggtaaccttg gggttggctc ttgtctatgt 120
ttcttggaac agaacgtcac agagggtgag aatcccgtgc gatgagatgc ccaattctat 180
gtaaggtgct ttcgaagagt cgagttgttt gggaatgcag ctctaagtgg gtggtaaatt 240
ccatctaaag ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtacagtg atggaaagat 300
gaaaagaact ttgaaaagag agtgaaaaag tacgtgaaat tgttgaaagg gaagggtatg 360
agatcagact tggtgttttg caaccttact ctcgggtggg gcccctgcag ttcatcgggc 420
cagcatcagt ttggatggta ggataatggc attggaatgt agcttggctt cggttaagtg 480
ttatagcctt tgttgatact gcctgtctag actgaggact gcgtctttga ctaggatgct 540
ggcataatga tcctataccg cccgtcttaa caccgaaacc a 581

Claims (3)

1.一种耐高盐环境的异养硝化菌，其特征在于：分类名称为Candida palmioleophila，命名为WW7，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2020年11月26日，保藏号为：GDMCC No.61320，保藏地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；所述异养硝化菌WW7的固体培养特征为：异养硝化培养基，培养温度为30±1℃，培养48h，菌落直径1~2mm，菌落呈白色，表面湿润，较光滑，易挑起，半球状；所述异养硝化菌WW7在革兰氏染色后的显微形态特征为：菌体较小，近似圆形，有出芽生殖的现象。
2.根据权利要求1所述的耐高盐环境的异养硝化菌菌株在污水处理方面的应用。
3.根据权利要求1所述的耐高盐环境的异养硝化菌菌株在制备菌种发酵剂中的应用。
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