CN112011486A - 一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌k8及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用。本发明筛选得到的菌株，通过生理生态学分析以及分子生物学鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。该菌株可在以氨氮、亚硝态氮或硝态氮为唯一氮源的条件下生长，在异养好氧条件下通过同步硝化反硝化作用，24h将100mg/L氨氮、100mg/L硝态氮和25mg/L亚硝态氮的去除率分别达到73.7％、51.7％和100％，且不积累无机氮；对水体中50mg/L氨氮和12.5mg/L亚硝态氮混合氮源的去除率分别达到89.1％和100％，无硝酸盐积累；且对蓝藻有很好的防治效果。该菌株还具有较强的产淀粉酶和蛋白酶能力，耐酸、耐胆盐，与酵母菌和乳酸菌复合制成发酵饲料，可提高饲料中氨基酸和总蛋白含量。

Description

一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用。
背景技术
随着水产养殖集约化程度的不断提高，残饵、排泄物、残体大量累积，加上农业退水的排放，致使养殖水体污染严重，最为突出的是养殖中后期氮素含量过高。水体中氮素含量过高会导致水体富营养化，藻类大量繁殖，消耗水体中的溶氧，使得水变腥臭，影响水产动物的生存。然而如何经济有效地去除养殖水体中的氮素，同时还能抑制蓝藻的产生，是水产养殖一直关注的问题。利用微生物硝化和反硝化作用去除水体中氮源污染物，具有修复时间短、操作简便、成本费用低、不会产生二次污染、污染物降解彻底等多种优势。传统理论一直认为，硝化和反硝化作用是两个完全独立的过程，分别在自养和厌氧条件下由不同的微生物完成。然而，1983年Robertson等首次发现菌株Thiosphaera pantotropha同时具有异养硝化和好氧反硝化能力，打破了传统的硝化和反硝化理论，目前大量在异养条件下具有硝化功能和好氧条件下具有反硝化功能的菌株被分离获得，其中部分菌种具有同步硝化反硝化能力。
枯草芽胞杆菌(Bacillus subrilis)是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性好氧菌，产中生芽孢。枯草芽胞杆菌具有易培养、繁殖快、易保存、对环境适应性强、无毒无污染的特点，是水产养殖一种常用的益生菌，主要利用其产胞外酶分解水体和底泥中的有机质从而降低水体的富营养化风险，未见报道其具有同步硝化反硝化能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8及其应用，解决了现有技术中去除水体氮源污染物效率低，功能单一的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCCNo.19558。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于防治蓝藻。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于饲料发酵。
本发明还提供了一种复合发酵剂，所述复合发酵剂中包括枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX。
作为优选，所述枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX的体积比为1:1.5～2.5:4～6。
本发明提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8。本发明的枯草芽胞杆菌K8与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的枯草芽胞杆菌K8具有同步硝化反硝化能力，脱氮速度快，24h将100mg/L氨氮、100mg/L硝态氮和25mg/L亚硝态氮的去除率分别达到73.7％、51.7％和100％，且不积累无机氮；对水体中50mg/L氨氮和12.5mg/L亚硝态氮混合氮源的去除率分别达到89.1％和100％，无硝酸盐积累；脱氮效率高，通过同步硝化反硝化作转化成气态氮。
2、本发明的枯草芽胞杆菌K8同时具有防治蓝藻的效果，室内试验和田间试验均证明，该菌能杀灭铜绿微囊藻，防治蓝藻爆发。
3、本发明的枯草芽胞杆菌K8与希氏乳杆菌、热带假丝酵母复合用于发酵饲料，活菌含量高，提高饲料的利用率和营养成分的含量。
4、本发明的枯草芽胞杆菌K8的淀粉酶和蛋白酶的酶活值高；耐酸，在pH3.0和4.0的培养基上的OD值分别达到0.67和1.36；耐胆盐，在0.3％的胆盐中的存活率达到40.8％，在模拟胃液中的存活率达92.3％。
附图说明
图1为枯草芽胞杆菌K8基于16SrRNA基因序列构建的系统发育树；
图2为枯草芽胞杆菌K8以氨氮为底物的脱氮效果；
图3为枯草芽胞杆菌K8以硝态氮为底物的脱氮效果；
图4为枯草芽胞杆菌K8以亚硝态氮为底物的脱氮效果；
图5为枯草芽胞杆菌K8以氨氮和亚硝态氮为混合氮源的脱氮效果。
保藏说明
枯草芽胞杆菌K8，拉丁文为Bacillus subtilis，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为：CGMCC No.19558。
具体实施方式
本发明提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCC No.19558。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的分离筛选方法，包括如下步骤：
(1)取南美白对虾养殖池底质活性污泥为待分离物；
(2)将待分离物用无菌水稀释，得到稀释的待分离物；
(3)将稀释的待分离物进行处理，得到处理的分离物；
(4)采用平板划线法分离处理的分离物后，得到分离的K8菌落。
在本发明中，所述稀释待分离物时的稀释倍数为待分离物体积的3～5倍，优选为4倍。
在本发明中，处理所述稀释的待分离物的方法为水浴处理法。
在本发明中，所述水浴处理法的温度为70～90℃，优选为80℃。
在本发明中，所述水浴处理法的时间为10～20min，优选为15min。
在本发明中，所述分离的K8菌落为单菌落。
在本发明中，所述分离的K8的单菌落通过继代培养的方式进行纯化，得到纯化的K8菌株。
在本发明中，所述继代培养纯化菌株的次数为4～6次，优选为5次。
在本发明中，所述纯化得到的K8菌株的形态学特征为：单细胞，杆状，细胞直径(0.7～0.8)×(3～4)μm，革兰氏染色阳性，芽胞中生，菌落表面粗糙不透明，微黄色，好氧。
在本发明中，所述K8菌株的核酸序列长度为1480bp。
在本发明中，所述K8菌株的16s rRNA的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取DNA，进行PCR扩增，得到扩增产物；
(2)扩增产物纯化后进行16s rRNA序列测定，得到K8菌株的16s rRNA的序列；
(3)将K8菌株的16s rRNA的序列进行Blast分析，并采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining软件，构建得到K8菌株的16s rRNA的系统发育树。
在本发明中，K8菌株与Bacillus subtilisNR_112116.2的同源相似性达到100％。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。
在本发明中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时K8菌液的培养基LB细菌培养基。在本发明中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时的K8菌液制备时的培养时间为12～36h，优选为24h。
在本发明中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时，接种量按体积比接种0.5～1.5％，优选为1％vt。
在本发明中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时的去除培养温度为28～32℃，优选为30℃。
在本发明中，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮时的去除培养转速为140～160r/min。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于防治蓝藻。
在本发明中，防治蓝藻时K8发酵液的用量为2～5Kg/亩，优选投放量为3.75Kg/亩。
在本发明中，防治蓝藻时K8发酵液的投放次数为1～3次，优选为2次。
在本发明中，防治蓝藻时K8发酵液每次投放的时间间隔为0～2天，优选为1天。
本发明还提供了一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，用于饲料发酵。
本发明还提供了一种复合发酵剂，所述复合发酵剂中包括枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX。
在本发明中，所述枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX的体积比为1：1.5～2.5：4～6，优选为1：2：5。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的分离筛选及纯化
取南美白对虾养殖池底质活性污泥，将污泥用无菌水以1：4的比例稀释，80℃水浴处理15min后，在平板上划线，将不同的单菌落进一步继代培养，继代5次后得到纯化的K8菌株。
实施例2一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的形态学观察以及16s rRNA的序列鉴定
将纯化的K8菌株进行形态观察、革兰氏染色观察，得到K8菌株的形态学特点。
提取K8菌株的DNA，进行PCR扩增，扩增产物纯化后进行测序，所得序列进行Blast分析，并采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining软件构建系统发育树。系统发育树结果见图1。
结果显示：K8菌株为单细胞，杆状，细胞直径(0.7～0.8)×(3～4)μm，革兰氏染色阳性，芽胞中生，菌落表面粗糙不透明，微黄色，好氧。
K8菌株的16s rRNA序列的长度为1480bp，在NCBI数据库Blast分析表明，K8与Bacillus subtilis的相似性为100％。从图1可知，K8与Bacillus subtilis NR_112116.2处在同一分支中。
实施例3一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的生理生化指标
通过3，5-二硝基水杨酸法测定K8菌株的淀粉酶活力。
通过偶氮酪蛋白法测定K8菌株的蛋白酶活力。
将K8菌株接种到pH3.0和4.0的LB培养基上，37℃振荡培养24h，检测K8菌株的OD值。
将K8菌株在0.30％的胆盐浓度下37℃处理20h，检测K8菌株的存活率。
将K8菌株在模拟胃液中37℃培养240min，检测K8菌株的存活率。
结果显示，K8菌株的淀粉酶活力为156.3U/mL，蛋白酶活力为200.8U/mL。K8菌株在pH3.0和4.0培养基上培养后，得到的菌株的OD值分别为0.67和1.30。K8菌株在0.30％的胆盐浓度下处理后存活率达到40.8％，在模拟胃液中处理后，存活率达92.3％。
应用实施例1一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8在去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮方面的应用
无菌条件下挑枯取草芽胞杆菌K8单菌落到灭菌LB细菌培养基中，培养24h，得到K8菌株的发酵液。取菌液5mL离心，弃上清，沉淀用无菌水冲洗2次，离心。将枯草芽胞杆菌K8按1％vt的接种量分别将沉淀接种至含100mL模拟污水的三角瓶中。模拟污水分别以100mg/L氨氮为单一氮源；或以100mg/L硝态氮为单一氮源；或以25mg/L亚硝态氮为单一氮源；或以50mg/L氨氮和12.5mg/L亚硝态氮为混合氮源。将三角瓶置于30℃摇床，150r/min振荡处理，24h分别取样检测水体中氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量。结果见图2、图3、图4、图5。
结果显示：从图2可知，K8菌株能将100mg/L的氨氮降至26.3mg/L，降解率达到73.7％，且只产生1.3mg/L的硝态氮，不产生亚硝态氮。这也进一步说明K8菌株能同步进行硝化反硝化反应，将氨氮转化为气态氮，彻底从水体中去除。
从图3可知，K8菌株能将100mg/L的硝态氮降至48.3mg/L，降解率达到51.7％，且只产生4.3mg/L的氨氮，不产生亚硝态氮，说明K8菌株能将硝态氮转化为气态氮，彻底从水体中去除。
从图4可知，K8菌株能将25mg/L的亚硝态氮彻底降解，且只产生2.5mg/L的氨氮，不产生硝态氮，说明K8菌株能将亚硝态氮转化为气态氮，彻底从水体中去除。
从图5可知，以氨氮和亚硝态氮为混合氮源时，K8菌株对水体中氨氮和亚硝态氮去除率分别达到89.1％和100％，无硝酸盐积累。这也说明K8菌株进行了同步硝化反硝化作用将氨氮和亚硝态氮转化成了气态氮。
应用实施例2一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8在防治蓝藻方面的应用
田间实验：本实验在天津市静海区一养殖户的80亩鱼塘爆发蓝藻时进行的。下风口已经形成油漆状蓝藻水华，并出现死鱼现象，经检测为铜绿微囊藻。8月13日在下风口集中投入K8的发酵液150kg，8月15日全池泼洒再次投入K8发酵液150kg。8月18日取样检测，蓝藻消失。检测完后，投入小球藻275kg，21日水色恢复正常。
室内实验：8月13日投菌前取下风口蓝藻水带回实验室，经检测蓝藻含量达到亿级每毫升。在2000mL的三角瓶中装蓝藻水1000mL，处理中加入K8菌液100mL，对照不加菌液，置于窗台上，自然光照。5天后观察发现加入K8菌液的蓝藻水由原来的蓝绿色变成土黄色，镜检发现细胞全部死亡，而对照无明显变化，在水体表面呈蓝绿色。
应用实施例3一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8在饲料发酵方面的应用
将枯草芽胞杆菌K8、希氏乳杆菌RX、热带假丝酵母分别接种至LB、MRS、YPD发酵培养基中，枯草芽胞杆菌35℃培养24h，希氏乳杆菌30℃培养24h，热带假丝酵母25℃培养48h(培养条件)，各自制成发酵液用于复合发酵饲料。
小型发酵：将5mLK8与8mL热带假丝酵母、30mL希氏乳杆菌RX加入到118mL水中，混合均匀加入到500g待发酵料中，搅拌均匀装入呼吸袋中，呼吸袋热耦合封口，30℃发酵48h，得到发酵料。得到的发酵料较发酵前的总酚、总蛋白及氨基酸的含量分别提高了6.20％、4.91％、6.15％，枯草芽胞杆菌、热带假丝酵母菌和希氏乳杆菌的有效活菌浓度分别达到1.6×106CFU/mL、2.5×108CFU/mL、2.0×109CFU/mL，说明有益菌发酵不仅增加了有益菌含量，还提高了饲料的营养成分。
规模发酵：将10L枯草芽胞杆菌K8与20L热带假丝酵母、50L希氏乳杆菌加入到240L水中，混合均匀加入到1000kg待发酵料中，搅拌均匀后分装到25kg呼吸袋中，呼吸袋热耦合封口，28℃发酵5d，得到发酵料。发酵饲料由暗褐色变成黄褐色，散发出酸香味。经检测枯草芽胞杆菌、热带假丝酵母菌和希氏乳杆菌的有效活菌浓度分别达到2.0×106CFU/mL、4.2×108CFU/mL、3.3×109CFU/mL。投喂后具有明显的诱食效果。
由以上实施例可知，本发明提供的枯草芽胞杆菌K8具有同步硝化反硝化能力，脱氮速度快，24h能将100mg/L的氨氮去除73.7％；脱氮效率高，通过同步硝化反硝化作转化成气态氮。同时具有防治蓝藻的效果，室内试验和田间试验均证明，该菌能杀灭铜绿微囊藻，防治蓝藻爆发。本发明的枯草芽胞杆菌K8与希氏乳杆菌、热带假丝酵母复合用于发酵饲料，活菌含量高，提高饲料的利用率和营养成分的含量。本发明的枯草芽胞杆菌K8的淀粉酶和蛋白酶的酶活值高；耐酸，在pH3.0和4.0的培养基上的OD值分别达到0.67和1.36；耐胆盐，在0.3％的胆盐中的存活率达到40.8％，在模拟胃液中的存活率达92.3％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8，其特征在于，所述枯草芽胞杆菌分类为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年4月10日，保藏编号为CGMCC No.19558。
2.一种权利要求1所述的一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，其特征在于，用于去除水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮。
3.一种权利要求1所述的一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，其特征在于，用于防治蓝藻。
4.一种权利要求1所述的一株同步硝化反硝化枯草芽胞杆菌K8的应用，其特征在于，用于饲料发酵。
5.一种复合发酵剂，其特征在于，所述复合发酵剂中包括枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX。
6.根据权利要求5所述的复合发酵剂，其特征在于，所述枯草芽胞杆菌K8、热带假丝酵母和希氏乳杆菌RX的体积比为1:1.5～2.5:4～6。
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