CN110564642A - 一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌及其应用。其技术方案是：本发明提供的一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌Y5属于海杆菌(Marinobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年8月22日，保藏编号为CCTCC NO:M 2019657。海杆菌(Marinobacter sp.)Y5为革兰氏阴性菌，该菌菌落呈圆形，乳白色，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。该菌在高盐环境中具有良好的异养硝化好氧反硝化能力，对盐浓度为10wt％、初始氨氮浓度为200mg/L培养基中的氨氮45h降解率高达99％，盐浓度升至15wt％时该菌仍然生长良好，且具有良好的脱氮能力。该菌可用于医药、炼油、印染、焦化、食品加工和制革等含盐有机工业废水的生物脱氮处理，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌技术领域。具体涉及一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌及其应用。
背景技术
为控制水体富营养化，必须脱除废水中的氨氮和总氮。目前废水脱氮主要采用传统生物脱氮工艺，即在好氧条件下，通过硝化菌将废水中的氨氮氧化为硝态氮，随后在缺氧环境通过反硝化菌将硝态氮还原为氮气。但由于硝化菌为好氧菌、反硝化菌为兼性厌氧菌，硝化和反硝化过程需要分别在好氧和缺氧的环境条件下进行，反应器必须分开。现有的生物脱氮法工艺流程长、基建投资高。
近年来，国内外研究者陆续发现了一些新型脱氮菌，即异养硝化好氧反硝化菌，这些菌能利用有机碳源，在好氧硝化的同时，还可以同时进行好氧反硝化，脱氮只需一个好氧反应器。已经分离纯化得到的新型脱氮菌包括泛养硫球菌属(Thiosphaera pantotropha)、产碱杆菌属(Alcaligenes.sp)、不动杆菌属(Acinetobacter.sp)和假单胞菌属(Pseudomonas.sp)等。利用异养硝化好氧反硝化菌脱氮只需一个好氧反应器，其突出优点是脱氮流程短，基建投资低。
但目前分离得到的这些脱氮菌主要来自淡水环境，对于医药、炼油、印染、焦化、食品加工、制革等行业的含盐含氮有机废水，难以进行有效脱氮。因为当废水中盐含量过高时，通常会造成脱氮微生物细胞脱水而引起细胞原生质分离，从而抑制脱氮菌的生长和活性，破坏脱氮菌的代谢功能并降低其脱氮能力。“一株耐盐脱氮除磷高地芽孢杆菌其在水处理中的应用”(CN102703350B)，公开了一株耐盐脱氮除磷高地芽孢杆菌应用于含盐废水的方法，该菌株在氨氮起始浓度为40mg/L，盐含量为3％时氨氮去除效果最好，48h达91.18％，但随着盐含量的增加，脱氨氮性能迅速下降，盐含量为10％时，氨氮去除率仅为78％，当盐含量为13％时，氨氮去除率更是下降至9.08％；“一株耐盐好氧反硝化菌及应用”(CN109486699A)，公开了一株分离自制革废水的耐盐假单胞菌Pseudomonas sp.DN-23，该菌株能在氯化钠3～6％的培养基中发生好氧反硝化，好氧反硝化性能良好。显然，上述菌株对高盐的耐受性较差，在高盐环境下的脱氮性能受限。
发明内容
本发明旨在于克服现有的技术缺陷，目的是提供一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌，该菌用于含盐有机废水的生物脱氮，脱氮效果好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌，来源于咸宁惠生制药有限公司废水生物处理装置的活性污泥。分别以氨氮和硝酸盐氮为氮源，以丁二酸钠为碳源和能源进行生长繁殖，利用异养硝化培养基和好氧反硝化培养基进行富集培养，在培养过程中，逐渐提高盐浓度进行梯度驯化，并通过平板划线分离纯化得到。
所述耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌为海杆菌(Marinobacter sp.)，编号为Y5，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019657，保藏日期为2019年8月22日。海杆菌(Marinobacter sp.)Y5为一株革兰氏阴性菌，该菌菌落呈圆形，乳白色，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。海杆菌(Marinobacter sp.)Y5具有同时硝化和反硝化能力，能在盐含量为15wt％的培养基中进行生长繁殖。生理生化试验表明，接触酶试验、糖酵解试验、硝酸盐还原试验和柠檬酸盐试验均为阳性；甲基红试验、V-P试验、淀粉水解试验、吲哚试验、明胶液化试验和产硫化氢试验均为阴性。
所述海杆菌(Marinobacter sp.)Y5用于含盐有机废水的生物脱氮。所述含盐有机废水为于医药废水、炼油废水、印染废水、焦化废水、食品加工废水和制革废水中的一种。
由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下积极效果：
本发明的海杆菌(Marinobacter sp.)Y5能在盐含量为15wt％的条件下进行异养硝化和好氧反硝化脱氮，在72h内能将初始氮源浓度为200mg/L的氨氮或硝酸盐氮去除90％以上。该菌可用于医药废水、炼油废水、印染废水、焦化废水、食品加工废水和制革废水的含盐有机工业废水的生物脱氮处理，应用前景广阔。
因此，本发明提供的耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌为海杆菌(Marinobactersp.)Y5，对含盐有机废水的生物脱氮具有显著效果。
附图说明
图1为本发明的菌株Y5的生长与脱氮特性关系图；
图2为初始pH值对本发明的菌株Y5的异养硝化性能影响图；
图3为初始pH值对本发明的菌株Y5的好氧反硝化性能影响图；
图4为培养温度对本发明的菌株Y5的异养硝化性能影响图；
图5为培养温度对本发明的菌株Y5的好氧反硝化性能影响图；
图6为摇床转速对本发明的菌株Y5的异养硝化性能影响图；
图7为摇床转速对本发明的菌株Y5的好氧反硝化性能影响图；
图8为盐浓度对本发明的菌株Y5的异养硝化性能影响图；
图9为盐浓度对本发明的菌株Y5的好氧反硝化性能影响图；
图10为本发明的菌株Y5对医药废水中氨氮的去除效果图；
图11为本发明的菌株Y5对炼油废水中氨氮的去除效果图；
图12为本发明的菌株Y5对印染废水中氨氮的去除效果图；
图13为本发明的菌株Y5对焦化废水中氨氮的去除效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限制。
实施例1
海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的分离、鉴定及其脱氮特性
1、菌株的分离、纯化
(1)菌种来源
菌源取自咸宁惠生制药有限公司废水生物处理装置的活性污泥。
(2)菌株的分离纯化
将采集的活性污泥混合液混匀，取2mL接种于l00mL已灭菌的LB培养基(蛋白胨为1wt％，氯化钠为1wt％，酵母提取物为0.5wt％)中，置于30℃、150r/min的恒温摇床富集培养15h。取5mL富集菌液转接至含200mg/L氨氮的异养硝化培养基中，于30℃、150r/min的恒温摇床中培养，待培养基由澄清变浑浊后，取5mL菌液转接至含200mg/L硝酸盐氮的好氧反硝化培养基中，依次交替进行硝化性能和反硝化性能驯化，并逐步增加培养基中盐含量(以NaCl质量计)，分别为：1％、3％、5％、7％、9％、12％、15％，逐步提高菌液对盐的耐受性。驯化后，将菌液进行梯度稀释(10-1～10-8)，涂布于异养硝化固体平板上，置于30℃恒温培养箱中培养2天，挑取单菌落，平板划线2～3次，得到纯化后的单菌落，测定每个菌株在15wt％盐浓度下的硝化性能和反硝化性能，挑选综合性能最优的菌株Y5斜面保种，并将其保藏于中国典型微生物保藏中心(武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019657。
其中，异养硝化培养基成分是：C4H4Na2O4·6H2O为15.0g，Na2HPO4·12H2O为8.0g，KH2PO4为1.5g，(NH4)2SO4为1.0g，MgSO4·7H2O为0.1g，FeSO4·7H2O为0.01g，微量元素储备液为2mL，补足蒸馏水至1000mL，pH为7.0～7.5；好氧反硝化培养基成分是：C4H4Na2O4·6H2O为15.0g，Na2HPO4·12H2O为8.0g，KH2PO4为1.5g，KNO3为1.5g，MgSO4·7H2O为0.1g，FeSO4·7H2O为0.01g，微量元素储备液为2mL，补足蒸馏水至1000mL，pH为7.0～7.5；所述微量元素储备液的组成为：MnSO4·4H2O为0.10g/L，ZnSO4·7H2O为0.12g/L，H3BO3为0.07g/L，Na2MoO4·2H2O为0.04g/L，CuSO4·5H2O为0.02g/L，CoCl2·6H2O为0.04g/L；在上述培养基中分别添加一定质量浓度的NaCl，依次提高其盐含量(NaCl含量)进行梯度驯化。
2、菌株的鉴定
(1)菌株Y5的形态学特征及生理生化特性
菌株Y5菌落呈圆形，乳白色，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。经革兰氏染色后，能够清楚地看到菌株为短杆状，呈红色，为革兰氏阴性菌。生理生化试验结果表明，接触酶试验、糖酵解试验、硝酸盐还原试验和柠檬酸盐试验为阳性；甲基红试验、V-P试验、淀粉水解试验、吲哚试验、明胶液化试验和产硫化氢试验为阴性。
(2)菌株Y5的16S rDNA鉴定
用DNA提取试剂盒提取菌株Y5的基因组DNA，然后进行16S rDNA基因克隆、测序，其16S rDNA序列见序列表，并在GenBank中进行Blast比对。结果显示，与其序列相似度达到99％的均为海杆菌属(Marinobacter sp.)，结合菌株Y5的生理生化特性，将其归属于海杆菌属(Marinobacter sp.)。
3、海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的生长及其脱氮特性
(1)菌悬液的制备
用接种环从试管斜面挑取一环菌株Y5接种于LB培养基中，30℃、150r/min培养24h，取2mL转接于新配制的LB培养基，30℃培养12h(细菌处于对数生长期)，取菌液于4000r/min条件下离心5min，收集菌体，再用已灭菌的异养硝化培养基洗涤2次，然后采用异养硝化培养基重悬菌体，调节细胞密度至OD600≈1，4℃保存备用。
(2)海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的生长与脱氮特性将菌株Y5接种于10wt％盐浓度、200mg/L初始氨氮浓度的异养硝化培养基中，于30℃、150r/min和初始pH＝7.2条件下培养，测定细菌的菌密度(OD600)和氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮的含量。结果如图1所示：在0～6h菌株Y5生长缓慢，处于延滞期，氨氮和总氮降解比较缓慢；6～33h菌株Y5进入对数生长期，氨氮快速降解，菌密度相应地快速升高，氨氮的降解与菌株Y5的增长趋势一致；33～39h菌株Y5生长进入稳定期，氨氮继续降低，但OD600值基本保持不变，39h后，OD600值开始下降，菌株进入衰亡期。整个过程中，硝酸盐氮从第9h开始出现积累，并在24～27h积累量达到最大，硝酸盐氮浓度此后逐渐降低，但没有检测到亚硝酸盐氮的积累，亚硝酸盐氮最大浓度也只有0.10mg/L，结果表明菌株Y5具有良好的同时硝化和反硝化性能。
实施例2
环境条件对海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的硝化和反硝化性能影响
1、初始pH值的影响
在氨氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、摇床转速为150r/min、培养温度30℃、盐浓度为10wt％的条件下，不同培养基初始pH值对菌株Y5的异养硝化性能的影响如图2所示。图2表明，菌株Y5当初始pH≤7时，氨氮降解速率慢，去除性能较差；当pH升高至8.0～9.0时，氨氮去除率明显提高，碱性环境有利于硝化进行。异养硝化性能对应的初始pH顺序为：pH＝8≈pH＝9＞pH＝7＞pH＝6＞pH＝5。
在硝酸盐氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、摇床转速为150r/min、培养温度为30℃、盐浓度为10wt％的条件下，不同培养基初始pH对菌株Y5的好氧反硝化性能的影响如图3所示。图3表明，菌株Y5反硝化的适宜pH为弱酸性及中性，在弱碱性环境的降解性能反而有所下降。好氧反硝化性能对应的初始pH顺序为：pH＝6≈pH＝7＞pH＝5＞pH＝8≈pH＝9。
2、培养温度的影响
在氨氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、pH为7.0、摇床转速为150r/min、盐浓度为10wt％的条件下，不同培养温度对菌株Y5的异养硝化性能的影响如图4所示。图4表明，菌株Y5的异养硝化性能随着温度的升高先提高而后降低，25℃时氨氮降解速率最慢，30℃和35℃时氨氮的降解速率相近，而当温度升高到40℃时，氨氮降解效果反而下降。异养硝化性能对应的培养温度顺序为：30℃≈35℃＞40℃＞25℃。在硝酸盐氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、pH为7.0、摇床转速为150r/min、盐浓度为10wt％的条件下，不同培养温度对菌株Y5的好氧反硝化性能影响如图5所示。图5表明，在温度25～40℃范围内，随着温度的升高，菌株Y5的好氧反硝化性能也是先提高而后降低，当温度为30℃时，菌株Y5的好氧反硝化性能最好。好氧反硝化性能对应的培养温度顺序为：30℃＞35℃＞40℃≈25℃。
3、摇床转速的影响
在氨氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、pH为7.0、培养温度30℃、盐浓度为10wt％的条件下，不同摇床转速对菌株Y5的异养硝化性能的影响如图6所示。图6表明，当摇床转速为150～200rpm时，菌株Y5的脱氮效果最好，72h氨氮去除率达90％以上；当摇床转速为100rpm时，72h氨氮去除率为80％左右；而当摇床转速增大到250rpm时，72h氨氮去除率为86％。异养硝化性能对应的摇床转速顺序为：150rpm≈200rpm＞250rpm＞100rpm。
在硝酸盐氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、pH为7.0、培养温度30℃、盐浓度为10wt％的条件下，不同摇床转速对菌株Y5的好氧反硝化性能影响如图7所示。图7表明，当摇床转速为150rpm和200rpm时，菌株Y5的好氧反硝化性能最好，72h硝酸盐氮的去除率分别为93％和91％，明显优于摇床转速分别为100rpm和250rpm时的好氧反硝化性能。好氧反硝化性能对应的摇床转速顺序为：150rpm≈200rpm＞250rpm≈100rpm。
4、盐浓度的影响
在氨氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、pH为7.0、摇床转速为150r/min、培养温度为30℃的条件下，不同盐浓度对菌株Y5的异养硝化性能的影响如图8所示。图8表明，在盐浓度为5％和10％时，菌株Y5的异养硝化性能差别不大，48h内能将200mg/L的氨氮降解完全，而当盐浓度增加到15％时，在培养前24h内，氨氮降解比较缓慢，当菌株Y5适应15％盐浓度环境后，氨氮开始快速降解，在培养72h后，氨氮去除率达到94％。异养硝化性能对应的盐浓度顺序为：5％≈10％＞15％。
在硝酸盐氮浓度为200mg/L、丁二酸钠为碳源、pH为7.0、摇床转速为150r/min、培养温度为30℃条件下，不同盐浓度对菌株Y5的好氧反硝化性能的影响如图9所示。图9表明，在盐浓度≤10wt％的条件下，菌株Y5能很好地进行好氧反硝化脱氮，而当盐浓度增加到15wt％后，在培养前24h内，硝酸盐氮降解比较缓慢，随后开始快速降解，在培养72h后，硝酸盐氮去除率达到90％以上。好氧反硝化性能对应的盐浓度顺序为：5％≈10％＞15％。
实施例3
海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对医药废水中氨氮的降解
将海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的菌悬液以5vol％的接种量投加至医药废水中，pH调至7，并额外添加10wt％NaCl，设置2组实验考察海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对医药废水中氨氮的去除效果：
(a)于250mL锥形瓶中加入45mL医药废水、45mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL Y5菌悬液、5mL活性污泥。
(b)于250mL锥形瓶中加入45mL医药废水、50mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL活性污泥。
置于30℃、150r/min的恒温摇床培养，定期取样测定培养液中氨氮浓度。如图10所示，单独添加活性污泥对含盐医药废水中的氨氮降解缓慢，投加菌株Y5则显著提高了活性污泥对含盐医药废水中氨氮的降解能力，在培养48h内，对含盐医药废水中氨氮去除率达85％，生物脱氮效果明显。
实施例4
海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对炼油废水中氨氮的降解
将海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的菌悬液以5vol％的接种量投加至炼油废水中，pH调至7，并额外添加10wt％NaCl，设置2组实验考察菌株Y5对含盐炼油废水中氨氮的去除效果：
(a)于250mL锥形瓶中加入45mL炼油废水、45mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL菌悬液、5mL活性污泥。
(b)于250mL锥形瓶中加入45mL炼油废水、50mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL活性污泥。
置于30℃、150r/min的恒温摇床培养，定期取样测定培养液中氨氮浓度。如图11所示，菌株Y5能很好的与活性污泥中其他微生物共存，显著提高了活性污泥对含盐炼油废水中氨氮的降解能力，在培养42h内对含盐炼油废水中氨氮去除率达92％以上，生物脱氮效果显著。
实施例5
海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对印染废水中氨氮的降解
将海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的菌悬液以5vol％的接种量投加至印染废水中，pH调至7，并额外添加10wt％NaCl，设置2组实验考察海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对含盐印染废水中氨氮的去除效果：
(a)于250mL锥形瓶中加入45mL印染废水、45mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL菌悬液、5mL活性污泥。
(b)于250mL锥形瓶中加入45mL印染废水、50mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL活性污泥。
置于30℃、150r/min的恒温摇床培养，定期取样测定培养液中氨氮浓度。如图12所示，海杆菌(Marinobacter sp.)Y5能较好地适应含盐印染废水环境，与活性污泥中其他微生物共存，提高活性污泥对含盐印染废水中氨氮的降解能力，在培养50h内对含盐印染废水中氨氮去除率达88％左右，生物脱氮效果明显。
实施例6
海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对焦化废水中氨氮的降解
将海杆菌(Marinobacter sp.)Y5的菌悬液以5vol％的接种量投加至焦化废水中，pH调至7，并额外添加10wt％NaCl，设置2组实验考察海杆菌(Marinobacter sp.)Y5对含盐焦化废水中氨氮的去除效果：
(a)于250mL锥形瓶中加入45mL焦化废水、45mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL菌悬液、5mL活性污泥。
(b)于250mL锥形瓶中加入45mL焦化废水、50mL异养硝化培养基、10g NaCl、5mL活性污泥。
置于30℃、150r/min的恒温摇床培养，定期取样测定培养液中氨氮浓度。如图13所示，菌株Y5能较好的与活性污泥中其他微生物共存，提高活性污泥对含盐焦化废水中氨氮的降解能力，在培养45h内对含盐焦化废水中氨氮去除率达90％左右，生物脱氮效果显著。
上述具体实施方式为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的构思与技术方案下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> 一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌及其应用
<141> 2019-09-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> Marinobacter sp. Y5
<400> 1
gcttaccatg cagtcgagcg gtaacagggg gtgcttgcac cccgctgacg agcggcggac 60
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cagaagtagt tagtctaacc ttcgggagga cga 1413
Claims (3)
1.一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌，其特征在于所述耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌为海杆菌属(Marinobacter sp.)，编号为Y5，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019657，保藏日期为2019年8月22日；海杆菌(Marinobacter sp.)Y5为一株革兰氏阴性菌，该菌菌落呈圆形，乳白色，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。
2.如权利要求1所述耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌的应用，其特征在于所述海杆菌(Marinobacter sp.)Y5用于含盐有机废水的生物脱氮。
3.如权利要求2所述耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌的应用，其特征在于所述含盐有机废水为医药废水、炼油废水、印染废水、焦化废水、食品加工废水和制革废水中的一种。
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| CN116555069A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-08-08 | 华北电力大学 | 一株具有耐盐好氧反硝化特性的柴油食烷菌 |
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