CN113186114B - 一株异养硝化-好氧反硝化嗜盐菌及其在环境保护中的应用 - Google Patents

一株异养硝化-好氧反硝化嗜盐菌及其在环境保护中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域。菌株于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21200。墨西哥微小杆菌SND‑01是一株异养硝化‑好氧反硝化嗜盐菌株，在温度20‑40℃、盐度10‑100g/L、C/N＝4‑20、溶解氧3‑5mg/L下，利用有机碳源将水中的无机氮转化成氮气，实现含盐废水的同步硝化反硝化脱氮。将本发明提供的菌株接种到含盐废水中，对氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为93％、100％和100％；同步去除氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮时，氮去除率达到100％。该菌株可以应用在水体修复、河道治理、污水处理等环境保护领域。

Description

一株异养硝化-好氧反硝化嗜盐菌及其在环境保护中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别是涉及异养硝化-好氧反硝化嗜盐菌株SND-01在环境保护中的应用。
背景技术
微生物遍布于地球的每个角落，其个体微小，与人类生活关系密切。通过筛选具有特定功能的菌株以实现其在食品、医药、工业、农业、环保、体育等领域的应用。在环保领域中，由于微生物具有获取成本低、处理效果好、条件控制简单等特点被广泛应用于污染治理。基于微生物技术研发新的处理工艺已经成为工艺研发的热点。生物法具有效率高、成本低、对环境副作用小等特点，被广泛应用于废水的处理与治理中。
传统生物脱氮方法中硝化细菌和反硝化细菌对氧的需求量不同，因此脱氮反应分为两个独立的过程。近年来，异养硝化-好氧反硝化菌株的发现使得同步硝化反硝化成为可能。同步硝化反硝化是异养硝化-好氧反硝化菌在好氧条件下同时进行硝化和反硝化，这使得生物脱氮可以在同一个反应器内同步进行，从而减少反应器数量，简化脱氮过程，降低运行成本。同时，相较于传统的自养型细菌，异养硝化-好氧反硝化菌具有生长周期更短、对环境适应性更强等特点，缩短了氮去除的时间，进一步提高脱氮效率。目前发现和分离的具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌株较少，而且多数都是淡水微生物。发现和分离具有耐盐或嗜盐能力的异养硝化-好氧反硝化菌株将扩大微生物的应用领域，促进对微生物在自然界作用的认知。
本发明从河流入海口底泥中筛选出一株具有异养硝化-好氧反硝化功能的嗜盐菌株。好氧条件下，该菌株具有高效的异养硝化-好氧反硝化功能，可以在一定盐度范围内去除废水中的无机氮(氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮)且无明显硝酸盐氮和亚硝酸盐氮积累。
发明内容
本发明提供一株异养硝化-好氧反硝化菌墨西哥微小杆菌(Exiguobacteriummexicanum)SND-01，该菌株是嗜盐异养硝化-好氧反硝化菌。
同时提供了嗜盐异养硝化-好氧反硝化菌墨西哥微小杆菌(Exiguobacteriummexicanum)SND-01在污水处理中的应用。
本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明的菌株墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01是一株嗜盐异养硝化-好氧反硝化菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.21200，保藏日期为2020年11月18日。
菌株墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01生长于基础培养基平板上，称取碳酸氢钠2g、磷酸二氢钠0.04g、磷酸二氢钾0.03g、硫酸镁0.05g、氯化钙0.08g、氯化铵0.25g，亚硝酸钠0.16g、氯化钠20g，葡萄糖2g、微量元素1ml、琼脂50g，将上述药品溶于1L的去离子水中，121℃灭菌20min后倒入培养皿制成平板培养基。培养皿中菌落形态为橙黄色圆形菌落、边缘光滑、表面湿润、中间略微凸起，菌落直径约为2-3mm；革兰氏阳性；细胞为球状；可在盐度10-100g/L、温度20-40℃范围内生长。菌株SND-01的氮代谢途径为NH4 +-N→NH2OH-N→NO2 --N→NO→N2O→N2。
对SND-01菌株16S rDNA测序并进行比对分析，其与Exiguobacterium mexicanumstrain 8N(GenBank登录号为NR 042424.1)同源相似性最高，为95％。
一种嗜盐菌株活化的方法，包括以下步骤：取50ml粒径800-900μm的嗜盐颗粒污泥进行破碎，用无菌水将1ml破碎后的液体稀释到其10-3至10-7倍，分别涂布在向基础培养基中添加琼脂制成的平板上。将涂布后的平板置于生化培养箱中37℃培养72h。72h后从平板中挑选形态、颜色不同的单菌落通过划线法进行扩大培养。再从扩大培养的平板中挑选单菌落通过划线法培养两代，检测培养两代后菌落16S rDNA序列。经过16S rDNA测序后无杂菌序列即得到纯化的菌株。挑取纯化后的菌株接种到100ml灭菌的培养基中。培养基类型可以为基础培养基、硝化培养基、反硝化培养基Ⅰ和反硝化培养基Ⅱ中任意一种，调节摇床参数20-40℃、110-140rpm/min培养48-72h，发酵液变浑浊即得到活化菌株。
一种含盐废水脱氮的方法，包括以下步骤：将纯化后的菌株接种到100ml灭菌的培养基中。培养基可以为基础培养基、硝化培养基、反硝化培养基Ⅰ和反硝化培养基Ⅱ中的任意一种。设置摇床温度30℃，转速120rpm/min培养72h。发酵液变浑浊即得到活化的菌株。将活化后的菌株墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01接种到盐度10-100g/L的废水中，在温度20-40℃、C/N＝4-20、溶解氧3-5mg/L下处理废水。
优选地，在盐度20g/L、温度30℃、C/N＝12、溶解氧5mg/L下处理废水。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明提供的菌株墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01可有效去除含盐废水中的无机氮(氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮)。对氨氮、硝态氮和亚硝态氮的去除率分别为93％、100％和100％。该生物脱氮法属于新型生物脱氮技术领域，不仅能在同一个含盐的体系中同时去除氨氮、硝态氮和亚硝态氮，而且在氨氮去除过程中没有硝态氮和亚硝态氮的积累，在实际应用中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为基于异养硝化-好氧反硝化菌SND-01的16S rDAN构建的系统发育树。
图2为异养硝化-好氧反硝化菌SND-01以NH4 +-N为唯一氮源进行异养硝化时的生长和脱氮特性。
图3为异养硝化-好氧反硝化菌SND-01以NO2 --N为唯一氮源进行好氧反硝化时的生长和脱氮特性。
图4为异养硝化-好氧反硝化菌SND-01以NO3 --N为唯一氮源进行好氧反硝化时的生长和脱氮特性。
图5为异养硝化-好氧反硝化菌SND-01以NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N为混合氮源进行同步异养硝化-好氧反硝化时的生长和脱氮特性。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步的详细阐述，所述实施例仅用于解释本发明，并非限制本发明的范围。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例中用到的培养基如下：
基础培养基：碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钠0.04g/L、磷酸二氢钾0.03g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钙0.08g/L、氯化铵0.25g/L，亚硝酸钠0.16g/L、氯化钠20g/L，葡萄糖2g/L、微量元素1ml/L。
硝化培养基：碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钠0.04g/L、磷酸二氢钾0.03g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钙0.08g/L、氯化铵0.20g/L、氯化钠20g/L，葡萄糖2g/L、微量元素1ml/L。
反硝化培养基Ⅰ：碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钠0.04g/L、磷酸二氢钾0.03g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钙0.08g/L、亚硝酸钠0.39g/L、氯化钠20g/L，葡萄糖2g/L、微量元素1ml/L。
反硝化培养基Ⅱ：碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钠0.04g/L、磷酸二氢钾0.03g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钙0.08g/L、硝酸钠0.48g/L、氯化钠20g/L，葡萄糖2g/L、微量元素1ml/L。
混合氮源培养基：碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钠0.04g/L、磷酸二氢钾0.03g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钙0.08g/L、氯化铵0.11g/L、亚硝酸钠0.13g/L、硝酸钠0.16g/L、氯化钠20g/L，葡萄糖2g/L、微量元素1ml/L。
微量元素：硫酸锌1g/L、氯化锰0.3g/L、硼酸3g/L、氯化钴2g/L、氯化铜0.1g/L、氯化镍0.2g/L、钼酸钠0.3g/L。
实施例1
嗜盐异养硝化-好氧反硝化菌墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01的生理生态特征与活化方法。
1.菌株的分离纯化：河流入海口底泥经驯化后形成嗜盐颗粒污泥。取50ml粒径800-90μm的嗜盐颗粒污泥置于100ml烧杯中，加入转子后放在磁力搅拌器上，调节转速500rpm/min对颗粒污泥破碎2h。用无菌水将1ml破碎后的液体稀释到其10-3至10-7倍，分别涂布在向基础培养基中添加琼脂制成的平板上。将涂布后的平板置于生化培养箱中37℃培养72h。72h后从平板中挑选形态、颜色不同的单菌落通过划线法进行扩大培养。再从扩大培养的平板中挑选单菌落通过划线法培养两代，检测培养两代后菌落16S rDNA序列。经过16SrDNA测序后无杂菌序列即得到纯化的菌株。
2.菌株的筛选及功能测试：从纯化后的平板上用200μl移液枪头挑取单菌落分别接种到灭菌的100ml硝化培养基、灭菌的100ml反硝化培养基Ⅰ和灭菌的100ml反硝化培养基Ⅱ中。设置摇床温度30℃，转速120rpm/min培养72h。每种培养基设置三个平行实验和一个空白实验。分别测试0h和72h培养基中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N的浓度，根据NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N浓度的变化挑选出具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌株。
3.经纯化和功能测试后得到一株具有异养硝化-好氧反硝化功能的嗜盐菌株SND-01。该菌株在平板培养基中的形态为：橙黄色圆形菌落、边缘光滑、表面湿润、中间略微凸起，直径约为2-3mm。革兰氏阳性。SEM扫描发现SND-01菌体为球状，大小为3μm×4μm。可以利用的碳源为葡萄糖，可以利用的氮源为氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮。氮代谢途径为：NH4 +-N→NH2OH-N→NO2 --N→NO→N2O→N2。菌株SND-01的16S rDNA测序委托中美泰和生物技术(北京)有限公司进行。将该序列输入GenBank中进行blast比对，使用MEGA-X绘制发育树。结果表明该菌与Exiguobacterium mexicanum strain 8N(GenBank登录号为NR 042424.1)的16S rDNA序列相似度较高，为95％(见图1)。菌株SND-01保藏号为CGMCC No.21200，保藏日期为2020年11月18日。
4.用200μl移液枪头挑取纯化后的单菌落接种到100ml灭菌的培养基中。培养基类型可以为：基础培养基、硝化培养基、反硝化培养基Ⅰ和反硝化培养基Ⅱ中任意一种。设置摇床温度30℃，转速120rpm/min培养72h。发酵液变浑浊即得到活化的菌株。
实施例2
实施例1所述菌株SND-01在硝化培养基中的生长和脱氮特性。
用200μl移液枪头从平板上挑取纯化后的单菌落接种于灭菌的100ml硝化培养基中。调节摇床参数30℃、120rpm/min培养72h。扩大培养后，在无菌环境中收集菌体，离心后倾去上清液，用无菌水冲洗菌体三次并调节OD600为0.2。将重新悬浮的菌液以1％(v/v)的接种量接分别种至三个含有1L硝化培养基的发酵罐中发酵。发酵液置于30℃恒温水浴锅中，调节溶解氧5mg/L。在第0h,15h,21h,27h,39h,45h,51h,63h,69h分别从三个发酵罐中取样，测定NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N的浓度和OD600。
结果见图2所示。菌株接种到1L的硝化培养基后迅速进入对数期，在第39h进入短暂的稳定期并迅速衰亡。菌株在生长的同时分解NH4 +-N，最大NH4 +-N去除速率为2.24mg/(L-1·h-1)。在第51h，NH4 +-N的去除率达到最大为93％。NH4 +-N降解过程中没有出现明显的NO2 --N和NO3 --N积累。随着菌株衰亡，部分胞内氮溶出导致氨氮浓度在第51h开始上升。
实施例3
实施例1所述菌株SND-01在反硝化培养基Ⅰ中的生长和脱氮特性。
用200μl移液枪头从平板上挑取纯化后的单菌落接种于灭菌的100ml反硝化培养基Ⅰ中。调节摇床参数30℃、120rpm/min培养72h。扩大培养后，在无菌环境中收集菌体，离心后倾去上清液，用无菌水冲洗菌体三次并调节OD600为0.2。将重新悬浮的菌液以1％(v/v)的接种量接分别种至三个含有1L反硝化培养基Ⅰ的发酵罐中发酵。发酵液置于30℃恒温水浴锅中，调节溶解氧5mg/L。在第0h,15h,21h,27h,39h,45h,51h,63h,69h分别从三个发酵罐中取样，测定NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N的浓度和OD600。
结果见图3所示。菌株接种到1L反硝化培养基Ⅰ后经历了较长的停滞期，从第21h开始生长。前45h，NO2 --N降解较慢，平均降解速率为0.82mg/(L-1·h-1)。随着菌株生长，生物量不断提高，NO2 --N降解速率增大，最大NO2 --N降解速率为2.30mg/(L-1·h-1)。经69h发酵，NO2 --N去除率达到100％。NO2 --N降解的前27h出现少量NO3 --N积累随后消失的现象，且反应过程中伴随着少量的NH4 +-N积累。
实施例4
实施例1所述菌株SND-01在反硝化培养基Ⅱ中的生长和脱氮特性。
用200μl移液枪头从平板上挑取纯化后的单菌落接种于灭菌的100ml反硝化培养基Ⅱ中。调节摇床参数30℃、120rpm/min培养72h。扩大培养后，在无菌环境中收集菌体，离心后倾去上清液，用无菌水冲洗菌体三次并调节OD600为0.2。将重新悬浮的菌液以1％(v/v)的接种量接分别种至三个含有1L反硝化培养基Ⅱ的发酵罐中发酵。发酵液置于30℃恒温水浴锅中，调节溶解氧5mg/L。在第0h,15h,21h,27h,39h,45h,51h,63h,69h分别从三个发酵罐中取样，测定NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N的浓度和OD600。
结果见图4所示。菌株经过15h停滞期后开始生长，经过54h的生长逐渐进入稳定期。第51h，NO3 --N被完全降解，去除率达到100％。反应过程中，NO3 --N平均去除速率为1.27mg/(L-1·h-1)，最大去除速率为3.63mg/(L-1·h-1)。在NO3 --N降解过程中出现了少量NH4 +-N和NO3 --N积累并消失的现象。
实施例5
实施例1所述菌株SND-01在添加混合氮源的含盐废水中生长和脱氮的应用。
用200μl移液枪头从平板上挑取纯化后的单菌落接种于灭菌的100ml混合氮源培养基中。调节摇床参数30℃、120rpm/min培养72h。扩大培养后，在无菌环境中收集菌体，离心后倾去上清液，用无菌水冲洗菌体三次并调节OD600为0.2。将重新悬浮的菌液以1％(v/v)的接种量分别接种至三个含有1L混合氮源培养基的发酵罐中发酵。发酵液置于30°0恒温水浴锅中，调节溶解氧5mg/L。在第0h,15h,21h,27h,39h,45h,51h,63h,69h分别从三个发酵罐中取样，测定NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N的浓度和OD600。
结果见图5所示。菌株接种后迅速开始生长，第51h达到最大OD600，为0.84，随后菌株逐渐衰亡。菌株优先利用的氮源为NH4 +-N。当76.7％的NH4 +-N被利用后，NO2 --N和NO3 --N开始被快速分解。相对于NO2 --N，菌株对NO3 --N的利用速率稍快。接种63h后，菌株对NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N的去除率均达到99％以上。虽然菌株对氮源的利用顺序不同，但是当反应时间充足时仍然可以有效地去除含盐废水中的无机氮。

Claims (6)

1.一株墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21200，保藏日期为2020年11月18日。
2.根据权利要求1所述墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01，其特征在于，利用的碳源为葡萄糖；利用的氮源为氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮；氮代谢途径为：NH4+-N→NH2OH-N→NO2--N→NO→N2O→N2。
3.根据权利要求1所述的墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)SND-01在含盐废水生物脱氮中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，将墨西哥微小杆菌(Exiguobacteriummexicanum)SND-01接种到盐度为10-100g/L的废水中，控制温度20-40℃、C/N＝4-20、溶解氧3-5mg/L下处理废水。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述墨西哥微小杆菌(Exiguobacteriummexicanum)SND-01在盐度20g/L、温度30℃、C/N＝12、溶解氧5mg/L下进行异养硝化和好氧反硝化。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述墨西哥微小杆菌(Exiguobacteriummexicanum)SND-01在盐度20g/L、温度30℃、C/N＝12、溶解氧5mg/L下在同一个好氧反应器中同步去除废水中的氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮。
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CN110564642A (zh) * 2019-09-16 2019-12-13 武汉科技大学 一株耐盐异养硝化好氧反硝化脱氮菌及其应用

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