CN110819537A - 微色二孢属真菌hnu107及其氨气废气降解中的应用 - Google Patents

微色二孢属真菌hnu107及其氨气废气降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开微色二孢属真菌HNU107及其氨气废气降解中的应用。本发明微色二孢属(Microdiplodia sp.)真菌菌株“HNU107”，保藏编号：CCTCC NO:M 2019501。真菌“HNU107”在含氨气废气降解中的应用。HNU107人工增加其在生物活性填料中的丰度，可提高生物活性填料对含氨废气的清除效率。添加微色二孢属真菌HNU107的反应器，在进入稳定期后，针对含氨废气的吸收清除效率相比对照组提高12.8％。添加微色二孢属真菌HNU107后的活性填料，其驯化时间缩短3天，可快速启动生物滴滤塔反应器。

Description

微色二孢属真菌HNU107及其氨气废气降解中的应用
技术领域
本技术属于环境污染治理领域，涉及一株微色二孢属(Microdiplodia sp.)硝化真菌“HNU107”及其在含氨工业废气生物降解中的应用。
背景技术
大气污染是当前最为严重的环境问题之一。随着经济的发展，工业排放是造成大气污染的主要原因。根据现有的研究报道，在实际排放的工业废气中，含氨废气排放占有重要的比例，因此被列入国家优先控制的气体污染物之一。氨气具有很大的刺激性气味，对周边居民影响较大，大量含氨废气的排放严重损害人类健康。此外，排放进入大气的氨与水形成气溶胶，是形成酸雨的主要原因。研发高效、无二次污染的生物降解技术是解决这类废气污染的有效技术之一。
近年来，人们发现大量微生物具有硝化功能，其中异养型硝化微生物在自然界中分布广泛，在氨气生物降解中发挥着重要功能。在异养型硝化微生物中，真菌是数据最多，效率最高的一个种群。前人科研工作通过选取不同的生物反应器的底泥，经过大量分离筛选，得到了一系列具有异养硝化能力的真菌，如：Candida palmioleophila HN5,青霉菌HY-1，链格孢菌HY-2，子囊菌HY-4和镰刀菌HY-5等都具有一定的硝化能力。
利用生物滴滤塔处理工业废气成为一种应用广泛的生物技术。生物滴滤塔反应器的形式是固体填料床，微生物在填料表面附着生长形成生物膜，气体流经反应器，污染物质转移到生物膜内部进而被微生物所降解。在启动生物滴滤塔清除废气的启动阶段，需要往底泥中接种微生物。但是目前的生物滴滤反应器存在效率低、退化快、保存困难等缺点，这在一定程度上限制了生物滴滤反应器在废气净化领域的应用。从生物滴滤塔底泥中筛选具有吸收、降解氨气的高效真菌，并将其以人工方式扩增后再加入生物滴滤塔反应器中，可以达到改良生物滴滤反应器的效果。此外，筛选得到的高效真菌，为研究含氨废气的生物降解机制提供了实验材料。
发明内容
本发明的一个目的是为了筛选并提供一种微色二孢属(Microdiplodia sp.)真菌菌株“HNU107”。
本发明提供的微色二孢属(Microdiplodia sp.)真菌菌株“HNU107”，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO:M2019501，保藏日期：2019年6月27日。
该菌株的生物学特征如下：菌落成灰白色，边缘整齐，菌丝较为蓬松，无隔膜；培养后期菌落呈现褐黄色，菌丝致密；显微镜下观察该真菌为粗短杆状菌，不产孢子。
本发明所涉及菌种的筛选技术方案是：
所提供菌株于工业企业的生物滴滤塔反应器活性污泥中筛选获得。取驯化后的生物反应器污泥5g，以蒸馏水稀释至10倍、100倍和1000倍三个不同的浓度梯度，分别涂布于PDA真菌固体培养基上。所述的PDA真菌培养基为：马铃薯200克，葡萄糖20 克，琼脂15克，蒸馏1000毫升。每个培养皿一毫升稀释后的污泥溶液，在25℃下恒温黑暗培养，培养一周后观察形成的独立菌落。从选定的菌落边缘挑取菌丝体，移到新鲜的PDA平板划线分离培养，重复至获得纯培养物，转入PDA斜面保存。
采取通用真菌DNA提取方法，提取微色二孢属真菌“HNU107”的基因组DNA，并利用真菌ITS区的通用引物扩增所选真菌的ITS区间序列，扩增的结果序列如SEQ ID NO.1所示。通过在NCBI中进行的BLAST检索，结果表明其与微色二孢属真菌G16A (GeneBank登入号：EF432267.1)的同源性最高，为99.33％，故鉴定该菌株为微色二孢属(Microdiplodia sp.)真菌。
本发明的另一个目的是提供上述真菌“HNU107”在含氨气废气降解中的应用。
作为优选，真菌“HNU107”在生物滴滤塔反应器降解净化含氨废气中的应用。
所述的生物滴滤塔反应器在如下参数下工作：设计废气风量8000m3/h，空塔气速1m/s，塔径1800mm，塔高9000mm，喷淋密度15m3/(m2·h)，填料高度1500mm，停留时间7s；其所在的生物滴滤塔的真菌加强型填料为微色二孢属真菌HNU107悬液吸附于基质上，并压制成型；其中每克基质中含有不低于5.0×107CFU的真菌HNU107，基质为活性炭、麦麸和木屑按照1：1～1.2：2～2.5的质量比混合的混合物。
本发明的又一个目的是提供一种发酵制品，为微色二孢属真菌HNU107的发酵液或液体菌剂。
微色二孢属真菌HNU107的发酵液的制备方法具体如下：
将微色二孢属真菌HNU107经PDA固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基，按10％的接种量(即种子液和发酵培养基的体积比为1:10)进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；发酵培养的条件为：30-35℃，保持溶解氧高于2.0mg/L，发酵罐压强为0.05MPa，每一轮培养时间48h；
上述发酵培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水补至总体积 1000毫升，pH值为6.8-7.5。
微色二孢属真菌HNU107的液体菌剂的制备方法具体如下：
将微色二孢属真菌HNU107经PDA固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基，按10％的接种量(即种子液和发酵培养基的体积比为1:10)进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；将发酵液置于4℃冷冻离心机，3000×g转速下，离心20min，弃去上清液后收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到真菌终浓度为0.5-0.8g/L 的液体菌剂。
发酵培养的条件为：30-35℃，保持溶解氧高于2.0mg/L，发酵罐压强为0.05MPa，每一轮培养时间48h；
上述发酵培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水补至总体积 1000毫升，pH值为6.8-7.5。
保藏说明：
本发明微色二孢属(Microdiplodia sp.)真菌菌株“HNU107”，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO:M 2019501，保藏日期：2019年6月27日。
本发明具有的有益效果是：
1)利用筛选得到的具有硝化能力的微色二孢属真菌HNU107，人工增加其在生物活性填料中的丰度，可提高生物活性填料对含氨废气的清除效率。添加微色二孢属真菌HNU107的反应器，在进入稳定期后，针对含氨废气的吸收清除效率相比对照组提高12.8％；
2)添加微色二孢属真菌HNU107后的活性填料，其驯化时间缩短3天，可快速启动生物滴滤塔反应器；
3)微色二孢属真菌HNU107菌种可长期保存，-80℃超低温冰箱中保存一年后，经活化可继续使用，对含氨废气的清除效率没有显著下降，具有较好的可保存性。
附图说明
图1为生物反应器结构示意图；
图2为菌株的菌落形态图；
图3为菌株的微观结构图；
图4为系统发育树图；
图5为处理组与对照组生物滴滤塔反应器对含氨废气的清除效率对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1：微色二孢属真菌“HNU107”的分离培养
微色二孢属真菌“HNU107”是分离自罗赛洛(温州)明胶有限公司生物反应器，该生物滴滤塔反应器设计结构如图1所示。
其分离方法如下：取驯化后的生物反应器污泥5g，以蒸馏水稀释至10倍、100倍和1000倍三个不同的浓度梯度，分别涂布于PDA真菌固体培养基上。每个培养皿涂布一毫升稀释后的污泥溶液，在25度下恒温黑暗培养，培养一周后观察形成的独立菌落。从选定的菌落边缘挑取菌丝体，转移到新鲜的PDA平板划线分离培养，重复至获得纯培养物，转入PDA斜面保存。
实施例2：微色二孢属真菌“HNU107”的形态学及分子生物学鉴定
在显微镜下，观察内生真菌的菌落、菌丝和孢子等特征，参照《真菌鉴定手册》进行鉴定。具体而言，采用点种法将筛选到的菌株接种于PDA平板上，置于28度恒温培养，肉眼观察菌株的形态特征，包括菌落形态、颜色、大小、边缘特征、菌丝性状、生长速度等特征。挑取菌落表面菌丝，置于光学显微镜(日本，OLYMPUS)观察有无孢子和产孢结构等。
本发明的微色二孢属真菌“HNU107”的形态特征如下：
如图2和图3所示，微色二孢属真菌“HNU107”菌株在PDA培养基，温度25度下，菌丝发达，质地呈绒毛状；幼时颜色为浅白色，老后颜色为浅黄色；在PDA平板上未见孢子及产孢结构。
实施例3：微色二孢属真菌“HNU107”的分子生物学鉴定
采取通用真菌DNA提取方法，提取微色二孢属真菌“HNU107”的基因组DNA。提取方法如下：取1.5mL菌液，12000×g，2min，收集菌体；加入500μL 5×CTAB(包含1％β-巯基乙醇)，液氮中速冻30s，再转至65度下温浴30s，反复上述过程3次；高速涡旋震荡3-5min，65度温浴20min，加入2mL的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1， V/V/V)，12000×g，10min，取上清液；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇，静止 20min后再次离心；倒掉上清液，以70％的酒精洗涤沉淀物；自然条件下干燥，得到真菌DNA备用。
用真菌通用引物ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG–3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，经PCR技术，扩增出真菌基因组的rRNA基因内部转录间隔区(ITS)。PCR反应体系配置如下：括2×power Taq PCR MasterMix(25 μL)；Primer1(2μL，0.2μmol/L)；Primer2(2μL，0.2μmol/L)；DNA模板(2μL)；ddH2O (19μL)。反应条件：94℃预变性3min；35个循环:94℃变性1min，57℃复性1min， 72℃延伸1min 20s；72℃延伸10min。将PCR产物纯化后测序。通过在NCBI中进行的BLAST检索，结果表明其与微色二孢属真菌G16A(GeneBank登入号：EF432267.1) 的同源性最高，为99.66％，故鉴定该菌株为微色二孢属真菌。
实施例4：微色二孢属真菌“HNU107”的系统进化分析
将实施例4中得到的ITS序列在NCBI中进行的BLAST检索，下载与之最相近的已知菌种ITS序列，用于构建系统发育树。采用clustalx1.83进行多序列比对，比对结果利用MEGA6.0软件并采用Maxium Likelihood统计学方法，Bootstrap值设置为1000，使用Tamura-Nei model碱基替换模式，构建基于rDNA ITS序列的系统发育树。使用 MEGA6.0软件中的P-distances法计算遗传进化距离。具体的系统进化树如图4所示。
实施例5：微色二孢属“HNU107”真菌发酵及填料制备
“HNU107”真菌经PDA固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基；于发酵罐中每一轮培养时间48h；添加含有马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水补至总体积1000毫升的液体培养基；将发酵液置于4度冷冻离心机，3000×g，离心20min, 弃去上清液后收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到终浓度为0.5-0.8g/L 的真菌悬液。将“HNU107”悬液吸附于填料上，完成富含“HNU107”真菌的填料制备。
实施例6：“HNU107”真菌提升生物滴滤反应器对含氨废气的吸收清除效率
设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，分别采用原始活性污泥和人工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥，检测一个工作日周期内，两组设备对含氨废气吸收清除效率的差异。选取两套设备启动14天后的第15个工作日，取样测定所需参数。在一个工作周期内，选取上午8点-晚上22点之间8个时间点，提取输入口和输出口的废气样本，测定氨气含量，单位为mg/m3。对照组生物滴滤塔反应器输入口的废气含氨气浓度在13.2～16.4mg/m3之间，输出口的废气含氨气浓度在1.65～2.23mg/m3之间，氨气的清除率在84.3％～88.6％之间。处理组生物滴滤塔反应器输入口的废气含氨气浓度在13.2～15.4mg/m3之间，输出口的废气含氨气浓度在0.23～0.64mg/m3之间，氨气的清除率在95.3％～98.4％之间。处理组生物滴滤塔反应器对含氨废气的清除效率显著高于对照组(图5)。
实施例7：“HNU107”真菌缩短生物滴滤塔反应器启动时间
设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，分别采用原始活性污泥和人工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥，检测从开始第一天到启动后第20天的含氨废气清除效率。取样时间固定为每天上午8点，提取输入口和输出口的废气样本，测定氨气含量，单位为mg/m3。所测得的数据见表格1。
表1的结果表明，同样的测定条件下，处理组的生物滴滤塔反应器从8天开始达到80％的效率，而对照组的生物滴滤塔反应器从第10天开始达到80％的效率。数据表明，“HNU107”真菌可以缩短生物滴滤塔反应器启动时间。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 微色二孢属真菌HNU107及其氨气废气降解中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
ggggggtttc ctacctgatc cgaggtcaaa gacggtaatg ttgcttcgtg gacgcgggcc 60
gcgcacctcg agaagcgcaa tgtgctgcgc gagaggaggc aaggaccgct gccaatgaat 120
ttggggcgag tccgcgcgca gaggcgggac agacgcccaa caccaagcag agcttgaggg 180
tgtagatgac gctcgaacag gcatgcccca tggaatacca aggggcgcaa tgtgcgttca 240
aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacactact tatcgcattt cgctgcgttc 300
ttcatcgatg ccagagccaa gagatccatt gttgaaagtt gtaacgattg tttgtatcag 360
aacaggtaat gctagatgca aaaaaaggtt ttgataggtt ccaacggcag gttgccccgc 420
cgaaggagaa cgaaaggtgc tcgtaaaaaa aggattcaga catgcggcgc gtgaaagtgt 480
tacctctacc gcccgacggt agctgttgct cccgccgagg gccgcgaccg cacctcatgg 540
aatagataat gatccttccg caggttcacc tacggaaacc ttgttacgat tttttacttt 600
cca 603

Claims (9)

1.一种真菌菌株HNU107，其特征在于分类为微色二孢属Microdiplodia sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO:M2019501，保藏日期：2019年6月27日；
生物学特征如下：菌落成灰白色，边缘整齐，菌丝较为蓬松，无隔膜；培养后期菌落呈现褐黄色，菌丝致密；显微镜下观察该真菌为粗短杆状菌，不产孢子。
2.一种发酵制品，为如权利要求1所述的一种真菌菌株HNU107的发酵液或液体菌剂。
3.如权利要求你2所述的发酵制品，其特征在于发酵液的制备方法具体是：
将如权利要求1所述的一种真菌菌株HNU107经PDA固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基，按10％的接种量进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；发酵培养的条件为：30-35℃，保持溶解氧高于2.0mg/L，发酵罐压强为0.05MPa，每一轮培养时间48h；
上述发酵培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水补至总体积1000毫升，pH值为6.8-7.5。
4.如权利要求你2所述的发酵制品，其特征在于液体菌剂的制备方法具体是：
将如权利要求1所述的一种真菌菌株HNU107经PDA固体培养基培养纯化后接种于发酵培养基，按10％的接种量进行逐级放大培养，最终得到培养物即为发酵液；将发酵液置于4℃冷冻离心机，3000×g转速下，离心20min，弃去上清液后收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到真菌终浓度为0.5-0.8g/L的液体菌剂；
发酵培养的条件为：30-35℃，保持溶解氧高于2.0mg/L，发酵罐压强为0.05MPa，每一轮培养时间48h；
上述发酵培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水补至总体积1000毫升，pH值为6.8-7.5。
5.如权利要求1所述的一种真菌菌株HNU107在含氨气废气降解中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于在生物滴滤塔反应器降解净化含氨废气中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于生物滴滤塔反应器中填料为每克基质中含有不低于5.0×107CFU的如权利要求1所述的真菌HNU107或如权利要求2-4任一所述的发酵制品。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于基质为活性炭、麦麸和木屑按照1：1～1.2：2～2.5的质量比混合的混合物。
9.如权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于所述的生物滴滤塔反应器的工作参数：设计废气风量8000m3/h，空塔气速1m/s，塔径1800mm，塔高9000mm，喷淋密度15m3/(m2·h)，填料高度1500mm×2，停留时间7s。
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