CN114058517B

CN114058517B - 一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用

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Publication number: CN114058517B
Application number: CN202111334945.3A
Authority: CN
Inventors: 王进; 潘鑫; 岳正波; 王陈
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2041-11-11
Also published as: CN114058517A

Abstract

本发明涉及废水处理技术领域，特别是涉及一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用。本发明所述菌藻混合物包括曲霉菌(Aspergillussp)MF1和油球藻(Graesiellasp)MA1；所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比为1:(3～6)；所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCCNO.61350；所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCCNO.60820。本发明从酸性矿山废水中筛选出曲霉菌MF1和油球藻MA1，并通过适宜的比例复配，复配后的菌藻混合物不仅在低pH值(pH值≥3.0)下对重金属的耐受浓度高，而且培养成本低。

Description

一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及废水处理技术领域，特别是涉及一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用。

背景技术

在废水处理方法中，利用好氧菌和微藻建立共生系统以消除污水中富余的营养元素，已经被广泛认可并在实践中开始有应用案例，该共生系统中主要由微藻(小球藻、绿藻、栅藻等)和好氧细菌(硝化细菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌等)构成，微藻通过光合作用为好氧菌提供氧气、而好氧菌在分解有机质过程中为微藻提供二氧化碳，从而达成互惠互利的共生关系。近年来，菌藻共生体系在废水处理中的潜力被广泛关注。

但是，现有的菌藻共生体系多为细菌与微藻结合，而该共生体系常用于生活污水的处理与处置，对在低pH值下重金属的耐受浓度低，且培养成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用。本发明提供的菌藻混合物不仅在低pH值下对重金属的耐受浓度高，而且培养成本低。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种菌藻混合物，所述菌藻混合物包括曲霉菌(Aspergillus sp)MF1和油球藻(Graesiella sp)MA1；所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比为1:(3～6)；

所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCC NO.61350；

所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCC NO.60820。

优选的，所述曲霉菌MF1的18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述油球藻MA1的18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种菌藻共生体系，所述菌藻共生体系包括上述的菌藻混合物。

本发明还提供了上述菌藻共生体系的构建方法，包括：将上述的菌藻混合物与共生培养基混合培养，得到菌藻共生体系；所述共生培养基包括以下组分：10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨、1g/L酵母粉、4.5g/LNaNO₃、0.12g/LK₂HPO₄、0.225g/L MgSO₄·7H₂O、0.108g/LCaCl₂·2H₂O、0.018g/L柠檬酸、0.018g/L柠檬酸铁铵、0.003g/L EDTA、0.06g/L Na₂CO₃、0.00858g/L H₃BO₄、0.00543g/L MnCl₂·H₂O、0.000666g/L ZnSO₄·7H₂O、0.000237g/LCuSO₄·5H₂O、0.00117g/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.000147g/L Co(NO₃)₂·6H₂O。

优选的，以菌藻混合物的干重计，所述菌藻混合物的接种量为0.24～0.42g/L。

优选的，所述混合培养的光照强度为2500lux，光暗比为14:10，培养温度为25℃，培养时间为96～144h。

本发明还提供了上述菌藻混合物或上述的菌藻共生体系在降低废水中的杂质中的应用，所述杂质包括重金属、钙和硫酸根离子中的一种或多种。

优选的，所述废水包括酸性废水；所述酸性废水的pH值≥3.0。

优选的，所述重金属包括：铜、锰、镉、铝、铁、铬和锌中的一种或多种。

本发明还提供了一种降低废水中的杂质的方法，包括以下步骤：

将上述的菌藻共生体系与废水混合，得到杂质含量低的废水；所述菌藻共生体系与废水的体积比为1:50；所述杂质包括重金属、钙和硫酸根离子中的一种或多种。

有益效果：

本发明提供了一种菌藻混合物，所述菌藻混合物包括曲霉菌(Aspergillus sp)MF1和油球藻(Graesiella sp)MA1；所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比为1:(3～6)；所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCC NO.61350；所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCC NO.60820。本发明从酸性矿山废水中筛选出曲霉菌MF1和油球藻MA1，并通过适宜的比例复配，复配后的菌藻混合物不仅在低pH值(pH值≥3.0)下对重金属的耐受浓度高，而且培养成本低。

生物保藏信息

曲霉菌MF1，拉丁名为Aspergillus sp，于2020年12月7日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.61350；

油球藻MA1，拉丁名为Graesiella sp，于2019年10月23日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，(简称GDMCC)保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.60820。

附图说明

图1为曲霉菌MF1的菌落形貌及菌体形态图；

图2为曲霉菌MF1的18SrDNA的PCR电泳图；

图3为曲霉菌MF1的系统发育树；

图4为油球藻MA1的菌落形貌及菌体形态图；

图5为油球藻MA1的18SrDNA的PCR电泳图；

图6为油球藻MA1的系统发育树；

图7为分别含有曲霉菌MF1、油球藻MA1和二者混合物的培养基；

图8为微藻-真菌混合物的形态图；

图9为微藻-真菌共生机制。

具体实施方式

所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCC NO.61350；

所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCC NO.60820。在本发明中，所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比优选为1:6；所述干重优选为105℃下烘干8h后的重量。

本发明及实施例中的菌藻混合物的制备方法，优选包括以下步骤：

取5ml处于对数生长期的油球藻和曲霉菌，分别于8000rpm离心5min后于105℃下烘干8h，根据前后质量差获得油球藻和曲霉菌干重，计算得到对数生长期的干重浓度；经计算曲霉菌对数生长期的干重浓度为14.65g/L；油球藻对数生长期的干重浓度为58.72g/L；

通过接种时所取处于对数生长期的菌液或藻液体积来计算确定接种的菌液和藻液的干重。

本发明所述曲霉菌MF1优选具有如下性质：

(1)菌落呈灰黄色，表面干燥凹凸不平，中部隆起，边缘平整；

(2)菌丝生长旺盛，且菌丝一端是长柱状，另一端呈冠状，外有一圈孢子生长，孢子呈绿色，椭圆形；

(3)菌株耐酸性强，可以在pH≥3.5的环境中存活；

(4)曲霉菌MF1的18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：TGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCCACCCGTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTCGACGGCCG CCGGGGAGGCCTTGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGCAGTCTGAGTTGATTATCGTAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCCTCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCTGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACACCCAACTTTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA。

本发明本发明所述油球藻MA1优选具有如下性质：1)所述油球藻MA1耐酸性强，可以在pH≥3.5的环境中存活；2)所述油球藻MA1的18S rDNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：2所示：GGGGGCTGGTCCTAGTATAAACTGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGGTGGTACCTTACTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATATATTAGATAAAAGGCCGACCGGGCTTTGCCCGACCCGCGGTGAATCATGATATCTTCACGAAGCGCATGGCCTTGCGCCGGCGCTGTTCCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCATTTCATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTCTAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTATGGCCTTCCTTTCTGTCGGGGACGGGCTTCTGGGCTTAATTGTCCGGGACTCGGAGTCGACGTGGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTACGCCCTGAATACTTTAGCATGGAATAACACGATAGGACTCTGGCCTATCTTGTTGGTCTGTAGGACTGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAA GAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGCGAATGTTTTTTTAATGACTTCGCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGCCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCCTAGTTGCTTTTTGCAGCTAGCTGACTTCTTAGAGGGACTATGGCGT。

本发明从酸性矿山废水中筛选出曲霉菌MF1和油球藻MA1，并通过适宜的比例复配，复配后的菌藻混合物不仅在低pH值(pH值≥3.0)下对重金属的耐受浓度高，而且培养成本低；另外本发明通过适宜的比例复配，复配后的菌藻混合物可在pH值为3.0～8.0的环境中存活，可去除不同pH值的废水中的重金属。

本发明还提供了一种菌藻共生体系，所述菌藻共生体系包括上述的菌藻混合物。共生体系中微藻通过光合作用给真菌提供氧气、有机物及其他营养物质，作为回报，真菌通过保持水分为微藻提供保护，使其免受强光的伤害，同时提供矿物质营养成分。共生体系能通过生物吸附，生物积累和生物氧化等机制去除金属离子。

本发明还提供了上述菌藻共生体系的构建方法，包括：将上述的菌藻混合物与共生培养基混合培养，得到菌藻共生体系；所述共生培养基包括以下组分：10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨、1g/L酵母粉、4.5g/LNaNO₃、0.12g/L K₂HPO₄、0.225g/L MgSO₄·7H₂O、0.108g/L CaCl₂·2H₂O、0.018g/L柠檬酸、0.018g/L柠檬酸铁铵、0.003g/L EDTA、0.06g/L Na₂CO₃、0.00858g/L H₃BO₄、0.00543g/L MnCl₂·H₂O、0.000666g/L ZnSO₄·7H₂O、0.000237g/LCuSO₄·5H₂O、0.00117g/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.000147g/L Co(NO₃)₂·6H₂O。本发明对所述共生培养基的各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明所述的共生培养基可以使菌藻混合物在短时间内培养成菌藻共生体系，且获得的生物量高，培养成本低。

在本发明中，以菌藻混合物的干重计，所述菌藻混合物的接种量优选为0.24～0.42g/L，进一步优选为0.42g/L；更优选为曲霉菌MF1接种0.06g/L，油球藻MA1接种0.36g/L。

在本发明中，所述混合培养的光照强度优选为2500lux，光暗比优选为14:10，培养温度优选为25℃，培养时间优选为96～144h，更优选为96h。

在本发明中，所述废水包括酸性废水；所述酸性废水的pH值≥3.0；所述重金属优选包括：铜、锰、镉、铝、铁、铬和锌中的一种或多种。本发明提供的菌藻混合物或菌藻共生体系不仅可以去除中性废水中的重金属等杂质，还可以去除酸性废水中的重金属等杂质。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种菌藻混合物，1(干重)份曲霉菌(Aspergillus sp)MF1和6(干重)份油球藻(Graesiella sp)MA1组成；所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCC NO.61350；所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCC NO.60820。

曲霉菌MF1的筛选过程如下：

曲霉菌MF1的富集培养：水样取自马鞍山东部矿区某酸水库中，取50mL酸性矿山废水，用台式离心机以3000r·min^-1低速离心去除杂质；移取1mL离心后上清液接种到50ml改良马丁式液体培养基(配方见表1)中，在28℃、转速120r·min^-1条件下富集培养72h，隔3天按体积比2％接种量转培一次，转培2次后备用；

曲霉菌MF1的分离纯化：实验前将孟加拉红培养基、培养皿、涂布棒、稀释管、纯水等在121℃高温灭菌锅灭菌20min后，在无菌环境下倒25～30mL平板，冷却备用；取1mL 3次转培富集后菌液，在稀释管中按照l0^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5梯度将培养液依次稀释，无菌环境下分别吸取0.2mL不同梯度的稀释菌液涂布于孟加拉红培养基(配方见表1)平板上，倒置培养于28℃恒温培养箱，培养2～3天至平板长出肉眼可见的菌落；选取平板上生长的典型单一菌落，反复划线，直到镜检菌体形态均一后，停止划线分离。将获得的纯菌落接种于保菌管中，作为菌种保藏于4℃冰箱，一天后转到-81℃冰箱保藏；

表1培养基配方

形态学鉴定：分离纯化后的菌株，用高倍荧光显微镜对菌落、菌丝、孢子等结构进行观察，记录真菌颜色、大小、形状，并参照《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)和《中国真菌志》(张中义，2014)，进行鉴定，鉴定结果(图1)为：菌落呈灰黄色，表面干燥凹凸不平，中部隆起，边缘平整；菌丝生长旺盛，且菌丝一端是长柱状，另一端呈冠状，外有一圈孢子生长，孢子呈绿色，椭圆形；初步鉴定结果为曲霉菌属；

分子生物学鉴定：按照上海生物工程股份有限公司提供的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)提取筛选到的真菌DNA，对提取DNA进行PCR扩增，引物为18SrDNA通用引物NS1(SEQ ID NO：3所示：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')，NS6(SEQ ID NO：4所示：5'-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3')；采用凝胶电泳法观察PCR扩增结果(1％琼脂糖电泳，150V、100mA20min电泳观察，结果见图2)，PCR产物由上海生物工程股份有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示；18SrDNA测序结果在NCBI上blast比对，利用软件MEGA-X构建系统发育树，见图3；

由图2、3可知，所筛选菌株为曲霉真菌Aspergillus sp；

油球藻MA1的筛选过程如下：

油球藻MA1筛选：从安徽某东部矿山产生的酸性矿山废水中收集了一桶稀藻液，置于低温条件下贮存带回实验室，取400ml稀藻液通过抽滤机经过0.22μm膜抽滤，得到一张藻膜，将其置于灭菌过的pH为3.0的BG11培养液(配方见表2)中培养，置于25℃，3000lux的光照条件下富集一星期；

表2BG11培养基成分

藻的培养：待锥形瓶中藻浓度达到肉眼可见的绿色后，开始准备稀释涂布；准备三支10ml的离心管，以及一定量的无菌水，吸取1ml藻液于第一支装有9ml的离心管中，充分混合摇匀，重复上述操作2次，最终得到稀释10倍、100倍和1000倍梯度的藻液；在无菌操作台中，在酒精灯火焰旁用移液枪分别吸取不同稀释梯度的0.1ml藻液滴于培养皿上，用涂布棒将其涂布均匀，然后用封口膜将培养皿封好置于25℃，3000lux的光照条件下培养3～5天；

藻的鉴定：培养3～5天后，可以观察到稀释100倍的藻液接种的培养皿中有各种肉眼可见的藻落和菌落，在无菌操作台中用接种环在酒精灯火焰旁挑取单藻落于培养皿中三区划线，然后置于25℃，3000lux的光照条件下培养3～5天，待长出藻后(图4中的a)，用400倍荧光显微镜对藻落、藻细胞器等结构进行观察(图4中的b)，并与资料比对进行分子生物学鉴定；

分子生物学鉴定：方法同曲霉菌MF1的分子生物学鉴定，凝胶电泳结果见图5；测序结果如SEQ ID NO：2所示；系统发育树见图6；

由图4中的b可知，该藻为球形或近球形单细胞微藻；

由图5可知，条带位于1000～3000bp之间，大小为1348bp；

由图6可知，该藻为油球藻。

实施例2

一种菌藻混合物，1份(干重)曲霉菌(Aspergillus sp)MF1和3份(干重)油球藻(Graesiella sp)MA1组成(见图7～图9)；所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCC NO.61350；所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCC NO.60820。

实施例3

一种菌藻共生体系，由以下步骤构建得到：

将实施例1制备的菌藻混合物与共生培养基混合培养，得到菌藻共生体系；所述共生培养基中由以下组分组成：10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨、1g/L酵母粉、4.5g/LNaNO₃、0.12g/LK₂HPO₄、0.225g/LMgSO₄·7H₂O、0.108g/L CaCl₂·2H₂O、0.018g/L柠檬酸、0.018g/L柠檬酸铁铵、0.003g/L EDTA、0.06g/L Na₂CO₃、0.00858g/L H₃BO₄、0.00543g/L MnCl₂·H₂O、0.000666g/L ZnSO₄·7H₂O、0.000237g/L CuSO₄·5H₂O、0.00117g/LNa₂MoO₄·2H₂O和0.000147g/L Co(NO₃)2·6H₂O；以菌藻混合物的干重计，所述菌藻混合物的接种量为0.42g/L；所述混合培养的光照强度为2500lux，光暗比为14:10，培养温度为25℃，培养时间为144h。

实施例4

一种与实施例3相似的菌藻共生体系，区别在于，将实施例1制备的菌藻混合物替换为实施例2制备的菌藻混合物，所述菌藻混合物的接种量为0.24g/L。

应用例1

菌藻混合物对Mn²⁺的耐受和去除试验，具体步骤如下：

向6瓶pH为3.5的共生培养基(配方与实施例3中的共生培养基相同，培养基均按100mL的量添加于300mL锥形瓶中)中添加MnSO₄·H₂O溶液，调节培养基中Mn²⁺浓度分别为0mg/L、50mg/L、100mg/L、300mg/L、500mg/L、1000mg/L，再按实施例3中的接种量将实施例1制备的藻菌混合物分别接种到6瓶共生培养基中，摇床转速120r/min的光照恒温振荡培养箱中连续培养(培养的光照强度为2500lux，光暗比为14:10，培养温度为25℃)144h；上述6瓶共生培养基每瓶分别设置3个平行，实验结果取平均值；

每隔48h取样5mL放置于超速低温离心机中，调节转速为8000r·min^-1离心5min，保留上清液用于测定溶液中Mn²⁺的浓度变化，底部菌丝与藻用于测定干重，实验结果见表3；

每48h取样5mL，3500r/min离心，用0.22μm滤膜过滤(弃初始滤液消除滤膜吸附误差)，加入30μL 0.1mol/L HNO₃固定，用火焰原子吸收分光光度计测定培养液中残余的锰离子，实验结果见表4。

表3pH3.5下不同Mn²⁺的浓度处理藻菌混合物的干重(单位g)

表4pH3.5下菌藻共生体系对于Mn²⁺的去除结果(单位mg/L)

注：表4中0h的Mn²⁺浓度为火焰原子吸收分光光度计测定的浓度，和配制的Mn²⁺浓度存在一定误差，但误差在测量允许的范围内，下表同理。

由表3和表4可知，菌藻共生体系对Mn²⁺有着较高的耐受性，在300mg/L的浓度下依然有着较好的去除效率，其次共生体系对于低浓度Mn²⁺(<100mg/L)有着显著的去除效果，其去除效率随着Mn²⁺含量的升高而逐渐降低。

应用例2

一种与应用例1相似的试验，区别在于，6瓶共生培养基的pH值为7，试验结果见表5和表6。

表5pH7下不同Mn²⁺的浓度处理藻菌混合物的干重(单位g)

表6pH7下菌藻共生体系对于Mn²⁺的去除结果(单位mg/L)

由表3～表6可知，菌藻共生体系对Mn²⁺有着较高的耐受性，且随着溶液pH提高耐受性更好；其次共生体系对于低浓度Mn²⁺(<100mg/L)有着显著的去除效果，其去除效率随着pH值升高而逐渐升高。

应用例3

一种与应用例1相似的试验，区别在于，6瓶共生培养基的中接种的菌藻混合物为实施例2制备的菌藻混合物，接种量为0.24g/L，试验结果见表7和表8。

表7pH3.5下不同Mn²⁺的浓度处理藻菌混合物的干重(单位g/L)

表8pH3.5下菌藻共生体系对于Mn²⁺的去除结果(单位mg/L)

由表3、表4、表7和表8可知，菌藻共生体系对Mn²⁺有着较高的耐受性，且在菌藻干重比为1：6时耐受性更好；其次共生体系对于低浓度Mn²⁺(<100mg/L)有着显著的去除效果，其去除效率在菌藻干重比为1：6时更高。

应用例4

一种与应用例1相似的试验，区别在于，6瓶共生培养基中未添加Mn²⁺，且培养基的pH不同，藻菌混合物接种量为0.05g/L，实验结果见下表9。

表9不同pH值组藻菌混合物的干重(单位g/L)

由表9可知，菌藻共生体系能在pH 3～8条件下均能生长，对于低pH具有较好的耐受效果，在pH 3.5依然有着良好的生长趋势，当pH降低至2.5时藻菌生长受到严重限制。

对比例1

一种与实施例1相似的菌藻混合物，区别在于，所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比为1:1。

对比例2

一种与实施例1相似的菌藻混合物，区别在于，所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比为1:9。

对比应用例1

一种与应用例1相似的试验，区别在于，6瓶共生培养基的中接种的菌藻混合物为对比例1制备的菌藻混合物，接种量为0.12g/L，试验结果见表10和表11。

表10pH3.5下不同Mn²⁺的浓度处理藻菌混合物的干重(单位g)

表11pH3.5下菌藻共生体系对于Mn²⁺的去除结果(单位mg/L)

对比应用例例2

一种与应用例1相似的试验，区别在于，6瓶共生培养基的中接种的菌藻混合物为对比例2制备的菌藻混合物，接种量为0.6g/L，试验结果见表12和表13。

表12pH3.5下不同Mn²⁺的浓度处理藻菌混合物的干重(单位g)

表13pH3.5下菌藻共生体系对于Mn²⁺的去除结果(单位mg/L)

由表3～表13可知，菌藻共生体系对Mn²⁺有着较高的耐受性，且在菌藻干重比为1：6时耐受性更好；其次共生体系对于低浓度Mn²⁺(<100mg/L)有着显著的去除效果，其去除效率在菌藻干重比为1：6时更高。

对比应用例3

一种与应用例1相似的试验，区别在于，采用微藻培养基(配方为：10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨和1g/L酵母粉)与真核培养基(实施例1中表2的配方)的不同体积配比，接种物为实施例1制备的藻菌混合物，实验结果见表14和表15。

表14pH3.5下不同培养基配比条件下藻菌混合物的干重(单位g/L)

表15 pH3.5下不同培养基配比条件下藻菌混合物叶绿素a含量(单位μg/L)

由表14和表15可知，在真菌培养基:微藻培养基配比为1:3时真菌和微藻均能快速生长从而形成共生体系，故选定共生体系培养基比例为1:3。

应用例4

一种降低废水中的杂质的方法，由以下步骤组成：将实施例3构建的的菌藻共生体系与废水(取自马鞍山东部矿区的某酸水库，废水的性质：pH值为3.4，富含多种重金属离子和高浓度硫酸盐)混合，得到杂质含量低的废水；所述菌藻共生体系与废水的体积比为1:50。

对比应用例4

一种与应用例3相似的方法，唯一区别在于，将实施例3构建的菌藻共生体系替换为实施例3中的共生培养基。

应用例5

从混合开始每隔21d测定应用4和对比应用例4中的pH、溶解氧、硫酸根浓度、钙离子浓度、铜离子浓度、锰离子浓度、镉离子浓度、铝离子浓度、铁离子浓度、铬离子浓度和锌离子浓度，其中pH采用pH计测定，溶解氧使用便携式溶解氧仪测定，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定硫酸根浓度、钙离子浓度、铜离子浓度、锰离子浓度、镉离子浓度、铝离子浓度、铁离子浓度、铬离子浓度和锌离子浓度；测定结果见表16～表26。

表16不同处理组不同时间下测定的pH值

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	3.39	3.8	3.91	3.99	4.23
对比应用例4	3.07	2.65	2.73	2.74	2.74

表17不同处理组不同时间下测定的溶解氧(mg/L)

表18不同处理组不同时间下测定的硫酸根浓度(g/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	39138	34676	31762	28566	24956
对比应用例4	37410	36654	35936	35076	33682

表19不同处理组不同时间下测定的钙离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	544	503	494	426	335
对比应用例4	591	573	566	544	543

表20不同处理组不同时间下测定的铜离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	29.51	23.53	12.05	4.59	1.28
对比应用例4	29.38	31.06	28.69	27.21	25.94

表21不同处理组不同时间下测定的锰离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	898	832	703	570	458
对比应用例4	900	861	842	812	790

表22不同处理组不同时间下测定的镉离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	0.274	0.235	0.217	0.004	0.000
对比应用例4	0.268	0.244	0.240	0.235	0.227

表23不同处理组不同时间下测定的铝离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	1072	859	639	499	317
对比应用例4	1125	1067	1033	996	979

表24不同处理组不同时间下测定的铁离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	522	214	175	125	107
对比应用例4	526	503	349	314	272

表25不同处理组不同时间下测定的铬离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	0.210	0.136	0.044	0.024	0.000
对比应用例4	0.208	0.192	0.191	0.187	0.179

表26不同处理组不同时间下测定的锌离子浓度(mg/L)

组别	0d	21d	42d	63d	84d
						应用例4	42.37	38.12	33.82	27.57	1.12
对比应用例4	38.88	37.68	34.92	34.39	33.14

由表16～表26可知，藻菌共生体系能通过改变周边环境的pH应对极端酸性环境，真菌菌丝能为微藻的生长提供附着点以保护微藻细胞应对重金属的胁迫，同时微藻的光合作用能为真菌的代谢繁殖提供氧气和营养条件。此外，藻菌共生体系的形成能通过生物吸附，吸收及生物氧化作用去除废水中的多种金属离子和硫酸盐；共生体系对于低浓度的金属离子如Cd²⁺、Cr²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺有着高效的去除作用，对于高含量的Fe³⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Ca²⁺和硫酸根等离子也有着显著的去除效果。实验结果表明，通过真菌-微藻共生体系在应对极端环境压力的同时能有效去除废水中的多种金属离子。

综上所述，本发明提供的菌藻混合物或菌藻共生体系不仅在低pH值(pH值≥3.0)下对重金属的耐受浓度高，去除率高；而且培养成本低。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种菌藻混合物、菌藻共生体系及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 569

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcggaagga tcattaccga gtgagggccc tctgggtcca acctccccac ccgtgtctat 60

cgtaccttgt tgcttcggcg ggcccgccgt ttcgacggcc gccggggagg ccttgcgccc 120

ccgggcccgc gcccgccgaa gaccccaaca tgaacgctgt tctgaaagta tgcagtctga 180

gttgattatc gtaatcagtt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg 240

aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc 300

tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc 360

tgccctcaag cacggcttgt gtgttgggcc cccgtccccc tctcccgggg gacgggcccg 420

aaaggcagcg gcggcaccgc gtccggtcct cgagcgtatg gggctttgtc acctgctctg 480

taggcccggc cggcgccagc cgacacccaa ctttattttt ctaaggttga cctcggatca 540

ggtagggata cccgctgaac ttaagcata 569

<210> 2

<211> 1348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggggctggt cctagtataa actgcttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca 60

gttatagttt atttggtggt accttactac tcggataacc gtagtaattc tagagctaat 120

acgtgcgtaa atcccgactt ctggaaggga cgtatatatt agataaaagg ccgaccgggc 180

tttgcccgac ccgcggtgaa tcatgatatc ttcacgaagc gcatggcctt gcgccggcgc 240

tgttccattc aaatttctgc cctatcaact ttcgatggta ggatagaggc ctaccatggt 300

ggtaacgggt gacggaggat tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac 360

cacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ctgatacggg gaggtagtga 420

caataaataa caataccggg catttcatgt ctggtaattg gaatgagtac aatctaaatc 480

ccttaacgag gatccattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc 540

caatagcgta tatttaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttggattt cgggtgggtt 600

ctagcggtcc gcctatggtg agtactgcta tggccttcct ttctgtcggg gacgggcttc 660

tgggcttaat tgtccgggac tcggagtcga cgtggttact ttgagtaaat tagagtgttc 720

aaagcaggct tacgccctga atactttagc atggaataac acgataggac tctggcctat 780

cttgttggtc tgtaggactg gagtaatgat taagagggac agtcgggggc attcgtattt 840

cattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat gaaagacgaa ctactgcgaa agcatttgcc 900

aaggatgttt tcattaatca agaacgaaag ttgggggctc gaagacgatt agataccgtc 960

gtagtctcaa ccataaacga tgccgactag ggattggcga atgttttttt aatgacttcg 1020

ccagcacctt atgagaaatc aaagtttttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaaggctg 1080

aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac 1140

tcaacacggg aaaacttacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gagagctctt 1200

tcttgattct atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtgggttgc cttgtcaggt 1260

tgattccggt aacgaacgag acctcagcct gctaaatagt cctagttgct ttttgcagct 1320

agctgacttc ttagagggac tatggcgt 1348

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtagtcatat gcttgtctc 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatcacaga cctgttattg cctc 24

Claims

1.一种菌藻混合物，其特征在于，所述菌藻混合物包括曲霉菌（Aspergillus sp）MF1和油球藻（Graesiella sp）MA1；所述曲霉菌MF1和油球藻MA1的干重比为1:（3~6）；

所述曲霉菌MF1的保藏编号为GDMCC NO.61350；

所述油球藻MA1的保藏编号为GDMCC NO.60820。

2.根据权利要求1所述的菌藻混合物，其特征在于，所述曲霉菌MF1的18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述油球藻MA1的18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种菌藻共生体系，其特征在于，所述菌藻共生体系包括权利要求1或2所述的菌藻混合物。

4.权利要求3所述菌藻共生体系的构建方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的菌藻混合物与共生培养基混合培养，得到菌藻共生体系；所述共生培养基包括以下组分：10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨、1g/L酵母粉、4.5g/L NaNO₃、0.12g/L K₂HPO₄、0.225g/LMgSO₄·7H₂O、0.108g/L CaCl₂·2H₂O、0.018g/L柠檬酸、0.018g/L柠檬酸铁铵、0.003g/LEDTA、0.06g/L Na₂CO₃、0.00858g/L H₃BO₄、0.00543g/L MnCl₂·H₂O、0.000666g/L ZnSO₄·7H₂O、0.000237g/L CuSO₄·5H₂O、0.00117g/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.000147g/L Co(NO₃)₂·6H₂O。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，以菌藻混合物的干重计，所述菌藻混合物的接种量为0.24~0.42g/L。

6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述混合培养的光照强度为2500lux，光暗比为14:10，培养温度为25℃，培养时间为96~144h。

7.权利要求1或2所述菌藻混合物或权利要求3所述的菌藻共生体系在降低废水中的杂质中的应用，其特征在于，所述杂质包括铜、锰、镉、铝、铁、铬、锌、钙和硫酸根离子中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述废水包括酸性废水；所述酸性废水的pH值≥3.0。

9.一种降低废水中的杂质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求3所述的菌藻共生体系与废水混合，得到杂质含量低的废水；所述菌藻共生体系与废水的体积比为1:50；所述杂质包括铜、锰、镉、铝、铁、铬、锌、钙和硫酸根离子中的一种或多种。