CN113195122A - 遭石油相关物质污染的环境的净化方法和所使用的材料 - Google Patents

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Abstract

在利用微生物净化遭石油相关物质污染的环境的技术中，在必要的工事中，所有现有的微生物均存在耐压性差、难以用于通过高压注入到地下深处的问题。另外，通常微生物的生存会受到环境温度等的影响，存在使用时需要注意保存条件、环境条件(温度、压力、pH等)的问题。本发明获得了对高温、高压均有耐受性且具有优异的石油相关物质分解能力的微生物，由此，提供使用对温度、pH、压力等环境压力适应性强的生物体的、有用性高且利用了优异的石油相关物质分解能力的生物修复技术、尤其是生物强化技术。

Description

遭石油相关物质污染的环境的净化方法和所使用的材料
技术领域
本发明涉及使用微生物的、遭石油相关物质污染的土或(和)水的净化。
背景技术
近年来，世界各国均在推进土地的二次开发事业、对土壤污染对策立法，需要开发遭有害物质污染的土地、地下水的安全且廉价的净化手段。从1900年代开始，国内外在积极地研究土地(以下也称为土壤)、环境水质的净化对策，供于实际使用的方法也不少，但是大部分方法为洗涤、热处理、抽吸除去等物理处理方法以及利用试剂来分解除去、使其不溶等化学处理方法。
另一方面，在分解石油成分的微生物的研究不断发展的背景下，开发出利用在污染现场生息的微生物进行修复的技术(生物刺激)，并已经进入实用化阶段。但是，生物刺激存在如下缺点，即，净化是受生息着的微生物的生物功能限定的。目前，作为导入将污染物质完全分解的微生物而进行高效净化的方法，将分解污染物质的微生物导入污染土壤中并使其高浓度地保持的方法、即生物强化的开发备受人们期待〔非专利文献1〕。日本经济产业省和环境省于2005年3月发布了“基于微生物的生物修复的利用指南”，作为将微生物导入土壤中·地下水污染位置进行净化时的指南〔非专利文献2〕。该指南从制度上公开承认了使用微生物的安全性和净化技术方法，但是尚未推广和普及。
对于需要使有用的微生物在自然环境下选择性活化的生物强化而言，大多数情况下必须对含微生物的水溶液加压而进行注入。
到目前为止，作为能够用于石油污染的生物修复的实用的微生物，作为石油分解菌，已分离出假单胞杆菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobactor)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)等细菌；念珠菌属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)等酵母〔非专利文献3〕。出于将这些具有石油分解能力的微生物投入到遭污染的环境来分解污染物质、实现净化的目的而一直使用的微生物对高分子(碳数30以上)的烃的分解活性低、而且细胞在高压下会死亡，因此，对于注入地下深处而言在技术方面存在待解决的课题。
通常若对微生物菌体加压则会死亡，因此，必须通过加压来注入微生物的土壤中等深部环境处的生物修复极为困难，开发新型技术极具意义。另外，另一方面，关于芽孢杆菌(Bacillus)属内生孢子，有通过压力而活化和杀菌方面的报道〔非专利文献4〕。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:高畑阳：バイオオーグメンテーションの実用化の可能性と課題(生物强化的实用化的可能性和课题)、环境生物技术学会志、第13卷、19-23、2013年。
非专利文献2:微生物によるバイオレメデイエーション利用指針(基于微生物的生物修复的利用指南)：2005年3月、经济产业省·环境省。
非专利文献3:どんな微生物が石油を分解するか？(什么样的微生物能分解石油？)：独立行政法人制品评价技术基盘机构(生物技术中心主页https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/bioreme2009/knowledge/bacteria/bacteria-1.html)。
非专利文献4:西贤司、加藤良、富田守：Bacillus属芽胞の圧力による活性化と殺菌(芽孢杆菌属内生孢子在压力下的活化和杀菌)、酿造协会志、第50卷(第2期)104110，1995年。
发明内容
发明要解决的问题
到目前为止，作为净化遭石油相关物质污染的环境的方法，虽然已开发出利用具有污染物质分解能力的微生物的方法，但是所有微生物的耐压性均差，在需要通过高压注入到地下深处的工事中，难以实现高效的工事。另外，通常微生物的生存会受到环境温度等的影响，使用时需要注意保存条件、环境条件(温度、压力、pH等)。
用于解决问题的方案
本申请的发明人在开发解决该技术难点的方案时，反复进行了深入研究，从而完成了本申请发明。
作为解决上述现有的生物强化法的难点、能够克服保存和使用时受环境条件限制的方法，对于使用作为对温度、pH、压力等环境压力适应性强的生物体的细菌孢子(内生孢子)〔非专利文献4：西贤司、加藤良、富田守：芽孢杆菌属内生孢子在压力下的活化と杀菌、酿造协会志、第50卷(第2号)104110，1995年〕的工艺进行了深入研究，从而完成了本申请发明。
一般情况下，以往的工艺中使用的微生物会在温度100℃或压力5MPa程度下完全死亡，而本申请发明所开发的菌株为在100℃下也不死亡、在压力200MPa下也不死亡的菌株。
即，筛选出了作为形成内生孢子从而在温度70℃下也能存活的菌株且在有氧条件下分解石油相关物质(烃)的细菌。通过使检索到的多种细菌同时进行作用，从而成功地发挥了连高分子的烃化合物(碳数35以上的烃)也能分解的功能，从而完成了本申请的基本技术发明。
本发明提供以下方案。
〔1〕一种石油相关物质的分解方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物。
〔2〕根据上述〔1〕所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，将微生物和促进微生物增殖的成分组合使用。
〔3〕根据上述〔1〕所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，组合使用生物质材料。
〔4〕根据上述〔1〕所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的孢子。
〔5〕根据上述〔1〕所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，芽孢杆菌(Bacillus)属细菌为与选自由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)组成的组中的菌的基因同源性高的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。
〔6〕根据上述〔1〕所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，分解土壤中的高分子(碳数30以上)的石油相关物质。
〔7〕根据上述〔1〕所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，将芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)的菌体或孢子与芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)的菌体或孢子组合使用。
〔8〕一种分解除去水中的烃的方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属细菌分解除去水中的烃。
〔9〕一种烃类的生物化学分解方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物。
〔10〕一种芽孢杆菌(Bacillus)属细菌或其孢子，其特征在于，其为与选自由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)组成的组中的菌的基因同源性高的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，且具有石油相关物质分解活性。
〔11〕一种微生物，其特征在于，其选自由芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)和其后代、芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)和其后代、和它们的孢子(内生孢子)组成的组。
〔12〕一种环境污染物质去除剂，其特征在于，含有芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)的菌体或孢子以及含有芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)的菌体或孢子作为有效成分。
发明的效果
本发明提供对高温和高压具有耐受性、且具有优异的石油相关物质分解能力的微生物。通过本发明，能够克服环境污染物质去除剂受保存、使用时的环境条件限制的问题，能够提供使用对温度、pH、压力等环境压力适应性强的生物体的、有用性高的、利用了优异的石油相关物质分解能力的生物修复技术、尤其是生物强化技术。例如，本发明所开发的菌株为在100℃下也不死亡、在压力200MPa下也不死亡的菌株，其为形成内生孢子从而在高温下也能存活的菌株，具有在有氧条件下分解石油相关物质(例如烃等)的特征，而且，通过使多种菌同时进行作用，能够发挥连高分子的烃化合物(碳数35以上的烃等)也能分解的优异能力。
通过以下的记载，本领域技术人员将更加清楚本发明的其它目的、特征、优异性和其所持观点。但是，包括以下记载和具体实施例等记载在内的本件说明书的记载是用于示出本发明的优选方式的，应理解其仅是为了说明而示出的。本领域技术人员可根据以下的记载和来自本说明书的其它部分的知识容易地在本说明书所公开的本发明的意图和范围内进行各种变化和/或改变(或修饰)。本说明书所引用的全部专利文献和参考文献是出于说明目的而引用的，它们应被解释为其内容作为本说明书的一部分而包含在本申请中。
附图说明
图1示出了显示sf-1菌和sf-5菌的培养液中的润滑油分解情况的替代附图的照片。培养基：蛋白胨0.5％、酵母提取物0.5％、润滑油5％、用氢氧化钠调节为pH7.0。培养条件：28℃、振荡培养100rpm、36小时。对照中未接种菌，其它条件相同。
图2为关于实施例1中发现和分离的sf-1株的、株式会社TechnoSuruga Labo出具的报告书。
图3为关于实施例1中发现和分离的sf-5株的、株式会社TechnoSuruga Labo出具的报告书。
图4示出用sf-1株和sf-5株组合处理的、含有柴油的土壤试样的GC-FID分析图。
图5示出用sf-1株和sf-5株组合处理的、含有润滑油的土壤试样的GC-FID分析图。
图6示出利用本发明的微生物材料进行反应处理的土壤试样中的烃的GC-FID分析图的变化。
具体实施方式
到目前为止，作为净化遭石油相关物质污染的环境的方法，虽然已开发出利用具有污染物质分解能力的微生物的方法，但是所有微生物的耐压性均差，在需要通过高压注入到地下深处的工事中，难以实现高效的工事。另外，通常微生物的生存会受到环境温度等的影响，使用时需要注意保存条件、环境条件(温度、压力、pH等)。
对于这一课题，本发明中如下所述地摸索了解决方法。
为了解决上述现有的生物强化法的难点，作为能够克服保存和使用时受环境条件限制的方法，对于使用作为对温度、pH、压力等环境压力适应性强的生物体的细菌孢子(内生孢子)〔西贤司、加藤良、富田守：芽孢杆菌属内生孢子在压力下的活化和杀菌、酿造协会志、第50卷(第2号)104110，1995年〕的工艺进行了深入研究，从而完成了本申请发明。
一般情况下，以往的工艺中使用的微生物会在温度100℃或压力5MPa程度下完全死亡，而本申请发明所开发的菌株在100℃下也不死亡、在压力200MPa下也不死亡。
本发明中，作为所使用的微生物，对于形成内生孢子从而在温度70℃下也能存活的菌株、在有氧条件下分解石油相关物质(烃)的细菌进行了筛选。通过使检索到的多种细菌同时进行作用，从而成功地连高分子的烃化合物(碳数35以上的烃)也实现了分解，从而完成了本申请的技术发明。
本发明的微生物属于芽孢杆菌(Bacillus)属，具有在有氧条件下分解石油相关物质、例如烃的能力。本发明的微生物虽然润滑油分解活性弱，但是其产生具有表面活性功能的物质而促进其它微生物分解润滑油，而且其润滑油分解活性可以被其它生产具有表面活性功能的物质的微生物增强。作为本发明的微生物，可列举以分解石油制品、例如润滑油的活性为指标而培养筛选出的微生物，作为这样的微生物，可例示本发明人分离出的sf-1株、sf-5株等。
对这些菌株的核糖体DNA(16S rDNA-500)的碱基序列、即序列表的序列号1(SEQID NO:1)、序列表的序列号2(SEQ ID NO:2)的同源性分析表明，与选自由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)PD-A10T株、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NBRC15535T株和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CR-50T株组成的组中的菌显示高的基因同源性(例如99.6％的同源性)，本发明的芽孢杆菌(Bacillus)属菌可包括具有高于该同源性的基因同源性的菌。
本发明的微生物中，除了包括sf-1株、sf-5株以外还包括与这些菌株显示一定的相似性的微生物。显示一定的相似性的微生物例如是指：核糖体DNA(16S rDNA-500)的碱基序列与上述2个菌株相似的微生物。具体而言，与上述菌株显示一定的相似性的微生物包括：核糖体DNA(16S rDNA-500)的碱基序列与序列号1或序列号2中记载的碱基序列99.7％以上、优选99.8％以上、特别优选99.9％以上同源的微生物。
这样的与上述菌株显示一定的相似性的微生物可以以石油相关物质、例如挥发油的分解活性为指标利用实施例1中记载的方法分离；或者可以从土壤试样中以序列号1～2中记载的碱基序列为指标来分离。
关于本发明的微生物的培养、增殖，可列举常规培养方法。培养优选在有氧条件下进行。培养时，使用含有该微生物所同化的、能够同化的碳源、氮源等的培养基。作为碳源，可以是该微生物所同化或能够同化的任意碳源，可列举例如葡萄糖、蔗糖、果糖、糖蜜、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解产物、糊精等糖类或碳水化合物、石蜡等，进一步地，可列举乙酸、柠檬酸、丁酸、富马酸、苯甲酸等有机酸类；甲醇、乙醇、丁醇、甘油等醇类；油酸、硬脂酸等脂肪酸和其酯类；大豆油、菜籽油、猪油等油脂类，它们可以单独使用或混合使用。
作为氮源，可以为能够同化的任意氮源，可列举例如氨、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵、磷酸铵等铵盐类；硝酸钠、硝酸钾等硝酸盐类；尿素、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、玉米蛋白粉、酪蛋白水解物、麸皮、酵母提取物、干燥酵母、各种发酵菌体和其消化物、大豆粉、大豆粕和大豆粕水解物、棉籽粉、肉提取物、其它有机或无机的含氮物等，它们可以单独使用或混合使用。培养基中可以任选适宜添加无机盐类、矿物质、维生素、微量金属盐等营养素。
关于作为无机盐而添加于培养基的物质，可列举磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、其它根据需要的微量金属盐。另外，作为用于促进本发明的微生物增殖的营养源，可以适量添加维生素等。此外，可以适宜选择使用该领域中通常使用的物质。在包含有机物、无机盐、氮源、其它营养源的培养基等中接种本发明的微生物，通过例如静置培养法、振荡培养法、深部通气搅拌培养法等在有氧条件下进行培养。
上述培养中的温度条件设为所使用的微生物的生长温度范围、优选最适生长温度范围。例如，可以设为20～30℃、优选25℃。需要说明的是，培养基的pH可以设在6.5～7.5的范围。
培养时间根据营养源的量、种类而不同，可按照使其实现充分增殖的方式来选择。例如，培养时间可以为数分钟、数小时、或者数天。
本发明的微生物可以用于遭石油相关物质污染的环境的净化。即，本发明提供一种环境污染物质去除剂，其含有微生物作为有效成分。这里所称的“环境”除了包括土壤、海洋、湖沼、河流、地下水之外，还包括排水等。另外，可以为也包括废弃物、例如工业废弃物、家庭废弃物、工厂废弃物、工厂排水等的意思。环境的净化如下进行：将在上述条件下培养的微生物的培养液、含有该微生物的孢子(内生孢子)的液体、或者对微生物或其芽孢进行冷冻干燥处理而得的干燥粉末撒入或注入污染环境。此时，可以将多种微生物组合使用；或者，可以将微生物与辅助增殖的成分、无机盐类混合·造粒，制剂化而形成粉末状和颗粒状等，将其撒到污染环境中。处理中使用的微生物的量可根据土壤和海水的污染状况等任意设定。另外，被污染的排水的净化同样可以通过将上述培养液或干燥菌体与污染排水混合、在有氧条件下培养来进行。
本发明中作为对象的“石油相关物质”可包括液状的化石燃料，可以包括例如：原油；对原油进行纯化分离而制造的石油制品，例如汽油、煤油、轻油、重油、润滑油、发动机油、柴油、石蜡、焦油、沥青等；以及，作为它们的成分的直链状烷烃、支链状烷烃、环烷烃、烷基环烷烃等饱和烃；不饱和脂肪族烃；苯、甲苯、萘、菲、蒽等芳香族烃；这些烃的衍生物、硫化物、氮化物、氧化物等。该石油相关物质中，也可以包括源自石油制品的通过有机合成技术产生的对环境有不良影响的物质。
本发明还涉及：将多种对高温、高压等显示耐受性的该微生物组合使用，从而得到更优异的石油相关物质分解性能的技术。例如，通过将芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)的菌体或孢子与芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)的菌体或孢子作为有效成分组合使用，能够良好地分解以往认为难以分解的高分子的烃、例如C30程度的高分子的烃。而且，本发明还提供：将对于该微生物而言同化或能够同化的生物质材料、以及显示成长促进活性的生物质材料组合使用的技术。通过组合使用该生物质材料，还能够得到更优异的石油相关物质分解性能，能够实现高效的环境净化。作为该生物质材料，可列举各种源自生物的物质。例如，包括上述培养中利用的营养源等，可利用各种形态的生物质材料。而且，作为该生物质材料，可以从该领域、其它领域中已知可被生物利用的物质中选择、使用，可列举例如废弃物系生物质、未利用生物质、来自资源作物的生物质。作为废弃物系生物质，可列举例如废弃的纸、纸浆废液、家畜排泄物、食品废弃物、建筑废弃木材、伐木场的废材、锯末、树木的枝叶、草、污水污泥、污水有机物等。作为未利用生物质，可列举例如稻草、麦杆、谷壳、农作物的未利用部分、海草、浮游生物等。作为来自资源作物的生物质，可列举例如甘蔗、玉米等。进一步地，本发明中，组合使用表面活性剂等具有将油性成分乳化的活性的物质、或组合使用产生此种成分的微生物的方式是有利的。顺带说明一下，芽孢杆菌af-1菌生产具有表面活性功能的物质。
以下列举实施例来具体说明本发明，但是该实施例仅仅是为了说明本发明、参考其具体方式而提供的。这些例示用于说明本发明的特定的具体的方式，不表示对本申请所公开的发明的范围进行限定或限制。应理解，本发明可以为基于本说明书的思想的各种实施方式。
除非另有详细记载，否则全部实施例均使用标准的技术来实施、或均可以使用标准的技术来实施，这些技术对于本领域技术人员而言是公知惯用的。
后述的实施例1中记载的sf-1株于2018年6月7日保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8(邮政编码292-0818)的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)而保管(识别代码芽孢杆菌af-1、保藏编号NITE P-02735、保藏日:2018年6月7日)。另外，后述的实施例1中记载的sf-5株于2018年6月7日保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2丁目5番地8(邮政编码292-0818)的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)而保管(识别代码芽孢杆菌af-5、保藏编号NITE P-02736、保藏日:2018年6月7日)。
实施例1
〔具有石油相关物质分解能力的菌株的获得和石油相关物质分解活性的定性〕
通过下述方法对具有石油相关物质分解能力的菌株进行了检索。
即，向口径1.3cm的玻璃制试管中加入灭菌后的液体(包含0.5％的蛋白胨和0.1％的酵母提取物的水溶液)5mL和0.5mL～1.0mL的润滑油，进行搅拌。
将其作为筛选培养基，少量添加分离源样品，在27℃下振荡培养。
对于该培养液而言，在静置时，石油相关物质会在液体上表面形成层而与培养液层分离，将该石油层通过培养而减少的样品的培养液层反复移植到上述筛选培养基中，从而富集培养微生物。
将该筛选培养的一例示于图1的照片，通过该方法收集认为有润滑油分解活性的菌株。顺带说明，在本发明的研究中发现，如本实施例所示那样形成包含石油分解菌的球状的液泡(参照图1的照片)，能够以其为指标容易地检测石油分解菌。
通过该方法，以大阪府堺市内的土壤为试样来检索具有分解石油(润滑油)的活性的微生物，从市内的污泥中分离出符合目的的细菌(称为sf-1株)和(称为sf-5株)的2个菌株。sf-1株虽然润滑油分解活性弱，但是产生具有表面活性功能的物质，促进sf-5株分解润滑油。
实施例2
本发明涉及使用sf-1株和/或sf-5株这两个菌株的、石油污染的净化方法，以下所示的实施例中，只要没有特别声明则使用下述所示的石油相关物质〔分解活性测定方法〕。
本发明涉及的遭石油相关物质污染的土壤的净化活性的测定(以下记作活性测定)按照下述方法来进行。
使用的土壤样品收集自对大阪府内的山林进行平整而形成的农场用地。关于石油污染土壤的试样，使用从上述农场用地的距离表面的深度为约1米处收集的土壤并使其吸附柴油和/或润滑油而制备。柴油和润滑油均使用日本国内销售的商品。
向其中添加sf-1株和sf-5株的芽孢的混合物(M-U)和可诱发、促进M-U中的芽孢的发芽/增殖的材料(A-U)，充分搅拌，作为活性测定用样品。
活性测定通常下述步骤来进行。即，使上述活性测定用样品在27℃下反应，通过下述〔石油相关物质的提取方法〕所示的方法提取样品中的石油相关物质，通过测定提取物的重量变化的重量法和表1所示的条件下的气相色谱法(GC-FID)来进行分析。
[表1]
气相色谱(GC-FID)的条件
Figure BDA0002962125470000121
〔分解活性的测定法〕
按照下述方法进行本发明的遭石油相关物质污染的土壤(和/或称为污染土壤标准品)的净化活性的测定(以下记作活性测定)。
向土壤标准品中以指定的重量比添加柴油或润滑油，用搅拌机充分搅拌，作为石油污染土壤样品。向其中添加M-U和A-U，用搅拌机充分搅拌，作为活性测定用样品。
活性测定通常下述步骤来进行。即，使上述活性测定用样品在27℃下反应，通过下述〔石油相关物质的提取方法〕的方法提取样品中的石油相关物质，通过测定重量变化的重量法和表1所示的条件下的气相色谱法(GC-FID)来进行分析。
〔石油相关物质的提取方法〕
从土壤标准品提取石油相关物质的标准步骤如下。即，(1)将5g土壤样品放入50mL容积的FALCON管中，(2)向其中添加15g Na2SO4和15mL正己烷，进行搅拌，提取石油相关物质，(3)通过过滤来收集提取液。将该操作重复3次，作为提取液。(4)将该提取液减压浓缩而除去正己烷，收集石油相关物质，进行称量，测定石油相关物质的含量。通过该方法测定M-U和A-U的石油相关物质分解活性。
另外，也通过基于表1所示的条件的气相色谱按照常规分析方法测定了石油相关物质的含量。
实施例3
〔菌株sf-1和菌株sf-5的鉴定〕
实施例1中发现和分离的sf-1株和sf-5株均为好氧细菌，为形成芽孢的革兰氏阳性杆菌。这些性质表明其为在分类学上属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌。
另外，根据核糖体DNA(16S rDNA-500)的同源性分析(图2和图3)，这2个菌株均被鉴定为与暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)近缘(同源率99.6％)的芽孢杆菌属未定名种(Bacillus sp.)。
将从菌株sf-1和菌株sf-5提取的16S rDNA-500的碱基序列(来自株式会社TechnoSuruga Labo的报告书)示于以下。
sf-1株的DNA的碱基序列〔序列表的序列号1(SEQ ID NO:1)〕
(sf-1株的DNA的碱基序列)
Figure BDA0002962125470000131
sf-5株的DNA的碱基序列〔序列表的序列号2(SEQ ID NO:2)〕
(sf-5株的DNA的碱基序列)
Figure BDA0002962125470000141
另外，通过BLAST检索显示最高同源性的种(基准株)为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)PD-A10T株、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NBRC15535 T株、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CR-50T株，综合考察的结果，鉴定为与暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)近缘的芽孢杆菌属未定名种(Bacillus sp.)(株式会社TechnoSuruga Labo出具的报告书：图2和图3)。顺带一提，暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)为多次从PIUKEM(原产泰国的河蟹的腌渍物)中分离出的菌种，是被评价为生物安全水平1(图2和图3：根据日本细菌学会生物安全指南)的安全性高的菌株。
根据这些事实，判定sf-1株和sf-5株为极适合于使用大量微生物菌体进行石油污染的净化(生物强化)的微生物。需要说明的是，通过使用小鼠的动物试验确认，经口急性毒性和迟发型超敏反应均为阴性。
实施例4
〔通过组合使用sf-1株和sf-5株进行的柴油和润滑油的分解〕
本发明中使用的土壤标准品均收集自日本国平整山林而成的农业用地。作为微生物材料，使用(1g中分别含有107个sf-1株和sf-5株的芽孢的粉末：以下称为M-U)。
进一步地，开发了作为具有微生物材料的发芽/增殖活性的材料的A-U。A-U的成分只要为具有芽孢的发芽和该菌株的增殖活性的物质即可，可以为单质也可以为混合物，其组成没有限制。例如，可以使用糖质、蛋白质、酵母提取物、核酸、磷酸、钾、钙、镁盐等的混合物，以单品或混合物的任一形式使用均可。若示出本发明的A-U的一例，为包含葡萄糖2％、蛋白胨0.5％和酵母提取物0.3％的混合物。
以下，将表2所示的组成的土壤标准品100g添加到500mL容积的塑料制容器中，盖上棉塞，在27℃下反应，进行柴油和润滑油的分析，评价M-U的效果。
[表2]
利用微生物材料对遭石油制品污染的土壤的净化活性的评价试验的条件
Figure BDA0002962125470000151
其结果是，对比表3～6中的1-1与1-2或对比1-3与1-4的结果可知，与前者相比，后者的柴油或润滑油的分解速度均大。
[表3]
反应物1-1中的柴油的含量变化
反应时间(天) 柴油浓度(ppm)
7 4,700
14 4,100
21 3,900
35 3,600
[表4]
反应物1-2中的柴油的浓度变化
反应时间(天) 柴油浓度(ppm)
7 2,600
14 1,650
21 1,530
35 1,160
[表5]
反应物1-3中的润滑油的浓度变化
反应时间(天) 润滑油浓度(ppm)
7 4,300
14 4,100
21 3,950
35 2,940
[表6]
反应物1-4中的润滑油的浓度变化
反应时间(天) 润滑油浓度(ppm)
7 4,680
14 1,450
21 1,280
35 1,100
由此证明，微生物(M-U)的投入量与柴油、润滑油的除去量有相关性，证明本发明技术所分离的菌株对除去柴油污染有效。
实施例5
对于实施例4示出的表2所示的条件的1-2、1-4，通过GC-FID法(气相色谱法)研究了柴油、润滑油的分解状态。将其结果在图4、图5中进行比较并示出。根据这些结果，认为本发明的方法可以使以往较为困难的润滑油的微生物分解以恒定的速度进行，分解反应与投入的M-U的量有相关性，为能够用于润滑油的净化的方法。
另外，根据利用GC-FID法得到的分析结果可知，该方法能够分解C30(碳数30、色谱图中的最大峰值的部分)程度的高分子的烃。根据目前的见解，C30程度的高分子的烃的微生物分解并非易事，因此本发明的技术可以说是极重要的技术。
实施例6
在增加土壤量的条件下进行了润滑油的净化试验。即，向3kg的土壤样品中添加润滑油10,000ppm，用转鼓式的混合机充分搅拌。再向其中添加M-U 60g、A-U 90g和水750mL，充分搅拌，作为净化用试样。将该试样放入木箱(14m×13cm×16cm)中，将试样的上表面用被水润湿的棉布覆盖。将该木箱置于恒温器的上部，在恒温器的下部放入了装有水的托盘，在25℃下反应。
反应中，以1周的间隔采集距离试样表面5cm深度处的土，测定石油相关物质的浓度。将测定结果示于表7和图6，通过22间的反应，达到了土壤中检测不到润滑油的状态。这些结果证明了本发明对遭石油相关物质污染的土壤的净化有效性。
[表7]
反应土壤中的润滑油浓度的变化(GC-FID分析值)
反应时间(周) 润滑油浓度(ppm)
0 6,780
2 3,140
4 3,900
6 3,350
16 1,210
22 检测不到
产业上的可利用性
本发明中，发现了对高温、高压的耐受性优异、对高分子(碳数30以上)的烃等也显示优异的分解活性的微生物，为能够投入到土壤深处的石油相关物质净化技术，为能够用于石油污染的生物修复的实用技术。根据本发明，能够利用耐压性优异的微生物，在需要通过高压注入到地下深处的工事中，能够实现高效的工事，能够有利地净化遭石油相关物质污染的环境。本发明能够帮助遭有害物质污染的土地、地下水的安全且廉价的净化手段的开发。
显而易见的是，本发明可以以上述的说明和实施例中明确记载的方式以外的方式来进行。能够根据上述教导来进行本发明的多种改变和变形，因此这些也包括在本申请所附的权利要求书的范围内。
保藏编号
芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌af-1株:NITE P-02735
芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌af-5株:NITE P-02736
序列号1,16S-rDNA
序列号2,16S-rDNA
序列表
<110> IGA生物研究股份有限公司(IGA BIO RESEARCH CO.,LTD)
<120> 遭石油相关物质污染的环境的净化方法和所使用的材料
<130> PH30-016ST（整理编号）
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌 sf-1(Bacillus sp. af-1)
<220>
<221> 来源
<222> (1)..(498)
<223> 16S-rDNA
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgc 498
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌sf-5(Bacillus sp. af-5)
<220>
<221> 来源
<222> (1)..(498)
<223> 16S-rDNA
<400> 2
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgc 498

Claims (12)

1.一种石油相关物质的分解方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物。
2.根据权利要求1所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，将微生物和促进微生物增殖的成分组合使用。
3.根据权利要求1所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，组合使用生物质材料。
4.根据权利要求1所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的孢子。
5.根据权利要求1所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，芽孢杆菌(Bacillus)属细菌为与选自由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)组成的组中的菌的基因同源性高的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。
6.根据权利要求1所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，分解土壤中的高分子(碳数30以上)的石油相关物质。
7.根据权利要求1所述的石油相关物质的分解方法，其特征在于，将芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)的菌体或孢子和芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)的菌体或孢子组合使用。
8.一种分解除去水中的烃的方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属细菌分解除去水中的烃。
9.一种烃类的生物化学分解方法，其特征在于，使用芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物。
10.一种芽孢杆菌(Bacillus)属细菌或其孢子，其特征在于，其为与选自由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)组成的组中的菌的基因同源性高的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，具有石油相关物质分解活性。
11.一种微生物，其特征在于，其选自由芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)和其后代、芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)和其后代、和它们的孢子(内生孢子)组成的组。
12.一种环境污染物质去除剂，其特征在于，含有芽孢杆菌af-1株(保藏编号:NITE P-02735)的菌体或孢子以及含有芽孢杆菌af-5株(保藏编号:NITE P-02736)的菌体或孢子作为有效成分。
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