TW202016292A - 遭石油相關物質污染之環境的除污方法及使用之材料 - Google Patents
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Abstract
於利用微生物對遭石油相關物質污染之環境進行除污之技術中，存在習知之任何之微生物均耐壓性較低，對於需要以高壓較深地注入至地下之工程而言較為困難之問題。又，於很多情形時，存在微生物之生存受到環境之溫度等影響，使用時需要細心地注意保存或環境之條件(溫度、壓力、pH等)之問題。
本發明提供一種生物修復技術、尤其是生物強化技術，其獲得對於高溫或高壓均具有耐性，另一方面具有優異之使石油相關物質分解之能力之微生物，藉此，使用對於溫度、pH、壓力等環境之負載較強之生物體，利用有用性較高且優異之石油相關物質分解能力。
Description
本發明係關於一種使用微生物對遭石油相關物質污染之土或者(及)水進行除污。
近年來，世界各國正在推進土地之再開發事業或土壤污染對策之法制化，要求開發對於遭有害物質污染之土地或地下水的安全且經濟之淨化手段。國內外自1900年代開始盛行研究土(以下，亦稱為土壤)或環境水質之淨化對策，提供於實用之方法亦不少，但該等方法中，藉由洗淨、熱處理、吸收去除等物理處理法、或利用藥品之分解去除或不溶化等化學處理法者較多。
另一方面，以使石油成分分解之微生物之研究的發展為背景，正在開發活用棲息於污染現場之微生物進行修復之技術(生物刺激)並推進實用化。但是，於生物刺激中存在除污會受到所棲息之微生物之生物功能限定之缺點。現在，作為導入使污染物質完全地分解之微生物，從而高效率地進行除污之手法，生物強化之開發備受期待，生物強化係將使污染物質分解之微生物導入至污染土中並保持為高濃度之方法[非專利文獻1]。日本國之經濟產業省及環境省於2005年3月通告了「利用微生物之生物修復利用指南」作為於將微生物導入至土中、地下水污染位置進行淨化之情形時的準則[非專利文獻2]。該指南雖為對使用微生物之安全性與除污技術方法
進行官方認證的制度，但尚未廣泛地普及。
需要選擇性地使有用之微生物於自然環境下活化之生物強化中，必須將含有微生物之水溶液藉由加壓而投入之情形較多。
迄今為止，作為能夠利用於石油污染之生物修復之實用之微生物，分離出假單胞菌(Pseudomonas)屬、不動桿菌(Acinetobactor)屬、赤球菌(Rhodococcus)屬、不動菌(Acinetobacter)屬等細菌，念珠菌(Candida)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬等酵母作為石油分解菌[非專利文獻3]。以將該等具有石油分解能力之微生物投入至遭污染之環境，使污染物質分解而進行除污為目的，迄今為止所使用之微生物之高分子(碳數30以上)之烴之分解活性較低，進而細胞於高壓下會死絕，因此為了投入至較深之地下，於技術上有需解決之課題。
一般而言，由於微生物菌體一旦加壓就會死絕，因此必須藉由加壓而投入微生物之土中等深部環境中之生物修復極其困難，新穎技術之開發極為有意義。又，另一方面，關於桿菌(Bacillus)屬芽孢，亦有與藉由壓力進行活化與殺菌有關之報告[非專利文獻4]。
非專利文獻1：高畑 陽：生物強化之實用化之可能性與課題，環境生物技術學會雜誌，第13卷，19-23，2013年。
非專利文獻2：微生物之生物修復之利用指南：2005年3月，經濟產業省、環境省。
非專利文獻3：什麼樣的微生物使石油分解？：獨立行政法人製品評價技術基盤機構(參照生物技術中心主頁https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/bioreme2009/knowledge/bacteria/bacteria-1.html)。
非專利文獻4：西 賢司、加藤 良、富田 守：桿菌屬芽孢之藉由壓力之活化與殺菌，釀造協會雜誌，第50卷(第2號)104110，1995年。
迄今為止，正在開發利用具有污染物質之分解能力之微生物的方法作為對遭石油相關物質污染之環境進行除污的方法，但任何之微生物均耐壓性較低，對於需要以高壓較深地注入至地下之工程而言，難以成為效率高之工程。又，於很多情形時，微生物之生存受到環境之溫度等影響之情形較多，使用時需要細心地注意保存或環境之條件(溫度、壓力、pH等)。
本案發明人對解決該技術上之難點之手段之開發加以潛心研究，從而完成本案發明。
作為可解決上述習知之生物強化法之難點，且消除保存或使用時之環境條件之限制之方法，對使用細菌之孢子(芽孢)[非專利文獻4：西 賢司、加藤 良、富田 守：桿菌屬芽孢之藉由壓力之活化與殺菌，釀造協會雜誌，第50卷(第2號)104110，1995年]作為對溫度、pH、壓力等環境之負載較強之生物體的實施方法進行潛心研究，從而完成本案發明。
且說，習知之實施方法中所使用之微生物於溫度100℃、或者壓力5MPa左右下會完全死絕，但本案發明中所開發之菌株係即便於100℃下也不會死絕，且於壓力200MPa下也不會死絕之菌株。
即，於形成芽孢，且即便於溫度70℃下亦可生存之菌株中，挑選出於好氧之條件下使石油相關物質(烴)分解之細菌。藉由使檢索出之數種細菌同時作用，而成功地發揮使高分子之烴化合物(碳數35以上之烴)亦分解之功能，從而完成本案之基礎技術發明。
本發明提供以下之態樣。
一種石油相關物質之分解法，其特徵在於其使用桿菌(Bacillus)屬之微生物。
如上述[1]所記載之石油相關物質之分解法，其併用微生物與促進微生物之增殖之成分。
如上述[1]所記載之石油相關物質之分解法，其併用生質物質。
如上述[1]所記載之石油相關物質之分解法，其使用桿菌(Bacillus)屬細菌之孢子。
如上述[1]所記載之石油相關物質之分解法，其中，桿菌(Bacillus)屬細菌係與選自由暹羅芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、及貝萊斯芽孢桿菌所組成之群者的基因之同源性較高的桿菌(Bacillus)屬細菌。
如上述[1]所記載之石油相關物質之分解法，其使土壤中之高分子(碳數30以上)之石油相關物質分解。
如上述[1]所記載之石油相關物質之分解法，其併用桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)之菌體或孢子、與桿菌屬af-5菌
株(寄存編號：NITE P-02736)之菌體或孢子。
一種方法，其特徵在於其使用桿菌(Bacillus)屬細菌將水中之烴分解去除。
一種烴類之生物化學性分解法，其特徵在於其使用桿菌(Bacillus)屬之微生物。
一種桿菌(Bacillus)屬細菌或其孢子，其特徵在於其係與選自由暹羅芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、及貝萊斯芽孢桿菌所組成之群者的基因之同源性較高的桿菌(Bacillus)屬細菌，且具有石油相關物質之分解活性。
一種微生物，其特徵在於其係選自由桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)及其後代、桿菌屬af-5菌株(寄存編號：NITE P-02736)及其後代、及其等之孢子(芽孢)所組成之群。
一種環境污染物質去除劑，其特徵在於其含有桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)之菌體或孢子、與桿菌屬af-5菌株(寄存編號：NITE P-02736)之菌體或孢子作為有效成分。
藉由本發明而提供一種對於高溫或高壓均具有耐性，另一方面具有優異之使石油相關物質分解之能力之微生物。藉由本發明，能夠消除環境污染物質去除劑中之保存或使用時之環境條件之限制等問題，且可提供一種生物修復技術、尤其是生物強化技術，其使用對於溫度、pH、壓力等環境之負載較強之生物體，利用了有用性較高且優異之石油相關物質分解能力。例如，本發明中所開發之菌株係即便於100℃下也不會死絕，且於壓力200MPa下也不會死絕之菌株，其於形成芽孢，且即便於高溫亦可生存之菌株
中，具有於好氧之條件下使石油相關物質(例如烴等)分解之特徵，進而可藉由使數種細菌同時作用，而發揮使高分子之烴化合物(碳數35以上之烴等)亦分解之優異之能力功能。
至於本發明之其他目的、特徵、優秀性及其所具有之觀點，本領域技術人員可根據以下之記載而理解。然而，希望理解為包含以下之記載及具體之實施例等記載在內之本案說明書之記載係表示本發明之較佳之態樣者，其所表示之內容僅用於說明。本領域技術人員可根據以下之記載及本說明書之其他部分之知識而容易地理解於本說明書所揭示之本發明之意圖及範圍內完成各種變化及/或改變(或者修飾)。本說明書中所引用之所有之專利文獻及參考文獻係以說明為目的而引用者，該等應作為本說明書之一部分並將其內容包含於本文中進行解釋。
圖1表示顯示sf-1菌株及sf-5菌株分解培養液中之潤滑油之情況之圖式代用照片。培養基：蛋白腖0.5%、酵母萃取物0.5%、潤滑油5%、藉由氫氧化鈉調整為pH7.0。培養條件：28℃，振盪培養100rpm、36小時。對照係不進行植菌，而其他條件相同者。
圖2係關於實施例1中表現、單離之sf-1菌株的TechnoSuruga Laboratory股份有限公司之報告書。
圖3係關於實施例1中表現、單離之sf-5菌株的TechnoSuruga Laboratory股份有限公司之報告書。
圖4表示sf-1菌株與sf-5菌株之併用處理中之含有柴油之土試樣之GC-FID分析之圖表。
圖5表示sf-1菌株與sf-5菌株之併用處理中之含有潤滑油之土試樣之GC-FID分析之圖表。
圖6表示藉由本發明之微生物材料進行了反應處理之土試樣中之烴之GC-FID分析之圖表之變化。
迄今為止，正在開發利用具有污染物質之分解能力之微生物作為遭石油相關物質污染之環境的除污方法，但任何之微生物均耐壓性較低，對於需要以高壓較深地注入至地下之工程而言，難以做到高效率地注入。又，於很多情形時，微生物之生存受到環境之溫度等影響之情形較多，使用時需要細心地注意保存或環境之條件(溫度、壓力、pH等)。
於本發明中，依以下方式探索此種課題之解決方法。
作為以解決上述習知之生物強化法之難點為目的，可消除保存或使用時之環境條件之限制的方法，有使用細菌之孢子(芽孢)[西賢司、加藤良、富田守：桿菌屬芽孢之藉由壓力之活化與殺菌，釀造協會雜誌，第50卷(第2號)104110，1995年]作為對於溫度、pH、壓力等環境之負載較強之生物體之實施方法，對於此種實施方法進行潛心研究，從而完成本申請案之發明。
且說，習知之實施方法中所使用之微生物於溫度100℃、或者壓力5MPa左右下會完全死絕，但本案發明中所開發之菌材即便於100℃也不會死絕，且於壓力200MPa下也不會死絕。
作為本發明中所使用之微生物，於形成芽孢，且即便於溫度70℃亦可生存之菌株中，挑選出於好氧之條件下使石油相關物質(烴)分解之細菌。成功地使該細菌發揮了以下之功能：藉由使檢索出之
數種細菌同時作用，而成功地發揮使高分子之烴化合物(碳數35以上之烴)分解之功能，從而完成本申請案之技術發明。
本發明之微生物係屬於桿菌(Bacillus)屬，且具有於好氧之條件下使石油相關物質、例如烴分解之能力者。本發明之微生物可為潤滑油之分解活性雖然微弱，但生產具有界面活性功能之物質，促進其他微生物之潤滑油之分解者，進而其潤滑油之分解活性可藉由生產其他具有界面活性功能之物質之微生物而增強。關於本發明之微生物，可列舉以使石油製品、例如潤滑油分解之活性為指標進行培養篩選者，作為此種微生物，可例示由本發明人所單離之sf-1菌株、sf-5菌株等。
根據對於該等菌株之核糖體DNA(16S rDNA-500)之鹼基序列、即序列表之序列編號1(SEQ ID NO：1)或序列表之序列編號2(SEQ ID NO：2)之同源性之分析，表現出與選自由暹羅芽孢桿菌PD-A10T菌株、解澱粉芽孢桿菌NBRC 15535T菌株、及貝萊斯芽孢桿菌CR-50T菌株所組成之群者較高之基因之同源性(例如，99.6%之同源性)，但本發明之桿菌(Bacillus)屬菌亦可包含具有較該同源性高之基因同源性者。
本發明之微生物中，除sf-1菌株、sf-5菌株以外，亦含有與該等菌株表現出一定類似性之微生物。所謂表現出一定類似性之微生物，是指例如核糖體DNA(16S rDNA-500)之鹼基序列與上述2種菌株類似之微生物。具體而言，與上述菌株表現出一定類似性之微生物包含以下之微生物：核糖體DNA(16S rDNA-500)之鹼基序列與序列編號1或序列編號2所記載之鹼基序列99.7%以上同源，較佳為99.8%以上同源，特佳為99.9%以上同源。
此種與上述菌株表現出一定類似性之微生物可利用以石油相關物質、例如揮發油之分解活性為指標的實施例1所記載之手法，自土壤試樣中，以序列編號1~2所記載之鹼基序列為指標而單離。
對本發明之微生物進行培養而使其增殖，可列舉通常之培養法。培養較佳為能夠於好氧之條件下進行。於培養中使用含有該微生物可同化、合成代謝之碳源或氮源等之培養基。作為碳源，若為該微生物可同化、合成代謝者，則可為任意之碳源，例如可列舉：葡萄糖、蔗糖、果糖、糖蜜、澱粉、可溶性澱粉、澱粉水解物、糊精等糖類或者碳水化合物、石蠟類等，進而可列舉：醋酸、檸檬酸、丁酸、反丁烯二酸、苯甲酸等有機酸類，甲醇、乙醇、丁醇、甘油等醇類，油酸、硬脂酸等酯肪酸及其酯類，大豆油、菜籽油、豬油等油脂類等，該等可單獨或混合使用。
作為氮源，若為可合成代謝者，則可為任意之氮源，例如可列舉：氨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨、磷酸銨等銨鹽類，硝酸鈉、硝酸鉀等硝酸鹽類，脲、蛋白腖、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、玉米筋粉、酪蛋白水解物、麥麩、酵母萃取液、乾燥酵母、各種醱酵菌體及其消化物，大豆粉、大豆粕及大豆粕水解物、棉籽粉、肉汁、其他有機或無機之含氮物等，該等可單獨或混合使用。亦可於培養基中任意地適當添加無機鹽類、礦物質、維生素、微量金屬鹽等營養素。
作為無機鹽而添加於培養基中之物質，可列舉：磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、其他視需要之微量金屬鹽。進而，亦可適量添加維生素等作為用於促進本發明之微生物之增殖之營養源。此外，可適當選擇並使用於該領域中所通常使用者。將本發明之微生
物接種於含有有機物、無機鹽、氮源、其他營養源之培養基等中，利用例如靜置培養法、振盪培養法、深部通氣攪拌培養法等於好氧之條件下進行培養。
上述培養中之溫度條件係設定為所使用之微生物之生長溫度之範圍，較佳係設定為最佳生長溫度之範圍。可設定為例如20~30℃，較佳為25℃。再者，培養基之pH若設定為6.5~7.5之範圍即可。
培養時間係因營養源之量或種類而異，可以能夠達成充分之增殖之方式進行選擇。例如，培養時間可為數分鐘，可為數小時，亦可為數日。
本發明之微生物可利用於遭石油相關物質污染之環境的淨化。即，本發明提供一種含有微生物作為有效成分之環境污染物質去除劑。此處，所謂之「環境」，除土壤、海洋、湖泊、河川、地下水以外，亦包括排水等。進而，亦可為包含廢棄物、例如產業廢棄物、家庭廢棄物、工廠廢棄物、工廠排水等之含義。環境之淨化係藉由使以下物質分散或注入至污染環境中而進行：於上述條件下培養之微生物之培養液、該微生物之孢子(芽孢)含有液、或者對微生物或其孢子進行冷凍乾燥處理而成之乾燥粉末。此時，亦可使併用有數種微生物，或者對微生物與輔助增殖之成分或無機鹽類進行混合、造粒，且製劑化為粉末狀及顆粒狀等而成者分散於污染環境中。處理所使用之微生物之量，可根據土壤及海水之污染狀況等任意地決定。進而，遭污染之排水之淨化係同樣地將上述培養液或者乾燥菌體與污染排水混合，並於好氧之條件下培養而進行。
本發明中作為對象之所謂「石油相關物質」可包含液狀之化石燃料、例如：原油，藉由對原油進行精製分離而製造之石
油製品、例如：汽油、煤油、輕油、重油、潤滑油、機油、柴油、石蠟、焦油、瀝青等，進而亦可包含屬於其等成分之直鏈狀烷烴、分枝狀烷烴、環烷烴、烷基環烷烴等飽和烴、不飽和脂肪族烴、苯、甲苯、萘、菲、蒽等芳香族烴、其等之烴衍生物、硫化物、氮化物、氧化物等。該石油相關物質亦可包含由源自石油製品之有機合成技術產生出的對環境造成惡劣影響者。
本發明亦關於以下之技術：組合使用數種對於高溫或高壓等顯示出耐性之該微生物，藉此獲得更優異之石油相關物質之分解性能。例如，藉由使用併用桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)之菌體或孢子與桿菌屬af-5菌株(寄存編號：NITE P-02736)之菌體或孢子作為有效成分，可使習知被視為難以分解之高分子之烴、例如C38左右之高分子之烴亦被良好地分解。進而，本發明亦提供使用併用能夠對該微生物進行同化、合成代謝之生質物質，進而展現出成長促進活性之生質物質之技術。藉由併用該生質物質，亦可獲得更優異之石油相關物質之分解性能，且能夠高效率地實現環境之除污。作為該生質物質，可列舉起源於各種生物者。例如，可含有上述培養中所利用之營養源等，亦可利用各種形態之生質物質。並且，作為該生質物質，可自該領域或其他領域中已知能夠生物利用之物質中選擇並利用，例如可列舉：廢棄物系生質、未利用生質、源自資源作物之生質。作為廢棄物系生質，例如可列舉：被廢棄之紙、紙漿廢液、家畜排泄物、食品廢棄物、建設產生木材、製材工廠剩材、鋸屑、樹木之枝葉、草、污水污泥、污水有機物等。作為未利用生質，例如可列舉：稻稈、麥稈、稻殼、農作物之未利用部分、海草、浮游生物等。作為源自資源作物之生質，例如可列
舉：甘蔗、玉米等。進而，於本發明中，併用具有使界面活性劑等油性成分乳化之活性的物質，或併用產生此種成分之微生物之方法亦有利。且說，桿菌屬af-1菌株係生產具有界面活性功能之物質。
以下，揭示實施例而對本發明具體地進行說明，但該實施例僅是用於說明本發明，為了參考其具體之態樣而提供者。該等例示係用於說明本發明之特定之具體態樣者，但並非限定或者限制本申請案中所揭示之申請專利範圍。於本發明中，應理解為能夠實現基於本說明書之思想的各種實施形態。
所有實施例除了另有詳細記載以外，均係使用標準之技術而實施者，或可以實施者，這一點對於本領域技術人員而言係周知且慣用者。
後述之實施例1中所記載之sf-1菌株係自2018年6月7日起被寄存保管於千葉縣木更津市上總鐮足2丁目5號地8(郵遞區號292-0818)之獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)(識別顯示：桿菌屬af-1，寄存編號：NITE P-02735，收置日期：2018年6月7日)。又，後述之實施例1中所記載之sf-5菌株係自2018年6月7日起被寄存保管於千葉縣木更津市上總鐮足2丁目5號地8(郵遞區號292-0818)之獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)(識別顯示：桿菌屬af-5，寄存編號：NITE P-02736，收置日期：2018年6月7日)。
利用下述之手法對具有石油相關物質之分解能力之菌株進行檢索。
即，向口徑1.3cm之玻璃製試管中加入經殺菌後之液體(含有0.5%之蛋白腖與0.1%之酵母萃取液之水溶液)5mL與0.5mL~1.0mL之潤滑油並進行攪拌。
將其作為篩選培養基，少量添加分離源之樣品，於27℃下進行振盪培養。
於該培養液中，靜置後，石油相關物質於液體上表面形成層而與培養液層分離，將該石油層因培養而減少之樣品的培養液層反覆地移植於上述篩選培養基中，對微生物進行增殖培養。
將該篩選培養之一例示於圖1之照片中，利用該手法收集被視為具有潤滑油之分解活性之菌株。且說，於本發明之研究中，如本實施例所示，表現形成包含石油分解菌之球狀之液泡(參照圖1之照片)，將其作為指標，可容易地檢測出石油分解菌。
利用該手法，將大阪府堺市內之土壤作為試樣，進行具有使石油(潤滑油)分解之活性之微生物的檢索，自市內之污泥中單離出符合目標之細菌(稱為sf-1菌株)與(稱為sf-5菌株)之2種菌株。sf-1菌株雖然潤滑油之分解活性微弱，但生產具有界面活性功能之物質，促進sf-5菌株對潤滑油之分解。
本發明係關於使用sf-1菌株及/或sf-5菌株之兩種菌株之石油污染之除污法，但於以下所示之實施例中，只要無特別說明，則使用下述所示之石油相關物質之[分解活性之測定法]。
關於本發明之遭石油相關物質污染之土壤之除污活性之測定
(以下，稱為活性之測定)係依據下述手法而進行。
所使用之土壤品係採取自對大阪府內之山林進行整地並修建完成之農場用地。使用於距離上述農場用地之表面深度約1米處所採取之土，使柴油及/或潤滑油吸附於該土，以此製備石油污染土之試樣。柴油及潤滑油均使用日本國內所市售之商品。
於其中添加sf-1菌株及sf-5菌株之孢子之混合物(M-U)及誘發、促進M-U中之孢子發芽、增殖之素材(A-U)，進行充分攪拌而製成活性測定用樣品。
活性之測定係根據以下之順序進行。即，使上述之活性測定用樣品於27℃下反應，樣品中之石油相關物質係藉由下述之[石油相關物質之萃取法]所示之手法進行萃取，然後藉由測定萃取物之重量之變化的重量法及表1所示之條件下之氣相層析法(GC-FID)進行分析。
[表1]
有關本發明之遭石油相關物質污染之土(及/或稱為污染土標本)之除污活性之測定(以下稱為活性之測定)係依據下述之手法進
行。
以既定之重量比向土標本中添加柴油或者潤滑油，使用摻合器充分地攪拌而製成石油污染土樣品。向該樣品添加M-U及A-U，利用摻合器進行充分攪拌而製成活性測定用樣品。
活性之測定係根據以下之順序進行。即，使上述之活性測定用樣品於27℃下反應，樣品中之石油相關物質亦係藉由下述之[石油相關物質之萃取法]之手法進行萃取，然後藉由測定重量之變化的重量法及表1所示之條件下之氣相層析法(GC-FID)進行分析。
自土標本萃取石油相關物質之標準順序係如下所示。即，(1)將5g之土樣品放入至容量為50mL之Falcon管中，(2)向該管添加15g之Na2SO4與15mL之正己烷，進行攪拌而萃取石油相關物質，(3)過濾並收集萃取液。反覆進行該操作3次而製成萃取液。(4)對該萃取液進行減壓濃縮而去除正己烷，收集並稱量石油相關物質，測定石油相關物質之含量。利用該手法測定M-U及A-U之石油相關物質之分解活性。
又，亦藉由慣例之分析法、即利用表1所示之條件的氣相層析法而測定石油相關物質之含量。
實施例1中所表現、單離之sf-1菌株及sf-5菌株均為好氧性之細菌，且為形成孢子之革蘭氏陽性之桿菌。該等性質係表示於分類學
上被分類為桿菌(Bacillus)屬之細菌。
又，根據核糖體DNA(16S rDNA-500)之同源性之分析(圖2及3)，此2種菌株均被鑑定為與暹羅芽孢桿菌近緣(同源率99.6%)之桿菌屬。
自菌株sf-1與菌株sf-5萃取之16S rDNA-500之鹼基序列(參照TechnoSuruga Laboratory股份有限公司之報告書)示於以下。
sf-1菌株之DNA之鹼基序列[序列表之序列編號1(SEQ ID NO：1)]
sf-5菌株之DNA之鹼基序列[序列表之序列編號2(SEQ ID NO：2)]
[化2](sf-5菌株之DNA之鹼基序列)
又，根據BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，碱基局部比對檢索工具)檢索，展現出最高之同源性之種菌(基準菌株)係暹羅芽孢桿菌PD-A10T菌株、解澱粉芽孢桿菌NBRC 15535T菌株、貝萊斯芽孢桿菌CR-50T菌株，且綜合考察之結果，鑑定為與暹羅芽孢桿菌近緣之桿菌屬(參照TechnoSuruga Laboratory股份有限公司之報告書：圖2及3)。且說，暹羅芽孢桿菌係自醃製蟹(泰國原產之澤蟹之鹽漬物)較多地分離出之菌種，且被評價為生物安全等級1(參照圖2及3：日本細菌學會生物安全指南)之安全性較高之菌株。
根據該等事實，sf-1菌株與sf-5菌株被評價為於使用大量之微生物菌體之石油污染之除污(生物強化)中使用時極其適合之微生物。再者，於使用小鼠之動物實驗中，確認了經口急性毒性及延遲型過敏反應均為陰性。
本發明中所使用之土之標本均採取自於日本國內對山林進行整地而成之農場用地。作為微生物材料，使用(於1g中分別含有107個sf-1菌株與sf-5菌株之孢子的粉末；以下稱為M-U)。
進而，開發A-U作為具有微生物材料之發芽、增殖活性之素材。A-U之成分若為具有孢子之發芽及該菌株之增殖活性之物質，則無論其組成，可為單品或混合物。例如，使用糖類、蛋白質、酵母之萃取物、核酸、磷酸、鉀、鈣、鎂鹽等之混合物，可使用任何單品或混合物。若表示本發明之A-U之一例，係含有葡萄糖2%、蛋白腖0.5%及酵母萃取液0.3%之混合物。
以下，將表2所示之組成之土之標本100g放入至容量為500mL之塑膠製容器中，塞上棉塞，使其於27℃下進行反應，進行柴油與潤滑油之分析，評價M-U之效果。
[表2]
其結果，若對表3~6中之1-1與1-2、或者1-3與1-4之結果進行比較，則均為與前者相比，後者之柴油或者潤滑油之分解速度明顯較快。
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
由此證實了微生物(M-U)之投入量與柴油或潤滑油之去除量有相關性，且證實了藉由本發明技術所分離之菌株對柴油污染之去除有效。
關於實施例4中所示之表2所示之條件之1-2、1-4，利用GC-FID法(氣相層析法)研究了柴油或潤滑油之分解之狀態。對其結果進行比較並示於圖4、圖5中。根據該等結果，認為於本發明之方法中，以一定之速度進行習知困難較多之潤滑油之微生物分解，且分解反應與所投入之M-U之量相關，係可活用於潤滑油之除污之方法。
又，根據利用GC-FID法之分析結果，可知利用該方法可使C30(碳數30，層析圖中之最大峰值之部分)左右之高分子之烴分解。
根據迄今為止之見解，C30左右之高分子之烴之微生物分解並不容易，因此本發明之技術可謂是極其珍貴之技術。
於使土之量增加之條件下進行潤滑油之除污測試。即，以潤滑油成為10,000ppm之方式向3kg之土樣品中添加潤滑油，使用轉筒式攪拌器充分地進行攪拌。進而，於其中添加M-U 60g、A-U 90g及水750mL而進行充分攪拌，製成除污用試樣。將該試樣放入至木箱(14cm×13cm×16cm)中，藉由用水濕潤之棉布覆蓋試樣之上表面。將該木箱放置於恆溫器之上段，該恆溫器於下段放入有裝有水之槽，於25℃下進行反應。
於反應中，以1週之間隔採取距試樣表面5cm之深度之土，測定石油相關物質之濃度。將測定結果示於表7及圖6中，經過22週之反應，呈無法自土中檢測出潤滑油之狀態。該等結果證實了本發明對遭石油相關物質污染之土之除污之有效性。
[表7]
本發明係關於一種石油相關物質之除污技術，其中發現對於高溫或高壓之耐性優異，且對於高分子(碳數30以上)之烴等
亦展示出優異之分解活性之微生物，可投入至較深之地下，成為能夠利用於石油污染之生物修復中之實用的技術。根據本發明，利用耐壓性優異之微生物，對於需要以高壓較深地注入地下之類之工程而言，能夠使工程之效率良好，能夠有利地對遭石油相關物質污染之環境進行除污。本發明可有助於開發遭有害物質污染之土地或地下水之安全且經濟之淨化手段。
可知本發明亦可實行除上述說明及實施例中特別記載以外者。鑒於上述之教示，可對本發明進行很多改變及變形，因此該等亦係本件隨附之申請專利範圍內者。
桿菌屬(Bacillus sp.)菌af-1菌株：NITE P-02735
桿菌屬(Bacillus sp.)菌af-5菌株：NITE P-02736
SEQ ID NO：1，16S-rDNA
SEQ ID NO：2，16S-Rdna
國內寄存資訊
無
國外寄存資訊
1.寄存國家-日本、寄存機構-獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄存中心(NITE-IPOD)、寄存日期-2018年6月7日、寄存編號-NITE P-02735
2.寄存國家-日本、寄存機構-獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄存中心(NITE-IPOD)、寄存日期-2018年6月7日、寄存編號-NITE P-02736
<110> IGA Bioresearch股份有限公司
<120> 遭石油相關物質污染之環境的除污方法及使用之材料
<130> PH30-016ST(整理編號)
<160> 2
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> 桿菌屬sf-1
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<221> 來源
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<220>
<221> 來源
<222> (1)..(498)
<223> 16S-rDNA
<400> 2
Claims (12)
- 一種石油相關物質之分解法，其特徵在於其使用桿菌(Bacillus)屬之微生物。
- 如請求項1之石油相關物質之分解法，其併用微生物與促進微生物之增殖之成分。
- 如請求項1之石油相關物質之分解法，其併用生質物質。
- 如請求項1之石油相關物質之分解法，其使用桿菌(Bacillus)屬細菌之孢子。
- 如請求項1之石油相關物質之分解法，其中，桿菌(Bacillus)屬細菌係與選自由暹羅芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、及貝萊斯芽孢桿菌所組成之群者的基因之同源性較高的桿菌屬細菌。
- 如請求項1之石油相關物質之分解法，其使土壤中之高分子(碳數30以上)之石油相關物質分解。
- 如請求項1之石油相關物質之分解法，其併用桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)之菌體或孢子、與桿菌屬af-5菌株(寄存編號：NITE P-02736)之菌體或孢子。
- 一種方法，其特徵在於其使用桿菌(Bacillus)屬細菌將水中之烴分解去除。
- 一種烴類之生物化學性分解法，其特徵在於其使用桿菌(Bacillus)屬之微生物。
- 一種桿菌(Bacillus)屬細菌或其孢子，其特徵在於其係與選自由暹羅芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、及貝萊斯芽孢桿菌所組成之群選擇者的基因之同源性較高的桿菌(Bacillus)屬細菌，且具有石油相關物質之分解活性。
- 一種微生物，其特徵在於其係選自由桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)及其後代、桿菌屬af-5菌株(寄存編號：NITE P-02736)及其後代、及其等之孢子(芽孢)所組成之群。
- 一種環境污染物質去除劑，其特徵在於其含有桿菌屬af-1菌株(寄存編號：NITE P-02735)之菌體或孢子、與桿菌屬af-5菌株(寄存編號：NITE P-02736)之菌體或孢子作為有效成分。
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